Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 1 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM TRẦN THỊ LIÊN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA PHỤ PHẨM CHÈ TRONG QUÁ TRÌNH CHẾ BIẾN CHÈ KHÔ CỦA LOÀI CHÈ XANH (CAMELLIA SINENSIS (L.) KUNTZE) Ở THÁI NGUYÊN Chuyên ngành: HOÁ HỮU CƠ Mã số: 60.44.01.14 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC VẬT CHẤT Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. NGUYỄN THỊ THANH HƢƠNG THÁI NGHUYÊN, NĂM 2014 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 2 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM TRẦN THỊ LIÊN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA PHỤ PHẨM CHÈ TRONG QUÁ TRÌNH CHẾ BIẾN CHÈ KHÔ CỦA LOÀI CHÈ XANH (CAMELLIA SINENSIS (L.) KUNTZE) Ở THÁI NGUYÊN LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC VẬT CHẤT THÁI NGHUYÊN, NĂM 2014 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 3 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Chè xanh có tên khoa học Camellia sinensis (L.) Kuntze. Đó là loại đồ uống quen thuộc ở Việt Nam và nhiều nước châu Á từ hàng ngàn năm. Dịch chiết lá chè có hoạt tính sinh học rất cao, chủ yếu là do các poliphenol trong chè. Ngày nay đã tìm được tác dụng của poliphenol chè ở mức độ khác nhau đối với bệnh ung thư, bệnh tim mạch, bệnh cao huyết áp, bệnh đường ruột, bệnh răng và có tác dụng làm chậm quá trình lão hóa, tăng tuổi thọ. Poliphenol chè được sử dụng có hiệu quả và an toàn trong công nghệ thực phẩm để thay thế các antioxidant tổng hợp như BHA, BHT dễ gây tác dụng phụ có hại. Nhờ những tác dụng quý giá như nói trên của các poliphenol chè, nên chúng có giá trị cao trên thị trường hiện nay. Thái Nguyên là tỉnh Trung du nổi tiếng với sản phẩm chè xanh, nhưng hiện nay mới chỉ sản xuất Chè (khô) cho tiêu dùng trong nước hay xuất khẩu, vì vậy mới sử dụng chè búp và lá chè non, còn lại lượng rất lớn lá chè già, chè cám và các phụ phẩm chè khô hiện còn bị bỏ phí, làm cho hiệu quả canh tác cây chè vẫn còn thấp. Như vậy, ở đó còn tiềm tàng một nguồn lợi lớn, có thể từ đó tạo ra nguồn nguyên liệu làm thuốc chữa bệnh, bổ dưỡng và các chất phụ gia có giá trị cao trong công nghiệp thực phẩm. Nếu khai thác được nguồn poliphenol chè từ lá chè già và phụ phẩm chè chắc chắn sẽ nâng cao đáng kể hiệu quả canh tác của các vùng trồng chè. Dựa trên nguồn nguyên liệu phong phú đó, chúng tôi đã lựa chọn đề tài: "Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của phụ phẩm Chè trong quá trình chế biến Chè (khô) của loài Chè xanh (Camellia sinensis (L.) Kuntze) ở Thái Nguyên”. 2. Mục tiêu của đề tài 2.1 Nghiên cứu xác định nguyên liệu chè phụ phẩm để thu cao chè tổng. 2.2 Khảo sát thành phần hóa học của chè khô phụ phẩm. 2.3 Xác định hoạt tính sinh học của cao chè thu được: hoạt tính chống oxi hóa, hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định, hoạt tính gây độc tế bào với dòng ung thư ở người (KB). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 4 3. Đối tƣợng nghiên cứu Các phụ phẩm và phế phẩm chè thải loại của quá trình sản xuất chè xanh như: lá chè già, chè cám và vụn chè…của giống chè Trung du (chiếm ≈ 78% diện tích đất trồng chè) được chế biến bằng công nghệ chế biến chè xanh truyền thống. 4. Phạm vi nghiên cứu Đề tài được nghiên cứu trên các phụ phẩm chè của giống chè Trung du trong quá trình chế biến chè xanh tại một số cơ sở sản xuất chè xanh trên địa bàn tỉnh Thái Nguyên bằng công nghệ thủ công truyền thống. 