BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM - o0o - VÕ THỊ TUYẾT NGHI N CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA THỜI GIAN THỦY PH N VÀ TỈ LỆ ENZYME ĐẾN ĐỘ THỦY PH N, THÀNH PHẦN HĨA HỌC, ĐỘ HỒ TAN VÀ KHẢ NĂNG CHỐNG OXY HÓA CỦA SẢN PHẨM THỦY PH N PROTEIN TỪ HỖN HỢP ĐẦU VÀ XƢƠNG CÁ ĐỔNG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ CHẾ BIẾN THỦY SẢN GVHD: TS NGUYỄN THỊ MỸ HƢƠNG NHA TRANG -06/ 2014 i LỜI CẢM ƠN Đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy cô khoa Công nghệ thực phẩm – trƣờng Đại học Nha Trang tận tình dẫn, dạy bảo, truyền đạt kiến thức quý báu cho em suốt thời gian học tập tu dƣỡng trƣờng Qua tháng thực đề tài trƣờng Đại học Nha Trang, em nhận đƣợc nhiều hỗ trợ, giúp đỡ từ quý thầy cô môn: chế biến thủy sản, chế biến thực phẩm, cơng nghệ sinh học, hóa sinh – vi sinh, môi trƣờng Em xin chân thành cảm ơn thầy cô tạo điều kiện để em hồn thành đề tài Đặc biệt em xin chân thành cảm ơn cô TS Nguyễn Thị Mỹ Hƣơng tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ em suốt trình thực đề tài Xin gửi lời cảm ơn đến bạn sinh viên khóa nhiệt tình giúp đỡ suốt thời gian thực đề tài phịng thí nghiệm Và cuối xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến ba mẹ động viên, nhắc nhở tạo điều kiện suốt thời gian học tập làm đề tài trƣờng Nha Trang, tháng năm 2014 Sinh viên thực Võ Thị Tuyết ii MỤC LỤC MỤC LỤC ii DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT viii MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan nguyên liệu cá Đổng 1.1.1 Các loài cá Đổng 1.1.2 Thành phần hóa học dinh dƣỡng cá Đổng 10 1.1.3 Tình hình khai thác chế biến xuất cá Đổng .11 1.2 Phụ phẩm khả tận dụng phụ phẩm 12 1.2.1 Phụ phẩm 12 1.2.2 Khả tận dụng phụ phẩm 12 1.3 Enzyme proteaza thủy phân protein enzyme proteaza 14 1.3.1 Enzyme proteaza 14 1.3.2 Các yếu tố ảnh hƣởng tới thủy phân protein enzyme 14 1.3.4 Đặc tính, chức sản phẩm thủy phâm 17 1.4 Tình hình nghiên cứu nƣớc thủy phân, đặc tính sinh hóa chức sản phẩm thủy phân 19 1.4.1 Các nghiên cứu nƣớc 19 1.4.2 Các nghiên cứu nƣớc 20 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHI N CỨU 22 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 22 2.1.1 Hỗn hợp đầu xƣơng cá Đổng sộp vàng .22 2.1.2 Enzyme 23 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu .23 2.2.1 Xác định thành phần hóa học hỗn hợp đầu xƣơng cá Đổng 23 iii 2.2.2 Xác định khối lƣợng sản phẩm thu đƣợc từ thủy phân hỗn hợp đầu xƣơng cá Đổng theo thời gian 24 2.2.3 Xác định khối lƣợng sản phẩm thu đƣợc từ thủy phân hỗn hợp đầu xƣơng cá Đổng theo tỷ lệ enzyme khác 27 2.2.4 Nghiên cứu ảnh hƣởng thời gian thủy phân đến độ thủy phân, thành phần hóa học, độ hịa tan khả chống oxy hóa sản phẩm thủy phân protein từ hỗn hợp đầu xƣơng cá Đổng 30 2.2.5 Nghiên cứu ảnh hƣởng tỷ lệ enzyme Protex đến độ thủy phân, độ hịa