m BỘ Y T Ê TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI . . DIỆP THỊ MINH QUYẾT TỔNG HỢP VÀ THẢM DÒ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT CỦA 4- AMINO- 4H -1,2,4- TRIAZOL (KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP Dược s ĩ KHÓA 1999-2004) Người hướng dẫn: PGS.TS. NGUYỄN QUANG ĐẠT TS. NGUYỄN NGỌC ANH Nơi thực hiện: BỘ MÔN HÓA HỮU c Thời gian thực hiện: - /2004 rợ: ■Si. ĩ iu 'T Ĩ m ịp HÀ NỘI, / 2004 DV & L ÍS S . ị’ LÒI CẢM ON Với lòng kính trọng biết ơn sâu sắc, xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến: PGS. TS.Nguỵễn Quang Đạt, Trưởng môn Hóa hữu - Trường Đại Học Dược Hà Nội. Tổ. Nguyễn Ngọc Anh, giảng viên môn Hóa Hữu Cơ. Là người thầy trực tiếp hướng dẫn, bảo tận tình giúp đỡ nhiều trình thực hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến: TS. Cao Văn Thu - Bộ môn Công nghiệp dược, Tổ. DỖ Ngọc Thanh Phòng thí nghiệm trung tâm trường Đại Học Dược Hà Nội, KS. Thành Thu Thuỷ - Phòng máy khối phổ - Viện hóa học, TS. Lê Mai Hương - Phòng thực nghiệm sinh học - Viện hoá học hợp chất thiên nhiên - Trung tâm khoa học tự nhiên công nghệ quốc gia toàn thể thầy cô giáo, cán kỹ thuật viên môn Hóa Hữu Cơ, thầy cô giáo toàn trường nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi để hoàn thành khóa luận này. Cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới gia đình bạn bè, người động viên giúp đỡ sống học tập. Hà Nội, ngày 30/5/2004 Sinh viên D iệp T hị M inh Q uyết MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN KÝ HIỆU VIẾT TẮT ĐẶT VẤN ĐỂ .1 Phần 1. TỔNG QUAN 1.1. Tác dụng sinh học dẫn chất triazol . 1.1.1. Tác dụng kháng khuẩn .2 1.1.2. Tác dụng kháng nấm 1.1.3. Tác dụng kháng virus . 1.1.4. Tác dụng chống ung thư .6 1.2. Phương pháp tổng hợp 4- amino- 4H-1,2,4- triazol .6 1.3. Phương pháp tổng hợp dẫn chất azomethin 4- amino- 4H1,2,4- triazol 1.3.1. Phản ứn^ ngưng tụ aldehyd thơm với amin bậc . 1.3.2. Tổng hợp azomethin 4- amino- H -1,2,4- triazol 11 Phần 2. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 13 2.1. Nguyên liệu phương pháp thực nghiệm 13 2.1.1. Hoá c h ấ t . 13 2.1.2. Phương tiện .13 2.1.3. Phương pháp thực nghiệm 13 2.2. Tổng hợp hoá h ọ c 13 2.2.1. Sơ đồ tổng hợp hoá học 13 2.2.2. Tổng hợp 4- amino- 4H- 1,2,4- triazol 14 2.2.3. Tổng hợp azomethin 4- amino- 4H-1,2,4- triazol . 15 2.3. Kiểm tra độ tinh khiết xác định cấu trú c 26 2.3.1. Sắc ký lớp mỏng . 26 2.3.2. Phân tích phổ hồng ngoại 27 2.3.3. Phân tích phổ tử ngoại 29 2.3.3. Phân tích phổ khối lượng . 30 2.4. Thử tác dụng sinh học . 33 2.4.1. Thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm 33 2.4.2. Thử tác dụng kháng dòng tế bào ung thư người 37 Phần 3. KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT . 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHU LUC KÝ HIỆU VIẾT TẮT. CTCT : Công thức cấu tạo. DĐVN : Dược điển Việt Nam. DMF : Dimethylíormanid. Et20 : Ether EtOH : Ethanol. IR : Phổ hồng ngoại. MeOH : Methanol. MS : Phổ khối lượng. SKLM : Sắc ký lớp mỏng, uv : Phổ tử ngoại. ĐẶT VẤN DÈ Thuốc sử dụng phòng chữa bệnh có nhiều nguồn gốc khác nhau, thuốc có nguồn gốc bán tổng hợp tổng hợp giữ vị trí quan trọng. Sự phát triển mạnh mẽ ngành khoa học kỹ thuật, công nghệ đã, có đóng góp to lớn công nghiên cứu tổng hợp thuốc có hiệu điều trị cao. Trong lĩnh vực tổng hợp hoá dược, để nhanh chóng tạo thuốc có tác dụng tốt hơn, độc có hiệu cao điều trị, nhà nghiên cứu thường dựa cấu trúc chất dùng làm