Sàng lọc một số hợp chất kháng viêm từ cây gắm (gnetum montanum) thông qua nlrp3

Nguyên nhân của phản ứng viêm Viêm là phản ứng của hệ miễn dịch đối với các kích thích có hại, chẳng hạn như mầm bệnh, tế bào bị tổn thương, hợp chất độc hại hoặc bức xạ [62] và hoạt độ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Trần Thị Hạnh Nguyên

Sàng lọc một số hợp chất kháng viêm từ cây Gắm

(Gnetum montanum) thông qua NLRP3

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 8420201

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2024

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp thạc sĩ của mình, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn các thầy, cô giáo cũng như toàn thể cán bộ, nhân viên Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Khoa Sinh học – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã truyền đạt những kiến thức quý báu, bổ ích, đồng thời tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành luận văn của mình

Tôi xin được dành lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới thầy giáo, TS Trịnh Tất Cường, TS Hoàng Đức Mạnh đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, dìu dắt tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã luôn sát cánh, chia sẻ và động viên trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi xin cảm ơn đề tài Klept 22.02 đã tài trợ kinh phí cho nghiên cứu này

Hà Nội, ngày 22 tháng 10 năm 2024

Học viên

Trần Thị Hạnh Nguyên

ELISA Enzyme – linked Immunosorbent assay

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 Diễn biến thời gian của phản ứng viêm [37] 5

Hình 2 Các mốc quan trọng trong quá trình phát triển của thuốc NSAID có chứa aspirin hoặc không chứa aspirin theo thứ tự thời gian [72] 10

Hình 3 Cơ chế kháng viêm không phụ thuộc COX của NSAID [72] 11

Hình 4 Tín hiệu thông qua TLR kích hoạt các chuỗi tín hiệu nội bào [11] 12

Hình 5 Các con đường kích hoạt NF-κB 13

Hình 6 Con đường MAPK [11] 14

Hình 7 Con đường JAK-STAT [18] 15

Hình 8 Cấu trúc của một số phức hợp inflammasome và NLRP3 inflammasome [89] 16

Hình 9 Inflammasome NLRP3 và một số chất ức chế inflammasome NLRP3 [4] 17

Hình 10 Hình ảnh dây gắm Gnetum montanum (Nguồn: eFloraofIndia) 21

Hình 11 Sắc ký bản mỏng Pinoresinol 28

Hình 12 HPLC Pinoresinol 29

Hình 13 Sắc ký bản mỏng Resveratrol 31

Hình 14 HPLC Resveratrol 32

Hình 15 Đại thực bào phân lập từ tủy xương chuột 33

Hình 16 Độc tính của Pinoresinol với đại thực bào 34

Hình 17 Độc tính của Resveratrol với đại thực bào 35

Hình 18 Khả năng kháng viêm của Pinoresinol 36

Hình 19 Khả năng kháng viêm của Resveratrol 39

Hình 20 Biểu hiện của p38, p-p38, ERK1/2, p-ERK1/2 41

Hình 21 Biểu hiện của NLRP3 42

Hình 22 Hoạt động ROS trên tế bào LPS, Lipopolysaccharide 44

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Quá trình viêm 3

1.1.1 Viêm là gì? Nguyên nhân của phản ứng viêm 3

1.1.2 Các dấu hiệu của viêm và phân loại viêm 4

1.1.3 Thực trạng về viêm và vai trò của viêm trong một số bệnh 7

1.1.4 Điều trị viêm 9

1.1.5 Các con đường truyền tín hiệu trong viêm 11

1.2 NLRP3 inflammasome 15

1.2.1 Cấu trúc và các yếu tố hoạt hóa NLRP3 inflammasome 15

1.2.2 Thụ thể NLRP3 và quá trình viêm 19

1.3 Dây gắm 20

1.3.1 Phân loại và hình thái 20

1.3.2 Dây gắm và quá trình viêm 22

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 23

2.1 Vật liệu và thiết bị 23

2.2 Phương pháp nghiên cứu 23

2.2.1 Tách chiết Pinoresinol, Resveratrol từ dây gắm 23

2.2.2 Tách chiết đại thực bào từ tủy xương chuột 24

2.2.3 Đánh giá độc tính của Pinoresinol, Resveratrol đối với sự sống sót của đại thực bào phân lập từ chuột 25

2.2.4 Đánh giá khả năng kháng viêm của Pinoresinol, Resveratrol trên đại thực bào phân lập từ chuột 25

2.2.5 Đánh giá khả năng biểu hiện của ERK1/2, p38, NLRP3 thông qua sự

kích thích của Pinoresinol, Resveratrol 26

2.2.6 Phân tích ROS 27

2.2.7 Phân tích thống kê 27

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

3.1 Tách chiết Pinoresinol từ dây gắm 28

3.1.1 Sắc ký bản mỏng Pinoresinol 28

3.1.2 Đánh giá độ tinh sạch của Pinoresinol bằng sắc ký lỏng cao áp 29

3.2 Tách chiết Resveratrol từ dây gắm 30

3.2.1 Sắc ký bản mỏng Resveratrol 30

3.2.2 Đánh giá độ tinh sạch của Resveratrol bằng sắc ký lỏng cao áp 31

3.3 Độc tính của Pinoresinol đối với sự sống sót của đại thực bào 33

3.4 Độc tính của Resveratrol đối với sự sống sót của đại thực bào 35

3.5 Khả năng kháng viêm của Pinoresinol trên đại thực bào 35

3.6 Khả năng kháng viêm của Resveratrol trên đại thực bào 38

3.7 Biểu hiện của ERK1/2, p38, NLRP3 thông qua sự kích thích của Pinoresinol và Resveratrol 40

3.8 Phân tích ROS 43

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46

TÀI LIỆU THAM KHẢO 47

MỞ ĐẦU

Viêm là phản ứng sinh học của hệ thống miễn dịch có thể được kích hoạt bởi nhiều yếu tố, bao gồm mầm bệnh, tế bào bị tổn thương và hợp chất độc hại Một trong những khám phá y học quan trọng nhất trong hai thập kỷ qua là hệ thống miễn dịch

và các quá trình viêm không chỉ liên quan đến một số rối loạn được chọn lọc mà còn liên quan đến nhiều vấn đề sức khỏe thể chất, tinh thần đang chi phối tình trạng bệnh tật và tử vong hiện nay trên toàn thế giới Về tinh thần bao gồm một số tình trạng tâm thần, chẳng hạn như lo âu, trầm cảm đơn cực và lưỡng cực, tâm thần phân liệt và rối loạn căng thẳng sau chấn thương Về tình trạng bệnh lý thể chất bao gồm hen suyễn, viêm khớp dạng thấp, bệnh tim mạch, béo phì, tiểu đường, loãng xương, bệnh Alzheimer, một số bệnh ung thư và đột quỵ… Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) xếp hạng các bệnh mãn tính là một trong những mối đe dọa lớn nhất đối với sức khỏe con người Tỷ lệ mắc các bệnh liên quan đến tình trạng viêm mãn tính dự kiến sẽ tăng liên tục trong 30 năm tới tại Hoa Kỳ Theo ước tính gần đây, năm 2014, gần 60% người Mỹ mắc ít nhất một tình trạng bệnh mãn tính, 42% mắc nhiều hơn một bệnh

và 12% người lớn mắc 5 hoặc nhiều tình trạng bệnh mãn tính Trên toàn thế giới, có