tan, khả chống oxy hóa sản phẩm thủy phân protein từ hỗn hợp đầu xƣơng cá Đổng 33 2.2.6 Phƣơng pháp phân tích 36 2.2.7 Phƣơng pháp xử lý số liệu .36 Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHI N CỨU VÀ THẢO LUẬN 37 3.1 Kết xác định thành phần hóa học hỗn hợp đầu xƣơng cá Đổng 37 3.2 Kết xác định khổi lƣợng sản phẩm tạo từ thủy phân hỗn hợp đầu xƣơng cá Đổng theo thời gian theo tỷ lệ enzyme 37 3.2.1 Kết xác định khổi lƣợng sản phẩm tạo từ thủy phân hỗn hợp đầu xƣơng cá Đổng theo thời gian 38 3.2.2 Kết sản phẩm tạo từ thủy phân hỗn hợp đầu xƣơng cá Đổng theo tỷ lệ enzyme 39 3.3 Ảnh hƣởng thời gian thủy phân đến độ thủy phân, thành phần hóa học, độ hịa tan khả chống oxy hóa sản phẩm thủy phân protein từ hỗn hợp đầu xƣơng cá Đổng .41 3.3.1 Ảnh hƣởng thời gian thủy phân đến độ thủy phân sản phẩm thủy phân protein từ hỗn hợp đầu xƣơng cá Đổng 41 3.3.2 Ảnh hƣởng thời gian thủy phân đến thành phần hóa học sản phẩm thủy phân protein từ hỗn hợp đầu xƣơng cá Đổng 42 3.3.3 Ảnh hƣởng thời gian thủy phân đến độ hòa tan sản phẩm thủy phân protein từ hỗn hợp đầu xƣơng cá Đổng 43 iv 3.3.4 Ảnh hƣởng thời gian thủy phân đến khả chống oxy hóa sản phẩm thủy phân protein từ hỗn hợp đầu xƣơng cá Đổng .44 3.4 Ảnh hƣởng tỷ lệ enzyme đến độ thủy phân, độ hịa tan khả chống oxy hóa sản phẩm thủy phân protein từ hỗn hợp đầu xƣơng cá Đổng .47 3.4.1 Ảnh hƣởng tỷ lệ enzyme đến độ thủy phân sản phẩm thủy phân protein từ hỗn hợp đầu xƣơng cá Đổng 47 3.4.2 Ảnh hƣởng tỷ lệ enzyme đến độ hòa tan sản phẩm thủy phân protein từ hỗn hợp đầu xƣơng cá Đổng 48 3.4.3 Ảnh hƣởng tỷ lệ enzyme đến khả chống oxy hóa sản phẩm thủy phân protein từ hỗn hợp đầu xƣơng cá Đổng 49 3.4.3.1 Ảnh hƣởng tỷ lệ enzyme đến khả khử gốc tự DPPH sản phẩm thủy phân protein từ hỗn hợp đầu xƣơng cá Đổng 50 3.4.3.2 Ảnh hƣởng tỷ lệ enzyme đến tổng lực khử sản phẩm thủy phân protein từ hỗn hợp đầu xƣơng cá Đổng .51 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO .55 PHỤ LỤC v DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Thành phần dinh dƣỡng cá Đổng [30] .10 Bảng 1.2 Trữ lƣợng khả khai thác cá tầng đáy Việt Nam [12] 11 Bảng 1.3 Sản lƣợng khai thác cá Đổng giới [12] .11 Bảng 1.4 Sản lƣợng xuất cá Đổng từ năm 2004 đến năm 2008 [12] .11 Bảng 3.1 Thành phần hóa học hỗn hợp đầu xƣơng cá Đổng sộp vàng 37 Bảng 3.2 Bảng khối lƣợng sản phẩm tạo từ thủy phân kg hỗn hợp đầu xƣơng cá Đổng theo thời gian .39 Bảng 3.3 Bảng khối lƣợng sản phẩm tạo từ thủy phân 250 g hỗn hợp đầu xƣơng cá Đổng theo tỷ lệ enzyme 40 Bảng 3.4 Thành phần hóa học sản phẩm thủy phân protein qua thời gian khác 43 vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cá Đổng sộp vàng Hình 1.2 Cá Đổng cờ Hình 1.3 Cá Đổng đầu vng Hình 1.4 Cá Đổng đen Hình 1.5 Cá Đổng vây sợi Hình 1.6 Cá Lƣợng sáu .8 Hình 1.7 Cá Lƣợng vạch xám .9 Hình 2.1 Nguyên liệu đầu xƣơng cá Đổng 