thuốc chất có tác dụng sinh học có triển vọng để tạo chất mới. Nhiều công trình nghiên cứu giới nước công bố cho thấy dẫn chất triazol có tác dụng sinh học đáng quan tâm như: hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus, chống ung thư. Nhiều dẫn chất triazol dùng điều trị, đặc biệt lĩnh vực kháng nấm. Tiếp tục phát triển hướng nghiên cứu dẫn chất triazol, khoá luận tốt nghiệp, đề mục tiêu nghiên cứu sau đây: - Tổng hợp 4- amino- 4H-1,2,4- triazol dẫn chất nó. - Thăm dò tác dụng sinh học chất tổng hợp với hy vọng tìm chất có hoạt tính sinh học cao rút số nhận xét sơ mối liên quan cấu trúc tác dụng dãy chất này. Với mục tiêu trên, hy vọng đề tài phần đóng góp vào việc nghiên cứu, tìm kiếm dẫn chất triazol có hoạt tính sinh học. PHẦN 1. TỔNG QUAN 1.1. TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CÁC DẪN CHẤT TRIAZOL. Nhiều công trình nghiên cứu giới nước công bố cho thấy dẫn chất triazol có tác dụng sinh học phong phú, đa dạng sử dụng có hiệu điều trị. Có thể kể đến số tác dụng sinh học sau: - Tác dụng kháng khuẩn - Tác dụng kháng nấm - Tác dụng kháng virus - Tác dụng chống ung thư 1.1.1. Tác dụng kháng khuẩn. > Tác dụng kháng khuẩn dẫn chất triazol nhiều tài liệu công bố: Năm 1971 B.M. Volynskii cộng (dẫn theo [12]) phát dẫn chất 4- amino- 4H-1,2,4- triazol với 5- nitro furfural có tác dụng kháng khuẩn: N----- N N------ N V V n= c h ^ J L No n= ch- ch= ch^ Furazonal o J L mo2 Furacrylin Furazonal có phổ kháng khuẩn rộng, tác dụng chủng vi khuẩn: Staphylococcus, Steptococcus, Pneumococcus, Salmonelal, Proteus, Diphtheritis bacteria, Diplococcus, kể chủng kháng sulíamid kháng sinh. Ở Liên Xô (cũ) Furazonal dùng điều trị lỵ trực trùng [18]. > Năm 1975 Leamanen; J.R.Bhuben (dẫn theo [12] ) công bố 3- amino- 1H-1,2,4- triazol có tác dụng kháng vi khuẩn Gram(-). H - N ------ N k NJ - N H > Các dẫn chất amino- 1,2,3- triazol có tác dụng sinh học kháng khuẩn, kháng nấm. Kết O.Livi; P.L.Perrarinl; J.Tonetle (dẫn theo [12]) phát năm 1975 năm 1978 chất: H3C \_____ ^ N (C 2H5)2 N R= > - C 6H5 , —COOH R= -H , -O C H Năm 1994 E.Ozkanli; S.Dalkava; U.Willke [15] phát dẫn chất 1H-1,2,4- triazol acetamid có tác dụng kháng khuẩn kháng nấm mạnh chủng vi khuẩn: Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa số vi nấm: C.albicans, c.parapsilosis, C.pseudotropicalis c.stellatoided. 1.1.2. Tác dụng kháng nấm. Là tác dụng đáng ý dẫn chất triazole. Các dẫn chất triazol với dẫn chất imidazol tạo thành họ thuốc azole chống nấm. Tác dụng chống nấm azole phát từ năm 1944 (Woolley 19 4 ) (dân theo [14] ), đến đầu năm 1970 công nhận nghiên cứu sâu tổng hợp hoá học, dược động học, độc tính thử lâm sàng. Trong năm gần đây, kết nghiên cứu đưa thuốc chống nấm thuộc họ triazol áp dụng điều trị [2] [5]: (công thức cấu tạo xem bảng 2). Bảng 1. Tác dụng kháng khuẩn số dẫn chất triazol. Chỉ định Các chất Fluconazol Bệnh vi nấm Candida miệng hầu người suy giảm miễn dịch Itraconazol Nhiễm Candida âm hộ, âm đạo Posaconazol Nhiễm nấm Aspergillus, Fusarium, Candida, Cryptococcus Saperconazol Voriconazol Nhiễm nấm Cryptococcus spp, Aspergillus Nhiễm nấm Aspergillus, Candida, Cryptococcus Có thể nhận định rằng: Các azol chứng tỏ bổ sung lớn vào danh mục thuốc chống nấm có độc tính thấp AmphotericinB, có tác dụng với nhiều loại nấm khác có tính chất dược động học ưu việt [14] [2]. Cơ chế tác dụng [2] [14]: Các thuốc chống nấm azol hoạt động theo chế tác dụng chung ức chế enzym cytocrom P450 