3 trong số 5 người tử vong liên quan đến các bệnh viêm mãn tính như đột quỵ, bệnh

hô hấp mãn tính, rối loạn tim, ung thư, béo phì và tiểu đường [73] Do đó, việc hiểu được cách tình trạng viêm ảnh hưởng đến sức khỏe và cách thức cũng như thời điểm chúng ta có thể can thiệp làm giảm nguy cơ mắc bệnh liên quan đến tình trạng viêm

là một trong những ưu tiên hàng đầu của khoa học

Protein thụ thể giống NOD 3 (NLRP3) inflammasome là một phức hợp protein điều chỉnh phản ứng miễn dịch bẩm sinh bằng cách kích hoạt caspase – 1 và các cytokine gây viêm interleukin (IL) – 1β và IL – 18 Nhiều nghiên cứu đã chứng minh tầm quan trọng của NLRP3 inflammasome trong sự phát triển của các bệnh liên quan đến miễn dịch và viêm, bao gồm viêm khớp, bệnh Alzheimer, bệnh viêm ruột và các bệnh tự miễn và các bệnh liên quan đến viêm khác

Dây gắm hay còn gọi gắm núi (danh pháp khoa học: Gnetum montanum) là một loài thực vật hạt trần trong họ Gnetaceae, là một loại dây leo thường xanh có

nguồn gốc từ miền nam Trung Quốc và Đông Nam Á Trong y học cổ truyền, người

ta tin rằng nó có tác dụng xua tan gió và loại bỏ độ ẩm, thúc đẩy lưu thông máu để loại bỏ ứ máu, làm giảm cứng cơ và giảm đau Ngoài ra, các nghiên cứu dược lý hiện đại đã xác nhận nhiều hoạt tính sinh học khác nhau của loại cây này, chẳng hạn như chống khối u, chống oxy hóa, kháng khuẩn và đặc biệt là tính chống viêm Cùng với

đó, ngày càng nhiêu hợp chất hóa học được tách chiết từ loài cây này

Tuy nhiên, hiện chưa có nhiều nghiên cứu khoa học chỉ ra cơ chế của các chất trong dây gắm có tác động đến quá trình viêm như thế nào Dựa trên cơ sở đã biết về vai trò quan trọng của NLRP3 đối với quá trình viêm, chúng tôi thực hiện đề tài:

“Sàng lọc một số hợp chất kháng viêm từ cây Gắm (Gnetum montanum) thông

qua NLRP3”

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Quá trình viêm

1.1.1 Viêm là gì? Nguyên nhân của phản ứng viêm

Viêm là phản ứng của hệ miễn dịch đối với các kích thích có hại, chẳng hạn như mầm bệnh, tế bào bị tổn thương, hợp chất độc hại hoặc bức xạ [62] và hoạt động bằng cách loại bỏ các kích thích có hại và bắt đầu quá trình chữa lành [23] Những kích thích có hại này khởi đầu một chuỗi tín hiệu hóa học, kích hoạt các tế bào miễn dịch, sau đó sản xuất và giải phóng các chất trung gian gây viêm (cytokine, chemokine, inteferon,…) [39], chẳng hạn như interleukin (IL)-1β, IL6, yếu tố hoại tử khối α (TNF – α)… Các cytokine này tương tác và kích hoạt các thụ thể (IL – 6R, TNFR – 1, TNFR – 2, TLR4, GM – CSFR, ) [43] Sự hoạt hóa các thụ thể kích hoạt quá trình phosphoryl hóa nhiều phân tử tín hiệu khác nhau như protein kinase hoạt hóa mitogen (MAPK), yếu tố nhân kappa – B (NF – kB), kinase Janus (JNK), dẫn đến sự hoạt hóa nhiều yếu tố phiên mã khác nhau Sự hoạt hóa của các yếu tố phiên

mã này điều chỉnh mức độ chất trung gian gây viêm trong các tế bào mô thường trú

và dẫn dụ các tế bào của hệ miễn dịch từ máu [48, 49] Các tế bào này sau đó sẽ tham gia vào các phản ứng khác nhau nhằm tiêu diệt các tác nhân có hại Do đó, viêm là một cơ chế phòng vệ rất quan trọng thông qua việc loại bỏ các yếu tố có hại, đồng thời khôi phục lại sự cân bằng nội môi của cơ thể

Nguyên nhân viêm có thể được phân loại thành 2 nhóm chính: tác nhân gây viêm ngoại sinh và nội sinh [61] Các mô bị tấn công bởi các tác nhân bên ngoài giải phóng các tín hiệu gây viêm Các yếu tố ngoại sinh này có thể là các loại vi khuẩn, vi rút, protein, các kháng nguyên lạ, các chất gây dị ứng, hợp chất độc hại, chất gây kích ứng và các vật lạ quá lớn để tiêu hóa hoặc gây tổn thương đại thực bào Đối với tác nhân nội sinh, các mô chết, bị tổn thương, hoạt động không bình thường hoặc bị căng thẳng sẽ giải phóng các tín hiệu gây viêm Các chấn thương vật lý bao gồm tê cóng, bỏng, chấn thương, dị vật, bức xạ ion hóa và các hợp chất hóa học như glucose, axit béo, độc tố, rượu và các chất kích thích hóa học như niken và các nguyên tố vi lượng khác, các tín hiệu do các tế bào bị tổn thương giải phóng và các phản ứng sinh lý đối với sự kích thích [11] cũng có thể dẫn đến sản xuất ra tín hiệu gây viêm

Mặc dù quá trình phản ứng viêm phụ thuộc vào bản chất chính xác của kích thích ban đầu và vị trí của nó trong cơ thể, nhưng tất cả chúng đều có chung một cơ chế, có thể được tóm tắt như sau: 1) các thụ thể trên bề mặt tế bào nhận ra các kích thích có hại; 2) các con đường truyền tín hiệu gây viêm được kích hoạt; 3) các chất trung gian gây viêm được giải phóng; và 4) các tế bào của hệ miễn dịch được dẫn dụ

và tham gia vào phản ứng viêm [11]

1.1.2 Các dấu hiệu của viêm và phân loại viêm

Viêm là một phần của miễn dịch không đặc hiệu xảy ra khi phản ứng với bất

kỳ loại chấn thương cơ thể nào [23] Từ 'viêm' bắt nguồn từ tiếng

Latin “inflammare” có nghĩa là bùng cháy 5 dấu hiệu cơ bản của viêm bao gồm:

nóng, đỏ, sưng, đau và mất chức năng Mặc dù có thể tìm thấy các tài liệu tham khảo

về tình trạng viêm trong các văn bản y khoa cổ đại nhưng người đầu tiên định nghĩa các triệu chứng lâm sàng của nó là bác sĩ Cornelius Celsus người La Mã vào thế kỷ thứ nhất sau Công nguyên [62] Ông viết trong tác phẩm duy nhất còn sót lại của mình “De Medicina’’: “Notae vero inflammationis sunt quattuor: rubor et tumor cum calore et dolore’’ (Bây giờ có bốn dấu hiệu của tình trạng viêm: đỏ và sưng kèm theo

nóng và đau) [8] Dấu hiệu chính thứ năm, functio laesa (mất chức năng), được Rudolph Virchow thêm vào năm 1858 trong cuốn sách Cellularpathologie của ông