22 Hình 2.2 Sơ đồ xác định khối lƣợng sản phẩm thu đƣợc từ thủy phân hỗn hợp đầu xƣơng cá Đổng thời gian khác 25 Hình 2.3 Sơ đồ xác định khối lƣợng sản phẩm thu đƣợc từ thủy phân hỗn hợp đầu xƣơng cá Đổng tỷ lệ enzyme khác 28 Hình 2.3 Sơ đồ nghiên cứu ảnh hƣởng thời gian thủy phân đến thành phần hóa học, độ thủy phân, độ hịa tan khả chống oxy hóa sản phẩm thủy phân protein từ hỗn hợp đầu xƣơng cá Đổng 31 Hình 2.4 Sơ đồ nghiên cứu ảnh hƣởng tỷ lệ enzyme Protex đến độ thủy phân, độ hòa tan khả chống oxy hóa sản phẩm thủy phân protein từ hỗn hợp đầu xƣơng cá Đổng 34 Hình 3.1 Bột protein thủy phân 37 Hình 3.2 Bột protein khơng tan 38 Hình 3.3 Bột khoáng 38 Hình 3.4 Ảnh hƣởng thời gian thủy phân đến độ thủy phân sản phẩm thủy phân protein từ hỗn hợp đầu xƣơng cá Đổng 42 Hình 3.5 Ảnh hƣởng thời gian thủy phân đến độ hòa tan sản phẩm thủy phân protein từ hỗn hợp đầu xƣơng cá Đổng 44 vii Hình 3.6 Ảnh hƣởng thời gian thủy phân đến khả khử gốc tự DPPH sản phẩm thủy phân protein từ hỗn hợp đầu xƣơng cá Đổng 45 Hình 3.7 Ảnh hƣởng thời gian thủy phân đến tổng lực khử sản phẩm thủy phân protein từ hỗn hợp đầu xƣơng cá Đổng 46 Hình 3.8 Ảnh hƣởng tỷ lệ enzyme đến độ thủy phân sản phẩm thủy phân protein từ hỗn hợp đầu xƣơng cá Đổng 47 Hình 3.9 Ảnh hƣởng tỷ lệ enzyme đến độ hòa tan sản phẩm thủy phân protein từ hỗn hợp đầu xƣơng cá Đổng 49 Hình 3.10 Ảnh hƣởng tỷ lệ enzyme đến khả khử gốc tự DPPH sản phẩm thủy phân protein từ hỗn hợp đầu xƣơng cá Đổng 50 Hình 3.11 Ảnh hƣởng tỷ lệ enzyme đến tổng lực khử sản phẩm thủy phân protein từ hỗn hợp đầu xƣơng cá Đổng 51 viii KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DH Độ thủy phân DPPH 2,2 – diphenyl-1-picryhydrazyl NTS Nitơ tổng số g gam kg kilogam v Tốc phản ứng vmax Tốc độ phản ứng cực đại mg miligam g microgam MỞ ĐẦU Tính cấp thiết để tài Trong năm gần đây, ngành chế biến thủy sản nƣớc ta đà phát triển mạnh Xuất thủy sản Việt Nam tăng lên rõ rệt (theo thống kê VASEP xuất thủy sản Việt Nam năm 2012 5.873,075 triệu USD tăng 6,3% so với kỳ năm 2011) Ngành thủy sản thực ngành kinh tế mũi nhọn nƣớc, nhƣng bên cạnh phát triển có lƣợng lớn ngun liệu cịn lại sau q trình chế biến thải Lƣợng nguyên liệu lại nhà máy chế biến cá chủ yếu đầu, xƣơng, nội tạng, vây,…chiếm khoảng từ 40 – 60% tổng khối lƣợng cá [16] dễ gây ô nhiễm môi trƣờng khơng có biện pháp xử lý kịp thời Hàng năm có hàng nghìn cá Đổng đƣợc đánh bắt, mặt hàng sản xuất từ cá Đổng đa dạng, phong phú, phụ phẩm đầu xƣơng cá Đổng đƣợc thải lƣợng lớn Từ phụ phẩm đầu xƣơng cá Đổng sản xuất philê tận dụng để sản xuất sản phẩm thủy phân Sản phẩm thủy phân đƣợc ứng dụng thực phẩm nuôi trồng thủy sản Để ứng dụng sản phẩm thủy phân vào thực phẩm ta cần phải nghiên cứu thành phần hóa học số đặc tính chức sản phẩm thủy phân, đƣợc hƣớng dẫn cô Nguyễn Thị Mỹ Hƣơng em thực đề tài “ t u , t ẩ t t ầ rot ó từ ỗ ọ , t o t ợ v k ầu v x v t ă ổ ố ox ó s ” Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài  Ý nghĩa khoa học Kết nghiên cứu góp thêm dẫn liệu khoa học có giá trị tham khảo cho cán khoa học kỹ thuật, nhà sản xuất kinh doanh sinh viên ngành Chế biến thủy sản giá trị dinh dƣỡng, độ thủy phân, độ hịa tan khả chống oxy hóa sản phẩm thủy phân từ đầu xƣơng cá Đổng PL Bảng Độ thủy phân dịch thủy phân mẫu có tỷ lệ enzyme thủy phân khác Mẫu Độ thủy phân (%) Mẫu 1: 0,1% enzyme 31,90a  0,63 Mẫu 2: 0,3% enzyme 37,32b 1,92 Mẫu 3: 0,5% enzyme 42,15c  0,98 Mẫu 4: 0,7% enzyme 44,60d  0,90 Mẫu 5: 0,9% enzyme 46,13d  0,81 Bảng Độ hòa tan bột thủy phân protein mẫu có tỷ lệ enzyme khác độ pH khác Mẫu Độ hòa tan (%) Mẫu 1: 0,1% enzyme 80,77a  1,33 Mẫu 2: 0,3% enzyme 85,32b  1,04 Mẫu 3: 0,5% enzyme 88,14c  1,44 Mẫu 4: 0,7% enzyme 91,75d  1,02 Mẫu 5: 0,9% enzyme 94,63e  0,75 PL Bảng Khả khử gốc tự DPPH sản phẩm bột thủy phân protein mẫu có tỷ lệ enzyme khác Mẫu DPPH (%) Mẫu 1: 0,1% enzyme 38,38a  0,73 Mẫu 2: 0,3% enzyme 41,80b  0,36 Mẫu 3: 0,5% enzyme 45,33c  0,57 Mẫu 4: 0,7% enzyme 48,38d  0,30 Mẫu 5: 0,9% enzyme 52,51e  0,81 Bảng Tổng lực khử sản phẩm bột thủy phân protein mẫu có tỷ lệ enzyme khác Mẫu Độ hấp phụ (700 nm) Mẫu 1: 0,1% enzyme 0,1543a  0,0018 Mẫu 2: 0,3% enzyme 0,1757b  0,0017 Mẫu 3: 0,5% enzyme 0,2011c  0,0063 Mẫu 4: 0,7% enzyme 0,2165d  0,0025 Mẫu 5: 0,9% enzyme 0,2363e  0,0027 PL Phụ lục 2: CÁC PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH Xác định hàm lƣợng ẩm phƣơng pháp sấy  Nguyên lý Dùng nhiệt độ cao để làm bay hết nƣớc mẫu thử, sau dựa vào hiệu số khối lƣợng mẫu thử trƣớc sau sấy tính đƣợc hàm lƣợng nƣớc thực phẩm  Dụ ụ - Tủ sấy điều chỉnh đƣợc nhiệt độ - Cân phân tích, độ xác 10-4g - Cố sấy sứ - Đũa thủy tinh - Bình hút ẩm có chứa Silicagen  T - Sấy cốc đến khối lƣợng không đổi: cốc đƣợc rửa sạch, úp khô, sấy nhiệt độ 100  150oC khoảng giờ, lấy làm nguội bình hút ẩm, sau đem cân tiếp tục sấy nhiệt độ trên, đến khối lƣợng hai lần cân liên tiếp sai khác không 0,0005g - Cân xác gam mẫu cốc sấy khô đến khối lƣợng không đổi Đánh tơi mẫu đũa thủy tinh, dàn mẫu đáy cốc, chuyển cốc vào tủ sấy, sấy 60 – 80oC vịng Sau nâng nhiệt độ sấy lên 100 – 105oC sấy liên tục vịng - Làm nguội mẫu bình hút ẩm sau đem cân khối lƣợng khơng đổi  Tính kết Độ ẩm (hàm lƣợng nƣớc) mẫu đƣợc tính theo cơng thức sau: X H 2O  G1  G2  100% G1  G Trong đó:  XH2O: Hàm lƣợng nƣớc mẫu (%) PL  G1: Khối lƣợng cốc sấy mẫu thử trƣớc sấy (g)  G2: Khối lƣợng cốc sấy mẫu thử sau sấy (g)  G: Khối lƣợng cốc sấy (g) Xác định hàm lƣợng tro phƣơng pháp nung  Nguyên lý Dùng sức nóng (550 – 600oC) nung cháy hồn tồn chất hữu Phần lại đem cân tính hàm lƣợng tro tồn phần thực phẩm  Dụng cụ, vật liệu thuốc thử - Chén nung sứ - Đèn cồn hay bếp điện - Lò nung điều chỉnh đƣợc nhiệt độ ( đến 550-600o ) - Cân