nấm, enzym cần thiết để demethyl hoá 14a- methylsterol thành ergosterol. Ergosterol sterol chủ yếu màng tế bào nấm. Khi ergosterol không tạo thành, màng tế bào nấm bị tổn thương nên làm thay đổi chức độ thấm màng, dẫn đến làm chất quan trọng tế bào nấm ion kali, acid amin nấm bị tiêu diệt. Ở mức độ phân tử, nguyên tử N vòng azol liên kết với phần Hem enzym cytocrom P450 lanosterol 14a - dimethylase cắt đứt chuyển hoá lanosterol thành ergosterol (Vanden Bossche 1985). Hiện thuốc chống nấm dẫn chất triazol dùng nhiều điều trị như: Fluconazol, Itraconazol, Posaconazol, Saperconazol, Voriconazol. Viroconazol chưa có thị trường có bệnh viện, kháng sinh có phổ tác dụng rộng, với nấm men, nấm sợi. B ả n g 2: Công thức cấu tạo số dẫn chất triazol chống nấm. C ô n g th ứ c c ấ u tạ o STT ?H f^N'"N-CH2-Ọ-CH2-M/JSS ệrQ F Fluconazol f^N>sN - C H - ẹ - líS '01 o . ltraconazol - Q > ^ ^~N\ ^CHg—0 — nH ^ ^ ‘N—CH-CH2-C H Sapeconazol ỸH?H3V=\ Vi— ch2— c ch ^ >1 N=/ Fnị^ S j= N Voriconazol 1.1.3. Tác dụng kháng virus. Một số dẫn chất 1,2,3- triazol carboxamid 1,2,4- triazol carboxamid có tác dụng kháng virus có chất áp dụng điều trị Ribavirin (1- p -D- Riboíura- nosyl- 1H-1,2,4- triazol-3 carboxamid) [2]. Bảng 6. Các dải hấp thụ đặc trưng phổ hồng ngoại, cmA. TI • A •9• B iện giải Chất V nh2 V c -H VCH, nh2 VC=N arom V o^c .^C^N V no2 (benzen, di vòng) I II 3326 3100 1633 3102 1620 1522 1452 1378 1604 1577 1503 1450 III 3084 1616 1580 1430 IV 3098 1676 1594 1430 V 3091 1620 1593 1513 1490 VI 3087 1612 1584 1500 1436 1620 1595 1516 1464 1617 1509 1490 1450 1620 1580 1489 1398 2915 Oas) VII 3131 VIII 3118 IX 3140 2830 (v.) 28 V c-ci arom 1522 (^as) 1357 (vs) 1519 (^as) 1346 (vs) 1085 1529 (Vas) 360 (vs) 2.3.3. Phân tích p h ổ tử ngoại Tại phòng thí nghiệm trung tâm — trường ĐH Dược Hà Nội, chất(I — IX) ghi phổ tử ngoại (UV) máy Carry IE UV-Visible Spectrophotometer varian dung môi EtOH tuyệt đối. Các gía trị Ầmax trình bày bảng 7. Các phổ đồ in phụ lục 2.1 — 2.9 . Bảng 7. Giá trị Ẳmax chất tổng hợp được. EtOH A,max Sô chất I II 203 ffl 204 207 IV V VI VII VIII IX 214 203 204 204 217 243 235 240 (nm) 278 260 298 283 300 298 385 362 325 333 * Biên giải phổ tử_ngoai. [10] [17] - Phổ tử ngoại thu chứng tỏ hấp thụ mạnh vùng tử ngoại chất tổng hợp cấu trúc có chứa hệ liên hợp 71-71 p-7T (vòng benzen, vòng 1,2,4- triazol, vòng furan nhóm —C=N, N 2, OH, o c h ). - Phổ tử ngoại chất I có cực đại 203 nm quy cho chuyển mức 71-71 vòng triazol. - Phổ tử ngoại dẫn chất azomethin I (II - IX) có 2, 29 cực đại vùng 203 — 207 nm, 214 — 243 nm, 260 — 300 nm, 325 — 385 nm. Các cức đại xuất hệ liên hợp phân tử mở rộng với vòng bezen, furan nhóm —C=N nhóm khác N , o c h 3, - OH , Cl. - X max hai vùng (203 — 207 nm 214 — 243 nm) quy cho chuyển mức lượng 71-71 vòng triazol, vòng benzen. - X max hai vùng (260 — 300 nm 325 — 385 nm) quy cho chuyển mức lượng 71-71 hệ liên hợp toàn phân tử. Có thể nhận xét chất IV, VI, VII IX có X max vùng bước sóng dài chất khác (325 — 385) phân tử có hệ liên hợp rộng chất khác có mặt nhóm -N 02 (IV), N(CH3)2 (VI), -OH (VII) gắn vào vị trí para nhân bezen nhóm -N 02 gắn vào vị trí vòng furan. 2.3.4. Phân tích p hổ khối lượng Phổ khối lượng ghi máy HP-5989B-MS, phòng phân tích cấu trúc — Viện hóa học — Trung tâm khoa học tự nhiên công nghệ quốc gia. Do điều kiện hạn chế, tiến hành ghi phổ khối lượng chất đại diện chất (IV) chất (V). Phổ đồ in phụ lục 3.1 — 3.2 Kết phân tích phổ khối lượng ghi bảng 30 Sơ đồ phân mảnh chất V. m/z 151 m^z 138 -N + 1H CIh Q ^ C H m/z 124 -c f ▼ C7H5 m/z 89 31 Bảng . Số liệu phổ khối lượng chất IV, V. C h ất C ô n g thứ c cấu tạo m / z 217 ( m - ) 187 (M — NO) 162 ( M — 2HCN — 1H ) IV / =N 149 ( M- —N ) ==N 135 ( 162 — N2+ 1H) (M=217) 89 (135 — N 2) 206 ( m ! ) ; 208( m +2 ) 171 (206 — Cl) 151 ( M — 2HCN — 1H ) ỵ= N ) 138 ( M---- N \= N 124 ( 151 — N2— 1H) V (M=206) 89 ( 124 — Cl) * Biên giỏi phổ khối ịươn&i [9] [17] Kết phân tích phổ khối lượng cho thấy hai chất (IV, V) có pic phân tử có số khối số khối chất dự kiến. Ở phổ đổ chất (V) có pic M+2 với cường độ «1/3 cường độ pic phân tử, điều chứng tỏ có nguyên tử clo phân tử chất V pic M+2 pic ion phân tử chứa đồng vị 37C1. Ngoài ra, phổ khối lượng cho phép nhận pic phân mảnh phù hợp với sơ đồ phân mảnh. 32 2.4. THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC. Để đáng giá hoạt tính sinh học chất tổng hợp với hy vọng tìm thấy dẫn chất 4- amino- 4H-1,2,4- triazol có hoạt tính sinh học, tiến hành thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm tác dụng kháng dòng tế bào ung thư người. 2.4.1. Thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm [6]. Trong điều kiện cho phép tiến hành thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm chất (I, II, IV, V, VI, IX), phòng thí nghiệm vi sinh — Bộ môn Vi sinh - ĐH Dược - Hà Nội. 2.4.1.1. Nguyên tắc. Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm chất xác định phương pháp khuếch tán môi trường thạch với khoanh giấy lọc tẩm chất thử. Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm đáng giá khả ức chế phát triển vi sinh vật, tạo thành vòng vô khuẩn có đường kính tỉ lệ thuận với logarit nồng độ chất thử. 2.4.1.2. Chất thử. Chất thử bao gồm chất: I, II, IV, V, VI, IX pha nồng độ 2mg/ml (0,2%) dung môi aceton. Chất đối chiếu: - Getamycin (Genta) pha nồng độ 20Ag/ml chủng vi khuẩn Gram(+) - Penicillin (Peni) pha nồng độ 20UI/ml chủng vi khuẩn Gram(-) - Nipagin (Nip) pha nồng độ lmg/ml vi nấm 2.4.1.3. Vi sinh vật kiểm định. Giống vi sinh vật kiểm định Bộ môn Vi Sinh cung cấp. Chúng tiến hành thử chủng vi khuẩn, chủng vi nấm. * chủng vi khuẩn Gram (+): - Bacillus pumilus (Bp) ATCC10241 33 - Bacillus subtilis (BS) ATTC 6633 - Sarcina lutea (SL) ATCC9341 - Staphylococcus aureus (Sta) ATCC1228 * chủng vi khuẩn Gram (-): - Escherichia coli (EC) ATCC25922 - Pseudomonas aeruginosa (Pseu) VM201 - Salmonella typhi (Sal) DT220 - Shigella Ịĩexneri (Shi) DT112 * chủng vi nấm: - Aspergillus niger (As) - Candida albicans (Cd) 2.4.1.4. M ôi trường dinh dưỡng * Môi trường canh thang: Cao thịt 0,3% Pepton 0,5% NaCl 0,5% Nước cất vđ 15ml * Môi trường thạch thường: Cao thịt Pepton 0,3% 0,5% NaCl 0,5% Thạch 1,6% Nước cất vđ 480ml * lOml dung dịch Tween 80 0,2% * Môi trường Sabouraud lỏng: Glucose 2% Pepton 1% Nước cất vđ lOml * Môi trường Sabouraud: Glucose 2% Pepton 1% 34 Thạch Nước cất vđ 1,6% 120ml 2.4.1.5. Tiến hành. - Các môi trường nuôi cấy tiệt trùng 120°c 20 phút trước sử dụng. - Chuẩn bị nhũ dịch vi sinh vật nồng độ ÌO6 — 107 tế bào/ml. Bằng cách dùng chủng thị phát triển thạch nghiêng sau 24 giờ, cấy truyền vi khuẩn vào ống nghiệm chứa 4,5ml môi trường canh thang, cấy truyền Candida albicans vào ống nghiệm chứa 4,5ml môi trường Sabouraud lỏng, cấy truyền Aspegillus niger vào ống nghiệm chứa 4,5ml dung dịch Tween 80. Các Ống nghiệm ủ ấm 37°c 24 giờ, sau lấy dùng. - Nhũ dịch vi khuẩn cấy vào môi trường thạch