[56] Bốn dấu hiệu chính của Celsus chỉ áp dụng cho tình trạng viêm cấp tính đi kèm

với vết thương và nhiễm trùng, functio laesa là dấu hiệu phổ biến duy nhất đi kèm

với tất cả các quá trình viêm Lưu lượng máu tăng dẫn đến đỏ và nóng, trong khi sưng

là kết quả của sự tích tụ chất lỏng Đau phát sinh do giải phóng các chất hóa học kích thích và mất chức năng phản ánh sự kết hợp của nhiều yếu tố

Viêm có thể được phân loại thành 3 loại dựa trên thời gian phản ứng với nguyên nhân gây thương tích: viêm cấp tính, biểu hiện ngay sau khi bị thương và thường kéo dài trong vài ngày; viêm mạn tính, có thể kéo dài trong nhiều tháng hoặc thậm chí nhiều năm nếu tình trạng viêm cấp tính không thuyên giảm và viêm bán cấp, giai đoạn chuyển tiếp từ cấp tính sang mạn tính, thường kéo dài từ 2 đến 6 tuần Diễn biến thời gian của phản ứng viêm cấp tính và mạn tính được thể hiện trên hình 1

Hình 1 Diễn biến thời gian của phản ứng viêm [37]

Viêm cấp tính là phản ứng thích nghi tức thời với độ đặc hiệu hạn chế do các kích thích có hại gây ra, chẳng hạn như nhiễm trùng và tổn thương mô Viêm cấp tính khởi phát nhanh trong vài phút hoặc vài giờ, thường khỏi trong vòng vài ngày, có các dấu hiệu và triệu chứng điển hình Tuy nhiên, nó có thể trở nên có hại nếu không được điều chỉnh, chẳng hạn trong sốc nhiễm trùng Đỏ là dấu hiệu dễ dàng quan sát thấy trong tình trạng viêm cấp tính do lưu lượng máu tăng lên tại vùng bị tổn thương

và là hệ quả của hiện tượng giãn mạch Giãn mạch được kích hoạt bởi nhiều chất trung gian khác nhau, ví dụ như histamine Quá trình này ban đầu ảnh hưởng đến các tiểu động mạch và sau đó tạo ra các mao mạch mới ở vùng bị tổn thương [1] Bên cạnh mạch máu, mạch bạch huyết cũng tăng cường hoạt động trong tình trạng viêm cấp tính Trong tình trạng viêm, lưu lượng bạch huyết tăng lên và giúp dẫn lưu dịch phù nề tích tụ do tính thấm mạch máu tăng lên Cùng với dịch phù nề, bạch cầu, mảnh vụn tế bào và vi khuẩn cũng có thể xâm nhập vào bạch huyết [81] Tương tự như mạch máu, mạch bạch huyết tăng sinh trong các phản ứng viêm Một số chất trung gian hóa học được sản xuất nội sinh là nguyên nhân gây ra sự lan rộng của phản ứng viêm cấp tính sau khi bị thương ở một vùng mô nhỏ vào các vị trí không bị thương,

từ đó gây ra các thay đổi cục bộ và toàn thân Các chất trung gian hóa học này bao gồm các chất trung gian được giải phóng từ các tế bào như histamine và prostaglandin

và các chất khác trong huyết tương được giải phóng bởi một số hệ thống có trong huyết tương: bổ thể, kinin, các yếu tố đông máu và một số chất trung gian gây viêm (cytokine, chemokine…) [35, 78] Quá trình viêm cấp tính là một quá trình, bắt đầu

bằng giai đoạn khởi đầu, được kích hoạt bởi tổn thương Giai đoạn này liên quan đến những thay đổi vi tuần hoàn, dẫn đến sự di chuyển của các tế bào bạch cầu đến vùng

bị thương Tiếp theo là giai đoạn khuếch đại, trong đó các chất hóa học hướng các loại tế bào bạch cầu bổ sung đến vị trí bị thương, tăng cường phản ứng Sự trung hòa nhanh chóng của chấn thương và loại bỏ các thành phần gây hại đặc trưng cho giai đoạn phá hủy Cuối cùng, giai đoạn kết thúc đòi hỏi tác động của các chất hóa học để ngăn chặn hoặc điều chỉnh quá trình viêm, ngăn ngừa tổn thương quá mức nếu không được kiểm soát [11] Viêm cấp tính có một số di chứng tại chỗ có thể xảy ra Chúng bao gồm hình thành mủ, tổ chức mô và tiến triển thành viêm mạn tính Tổ chức các

mô đề cập đến việc thay thế chúng bằng mô hạt với sự hình thành một lượng lớn fibrin, cuối cùng dẫn đến sự tăng sinh của các nguyên bào sợi dẫn đến xơ hóa [21]

Viêm mạn tính thường kéo dài hơn 2 tuần [79] Viêm mạn tính cũng được gọi

là tình trạng viêm chậm, kéo dài trong thời gian dài từ vài tháng đến nhiều năm Nhìn chung, mức độ và tác động của tình trạng viêm mạn tính khác nhau tùy theo nguyên nhân gây tổn thương và khả năng phục hồi của cơ thể Viêm mạn tính có thể là kết quả của những nguyên nhân sau: không loại bỏ được tác nhân gây viêm cấp tính như các vi sinh vật truyền nhiễm, động vật nguyên sinh, nấm, các ký sinh trùng có thể chống lại cơ chế phòng vệ của vật chủ và tồn tại ở mô trong thời gian dài; tiếp xúc với nồng độ thấp một chất gây kích ứng trong thời gian dài mà không thể loại bỏ trong cơ thể như các hóa chất công nghiệp, ví dụ như bụi silica; một rối loạn tự miễn trong đó hệ thống miễn dịch nhận diện thành phần bình thường của cơ thể là kháng nguyên lạ và tấn công các mô khỏe mạnh, gây ra các bệnh như viêm khớp dạng thấp, lupus ban đỏ, tiểu đường type 2,…; một khiếm khuyết trong các tế bào chịu trách nhiệm trung gian gây viêm dẫn đến tình trạng viêm dai dẳng hoặc tái phát, chẳng hạn như rối loạn tự viêm (sốt Địa Trung Hải); Các tác nhân gây viêm gây ra stress oxy hóa và rối loạn chức năng ty thể như tăng sản xuất các gốc oxy hóa tự do (ROS), tinh thể axit uric (urat), lipoprotein bị oxy hóa, homocysteine;… [73] Hầu hết các đặc điểm của tình trạng viêm cấp tính vẫn tiếp tục khi tình trạng viêm trở thành mạn tính, bao gồm sự giãn nở của các mạch máu (giãn mạch), tăng lưu lượng máu, tính thấm mao mạch và sự di chuyển của bạch cầu trung tính vào mô bị nhiễm trùng qua thành

mao mạch Tuy nhiên, thành phần của các tế bào bạch cầu thay đổi do các đại thực bào và tế bào lympho bắt đầu thay thế các bạch cầu trung tính có thời gian sống ngắn

Do đó, các dấu hiệu đặc trưng của tình trạng viêm mạn tính là sự xâm nhiễm của các

tế bào viêm chính như đại thực bào, tế bào lympho, tế bào plasma tại vị trí mô, tạo ra các cytokine gây viêm, các yếu tố tăng trưởng, enzyme, bên cạnh xơ hóa và hình thành u hạt do tăng sinh nguyên bào sợi cùng với sản xuất collagen [15, 64, 68, 94]