phân tích - Bình hút ẩm - H2O2 10 thể tích, HNO3 đậm đặc  Tiến hành - Nung chén sức chén kim loại rửa lò nung tới 550 – 600oC đến trọng lƣợng khơng đổi Để nguội bình hút ẩm, cân cân phân tích xác đến 10-4g - Cho vào chén khoảng 5g chất thử Cân tất cân phân tích, với độ xác nhƣ Cho tất vào lò nung tăng nhiệt độ từ từ 550 – 600oC Nung tro trắng, nghĩa loại hết chất hữu thơng thƣờng khoảng -7 - Trƣờng hợp cịn tro đen, lấy để nguội, cho thêm vài giọt H2O2 10 thể tích HNO3 đậm đặc nung lại tro trắng Để nguội bình hút ẩm, cân cân có độ xác nhƣ Tiếp tục nung thêm nhiệt độ 30 phút để nguội bình hút ẩm cân, lặp lặp lại thao tác trọng lƣợng không đổi Kết lần nung cân liên tiếp không đƣợc cách 0,0005 gam  Tính kết Hàm lƣợng tro theo phần trăm (X1) tính cơng thức: PL X1  G2  G % G1  G Trong đó: G1: Khối lƣợng chén nung mẫu (g) G: Khối lƣợng chén nung G2: Khối lƣợng chén nung tro trắng (g) Xác định hàm lƣợng nitơ tổng số phƣơng pháp Kjeldahl  Ngun lý Vơ hóa thực phẩm H2SO4 đậm đặc có chất xúc tác đặc biệt, dùng kiềm đặc mạnh NaOH đẩy NH3 từ muối (NH4)2SO4 thể tự NH3 đƣợc hấp thụ H2SO4 tiêu chuẩn Sau định lƣợng H2SO4 tiêu chuẩn dƣ NaOH tiên chuẩn Các phản ứng xảy ra: xúc tác + R – CH – COOH + H2SO4 NH2 2NaOH + (NH4)2SO4 nhiệt (đậm đặc, dƣ) độ = CO2 + SO2 + H2O + (NH4)2SO4 Na2SO4 + 2NH3 + 2H2O 2NH3 + H2SO4 tiêu chuẩn = (NH4)2SO4 2NaOH tiên chuẩn + H2SO4 tiêu chuẩn = Na2SO4 + 2H2O  Tiến hành Bƣớc 1: Vơ hóa mẫu  Đối với dịch thủy phân: Lấy 10 ml mẫu pha lỗng cho cẩn thaanh vào đáy bình Kjeldahl, thêm 2g hỗn hợp xúc tác CuSO4 K2SO4 (tỷ lệ 1:10) + 5ml H2SO4 đậm đặc Đặt nghiêng bình Kjeldahl góc 45 o bếp điện tủ Host tiến hành vô cơ, vô màu sắc chuyển từ màu nâu đen  vàng  xanh  xanh không màu đƣợc, sau vô xong, để nguội mẫu  Đối với bột thủy phân: Cân 0,2g mẫu gói giấy lọc khơng tro, cho cẩn thận vào đáy bình Kjeldahl, thêm 2g hỗn hợp xúc tác CuSO K2SO4 (tỷ lệ 1:10) + 5ml H2SO4 đậm đặc Đặt nghiêng bình Kjeldahl góc 45o bếp điện tủ PL Host tiến hành vô cơ, vơ màu sắc chuyển từ màu nâu đen  vàng  xanh  xanh không màu đƣợc, sau vô xong, để nguội mẫu  Chú ý: - Trong q trình vơ mẫu chƣa đạt đến màu xanh mà dung dịch bị cạn lấy bình để nguội thêm vào ml dung dịch H 2SO4 đậm đặc tiếp tục vơ - Khi vơ hóa mẫu, tránh tƣợng mẫu sôi mạnh bị bắn ngồi gây sai số, phải vơ triệt để hồn tồn Trong q trình vơ hóa mẫu tiến hành sục rửa thiết bị chƣng cất đạm, kiểm tra độ kín Yêu cầu thiết bị phải kín Bƣớc 2: Sục rửa thiết bị, kiểm tra độ kín thiết bị Bƣớc 3: Chuẩn bị cốc hứng Lấy cốc thủy tinh 250 ml cho vào cốc 20 ml H2SO4 0,1N vài giọt metyl đỏ 0,2% Đặt cốc dƣới đầu ống sinh hàn thiết bị chƣng cất đạm Đầu ống sinh hàn phải ngập vào dung dịch cốc Bƣớc 4: Chƣng cất Sau vô hóa mẫu xong để nguội đổ từ từ dung dịch bình Kjeldahl vào bình chƣng cất, dùng nƣớc cất tráng tráng lại bình vài lần, nƣớc tráng chuyển vào bình