thường, nhũ dịch vi nấm cấy vào môi trường Sabouraud đặc nhiệt độ 50 — 60°c, lắc đều, đổ vào đĩa petri với thể tích 20ml/đĩa. - Đưa mẫu thử vào môi trường kiểm định: Có cách đưa mẫu thử vào môi trường kiểm định: Đặt khoanh giấy lọc Đục lỗ thạch Đặt khối thạch Ở sử dụng phương pháp đặt khoanh giấy lọc (d = mm), khoanh giấy lọc có tẩm chất thử đặt bề mặt môi trường kiểm định. - Nuôi cấy: Các đĩa petri có mẫu thử nuôi cấy 37°c vi khuẩn, 30°c vi nấm, 18 — 24 giờ. - Mỗi mẫu thử đĩa chủng vi sinh vật. Đường kính vòng vô khuẩn đo thước kẹp parmer có độ xác 0,02 mm. Kết đánh giá dựa đường kính vòng vô khuẩn. Kết thể bảng 9. Hình ảnh minh hoạ tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm trình bày phần phụ lục 4. 35 Bảng 9. Kết thử hoạt tính sinh học chất I, II, IV, V, VI, IX (ở nồng độ mg/ml, đường kính vòng vô khuẩn tính mm Chất Đường kính vòng vô khuẩn Chủng Baciỉlus pumilus Bacillus s u b t ilis Sarcina lutea Staphylococcus aureus Escherichia co li Pseudomonas aerugỉnosa Salmonella typhi Shigella flexneri Aspergillus niger Candida albicans I II IV V VI IX Peni - - - - - 20,35 19,50 - - - 8,82 - 18,15 19,80 - - - - 18,51 18,60 - - - 7,55 - 14,31 15,60 - - - 8,33 - - - - - - 11,31 Genta 18,97 19,19 19,89 18,21 Nip - - - 8,12 - 15,10 17,13 - - - 7,96 - 18,30 18,56 - - - - - 19,20 14,7 - - - - - 20,23 - Ghi chú. ( - ) : Kết âm tính. 2.4.1.6. Kết quả. Từ kết thu trên, rút số nhận xét sau: - Ở nồng độ 2mg/ml chất II có tác dụng chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa so sánh với chất đối chiếu gentamycin thấy tác dụng yếu. - Chất V có tác dụng số vi khuẩn Gram(+), Gram(-). So sánh với chất đối chiếu penicillin gentamycin thấy chất IV có tác dụng yếu. 36 - Chất IX có tác dụng chủng vi khuẩn kiểm định. So sánh với chất đối chiếu thấy chất IX có tác dụng mạnh gần chất chất đối chiếu. - Kết thử nấm cho thấy chất IX có tác dụng mạnh chủng nấm, chất khác tác dụng. So sánh với chất đối chiếu Nipagin, thấy chất IX có tác dạng mạnh so với Nipagin chủng vi nấm thử. ♦♦♦ Nhân xét vế mối liên quan cấu trúc - tác dung. - Trong chất đem thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, nhận thấy chất trung gian 4- amino-4H- 1,2,4- triazol hoàn toàn tác dụng sinh học azomethin 4- amino- 4H- 1,2,4- triazol với Benzaldehyd (chất II) có tác dụng yếu chủng vi khuẩn. Khi nhóm chức vào vị trí C3, C4 Benzaldehyd, nhận thấy nhóm C1 xuất tác dụng tác dụng yếu, nhóm chức khác hoàn toàn tác dụng. Kết cho thấy thêm nhóm C1 vào phân tử chất có hoạt tính sinh vật thường đến kết tăng hoạt tính chất đó. - Azomethin 4- amino- 4H-1,2,4- triazol với furfural (chất VIII) tác dụng sinh học. Nhưng nhóm N vào vị trí C5 furfural lại cho chất IX có tác dụng tốt vi khuẩn vi nấm, chứng tỏ dẫn chất nitro furfural có tác dụng tốt. 2.4.2. Thử tác dụng kháng dòng tế bào ung thư người. Do điều kiện hạn chế, tiến hành thử tác dụng kháng dòng tế bào ung thư người chất (IV, V) để thăm dò hoạt tính kháng ung thư dãy chất này. 2.4.2.1. Nguyên tắc. