Trong đó, loài nấm Cryptosporiopsis eucalypti đã được xác định là sinh vật gây bệnh hại chính ở các khu rừng trồng bạch đàn.. Thực hiện đề tài “Tuyển chọn một số chủng nấm nội sinh có
TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
Tổng quan nghiên cứu về nấm nội sinh
1.1.1 Đa dạng nấm nội sinh
Nấm nội sinh là sinh vật sống trong các cây chủ khỏe mạnh mà không gây ra triệu chứng bệnh tật, đóng vai trò quan trọng trong sự sinh trưởng của cây trồng Chúng giúp cây chủ tăng cường khả năng chống chịu với các điều kiện môi trường khắc nghiệt và các tác nhân gây hại từ sinh học và phi sinh học.
Nấm nội sinh có thể xâm nhập và sống bên trong cây chủ qua hai phương thức: (i) bào tử nấm từ không khí tiếp xúc với bề mặt lá và xâm nhập qua khí khổng; (ii) thông qua hạt cây chủ để phát triển ở các thế hệ tiếp theo Ở cây chủ khỏe mạnh, nấm nội sinh tồn tại trong trạng thái tiềm ẩn mà không gây hại, nhưng chúng có thể trở thành tác nhân gây hại khi cây chủ bị rối loạn chức năng sinh lý hoặc thay đổi trạng thái di truyền do môi trường Một số loài nấm nội sinh cũng có khả năng trở thành nấm hoại sinh sau khi cây chủ chết Nấm nội sinh có thể sống trong nhiều mô thực vật khác nhau, với sự đa dạng cao về loài và các loại cây chủ.
Năm 2011 và 2018, các nghiên cứu cho thấy mỗi loài cây chủ có thể chứa từ một đến hàng trăm chủng nấm nội sinh (Aly et al 2011) Đa dạng nấm nội sinh được ghi nhận ở cả cây hạt trần và cây lá rộng, cũng như trong các hệ sinh thái rừng ôn đới và nhiệt đới (Gamboa và Bayman 2001; Pirttilọ và Frank 2011; Suryanarayanan 2013; Rashmi 2019; Yao et al 2019; Jia et al 2020) Sự đa dạng này thường cao hơn ở cây rừng so với các loài thực vật khác (Jia et al 2020) Tuy nhiên, sự chiếm ưu thế của các loài nấm nội sinh khác nhau giữa các cây chủ và bị ảnh hưởng bởi vị trí địa lý, điều kiện môi trường, loài cây, kiểu gen và tuổi của cây (Arnold 2007; Rashmi 2019; Jia et al 2020) Thêm vào đó, số lượng các chủng nấm nội sinh phân lập được còn phụ thuộc vào các phương pháp phân lập, bao gồm khử trùng bề mặt mô thực vật, kích thước mẫu và môi trường phân lập (Gamboa et al 2003; STONE et al 2004; Pirttilọ và Frank 2011).
Endophytic fungi, primarily belonging to over 800 genera, are predominantly represented by the genus Penicillium, followed by Alternaria, Colletotrichum, and others, with a relatively wide host range (Rashmi 2019) For instance, Penicillium is the most common endophyte found in rubber trees (Hevea brasiliensis) in Peru (Gazis and Chaverri 2010), in the chinaberry tree (Melia azedarach) in Brazil (Geris dos Santos et al 2003), and in coffee plants (Coffea arabica) in Colombia (Vega et al 2006) The genus Colletotrichum is dominant on apple trees (Malus domestica) in Brazil (Camatti-Sartori et al 2005) and on the frangipani tree (Plumeria rubra) in India (Suryanarayanan and Thennarasan 2004), while Colletotrichum gloeosporioides is the most prevalent species on lemon trees (Citrus lemon) in Argentina (Durán et al 2005) Additionally, Alternaria species are notably dominant on ash trees.
(Fraxinus excelsior) ở Đức (Reiher 2011), Tây Ban Nha (Trapiello et al 2017), Cộng hòa Séc (Haňáčková et al 2017) và Ukraine (Davydenko et al 2013)
Nghiên cứu cho thấy các loài nấm nội sinh như Alternaria spp và Lophodermium chiếm ưu thế trên nhiều loài cây chủ ở các khu rừng ôn đới Cụ thể, Lophodermium là chi nấm nội sinh phổ biến nhất được tìm thấy ở các loài Thông như Pinus taeda và Picea mariana tại Canada Ngoài ra, trên các cây thuộc họ cau, chi Idriella là loài nấm nội sinh phổ biến nhất, tiếp theo là Aspergillus và Phomopsis Tại Uruguay, các loài nấm nội sinh được phân lập từ hai loài Bạch đàn cho thấy Aureobasidium và Botryosphaeria là hai chi chiếm ưu thế Cuối cùng, Aureobasidium spp cũng là các loài nấm nội sinh phổ biến nhất được tìm thấy trên lá cây Dương lá rung ở Thụy Điển.