1.1.3 Thực trạng về viêm và vai trò của viêm trong một số bệnh

Viêm từ lâu đã được công nhận là nguyên nhân chính gây ra bệnh tật [11] Tổn thương do viêm cấp tính và mạn tính được quan sát thấy ở tất cả cơ quan, bao gồm tim, tuyến tụy, gan, thận, phổi, não, đường ruột và hệ thống sinh sản… Tình trạng viêm mạn tính tiến triển âm thầm là nguyên nhân chính gây ra nhiều bệnh mạn tính

đe dọa đáng kể đến sức khỏe và tuổi thọ con người Viêm cấp độ thấp ngày càng được công nhận là đặc điểm chung của các bệnh liên quan đến chuyển hóa (tiểu đường loại

2, gút,…), tâm thần và thoái hóa thần kinh [53, 74] Một số yếu tố thúc đẩy tình trạng viêm mạn tính cấp độ thấp, chẳng hạn như tuổi tác, hút thuốc, chế độ ăn uống, lối sống ít vận động, béo phì, hormone, căng thẳng và thói quen ngủ không đều đặn Năm

2000, gần 125 triệu người Mỹ đang sống chung với các tình trạng bệnh mạn tính và

61 triệu người (21%) mắc nhiều hơn một bệnh [73] Trên toàn thế giới, 3 trong số 5 người tử vong do các bệnh viêm mạn tính như đột quỵ, bệnh hô hấp mạn tính, rối loạn tim, ung thư, béo phì và tiểu đường Nghiên cứu công bố năm 2023 của Dongze Wu và cộng sự cho thấy tỷ lệ mắc một số bệnh về viêm phân bố ở tất cả các quốc gia trên thế giới, phân hóa ở tất cả các lứa tuổi trong vòng đời của con người, cùng với đó là tỷ lệ mắc khá tương đồng ở cả hai giới nam và nữ [92]

Bệnh tim mạch và bệnh lý nền tảng của nó, xơ vữa động mạch, là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây tử vong trên toàn thế giới Đến năm 2030, dự kiến

sẽ có gần 23,6 triệu người tử vong hàng năm do các rối loạn tim mạch [58] Các chất trung gian gây viêm đóng vai trò quan trọng trong xơ vữa động mạch, từ quá trình thu hút bạch cầu cho đến khi hình thành mảng xơ vữa Hệ thống miễn dịch bẩm sinh

là hàng phòng thủ tim chính chống lại các tác nhân gây bệnh và tổn thương mô Nhồi máu cơ tim, thường là kết quả của xơ vữa động mạch vành và liên quan đến mất cấp

tính nhiều tế bào cơ tim, là nguyên nhân phổ biến nhất gây tổn thương tim Các tế bào tim hoại tử bắt đầu một chuỗi phản ứng viêm để loại bỏ các tế bào chết và mảnh vụn khỏi vùng nhồi máu Các phối tử nội sinh được giải phóng sau chấn thương được các thụ thể bề mặt tế bào nhận biết là tín hiệu nguy hiểm và kích hoạt tình trạng viêm [25] Các chemokine tuyển dụng các bạch cầu gây viêm đến vùng nhồi máu và các cytokine thúc đẩy sự kết dính giữa bạch cầu và tế bào nội mô [29, 66] Cùng với

đó, TGF – β và IL – 10 thúc đẩy quá trình sửa chữa tim bằng cách ức chế tình trạng viêm, tăng cường điều biến kiểu hình nguyên bào sợi cơ và thúc đẩy lắng đọng chết nền ngoại bào [26, 45]

Viêm khớp dạng thấp (RA) là một bệnh tự miễn phổ biến đặc trưng bởi tình trạng viêm mạn tính của mô khớp [77] Tỷ lệ mắc bệnh là 0,5% đến 1% ở dân số Hoa

Kỳ [38], ở Ấn Độ là 0,9% trong khi ở Trung Đông và Bắc Phi là khoảng 0,16% [13]

RAcó thể xảy ra với đến bất kỳ người nào ở mọi lứa tuổi, và thường phát triển ở thập

kỷ thứ tư và thứ năm của cuộc đời Khoảng một nửa số bệnh nhân có biểu hiện sưng, đau và biến dạng các khớp nhỏ, đặc biệt là khớp liên đốt ngón tay và khớp cổ tay Bệnh được đặc trưng bởi sự phát triển và bị phá hủy khớp do viêm và tăng sản xuất hoạt dịch như là một hệ quả của sự gia tăng các tự kháng thể của yếu tố dạng thấp (RF) và peptide kháng citrullinated vòng (anti-CCP) Tế bào T, tế bào B, bạch cầu trung tính và đại thực bào chủ yếu có trong mô hoạt dịch tạo ra các phân tử gây viêm cũng như phân hủy phá vỡ chất nền ngoại bào (ECM) của sụn và xương [59] Biểu hiện lâm sàng của RA là cứng khớp buổi sáng, đau ở vai, cổ và vùng chậu, mất khả năng vận động kèm theo sốt, mệt mỏi, khó chịu, sụt cân và phát triển các cục u nhỏ dạng thấp khớp Mặc dù nguyên nhân và bệnh sinh của RA vẫn chưa được hiểu đầy

đủ nhưng hầu hết các nghiên cứu đều thống nhất rằng nó là một cuộc tấn công tự miễn dịch vào xương và khớp sụn, một hệ quả của sự gia tăng các kháng thể tự miễn như yếu tố dạng thấp (RF) và anti-CCP [9]

Viêm thần kinh được định nghĩa là phản ứng viêm trong não hoặc tủy sống Phản ứng viêm xảy ra ở não trong nhiều bệnh về hệ thần kinh trung ương, bao gồm các bệnh tự miễn, các bệnh thoái hóa thần kinh như bệnh Alzheimer và bệnh Parkinson, và bệnh động kinh… Tình trạng viêm này được trung gian bởi quá trình

sản xuất cytokine, chemokine, các gốc oxy hóa tự do và các chất truyền tin thứ cấp Phản ứng viêm ở não có thể làm tăng khả năng kích thích của tế bào thần kinh, làm tổn thương tế bào và làm tăng tính thấm của hàng rào máu não đối với nhiều phân

tử khác nhau [5, 69] Các quá trình viêm này cũng liên quan đến cả hệ thống miễn dịch Cytokine và thụ thể Toll – like (TLR) là các trung gian gây viêm chính trong quá trình chuyển đổi giữa bẩm sinh và thích nghi Phản ứng viêm ở hệ thần kinh trung ương cũng có thể được kích hoạt bởi các phối tử nội sinh được TLR nhận biết, quá trình viêm này thường xảy ra rất mạnh khi phản ứng với cả tác nhân truyền nhiễm và chấn thương não, chẳng hạn như tổn thương mô được quan sát thấy sau chấn thương não do thiếu máu cục bộ, độc tố, hoặc co giật Bối cảnh, diễn biến và thời gian của các phản ứng viêm này đều là những khía cạnh quan trọng trong việc tìm hiểu các quá trình này nhằm chẩn đoán và đưa ra phác đồ điều trị phù hợp