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính kháng dòng tế bào ung thư tiến hành theo mô hình thử nghiệm lưu hành áp dụng viện nghiên cứu ung thư quốc gia mỹ (NCI). Tế bào thử nghiệm có nguồn gốc dòng tế bào ung thư người: - Hep - 2: Tế bào ung thư gan người. - FL: Tế bào ung thư màng tử cung. 37 2A.2.2. Tiến hành. * Tế bào ung thư trì điều kiện tiêu chuẩn thử test với chất thử chuẩn bị sẳn nồng độ khác phiến kính vi lượng 96 giếng, dung môi DMSO 10% * Mẫu thử nghiệm (bao gồm tế bào + môi trường nuôi cấy + chất thử) ủ 37°c để tế bào phát triển. * Sau 72 lấy tế bào ra, cố định, rửa, nhuộm hoà lại dung dịch chuẩn. Đọc kết máy Elisa bước sóng 495 — 515 nm. Nồng độ ức chế tế bào ung thư chất thử tính đại lượng IC50. * Đọc kết biện luận. Giá trị IC50 tính chương trình Table curve với giá trị logarit dựa giá trị thang nồng độ khác chất thử giá trị ED (liều lượng tác dụng) đo được, mẫu có giá trị IC50 khác nhau. Các mẫu tinh khiết có giá trị IC50 < |ig/ml coi có hoạt tính. * Lưu ý: Song song làm phiếu đối chứng OD (ngày O) để đối chứng cho lượng tế bào thời điểm bắt đầu thí nghiệm. Về đối chứng âm: Giá trị OD DMSO 10% để làm đối chứng cho giá trị lượng tế bào kết thúc thí nghiệm. Cách cố định nhuộm với mẫu thử. * Dựa kết đo chứng OD (ngày O) OD DMSO 10% so sánh với giá trị OD mẫu chất thử để tìm giá trị ED50 theo công thức. Mẫu có giá trị ED < 50% mẫu có hoạt tính, dùng giá trị ED50 10 thang nồng độ dựa vào chương trình Table curve theo thang giá trị logarit đường cong phát triển tế bào nồng độ chất thử để tính giá trị IC50. LnY = a + bX Y: Nồng độ chất thử. X: Giá trị ED50. Chúng tiến hành thử hoạt tính kháng dòng tế bào ung thư 38 chất tổng hợp dòng tế bào ung thư. Kết trình bày bảng 10. Bảng 10. Kết thử hoạt tính kháng dòng tế bào ung thư người chất thử (IV, V). Dòng tê bào - giá trị IC50 Chất IV CTCT H e p -2 FL >5 >5 2,93 >5 02N-h(^)-CH=N-N/ ~ V K ết luận (|Ag/ml) CI-h(^^-CH=N-N/~ âm tính Dương tính dòng ♦> Nhận xét. Kết thử nghiệm cho thấy chất IV tác dụng chống ung thư. Chất V nồng độ IC50=2,93 |ag/ml có tác dụng kháng dòng tế bào ung thư gan người (Hep - 2), không tác kháng ung thư dòng tế bào ung thư màng tử cung (FL). Có thể nhận xét nguyên tử clo vị trí para hợp phần aldehyd góp phần mang lại hoạt tính kháng dòng tế bào ung thư Hep - chất V. 39 PHÂN 4. KẾT LUẬN VÀ DỀ ÃUẤT. Từ kết thực nghiệm trên, rút số kết luận sau: 1. Chúng tổng hợp chất bao gồm 4- amino- 4H-1,2,4- triazol (I) dẫn chất azomethin (II — IX), chất V chưa thấy công bố tài liệu tham khảo được. 2. Trong trình tổng hợp dẫn chất azomethin tiến hành theo dõi phản ứng SKLM để xác định thời gian phản ứng tối ưu cho mổi phản ứng. 3. Đã kiểm tra độ tinh khiết chất tổng hợp SKLM đo nhiệt độ nóng chảy. Xác định cấu trúc chất phân tích quang phổ hồng ngoại, tử ngoại phổ khối lượng. Kết cho phép sơ kết luận chất tổng hợp có công thức dự kiến. 4. Đã thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm chất: I, II, IV, V, VI, IX phương pháp khuếch tán môi trường thạch với chủng vi khuẩn, chủng vi nấm. Kết cho thấy chất IX có tác dụng mạnh hầu hết vi sinh vật kiểm định. Chất II chất V có tác dụng yếu số vi khuẩn tác dụng kháng nấm. Còn chất khác tác dụng kháng khuẩn kháng nấm. 5. Đã thử tác dụng kháng tế bào ung thư chất (IV,V) dòng tế bào ung thư tế bào ung thư gan người (Hep - 2) tế bào ung thư màng tử cung (FL). Kết cho thấy chất V có tác dụng dương tính dòng tế bào Hep — 2, chất IV tác dụng. * Với kết đạt được, hy vọng đề tài đóng góp nhỏ vào việc nghiên cứu, tìm hiểu dẫn chất 4- amino- 4H- 1,2,4triazol có hoạt tính sinh học. Chúng cho cần tiếp tục thử hoạt tính kháng tế bào ung thư chất chưa thử nghiên cứu sâu tác dụng chống ung thư chất V. Cần tiếp tục tổng hợp sàng lọc hoạt tính sinh học dẫn chất khác 4-amino- 4H- 1,2,4- triazol. 