5. Phƣơng pháp nghiên cứu. 1. Điều tra, thu thập, phân loại mẫu các phụ phẩm và phế phẩm chè thải loại của quá trình sản xuất chè khô thực nghiệm tại một số đơn vị trồng và chế biến chè tại địa bàn Thái Nguyên. 2. Xử lý mẫu thực vật và chiết mẫu bằng dung môi thích hợp (cồn thực phẩm, nước) để thu được các dịch chiết nhằm nghiên cứu thành phần hóa học. Nghiên cứu chọn điều kiện thích hợp (nguyên liệu, dung môi, môi trường, điều kiện, nhiệt độ, thời gian) để chiết được chọn lọc các dịch chiết. 3. Dịch chiết được tinh chế sơ bộ bằng cách chiết phân đoạn trong các dung môi có độ phân cực khác nhau hoặc lọc qua nhựa trao đổi. 4. Sử dụng phổ ESI-MS, 1 H – NMR, 13 C – NMR, DEPT để xác định thành phần, cấu trúc của các chất thu được. 5. Nghiên cứu thực hiện quy trình chiết tách chất từ các mẫu phụ phẩm và phế phẩm chè thải loại qui mô phòng thí nghiệm bao gồm các bước như sau: - Xác định mẫu để hàm lượng cao chè thu được cao nhất. - Khảo sát điều kiện chiết như: nguyên liệu, môi trường, dung môi, nhiệt độ, thời gian, điều kiện. - Nghiên cứu chọn lọc dung môi chiết an toàn, giá thành hợp lý (nước, cồn thực phẩm, ) 6. Sau khi có được các thông số cần thiết sẽ tiến hành nghiên cứu quy trình chiết tách cao chè từ nguyên liệu chè phụ phẩm mà đề tài xác định được. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 5 7. Đánh giá tính khả thi và hiệu suất kinh tế của quy trình chiết tách cao chè xanh từ nguyên liệu chè phụ phẩm để đưa ra quy trình chiết mẫu khả thi, thực tiễn. 8. Khảo sát hoạt tính chống oxi hóa, hoạt tính vi sinh vật kiểm định, hoạt tính kháng ung thư người trên dòng KB của cao chè chiết xuất được. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 6 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu về loài Chè (Camellia sinensis (L.) Kuntze) 1.1.1. Tên khoa học Tên Khoa học: Camellia sinensis (L.) Kuntze. var. assamica (Mast.) Pieere sec. Phamh. var bohea (L.) Pierre sec. Phamh. var. cantoniensis (Lour.) Pierre sec. Phamh. var. viridis (L.) Pierre sec. Phamh. Tên tiếng Việt: Chè; Trà. Tên khác: Thea sinensis L., Thea assamica Mast, Camellia assamica (Mast.) H. T. Chang, Thea sinensis L. var. assamica (Mast.) Pierre; Thea bohea L., Camellia bohea (L.) Lindl. in Lour, Thea sinensis L. var. bohea (L.) Pierre; Thea cantoniensis Lour., Thea sinensis L. var. cantoniensis (Lour.) Pierre; Thea viridisL., Camellia viridis (L.) Link, Thea sinensis L. var. viridis (L.) Pierre; Cây chè được xếp trong phân loại thực vật như sau [16]: Ngành Hạt kín Angiospermae Lớp Song tử điệp Dicotylednae Bộ Chè Theales Họ Chè Theaceae Chi Chè Camellia (Thea) Loài Chè C.sinensis 1.1.2. Đặc điểm thực vật của loài chè Trung du Thân và cành: Cây chè có thân thẳng và tròn, phân nhánh liên tục thành một hệ thống cành và chồi. Tùy theo chiều cao, kích thước của thân và cành, cây chè được chia thành 3 loại: cây bụi, cây gỗ nhỏ và cây gỗ vừa. Thân, cành và lá tạo thành tán cây chè; tán chè để mọc tự nhiên có dạng vòm đều. Hoa chè: Hoa chè bắt đầu nở khi cây chè đạt 2 – 3 tuổi, hoa mọc từ chồi sinh thực ở nách lá. Cây chè là một loại thực vật có hoa lưỡng tính, tràng hoa có 5 – 9 cánh màu trắng hay phớt hồng. Bộ nhị đực của hoa có 100 – 400 cái, trung bình có 200 – 300 cái. Các bao phấn của hoa chè gồm hai nửa bao, chia làm 4 túi phấn. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 7 Quả chè: Quả chè là loại quả có 1 – 4 hạt, có hình tròn, tam giác hoặc hình vuông, quả chè thường mọc thành từng chùm ba, ban đầu có màu xanh của chồi. Lá chè: Lá chè mọc cách nhau trên cành, mỗi đốt có một lá. Hình dạng và kích thước của lá chè thay đổi tùy theo từng giống. Giống chè Trung du: lá dài 4 – 14cm và rộng 2 – 2,5cm có màu xanh nhạt và bóng [16]. 1.1.3. Nguồn gốc và phân loại các loài Chè Nguồn gốc Theo truyền thuyết, cây chè lần đầu tiên được phát hiện bởi người Trung Quốc. Đầu tiên được sử dụng như một dược liệu, sau trở thành một thứ đồ uống mang đậm tính dân tộc của Trung Quốc. Ngày nay, cây chè được trồng ở nhiều nơi trên thế giới trong vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, trải dài từ 30 vĩ độ nam đến 45 vĩ độ bắc, tập trung chủ yếu ở các nước Châu Á chiếm 80-90% tổng diện tích chè thế giới [16]. Trong đó nổi tiếng là Ấn Độ, Trung Quốc, Kenya, Sri Lanka, Thổ Nhĩ Kỳ và Việt Nam [75]. Hình 1.3. Hình thân cây Chè Hình 1.4. Hình các bộ phận của cây Chè Hình 1.2. Hình hoa và quả của cây Chè Hình 1.1. Dịch chiết chè từ lá cây Chè Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 8 Đến nay có 56 nước trồng chè, sản xuất và chế biến chè ở các quy mô khác nhau, phân bố ở khắp 5 châu như sau: Châu Á có 20 nước bao gồm Trung Quốc, Ấn Độ, Srilanca, Indonexia, Nhật Bản, Thổ Nhỹ Kỳ, Banglades, Iran, Myanma, Việt Nam, Thái Lan, Lào, Malayxia, Campuchia, Nepan, Philippin, Triều Tiên, Apganistan và Pakistan. Châu Phi có 21 nước bao gồm Kenia, Malavi, Uganda, Iazania, Moozambich, Ruanda, Mali, Ghine, Morixom, Nam Phi, Ai Cập, Cônggô, Camơrun, Đảo rêuynion, Tchat, Rôđêria, Abitxi, Brundi, Maroc, Angiêri và Zimbabuê. Châu Mỹ có 12 nước bao gồm Achentina, Braxin, Pêru, Colômbia, Êcuado, Guatêmala, Praguay, Jamaica, Mêhicô, Bôlivia, Guyanna và Mỹ. Châu Đại Dương có 3 nước bao gồm Paqua Tân Ghinê, Fiji và Australi. Châu Âu có Cộng Hoà Liên Bang Nga và Bồ Đào Nha [15]. Ở Việt Nam, chè được trồng trong khoảng 30 tỉnh, trung du 14 tỉnh trong đó vùng trung du và miền núi phía Bắc chiếm khoảng trên 60%, Tây Nguyên khoảng 14%, còn lại là các vùng khác [16]. Các vùng trồng chè ở Việt Nam Tây Bắc: Sơn La, Lai Châu, Điện Biên, Yên Bái. Đông Bắc: Quảng Ninh, Lạng Sơn, Bắc Giang, Cao Bằng. Trung du và miền núi phía Bắc: Thái Nguyên, Phú Thọ, Hòa Bình, Hà Nội, Vĩnh Phúc. Cực bắc miền Trung: Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, Tây Nguyên, Lâm Đồng, Gia Lai, Kon Tum [76]. Phân loại Dựa theo đặc điểm thực vật học, đặc điểm sinh hoá, nguồn gốc phát sinh cây chè, Cohen Stuart (1919) đã chia Camellia Sinensis (L.) Kuntze thành 4 loại: a. Chè Trung Quốc lá to (Camellia sinensis var.Macrophylla) Đặc điểm: Thân gỗ cao tới 5m trong điều kiện sinh trưởng tự nhiên. Lá to, dài 12-15cm, rộng 5-7cm, màu xanh nhạt, bóng, năng suất phẩm chất tốt. Nguyên sản ở Vân Nam, Tứ Xuyên (Trung Quốc). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 9 b. Chè Trung Quốc lá nhỏ (Camellia sinensis var.Bohea) Đặc điểm: Cây bụi thấp, phân cành nhiều. Lá nhỏ, màu xanh đậm dài 3,5- 6,5cm, năng suất phẩm chất bình thường. Khả năng chịu rét ở nhiệt độ -12 0 C đến - 15 0 C. Phân bố chủ yếu ở miền đông, Đông Nam Trung Quốc, Nhật Bản và một số vùng khác. c. Chè Shan (Camellia sinensis var.Shan) Đặc điểm: Thân gỗ, cao từ 6-10m, lá to và dài 15-18cm, màu xanh nhạt. Tôm chè có nhiều lông tơ, trắng và mịn trong như tuyết. Có khả năng thích ứng trong điều kiện ẩm, địa hình cao, năng suất, phẩm chất thuộc loại tốt nhất. Nguyên sản ở Vân Nam (Trung Quốc), miền Bắc