chƣng cất, cho vài giọt phenolphthalein 1% vào bình chƣng cất Thêm từ từ dung dịch NaOH 30% vào bình chƣng cất dung dịch bình có màu đỏ tím đỏ đƣợc Dùng nƣớc cất tráng đƣờng ống dẫn vào bình chƣng cất Lắp kín thiết bị, cho nƣớc chảy vào ống sinh hàn bắt đầu chƣng cất, chƣng cất khoảng 20 phút kể từ dung dịch bình bắt đầu sơi, sau tiến hành thử để xác định xem mẫu thử hết đạm chƣa Cách thử nhƣ sau: nâng đầu ống sinh hàn lên khỏi cốc hứng (cốc hứng đặt đầu ống sinh hàn) Dùng bình tia rửa xung quanh ống sinh hàn Nƣớc PL rửa tiếp tục đƣợc hứng vào cốc hứng Chƣng cất khoảng – phút, dùng giấy quỳ giấy đo pH để thử Nếu pH = trình chƣng cất kết thúc Nếu pH > tiếp tục chƣng cất Bƣớc 5: Chuẩn độ Lấy cốc hứng đem chuẩn độ NaOH 0,1N có màu vàng dừng lại Đọc thể tích NaOH 0,1N tiêu tốn  Tính kết Nitơ tổng số đƣợc tính cơng thức sau:  Đối với dịch thủy phân:  TS  0,0014      F  1000 gN / lít  V Trong đó:  0,0014: số gam N tƣơng đƣơng với 1ml H2SO4 0,1N  A: số ml H2SO4 0,1N dùng  B: số ml NaOH 0,1N tiêu tốn chuẩn độ  F: Hệ số pha loãng  V: Số ml mẫu đem làm thí nghiệm  1000: hệ số quy đổi đơn vị (g/l)  Đối với bột thủy phân:  TS  0,0014   A  B   100 % B Trong đó:  0,0014: số gam N tƣơng đƣơng với 1ml H2SO4 0,1N  A: số ml H2SO4 0,1N dùng  B: số ml NaOH 0,1N tiêu tốn chuẩn độ Xác định hàm lƣợng protein thô: Hàm lƣợng protein thô = NTS  6,25 10 PL Xác định hàm lƣợng lipid theo phƣơng pháp Folch  Nguyên lý Dùng hỗn hợp dung môi Chlorofom : Methanol với tỷ lệ 2:1 để hòa tan tất chất béo thực phẩm Tách chiết hỗn hợp dung mơi chất béo, sau làm bay hết dung mơi, cân chất béo cịn lại tính hàm lƣợng chất béo có thực phẩm  Tiến hành Cân 1g thực phẩm cho vào bình tam giác 250 ml, dùng hỗn hợp dung môi Chlorofom/Methanol tỉ lệ 2/1 với thể tích gấp 20 lần (v/w) so với khối lƣợng mẫu Dùng đũa thủy tinh nghiền nhỏ sau lắc 45  60 phút Tiến hành lọc cho dịch lọc vào phễu chiết cho vào 1/5 thể tích dung dịch NaCl 0,9% sau lắc Sau để lắng khoảng hỗn hợp dung môi phân làm lớp, tiến hành chiết phần dung mơi hịa tan lipid vào bình cầu (đã sấy khô cân trọng lƣợng) Tiến hành cô quay chân không bay hết dung môi, sau thổi Nitơ để đuổi hết dung mơi Cân khối lƣợng bình cầu có chứa lipid tính hàm lƣợng lipid mẫu thử  Tính kết Hàm lƣợng lipid đƣợc tính theo cơng thức sau: L    1  o  100% Trong đó: Mo: Trọng lƣợng mẫu thử (g) M1: Trọng lƣợng bình cầu trống (g) M2: Trọng lƣợng bình cầu có chứa lipid sau cô quay thổi Nitơ (g) Xác định khả khử gốc tự DPPH DPPH có khả tạo gốc tự bền dung mơi phân cực nhƣ ethanol bão hịa Khi cho chất thử nghiệm vào hỗn hợp chất có khả 11 PL làm trung hịa bao vây gốc tự làm giảm cƣờng độ hấp phụ ánh sáng gốc DPPH Hoạt tính chống oxy hóa đƣợc đánh giá thơng qua giá trị hấp phụ ánh sáng dịch thí nghiệm so với đối chứng đọc máy đo UV – Vis bƣớc sóng 517 nm  Dụng cụ thiết bị - Ống nghiệm thủy tinh - Micro pipet - Cốc thủy tinh - Máy so màu UV – Vis  Hóa chất - Ethanol - 2,2 – diphenyl-1-picryhydrazyl (DPPH)  Cách tiến hành - Pha loãng mẫu: 100 mg mẫu đƣợc pha loãng 50 ml nƣớc cất - Pha DPPH 0,1 mM: 1,97 mg DPPH đƣợc pha 50 ml ethanol - Đối với mẫu đo cho vào ống nghiệm 1,5 ml mẫu pha loãng + 1,5 ml DPPH 0,1 mM Mẫu trắng chuẩn bị nhƣ nhƣng thay 1,5 ml mẫu 1,5 ml nƣớc cất Lắc đem ủ bóng tối nhiệt độ phịng 30 phút Sau đem đo độ hấp phụ bƣớc sóng 517 nm thiết bị UV-Vis Mỗi mẫu tiến hành đo lần  Khả khử gốc tự đƣợc tính theo công thức DPPH %  bSample  bX bSample 100% Trong đó:  AbSample: Độ hấp phụ mẫu trắng bƣớc sóng 517 nm  AbX : Độ hấp phụ mẫu bƣớc sóng 517 nm Xác định tổng lực khử  Dụng cụ, thiết bị 12 PL - Ống nghiệm thủy tinh - Micro pipet - Cốc thủy tinh - Máy so màu UV – Vis  Hóa chất - Ethanol - Đệm phosphate 0,2 M - Potassium ferricyanide 1% (K3Fe(CN)6) - Trichloro acetic acid 10% (CCl3.COOH hay TCA) - Ferric chloride 0,1% (FeCl3)  Cách tiến hành - Pha loãng mẫu: g mẫu đƣợc pha loãng 50 ml nƣớc cất - Cho 1ml mẫu pha loãng vào ống nghiệm + 2,5 ml đệm phosphate 0,2M + 2,5 ml K3Fe(CN)6 1%, đem ủ nhiệt độ 50oC Sau 30 phút lấy ống nghiệm tiếp tục cho vào ống nghiệm 2,5 ml Trichloro acetic acid 10% + 2,5 ml nƣớc cất + 2,5 ml Ferric chloride 0,1%, dung dịch đƣợc ủ 10 phút nhiệt độ phòng Sau đem đo độ hấp phụ bƣớc sóng 700 nm Đối với mẫu trắng thay ml mẫu ml nƣớc cất Xác định độ hòa tan theo Souissi cộng (2007) [26]  Dụng cụ, thiết bị - Máy li tâm - Cốc thủy tinh - Máy đo pH - Giấy lọc - Ống nghiệm - Máy đo UV-Vis  Hóa chất - NaOH 2M - HCl 2M 13 PL - CuSO4 - Sodium potassium tartrate (KNaC4H4O6.4H2O) - NaOH 10% - Bovine serum albumin (BSA) chuẩn  Tiến hành  Xử ý ẫu: Cân 0,25 g bột thủy phân protein 25 ml nƣớc cất Sau ta đem điều chỉnh pH = NaOH 2M, khuấy 10 phút Đem ly tâm tốc độ 7000 vòng/phút 10 phút Ly tâm xong ta tách dịch đem đo thể tích dịch, tách cặn đem cân khối lƣợng cặn  Dự - uẩ : Chuẩn bị dung dịch protein chuẩn (BSA) với hàm lƣợng 10 mg/ml ống nghiệm, cho vào ống nghiệm lần lƣợt 0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; ml dung dịch protein chuẩn trên, thêm nƣớc cất vào lần lƣợt ống với lƣợng nhƣ sau: 1; 0,8; 0,6; 0,4; 0,2; Tiếp tục thêm ml thuốc thử Biuret, lắc ủ 30 phút nhiệt độ phòng - Sau ủ, dung dịch đƣợc xác định độ hấp thụ quang học bƣớc sóng 570 nm - Dựa vào mối tƣơng quan hàm lƣợng protein độ hấp thụ quang học (absorbance) để thiết lập phƣơng trình đƣờng chuẩn protein - Phƣơng trình đƣờng chuẩn có dạng  a* b Trong đó: Y: Độ hấp thụ quang học bƣớc sóng 570 nm X: Hàm lƣợng protein (mg/ml) a, b: Hệ số - Đƣờng chuẩn 14 PL  Tính kết Độ hòa tan (%) = Protein tan (g)  100/Protein mẫu  H ợ rot t ợ xá ị theo Allan G Gornall [19] Lấy 10ml dịch lọc tiến hành lọc lần qua giấy lọc Whatman filter paper No Lấy 1ml dịch sau lọc lần bổ sung thêm ml dung