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Berker.H, Berger.v, Thực hành hoá hữu cơ, NXB khoa học kỹ thuật, tr.13 — 14. (Đọc theo dịch Phan Tống Sơn, Lê Đăng Doanh, 1977). [2]. Bộ môn hoá dược (2003), Hoá dược, Đại học Dược Hà Nội, tập 2, tr.275 — 280; 296 — 297. [3]. Bộ môn hoá hữu (1990), Hoá hữu cơ, Đại học Dược Hà Nội, tập 1, tr.77- 79. [4]. Bộ môn hoá phân tích (1998), Hoá phân tích, Đại học Dược Hà Nội, tập 2, tr. 85 - 98. [5]. Bộ môn vi sinh (2003), chuyên đề kháng sinh chống nấm, Đại học Dược Hà Nội, tr.4 - 8. [6]. Bộ y tế (1994), Dược điển Việt Nam II, NXB y học, tập 3, tr.503 — 513. [7]. Nguyễn Khang, Nguyễn Quang Đạt (1984), Nguyên lý tổng hợp thuốc hữucơ, NXByhọc, tr.108 - 116, 188 - 198,208 — 219. [8]. Thái Doãn Tĩnh (2002), Giáo trình sở lý thuyết hoá hữu cơ, NXB khoa học kỹ thuật, tr.374 — 382. [9]. Nguyễn Đình Triệu ( 1999), Các phương pháp vật lý ứng dụng hoá học, NXB đại học quốc gia Hà Nội. [10]. Nguyễn Đinh Triệu (2001), Các phương pháp phân tích vật lý hoá lý, NXB khoa học kỹ thuật, tập 1. [11]. Nguyễn Văn Yên (1985), Luận văn tốt nghiệp đại học Dược Hà Nội. [12]. R.Bohm, C.Karow (1981), “Biologisch aktive Triazole”, Die pharmazie, (4), tr.234, 7. [13]. E.C.Horning (1955), Organic syntheses collective, vol.3, tr.96 — 98. [14]. Caron A.Lyman, Thomas T. Walsh (1992), “Systemically Administered antiíungal agents”, Drugs 44 (1), tr.9 — 35. [15]. E.Ozkanli, S.Dlkava, U.Calius, A.Willke (1994), “Synthesis of some N-Arylazole acetamid derivatives and their antimicrobial activities”, Chemical Abstrats, vol.122, 133083p. [16]. Ruhemann, Merriman, Beilstein (1949), Handbuch der organischen chemie, tập 26, tr. 18-20. [17]. R.M.Silverstein, G.C.Bassler, J.C.Morrill (1981). Spectrometric identi/ication oỷorganic compounds 4th.ed — foh Wiley, New york. [18]. M.V.Rubtsov; A.G.Baichikov (1971), Syntetiseskie khimikoíarm.preparatư. Izg “Medicina”-Mockba, ctp.153-156. PHẦN PHỤ LỤC. Phụ lục 1.1 - 1.9: Phổ hồng ngoại chất (I — IX). Phụ lục 2.1 - 2.9: Phổ tử ngoại chất (I — IX). Phụ lục 3.1 - 3.2: Phổ khối lượng chất IV, V. Phụ lục : Hình ảnh minh hoạ tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm chất (I, II, IV, V, VI, IX) [...]... tục và phát triển 1.2 PHƯƠNG PHÁP TỔNG HỢP 4 AMINO - 4H -1,2 ,4- TRIAZOL 4- amino- 4H- 1,2 ,4- triazol được tổng hợp lần đầu tiên vào năm 1899 do Ruhemann và Stapleton thực hiện bằng cách đun nóng íormyl hydrazin ở nhiệt độ 150-200°c (dẫn theo [13]), đây là phương pháp khá đon giản và thuận tiện Về sau nhiều nhà tổng hợp hữu cơ đã nghiên cứu sâu hơn về phương pháp 6 tổng hợp 4- amino- 4H- 1,2 ,4- triazol. .. 1,2 ,4- triazol * Các dẫn chất của dị vòng triazol có ý nghĩa quan trọng và đã được nhiều tác giả nghiên cứu Trong công trình này chúng tôi đã tổng hợp thêm một số dẫn chất azomethin của 4- amino- 4H- 1,2 ,4- triazol với các aldehyd thơm, phản ứng xảy ra trong dung môi EtOH, ở nhiệt độ sôi cách thuỷ, sử dụng xúc tác acid (HC1, H2S 04) v ề mặt lý thuyết ta thấy sử dụng xúc tác acid là hợp lý vì 4- amino- 4H- ... Tổng hợp các dẫn chất azomethin của 4- amino- 4H- 1,2 ,4- trìazol Nhiều nhà nghiên cứu trong nước và nước ngoài đã đi sâu nghiên cứu phương pháp tổng hợp các azomethin của 4- amino- 4H- 1,2 ,4- triazol > Ruhemann; Merriman [16] đã thực hiện phản ứng tổng hợp các azomethin của 4- amino- 4H- 1,2 ,4- triazol với các aldehyd thơm trong dung môi EtOH ở nhiệt độ phòng với xúc tác piperidin: /= N Ar-CHO + /= N H2N-N... tôi tiến hành tổng họp 4- amino- 4H- 1,2 ,4- triazol theo phương pháp của M.V.Rubtsov; A.G.Baichikov 7 1.3 PHƯƠNG