của Miến Điện và Việt Nam. d. Chè Ấn Độ (Camellia sinensis var. Assamica) Đặc điểm: Thân gỗ cao tới 17m, phân thưa cành. Lá to dài tới 20-30cm, mỏng mềm và xanh đậm, phiến lá gợn sóng, có 12-15 đôi gân lá, rất ít hoa, quả, chịu rét và chịu lạnh kém, cho năng suất búp cao và chất lượng tốt, được trồng nhiều ở Miến Điện, Việt Nam. Hình 1.8. Chè Trung Quốc lá nhỏ Hình 1.7. Chè Shan Hình 1.6. Chè Trung Quốc lá to Hình 1.5. Chè Trung du Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 10 1.2. Thành phần hoá học của chè 1.2.1. Nƣớc Nước là thành phần chủ yếu trong búp chè. Trong búp chè (1 tôm + 3 lá) hàm lượng nước thường có từ 75-82%. Hàm lượng nước trong búp chè thay đổi tùy theo giống, tuổi cây, đất đai, kỹ thuật canh tác, thời gian hái và tiêu chuẩn hái… 1.2.2. Poliphenol Nhóm các hợp chất poliphenol là thành phần được quan tâm nhiều nhất trong lá chè. Các hợp chất poliphenol của lá chè rất khác với các hợp chất poliphenol được tìm thấy trong các loại cây khác. Các cấu tử chính chiếm đa số là các catechin (C, EC, EGCG, EGC, ECG, ). Ngoài ra, trong thành phần poliphenol của chè còn có một số chất khác tỉ lệ thấp như các flavonol (quercetin, kaempferol, rutin, ) các dẫn xuất glucoside như myricetin - 3 - glucoside, kaempferol-3- rhamnodiglucoside , các leucoanthocyanin, các hợp chất poliflavonoit như theaflavin (theaflavin-3-gallate, theaflavin-3'-gallate, theaflavin-3,3'-digallate ), thearubigin (procyanidine , procyanidine gallate ). Các dạng hợp chất như theaflavin, thearubigin chiếm tỉ lệ rất thấp trong búp chè và lá chè non nhưng tăng dần tỉ lệ trong các lá chè già hơn [8], [38], [74]. 1.2.3 Alkaloit Alkaloit là nhóm hợp chất vòng hữu cơ có chứa nitrogen trong phân tử. Phần lớn các alkaloit là những chất không màu, có vị đắng và ít hòa tan trong nước. Trong lá chè, người ta tìm thấy các alkaloit chủ yếu là caffein, theobromin và theophylin. Trong đó, caffein chiếm khoảng 2 – 5% lượng chất khô; theobromin và theophyllin với hàm lượng nhỏ hơn rất nhiều so với hàm lượng của caffein, chiếm khoảng 0.33% khối lượng chất khô [8]. Tuy vậy, vai trò của theobromin và theophyllin trong dược tính của cây chè quan trọng hơn so với caffein [3]. 1.2.4 Protein và axit amin Protein trong búp chè phân bố không đều, chiếm khoảng 15% tổng lượng chất khô của lá chè tươi. Các axit amin cơ bản trong lá chè bao gồm: aspartic, arginin, alutamic, serin, glutamin, tyrosin, valin, phenylalanin, leucin, isoleucin và theanin … Trong đó theanin chiếm hàm lượng cao nhất, khoảng 50-60% tổng hàm lượng axit amin tự do, theanin là axit amin đặc trưng của cây chè, theanin chỉ có thể được tìm thấy ở các cây họ chè và một số ít các loài nấm [8], [45]. [...]... cacboxylic trong lá chè không cao lắm [79] 1.4 Hoạt tính sinh học của poliphenol chè xanh 1.4.1 Tác dụng chống oxi hóa của flavonoit Một trong những cơ sở sinh hóa quan trọng nhất để flavonoit thể hiện được hoạt tính sinh học của chúng là khả năng kìm hãm các quá trình oxi hóa dây chuyền sinh ra bởi các gốc tự do hoạt động Hoạt tính này thể hiện mạnh hay yếu phụ thuộc vào đặc điểm cấu tạo hoá học của từng... diện trong lá chè tươi Kim loại Các chất vô cơ chiếm khoảng 5-6% khối lượng khô của chè, chiếm nhiều nhất là nhôm, mangan, magie [47] Các chất dễ bay hơi (tinh dầu ch ) Tinh dầu là một hỗn hợp các chất bay hơi tồn tại trong các cơ quan của cây chè [3] Tinh dầu của cây chè được hình thành trong quá trình sinh trưởng, phát dục của cây chè