1.1.4 Điều trị viêm

Hệ thống miễn dịch đã tiến hóa để nhận biết các kháng nguyên lạ Viêm là phản ứng phức tạp, điển hình của cơ thể đối với các tế bào, mô, cơ quan bị tổn thương Tùy thuộc vào tác nhân gây bệnh và mức độ tổn thương, phản ứng viêm có thể diễn

ra rất nhanh hoặc có thể phát triển thành một quá trình phức tạp liên quan đến nhiều loại tế bào hoặc thậm chí phát triển thành viêm quá mức Sự phát triển và diễn biến của các phản ứng viêm được điều chỉnh bởi các cytokine (chủ yếu được giải phóng

từ bạch cầu), các sản phẩm của hệ thống enzyme huyết tương, các chất trung gian lipid – icosanoid (prostanoid, leukotriene, thromboxane, các yếu tố hoạt hóa tiểu cầu) được tiết ra từ các tế bào khác nhau và các chất trung gian hoạt mạch được giải phóng

từ các tế bào nội mô và mast, basophil và tiểu cầu Các phương pháp điều trị tình trạng viêm quá mức tập trung vào việc ức chế, ngăn chặn hoặc ức chế các chất trung gian gây viêm, và nó không thay đổi đáng kể từ khi những người hành nghề y học dân gian cổ đại sử dụng vỏ cây liễu theo chỉ định của Hippocrates [24] Tuy nhiên,

việc sử dụng lá liễu chứa salicylate (loài Salix) để điều trị các bệnh thấp khớp đã có

từ thời người Sumer [65] Các hợp chất trong vỏ cây liễu, chẳng hạn như salicylate, cung cấp cơ sở cho việc phát triển aspirin, nhiều loại thuốc chống viêm không steroid

(NSAID) và các loại thuốc khác (Hình 2) Hiện nay, mỗi ngày có hơn 30 triệu viên aspirin hoặc NSAID không phải aspirin được tiêu thụ [3]

Hình 2 Các mốc quan trọng trong quá trình phát triển của thuốc NSAID có chứa

aspirin hoặc không chứa aspirin theo thứ tự thời gian [72]

Cơ chế hoạt động cơ bản của NSAID dựa trên sự ức chế các enzym COX do

đó ức chế giảm giải phóng prostaglandin Mặc dù việc ức chế các enzym COX đã được chứng minh là cơ chế chính cho hiệu quả của NSAID, nhiều nghiên cứu cũng chỉ ra các cơ chế kháng viêm mà không phải thông qua COX của NSAID (Hình 3)

Hình 3 Cơ chế kháng viêm không phụ thuộc COX của NSAID [72]

Mặc dù nhiều loại trong số này có hiệu quả, làm giảm các dấu hiệu và triệu chứng nghiêm trọng nhưng có thể gây ra tình trạng ức chế miễn dịch với các bệnh nhiễm trùng cơ hội [82] Bên cạnh đó, tỷ lệ lớn các NSAID có trên thị trường có tác dụng không mong muốn đáng kể, do đó nhu cầu về các loại thuốc chống viêm mới góp phần thúc đẩy nghiên cứu các phân tử mới hơn, an toàn hơn, hiệu quả hơn với ít tác dụng phụ hơn và có nguồn gốc từ thực vật [70]

1.1.5 Các con đường truyền tín hiệu trong viêm

Phản ứng viêm là sự kích hoạt, phối hợp của các con đường truyền tín hiệu nhằm điều chỉnh mức độ chất trung gian gây viêm trong các tế bào mô thường trú và các tế bào viêm được bổ sung từ máu Mặc dù cơ chế sinh bệnh của các bệnh khác nhau là khác nhau, nhưng trong hầu hết các trường hợp, các chất trung gian gây viêm, các con đường điều hòa và truyền tín hiệu là giống nhau Trong mọi trường hợp, các thụ thể nhận biết các kích thích có hại trên màng tế bào được kích hoạt, còn gọi là thụ thể nhận dạng mẫu (pattern – recognition receptors (PRRs)) Đây là họ thụ thể giúp nhận biết các mẫu phân tử vi khuẩn, nhiều tín hiệu nội sinh được kích hoạt trong quá trình tổn thương mô hoặc tế bào Các lớp họ PRR bao gồm các thụ thể Toll – like (TLR), các thụ thể lectin loại C (CLR), các thụ thể gen retinoic acid-inducible (RIG)-

I – like (RLR) và các thụ thể NOD – like (NLR) [88] Hơn mười thành viên của họ TLR đã được xác định và TLR là PRR được nghiên cứu kỹ nhất trong số các PRR đã biết Truyền tín hiệu qua TLR kích hoạt một chuỗi truyền tín hiệu nội bào dẫn đến sự

di chuyển vào nhân của các yếu tố phiên mã, chẳng hạn như protein hoạt hóa – 1 1) và NF-κB hoặc yếu tố điều hòa interferon 3 (IRF3) (Hình 4) [11]

(AP-Hình 4 Tín hiệu thông qua TLR kích hoạt các chuỗi tín hiệu nội bào [11]

Các kích thích gây viêm thông qua tương tác với PRR kích hoạt các con đường truyền tín hiệu nội bào quan trọng, bao gồm protein kinase hoạt hóa mitogen (MAPK), yếu tố nhân kappa – B (NF – κB) Bên cạnh đó, cytokine như interleukin – 1β (IL – 1β), interleukin – 6 (IL – 6) và yếu tố hoại tử khối u – α (TNF – α) thông qua tương tác thụ thể IL – 1 (IL – 1R), thụ thể IL – 6 (IL – 6R) và thụ thể TNF (TNFR) kích hoạt các con đường truyền tín hiệu này, bên cạnh con đường chất chuyển tín hiệu Janus kinase (JAK) và chất hoạt hóa phiên mã (STAT) [33, 34]

Yếu tố phiên mã NF – κB đóng vai trò quan trọng trong các quá trình viêm, đáp ứng miễn dịch, và apoptosis Họ NF-κB bao gồm năm yếu tố phiên mã có liên quan: P50, p52, RelA (p65), RelB và c-Rel [67] Trong điều kiện sinh lý bình thường, protein IκB có trong tế bào chất ức chế NF-κB Tín hiệu sau khi được truyền qua các thụ thể trên bề mặt tế bào sẽ kích hoạt kinase IκB (IKK), bao gồm hai tiểu đơn vị

kinase, IKKα và IKKβ, và một tiểu đơn vị điều hòa, như IKKγ IKK điều chỉnh hoạt hóa con đường NF-κB thông qua quá trình phosphoryl hóa IκB [48] Sự phosphoryl hóa IκB dẫn đến sự phân hủy của nó bởi proteasome và giải phóng NF-κB để di chuyển vào nhân và kích hoạt phiên mã gen Con đường này điều chỉnh sản xuất cytokine tiền viêm và dẫn dụ các tế bào viêm, góp phần vào phản ứng viêm Có ít nhất hai con đường riêng biệt để hoạt hóa NF-κB ( Hình 5) Con đường "chuẩn" được kích hoạt bởi các sản phẩm vi khuẩn và cytokine tiền viêm như TNF-α và IL-1, thường dẫn đến hoạt hóa các phức hợp chứa RelA hoặc cRel [44] Một con đường NF-κB “thay thế” được kích hoạt bởi các cytokine thuộc họ TNF-lymphotoxin β (TNFSF3), phối tử CD40 (CD40L và TNFSF5), yếu tố hoạt hóa tế bào B (BAFF và TNFSF13B), và chất hoạt hóa thụ thể của phối tử NF-κB (RANKL và TNFSF11), dẫn đến kích hoạt phức hợp RelB/p52 [7]

Hình 5 Các con đường kích hoạt NF-κB [44]