PHÁP TỔNG HỢP CÁC DẪN CHẤT AZOMETHIN CỦA 4AMINO- 4H- l,2 ,4- TRIAZOL 1.3.1 Phản ứng ngưng tụ aldehyd thơm với amin bậc 1 [1] [3] [8] Phương trình tổng quát: A r-C H O + H2N —A f ' — Ar — CH = N — A r ' + H20 Đây là phản ứng cộng hợp ái nhân ( AN) vào nhóm carbonyl của aldehyd thơm, tác nhân ái...Ribavirin là một nucleosid kháng virus phổ rộng được tổng hợp vào năm 1972 Ribavirin là thuốc chống virus cúm B khá mạnh, kháng virus hợp bào đường hô hấp (RSV) và á cúm, nó cũng có hoạt tính đối với một số virus khác như herper, thuỷ đậu, viêm gan, sởi 1.1 .4 Tác dụng chống ung thư Một số dẫn chất của amino triazol có tác dụng chống ung thư đã được tìm thấy Năm 1972 M.A.Hahn; R.H.Adanson và năm 1973... dòng tế bào ung thư người được tiến hành theo mô hình thử nghiệm hiện đang lưu hành và áp dụng tại viện nghiên cứu ung thư quốc gia mỹ (NCI) 2.2 TỔNG HỢP HOÁ HỌC 2.2.1 Sơ đồ tổng hợp hoá học Trong khoá luận này, chúng tôi đã tiến hành các phản ứng tổng hợp theo 13 sơ đồ phản ứng sau đây: HCOOH + NH2 H 2.H20 -N (I) Ar-CHO Ar—C H =N — N (II-IX ) 2.2.2 Tổng hợp 4- amino- 4 H -1,2 ,4- triazol ( I ) 4- amino- ... cộng sự (dẫn theo [12]) đã công bố Guanazol (3,5-diamino-lH-l,2 ,4- triazol) được áp dụng trong điều trị bệnh tăng bạch cầu H I Trước đó, các tác giả đã tìm thấy tác dụng chống Leukemia LT 210 ở chuột, chống các tế bào ung thư của Guanazol Các kết quả nghiên cứu trên cho thấy các dẫn chất triazol có tác dụng sinh học phong phú đa dạng Việc nghiên cứu tìm kiếm các dẫn chất triazol có hoạt tính sinh học cần... xúc tác acid là hợp lý vì 4- amino- 4H- 1,2 ,4- triazol là một base yếu nên cần dùng acid mạnh để proton hoá carbon của nhóm carbonyl làm tăng khả năng ái nhân của nhóm carbonyl do đó sẻ tăng khả năng phản ứng ngưng tụ Xuất phát từ 4- amino- 4H- 1,2 ,4- triazole tổng hợp được và các aldehyd thơm, chúng tôi tiến hành tổng hợp một số azomethin theo phương trình tổng 15 quát sau: =N =N HoN-N Ar-CHO HoO... trị Ẳmax của các chất tổng hợp được EtOH A,max Sô chất I II 203 ffl 2 04 207 (nm) IV V VI VII VIII IX 2 14 203 2 04 2 04 217 243 235 240 278 260 298 283 300 298 385 362 325 333 * Biên giải phổ tử_ngoai [10] [17] - Phổ tử ngoại thu được chứng tỏ sự hấp thụ mạnh ở vùng tử ngoại của các chất tổng hợp được do cấu trúc có chứa các hệ liên hợp 71-71 và p-7T (vòng benzen, vòng 1,2 ,4- triazol, vòng furan và các... amino- 4H- 1,2 ,4- triazol là chất trung gian để tổng hợp các chất khác trong công trình này Chúng tôi thực hiện phản ứng theo phương pháp của M.V.Rubtsov; A.G.Baichikov [18] vì thấy phương pháp này đơn giản và hiệu suất cao * • Phương trình phản ứng: HCOOH + H2N-NH2 H 20 h 2n - n 4h c2 4 4 h n PTL: 84, 08 • Dụng cụ: Bình cầu đáy tròn dung tích 250 ml, sinh hàn ngang, nhiệt kế, bình hứng • Tiến hành: Cho vào . các dẫn chất triazol có hoạt tính sinh học cần được tiếp tục và phát triển. 1.2. PHƯƠNG PHÁP TỔNG HỢP 4 ■ AMINO - 4H -1,2 ,4- TRIAZOL. 4- amino- 4H- 1,2 ,4- triazol được tổng hợp lần đầu tiên vào. TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI DIỆP THỊ MINH QUYẾT TỔNG HỢP VÀ THẢM DÒ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT CỦA 4- AMINO- 4H- 1,2 ,4- TRIAZOL (KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP Dược s ĩ KHÓA 1999-20 04) Người. 13 2.2.1. Sơ đồ tổng hợp hoá học 13 2.2.2. Tổng hợp 4- amino- 4H- 1,2 ,4- triazol 14 2.2.3. Tổng hợp các azomethin của 4- amino- 4H- 1,2 ,4- triazol 15 2.3. Kiểm tra độ tinh khiết và xác định cấu trúc