và trong quá trình chế biến chè [16] 1.3 Poliphenol chè xanh Trong. .. gel (Merck), sắc ký cột pha đảo với chất hấp phụ là RP-18 và sắc ký lọc gel Sephadex LH-20 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu 26 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Hoạt tính sinh học của các dịch chiết và các chất phân lập được Các phép thử hoạt tính sinh học được thực hiện tại Phòng thử hoạt tính sinh học, Viện Hóa học thuộc Viện khoa học và công nghệ Việt Nam và tiến hành nghiên cứu với 02 mẫu: - Mẫu chè khô chiết... Nghiên cứu quy trình chiết cao chè tổng từ lá cây Chè 2.4.1 Chuẩn bị nguyên liệu - Nguyên liệu lá Chè (tươi): Lá cây Chè già thuộc giống chè Trung du, thu hoạch từ cây chè trước khi đốn, nhặt bỏ lá vàng, rửa sạch và để ráo nước sau đó ngâm trong nước nóng 700C khoảng 15 phút để diệt men - Nguyên liệu Chè (kh ): Là chè cám và chè phế phẩm của quá trình sản xuất Chè xanh (thuộc giống chè Trung du) Với mục... được nghiên cứu trên động vật [27], [39], [72], viêm gan cấp tính ở người [51], nghiên cứu chè xanh có hỗ trợ vi sóng [22], chất lượng chè xanh [48] 1.5.2 Tình hình nghiên cứu, sản xuất chế phẩm poliphenol ở Việt Nam Nước ta đã có một số công trình nghiên cứu cơ bản về các loại hợp chất poliphenol đặc biệt trong chè xanh, lá dâu tằm, lá sake,… .trong các trường đại học, viện nghiên cứu hay các công ty chế. .. poliphenol chè xanh trong sản xuất thực phẩm chức năng Phần lớn lá chè xanh được sử dụng làm đồ uống Tuy nhiên, ngày nay khuynh hướng sử dụng chè xanh trong chế biến thức ăn rất được phát triển Các loại bánh kem chè xanh, bánh gatô chè xanh, kem chè xanh, thạch chè xanh, mỳ ăn liền chè xanh, sandwich chè xanh đang được tiêu thụ mạnh ở các nước Nhật Bản, Hàn Quốc, Anh, Mỹ, Úc Trung Quốc và Việt Nam... 20,8 1,1 19,8 1,0 ở trong thành phần protein, mà còn có ở trạng thái tự do, có ý nghĩa lớn đối với chất lượng chè [13] Hàm lượng axit amin trong lá chè phụ thuộc vào giống và điều kiện canh tác [19] Nghiên cứu về protit trong chè cho thấy trong thành phần của protit có 12 loại axit amin khác nhau, trong số đó có 2 loại axit amin: Asparagin và Glutamin [58] 1.2.5 Gluxit và pectin Trong lá chè chứa rất ít... có các loại bánh nướng chè xanh, bánh dẻo Số hóa bởi Trung tâm Học liệu 23 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ chè xanh Tuy nhiên, Nhật Bản vẫn là nước có nhiều loại đồ uống và thức ăn được chế biến từ chè xanh nhất [4] Poliphenol chè xanh với hoạt tính sinh học đã được chứng minh bằng các nghiên cứu khoa học từ trước đến nay Do đó xu hướng bổ sung hợp chất này vào các sản phẩm thực phẩm chức năng đang được... poliphenol chè đã loại bỏ caffein và các chất khác Cho đến nay, nhiều kết quả nghiên cứu ở nước ngoài về tác dụng của chè xanh đã được công bố Một số thành phần hoá học của chè xanh (poliphenol) được coi là chất thu dọn gốc tự do và hiện nay đã thu hút sự chú ý của nhiều nhà nghiên cứu [52], [55] Cơ chế chống gốc tự do của các catechin chè là cơ chế chống oxi hoá chung của các poliphenol, đó là khi kết... chiết cao chè tổng Sau khi đã chọn được nguyên liệu chè từ Chè (kh ) cho khối lượng poliphenol cao chè tổng là cao hơn, các thí nghiệm sau chúng tôi tiến hành nghiên cứu thêm nguyên liệu chè (kh ) phụ phẩm (chè cám, lá chè già phơi kh ) 3.1.2 Ảnh hƣởng của nhiệt độ chiết tới hàm lƣợng cao chè tổng Bảng 3.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ tới hàm lượng cao chè tổng Nhiệt độ chiết 800C 900C 1000C