MAPK là một họ protein kinase serine/threonine có chức năng hướng các phản ứng của tế bào tới nhiều loại kích thích khác nhau, bao gồm căng thẳng thẩm thấu,

mitogen, sốc nhiệt và cytokine gây viêm (như IL-1, TNF-α và IL-6), giúp điều hòa

sự tăng sinh, biệt hóa, sự sống còn của tế bào và apoptosis [43] MAPK ở động vật

có vú bao gồm kinase ERK1/2 được điều hòa bởi tín hiệu ngoại bào, p38 MAP Kinase

và kinase đầu N c-Jun (JNK) Mỗi con đường truyền tín hiệu MAPK bao gồm ít nhất

ba thành phần: MAPK, kinase MAPK (MAPKK) và kinase kinase MAPK (MAPKKK) MAPKKK phosphoryl hóa và kích hoạt MAPKK, sau đó phosphoryl hóa và kích hoạt MAPK [47] ERK thường được kích hoạt bởi các mitogen và tín hiệu biệt hóa, trong khi các kích thích gây viêm và căng thẳng kích hoạt JNK và p38 MKK1 và MKK2 kích hoạt ERK1/2, MKK4 và MKK7 kích hoạt JNK, và MKK3 và MKK6 kích hoạt p38 Việc kích hoạt MAPK, dẫn đến quá trình phosphoryl hóa và kích hoạt các yếu tố phiên mã bao gồm Erk1/2, JNK, p38 có trong tế bào chất, khiến chúng di chuyển vào nhân khởi đầu phản ứng viêm (Hình 6)

Hình 6 Con đường MAPK [11]

Con đường JAK-STAT được bảo tồn cao liên quan đến nhiều loại cytokine, yếu tố tăng trưởng, interferon và các phân tử liên quan, chẳng hạn như leptin và hormone tăng trưởng, và là một cơ chế truyền tín hiệu thông qua đó các yếu tố ngoại bào có thể kiểm soát biểu hiện gen [71] JAK liên kết với thụ thể được kích hoạt bởi các phối tử và phosphoryl hóa lẫn nhau, tạo ra các vị trí liên kết cho STAT, là các yếu

tố phiên mã nằm trong tế bào chất STAT tế bào chất được liên kết vào các vị trí này

trải qua quá trình phosphoryl hóa và dimer hóa sau đó trước khi chuyển đến nhân [90] Do đó, tín hiệu JAK/STAT cho phép truyền trực tiếp tín hiệu ngoại bào thành phản ứng phiên mã Các protein STAT được chuyển vào nhân liên kết với các vùng khởi động gen mục tiêu để điều chỉnh phiên mã của các gen gây viêm (Hình 7)

Hình 7 Con đường JAK-STAT [18]

1.2 NLRP3 inflammasome

1.2.1 Cấu trúc và các yếu tố hoạt hóa NLRP3 inflammasome

Inflammasome là thành phần quan trọng trong phản ứng của hệ thống miễn dịch bẩm sinh đối với các tác nhân gây bệnh, nó bao gồm một tập hợp đa protein trong tế bào chất Inflammasome kích hoạt các protease caspase riêng biệt để đáp ứng với nhiễm trùng hoặc các kích thích có hại Thụ thể NOD – like P3 (NLRP3) thuộc

họ thụ thể NOD – like (NLR) của PRR, nằm trong tế bào chất, có chức năng phát hiện tín hiệu nguy hiểm Dựa trên bản chất của miền đầu nitơ, các thành viên của họ NLR được chia thành bốn phân họ, bao gồm NLRA, NLRB, NLRC và NLRP NLRP3 inflammasome là một phức hợp protein điều chỉnh phản ứng miễn dịch bẩm sinh bằng cách kích hoạt caspase-1 và các cytokine gây viêm interleukin (IL)-1β và IL-18 Ngoài ra, nhiều thành viên của PRR đã được xác nhận là tạo thành inflammasome:

NLRP1, NLRP3 và NLRC4, AIM2 (absent-in-melanoma 2), NLRP2, NLRP6, NLRP7, NLRP12 và IFI16 [46, 83]

NLRP3 là protein PRR nằm trong tế bào chất, có khối lượng 118 kDa được biểu hiện bởi nhiều loại tế bào bao gồm bạch cầu trung tính, đại thực bào, tế bào thần kinh đệm, tế bào lympho, tế bào biểu mô, tế bào tạo xương, tế bào thần kinh và tế bào dendrit (tế bào đuôi gai) [76, 95] Protein NLRP3 chứa miền lặp lại giàu leucine đầu

C (LRR), miền NACHT chứa ATPase trung tâm làm trung gian cho quá trình oligomer hóa và miền pyrin đầu N (PYD) liên kết các protein để hình thành phức hợp inflammasome [46] Giống như các inflammasome khác, phức hợp inflammasome NLRP3 bao gồm một cảm biến (protein NLRP3), một bộ chuyển đổi (protein speck – like liên quan đến apoptosis, ASC) và một tác nhân phản ứng (effector) (caspase-1) [16] Cấu trúc của một số inflammasome đã biết khác nhau và cấu trúc phức hợp inflammasome NLRP3 được thể hiện dưới hình 8

Hình 8 Cấu trúc của một số phức hợp inflammasome và NLRP3 inflammasome [89]

Sự hình thành và hoạt hóa inflammasome NLRP3 diễn ra theo hai giai đoạn: tín hiệu sơ cấp và hoạt hóa (priming and activation) Tín hiệu sơ cấp chịu trách nhiệm cho sự điều hòa tăng phiên mã của protein NLRP3 và các cytokine tiền viêm, pro-interleukin (IL)-1β và pro-IL-18, thông qua con đường truyền tín hiệu NF-κB [51]

Ở dạng không hoạt động, NLRP3 liên kết với ADP có thể tồn tại dưới dạng monome hoặc oligome NLRP3 monome định vị trên màng, hoạt động như một khung để tạo thành oligome, cấu trúc 5 – 8 bộ dimer với các miền LRR lồng vào nhau và được sắp xếp lưng vào nhau tạo thành dạng vòng tròn [2] Quá trình hình thành và hoạt quá inflammasome NLRP3 được thể hiện trên hình 9

caspase-1 cũng chứa miền CARD (tương tác CARD-CARD) và sau đó

pro-caspase-1 được chuyển đổi thành dạng hoạt động là caspase-pro-caspase-1 thông qua quá trình tự phân giải do tiếp xúc gần [54, 57] Caspase-1 hoạt hóa các pro-IL-1β và pro-IL-18 thành các dạng hoạt động của chúng, tương ứng là IL-1β và IL-18 Nó cũng cắt và kích hoạt gasdermin D tạo lỗ màng (GSDMD) làm vỡ tính thẩm thấu của tế bào dẫn đến pyroptosis và giải phóng IL-1β và IL-18 [22]