dịch thuốc thử biuret, ủ 30 phút nhiệt độ phòng Sau ủ tiến hành đo độ hấp phụ quang học dung dịch bƣớc sóng 570nm ta xác định đƣợc giá trị Ym Thay giá trị Ym vừa xác định đƣợc vào phƣơng trình (1) ta tính đƣợc giá trị Xm  Tính kết quả: Hàm lƣợng protein tan mẫu đƣợc xác định theo công thức sau: % protein  V1 ml   X m mg / ml   100 W g   1000mg / g  15 PL Trong  V1: thể tích dịch lọc (ml)  Xm: hàm lƣợng protein ml dịch lọc (mg/ml)  W: khối lƣợng mẫu (g)  1000: hệ số chuyển đổi g mg Phƣơng pháp xác định độ thủy phân theo phƣơng pháp DNFB [25]  Dụng cụ hóa chất - Bình định mức 100 ml - Cốc thủy tinh 100 ml - Bể ổn nhiệt - Ống nghiệm - Tetra borat natri - Glycine - DNFB - HCl đậm đặc  Cách tiến hành  - X dự uẩ G r Dung dịch glycerine mM: Cân 0,0375g glycerine sau định mức với 100ml nƣớc cất - Dung dịch Tetra borat natri 2% - Hút 325l DNFB (Dinitrofluorobenzene) pha 25ml ethanol - Tiến hành hút vào ống nghiệm với nồng độ tƣơng ứng theo bảng Mỗi nồng độ cho vào ống 1ml dung dịch tetra borat natri 2% - Sau cho vào ống nghiệm 0,25ml dung dịch DNFB, lắc đem ủ bể ổn nhiệt 60oC thời gian 10 phút, tiến hành làm nguội Sau làm nguội ta cho 2ml HCl đậm đặc vào tất ống nghiệm, lắc đem đo hàm lƣợng OD máy quang phổ tử ngoại khả kiến bƣớc sóng 410nm 16 PL Nồng độ 0,0002 0,0004 0,0006 0,0008 0,001 Glycine 40 80 120 160 200 Nƣớc (l) 1000 960 920 880 840 800 OD 410nm 0,367 0,570 0,882 1,300 1,528 5mM - Đƣờng chuẩn:  - Xá ị t Hút 500l (mình làm 250l) dịch thủy phân cho vào bình định mức 100ml (mình làm 50ml), thêm nƣớc cất đủ vạch, lắc đổ cốc thủy tinh 100ml khơ (hệ số pha lỗng 200 lần) - Hút 1ml mẫu pha loãng vào ống nghiệm tƣơng ứng, mẫu ống nghiệm Sau cho 1ml dung dịch Tetra borat natri 2% vào ống nghiệm chứa mẫu ống nghiệm không chứa mẫu dịch thủy phân pha loãng để làm mẫu chuẩn Tiến hành cho vào ống nghiệm 0,25ml dung dịch DNFB, lắc 17 PL đem ủ bể ổn nhiệt 60oC thời gian 10 phút, tiến hành làm nguội Sau làm nguội ta cho 2ml HCl đậm đặc vào tất ống nghiệm, lắc đem đo hàm lƣợng OD máy quang phổ tử ngoại khả kiến bƣớc sóng 410nm - Cơng thức tính độ thủy phân: DH %  A e  200  100 P  8,6  0,001 Trong đó:  DH: Độ thủy phân (%)  Amine: số axit amine đƣợc tạo trình thủy phân (mol)  P: Hàm lƣợng protein 1ml dịch thủy phân ... định thành phần hóa học hỗn hợp đầu xƣơng cá Đổng - Nghiên cứu ảnh hƣởng thời gian thủy phân đến độ thủy phân, thành phần hóa học, độ hồ tan khả chống oxy hóa sản phẩm thủy phân protein từ hỗn hợp. .. hƣởng thời gian thủy phân đến độ thủy phân, thành phần hóa học, độ hịa tan khả chống oxy hóa sản phẩm thủy phân protein từ hỗn hợp đầu xƣơng cá Đổng 3.3.1 Ảnh hƣởng thời gian thủy phân đến độ thủy. .. đến độ thủy phân, thành phần hóa học, độ hịa tan khả chống oxy hóa sản phẩm thủy phân protein từ hỗn hợp đầu xƣơng cá Đổng .41 3.3.1 Ảnh hƣởng thời gian thủy phân đến độ thủy phân sản