Nhiều phân tử là nguyên nhân quan trọng gây ra sự hoạt hóa NLRP3 inflammasome, bao gồm lipopolysaccharide (LPS), ATP ngoại bào, tinh thể (ví dụ như MSU), dòng ion, tổn thương lysosome và sản xuất các gốc oxy hóa tự do (ROS)

do rối loạn chức năng ty thể gây ra

Các nghiên cứu ban đầu đã chỉ ra rằng dòng K+ ra khỏi tế bào là một hiện tượng phổ biến kích hoạt NLRP3 inflammasome Tuy nhiên, cho đến hiện tại, cơ chế chính xác của K+ hoạt hóa NLRP3 inflammasome vẫn chưa hoàn toàn rõ ràng và không có nghiên cứu nào chỉ ra rằng K + tương tác trực tiếp với protein NLRP3 [12] Người ta mới chỉ biết rằng, dòng K+ đi ra được trung gian bởi các kênh thụ thể P2X7, một kênh xuyên màng được kích hoạt trực tiếp bởi ATP ngoại bào Bên cạnh đó, một

số kênh kali miền hai lỗ (two-pore domain potassium – K2P) cũng có thể gây ra sự hoạt hóa NLRP3 inflammasome theo cách phụ thuộc vào K+ Mười lăm gen kênh K2P đã được xác định trong bộ gen người và sáu phân họ riêng biệt có thể được phân biệt dựa trên các đặc điểm cấu trúc và chức năng của chúng, bao gồm TASK, TALK, TRESK, TREK, THIK và TWIK Những kênh này thông qua ATP gây ra thay đổi dòng dòng Ca2+ và Na+, cuối cùng dẫn đến sự hoạt hóa NLRP3 inflammasome thông qua dòng K+ [17]

Rối loạn chức năng ty thể cũng là một yếu tố góp phần quan trọng vào hoạt hóa inflammasome NLRP3 Các tín hiệu được giải phóng bởi tổn thương ty thể chủ yếu bao gồm DNA ty thể (mtDNA) và các gốc oxy hóa tự do (mtROS) Shimada và cộng sự lần đầu tiên đề xuất rằng DNA ty thể bị oxy hóa (OX-mtDNA) có thể gây ra

sự hoạt hóa của NLRP3 inflammasome trong quá trình apoptosis Trong tế bào chất, mtDNA bị oxy hóa sẽ liên kết và kích hoạt NLRP3 inflammasome [84] Ngoài ra, mtROS không chỉ điều chỉnh trực tiếp quá trình lắp ráp của inflammasome mà còn

gián tiếp điều chỉnh hoạt động của inflammasome bằng cách ảnh hưởng đến các protein tế bào chất Cụ thể, mtROS làm trung gian cho sự phân ly của protein tương tác thioredoxin (TXNIP) khỏi thioredoxin và sau đó tương tác với protein NLRP3 để kích hoạt inflammasome NLRP3 [99] Sự kích hoạt con đường NF-κB bởi ROS không chỉ làm trung gian cho quá trình lắp ráp của inflammasome NLRP3 mà còn trực tiếp thúc đẩy biểu hiện của yếu tố hoại tử khối u-α (TNF-α), pro-IL-1β, IL-6 và các yếu tố gây viêm khác Các cơ chế cụ thể của sự hoạt hóa NLRP3 inflammasome

do rối loạn chức năng ty thể và sản xuất ROS vẫn cần được nghiên cứu thêm

Một nghiên cứu trước đó phát hiện ra rằng lysosome có thể hấp thụ silica và muối nhôm trong phế nang, gây ra tình trạng sưng tấy và vỡ Chuỗi sự kiện này sau

đó kích hoạt NLRP3 inflammasome Một trong những cơ chế nó là việc tổn thương lysosome sẽ giải phóng cathepsin B, từ đó kích hoạt NLRP3 inflammasome [31] Việc giải phóng cathepsin B không chỉ kích hoạt trực tiếp NLRP3 inflammasome mà còn làm trung gian cho rối loạn chức năng ty thể, dẫn đến kích hoạt NLRP3 inflammasome do mtROS [36]

1.2.2 Thụ thể NLRP3 và quá trình viêm

Trong hai thập kỷ qua, các thành phần phân tử và cơ chế hoạt hóa của các inflammasome khác nhau đã được nghiên cứu rộng rãi, tuy nhiên, NLRP3 inflammasome là loại được nghiên cứu và mô tả nhiều nhất hiện nay do khả năng được kích hoạt bởi một loạt các kích thích khác nhau và sự liên quan của nó trong một số bệnh viêm [4] Sự kích hoạt NLRP3 bất thường đã được chứng minh là làm trầm trọng thêm bệnh lý ở một số bệnh do viêm gây ra và các nghiên cứu đang được tiến hành đang tìm hiểu vai trò riêng biệt mà NLRP3 có thể đóng trong các trạng thái bệnh khác nhau Như đã biết, NLRP3 inflammasome kiểm soát hoạt động của enzyme phân giải protein caspase – 1 Sau đó, caspase – 1 điều chỉnh quá trình trưởng thành của IL – 1β và IL – 18 và quá trình chết tế bào Rất nhiều các nghiên cứu khác nhau

đã chứng minh vai trò của IL – 18 và IL – 1β trong quá trình nhiễm trùng với nhiều loại mầm bệnh cũng như trong các bệnh liên quan đến viêm Một trong những chức năng chính của IL-18 là thúc đẩy sản xuất IFN γ từ tế bào T và NK IL-18 cũng thúc đẩy tiết các cytokine tiền viêm khác như TNF – α , IL – 1β , IL – 8 và GM – CSF và

do đó, tăng cường sự mở rộng, di chuyển và kích hoạt của bạch cầu Ngoài ra, IL-18 tăng cường hoạt động gây độc tế bào và sự tăng sinh của tế bào T IL – 1β đã được chứng minh là có tác dụng bảo vệ trong một số mô hình nhiễm trùng do vi khuẩn, vi-rút và nấm IL-1β là một trong những cytokine tiền viêm mạnh nhất, nó ảnh hưởng đến hầu như mọi cơ quan và một số bệnh lý ở người chủ yếu do sản xuất IL-1 β không được kiểm soát [80] Tuy nhiên, sự cân bằng này khi bị phá vỡ có thể dẫn đến tình trạng viêm quá mức và không hồi phục, là nguyên nhân gây ra bệnh tật và tử vong nghiêm trọng Trên thực tế, tình trạng viêm quá mức đã được chứng minh là có hại trong nhiều bệnh khác nhau do hệ quả của tổn thương mô dẫn đến suy giảm chức năng của nhiều cơ quan [96] Trong số các cytokine gây viêm, IL – 1β có một trong những tiềm năng gây tổn thương cho các mô vật chủ cao nhất và trên thực tế, nhiều

cơ chế khác nhau được dành riêng để hạn chế hoạt động của nó, trong tế bào, bằng cách kiểm soát cẩn thận quá trình phiên mã và xử lý của nó bởi inflammasome và, ngoài tế bào, bằng cách ức chế tín hiệu thụ thể của nó [80] Chính vì vậy, việc kiểm soát hoạt động của các cytokine gây viêm là một trong những yếu tố thiết yếu nhằm duy trì trạng thái cân bằng giữa phản ứng bảo vệ hay gây hại của hệ miễn dịch, trong

đó NLRP3 inflammasome có thể trở thành mục tiêu tiềm năng trong việc kiểm soát

hoạt động của IL – 1β cũng như IL – 6

1.3 Dây gắm

1.3.1 Phân loại và hình thái

Dây gắm hay còn gọi gắm núi, có tên khoa học Gnetum montanum Markgraf,

là một loài thực vật hạt trần trong họ Gnetaceae Loài này được Markgr mô tả khoa

học đầu tiên năm 1930

Về mặt hình thái, dây Gắm là cây leo thân gỗ dài tới hơn 10m, Thân cành có tiết diện tròn hoặc bầu dục, nhẵn, đôi khi nhăn theo chiều dọc của dây Cuống lá 0,8 – 1,5 cm; phiến lá thường thuôn dài, đôi khi hình trứng, hình mác hoặc hình elip, kích thước rất thay đổi, 10 – 25 × 4 – 11 cm, dai hoặc gần như vậy, gân bên từ 8 – 13 ở mỗi bên, gân thứ cấp cong, cuống lá dài 1 – 1,5 cm, hình tròn hoặc hình nêm rộng, đỉnh tù hoặc nhọn, lá màu đen khi khô Cụm hoa mọc ở gốc hoặc ở đầu, phân nhiều nhánh, chủ yếu là các bông hoa đực Cụm hoa đực lỏng lẻo, phân nhánh một hoặc hai

lần, 2,5 – 6 cm; cuống hoa 6-12 mm; bông hoa đực 2-3 cm × 2,5-3 mm, vòng bao 13 – 18, mỗi vòng có 20 – 45 hoa cộng với 10 – 15 hoa bất thụ, lông ở gốc tạo thành một đệm dày đặc, ngắn Cụm hoa cái mọc bên, đơn độc hoặc mọc thành chùm, trục chính mỏng, có 3 hoặc 4 cặp nhánh; cuống hoa 2 – 3 cm; gai hoa cái 2 – 3 cm, mở rộng đến

10 cm khi trưởng thành, mỗi đốt có 5 – 8 hoa cái, lông ở gốc thưa, ngắn Quả hình elip, dài 1,5 x 1 cm, màu đỏ khi chín, cuống mập, dài 0,2 cm Hạt màu nâu vàng hoặc nâu đỏ, hình trụ hoặc hình trứng, 1 – 2 cm × 6,5 – 9 mm, gốc tròn, đôi khi co lại thành cuống dài 3 – 5 mm, lớp lông ngoài nhẵn, vỏ nhăn theo chiều dọc khi khô, đôi khi phủ vảy bạc Dây gắm thường ra hoa và thụ phấn khoảng tháng 4 – 6, hạt chín khoảng

tháng 8 –10 Đặc điểm hình thái của loài Gnetum montanum được mô tả trên hình 10

Dây gắm mọc khá phổ biến mọc trong rừng rậm ẩm ướt, độ cao 50 – 1800 m Phân

bố chủ yếu ở một số nước châu Á như Trung Quốc, Ấn Độ, Băng-la-đét, Đông Himalaya, Nê-pan, Quần đảo Andaman, Campuchia, Lào, Miến Điện, Thái Lan, Việt Nam

Hình 10 Hình ảnh dây gắm Gnetum montanum (Nguồn: eFloraofIndia)

1.3.2 Dây gắm và quá trình viêm

Gnetum montanum Markgraf từ lâu đã được sử dụng rộng rãi như một loại

thuốc dân gian Theo y học cổ truyền, dây Gắm có vị đắng, tính mát, có tác dụng giải độc, tiêu viêm, thư cân, hoạt huyết, sát trùng, thường được dùng làm thuốc giảm đau, chữa phong tê thấp, sản hậu môn, giải các chất độc, cũng dùng làm thuốc chữa sốt và sốt rét Trong y học cổ truyền Yao, người ta tin rằng nó có tác dụng xua tan gió và loại bỏ độ ẩm, thúc đẩy lưu thông máu để loại bỏ ứ máu, làm giảm cứng cơ và giảm đau [75] Các nghiên cứu hóa học hiện đại cho thấy loại cây này chứa nhiều hợp chất thuộc các nhóm stilben, sterol, flavonoid, alkaloid, lignans [93, 97] Có thể kể đến nhiều hợp chất đã được tách chiết từ dây Gắm như: lehmbachol, gnetulin, trans -shegansu B, cis -shegansu B, (+)-hannokinol, gnetol, resveratrol, 4', 5, 7-trihydroxy-3'-methoxyflavone, beta-sitosterol, daucosterol, ursolic acid, and tetracosanoic acid Nguồn hợp chất tự nhiên dồi dào từ loại thực vật này khiến nó trở thành mục tiêu tiềm năng của các nghiên cứu, dẫn đến ngày càng nhiều hoạt tính sinh học của các hợp chất khác nhau được công bố như tính kháng khuẩn, chống ung thư, chống oxy hóa, ức chế xanthine oxidase, và đặc biệt là kháng viêm

Mặc dù vậy, hiện nay, chưa có nhiều nghiên cứu chỉ ra cơ chế tác động của các hợp chất chiết xuất từ dây gắm đến quá trình viêm Xuất phát từ thực trạng hiện nay về vai trò của quá trình viêm trong nhiều bệnh khác nhau, dựa trên cơ sở đã biết

về tác động của dây Gắm đến quá trình viêm, cũng như tầm quan trọng của NLRP3 inflammasome trong quá trình viêm, chúng tôi thực hiện đề tài: “Sàng lọc một số hợp

chất kháng viêm từ cây Gắm (Gnetum montanum) thông qua NLRP3” với mục tiêu:

- Tinh sạch được ít nhất một chất từ dây Gắm có khả năng kháng viêm

- Đánh giá được tác động của chất đã tinh sạch đến sự biểu hiện của NLRP3 inflammasome

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu và thiết bị

- Vật liệu nghiên cứu:

Mẫu thực vật: cây dây Gắm được thu thập tại Hà Giang vào mùa thu Các mẫu này đã được định danh và lưu mẫu tại Bảo tàng Sinh học- Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội (HNU0245529) Sau khi phân loại mẫu thực vật xác định

được đây là cây dây Gắm có tên khoa học là: Gnetum montanum Markgr Mẫu được

sấy khô ở 600C trong 24 giờ, sau đó được nghiền thành dạng bột và bảo quản ở nhiệt

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Tách chiết Pinoresinol, Resveratrol từ dây gắm

Pinoresinol được tách chiết từ Gnetum montanum M theo phương pháp đã được mô tả trước đây của Lucy P Meagher và cộng sự [60] Cụ thể, bột khô Gnetum montanum M (100 gram) được chiết xuất bằng methanol/nước (80:20, v : v) (4

gam/50 mL) trong 4 giờ ở 55oC Dịch chiết sau đó được làm bay hơi ở 35oC để thu được cặn (8,83 gram) Phần cặn sau đó được hòa tan lại với nước trước khi được thủy phân bằng axit clohydric (nồng độ 1 M) trong 1 giờ ở 100oC theo tỷ lệ 10 mL dịch chiết trong 0.8 mL axit Dịch thủy phân sau đó được pha loãng hai lần với nước và tiếp tục được chiết xuất hai lần với cùng lượng thể tích của etyl axetat : hexan (1 : 1) Pha hữu cơ sau đó được thu, làm khô và hòa tan lại với methanol để kiểm tra sự có mặt của Pinoresinol Sự có mặt của Pinoresinol được xác nhận bằng sắc ký bản mỏng,

sử dụng DCM (Dichloromethane)– acetone – axit formic (80 : 18 : 2) làm pha động, phát hiện bằng UV 280 nm [30] Độ tinh khiết của Pinoresinol được đánh giá bằng phương pháp HPLC sử dụng hệ thống shimadzu Cột phân tích là Cosmosil 5C18 - AR- II Pha động sử dụng hệ dung môi gồm nước cất hai lần + axit formic 0,1% (dung môi A) và acetonitril + axit formic 0,1% (dung môi B) Gradient được đặt tại 20%