Trong những năm gần đây, nghiên cứu về đa dạng các loài nấm nội sinh trên cây rừng đã được thực hiện trên toàn cầu, dẫn đến việc phát hiện nhiều loài nấm mới Sự đa dạng của các loài nấm nội sinh có sự khác biệt đáng kể giữa các loài cây chủ và giữa các cơ quan của cây.
1.1.2 Ứng dụng nấm nội sinh trong lĩnh vực kiểm soát sinh học tác nhân gây bệnh
Nấm nội sinh mang lại nhiều lợi ích nhờ khả năng tạo ra các hợp chất sinh học có hoạt tính, được ứng dụng trong y học, dược phẩm, công nghiệp và nông nghiệp Kiểm soát sinh học các mầm bệnh thực vật đã được nghiên cứu như một biện pháp thay thế cho thuốc trừ sâu hóa học Nấm nội sinh đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát dịch bệnh trong nông nghiệp và lâm nghiệp Chúng tạo ra nhiều chất chuyển hóa thứ cấp có khả năng kháng lại các tác nhân gây bệnh Chẳng hạn, nấm Pestalotiopsis adusta sản sinh hai hợp chất Pestalachlorides A và B, có khả năng ức chế các loài nấm gây hại cho thực vật.
Verticillium albo-atrum, Gibberella zeae và Fusarium culmorum (Puri et al
Cytosporone B, C và Chaetomugilin A, D, được chiết xuất từ nấm nội sinh Chaetomimum globosum và Phomopsis spp của cây Ngân hạnh (Ginkgo biloba), có khả năng kháng nấm Candida albicans và Fusarium oxysporum, gây bệnh ở người, động vật và nhiều loại cây trồng Ngoài ra, hợp chất tự nhiên mới 7-(γ, γ)-dimethylallyloxymacrosporin (C21H20O5) lần đầu tiên được phát hiện trong Phoma sp., một loài nấm nội sinh từ cây rừng ngập mặn, cho thấy khả năng ức chế nhiều mầm bệnh thực vật như Colletotrichum musae, Colletotrichum gloeosporioides và Fusarium graminearum.
Nấm nội sinh đóng vai trò quan trọng trong việc tăng cường sự phát triển của cây trồng thông qua nhiều cơ chế khác nhau, như tổng hợp phytohormone và tạo ra các hợp chất sinh học giúp ức chế mầm bệnh Chúng cải thiện khả năng hấp thụ dinh dưỡng và tăng cường khả năng chịu đựng của cây trước các điều kiện môi trường khắc nghiệt Nhiều loài nấm nội sinh có khả năng hòa tan các chất dinh dưỡng thiết yếu trong đất, giúp cây trồng dễ dàng tiếp cận Đặc biệt, hai loài nấm thuộc chi Penicillium được tìm thấy trong lá chè có khả năng hòa tan phốt pho khó tan, với mức tối đa lên tới 86,1 μg/mL.
Mucor sp., Aspergillus spp., Mucor hiemalis và Trichoderma peudokoningii được phân lập từ cây Cà chua (Solanum lycopersicum) có khả năng tăng cường sự phát triển của cây trồng bằng cách hòa tan phốt pho khó tan và các chất dinh dưỡng cần thiết (Chadha et al 2015) Nấm nội sinh từ cây Chè Ấn Độ (Camellia sinensis) cũng có khả năng hòa tan nhiều chất dinh dưỡng, với Penicillium sclerotiorum là loài phân giải phốt pho tốt nhất, trong khi Aspergillus niger và Penicillium sp phân giải kali và kẽm tốt nhất (Nath et al 2012) Các phytohormone như gibberellins (GAs), indole acetic acid (IAA) và cytokinin cũng được sản xuất bởi nấm nội sinh (Hamayun et al 2009; Khan et al 2015) Cladosporium sphaerospermum từ rễ cây Đậu tương (Glycine max) tạo ra gibberellins chủ yếu là GA3, GA4 và GA7, giúp thúc đẩy sự phát triển của cây lúa (Hamayun et al 2009) Fusarium tricinctum và Alternaria alternata từ lá cây Cà đen (Solanum nigrum) sản xuất IAA để kích thích sự phát triển của cây lúa Dongjin (Khan et al 2015).
1.1.3 Nghiên cứu ứng dụng nấm nội sinh ở Việt nam
Nghiên cứu về nấm nội sinh thực vật đã được thực hiện tại Việt Nam từ lâu, với việc phân lập thành công 115 chủng nấm từ rễ cây lúa nương ở Điện Biên Các chủng nấm này chủ yếu thuộc các chi khác nhau, mở ra triển vọng ứng dụng trong nông nghiệp và bảo vệ môi trường.
Các chủng nấm như Acremonium, Collectotrichum, Aspergillus, Cladosporium, Verticillum và Fusarium, đặc biệt là bốn chủng thuộc loài Fusarium oxysporum, đã chứng minh khả năng ngăn ngừa sự xâm nhiễm của tuyến trùng Meloidogyne graminicola gây hại trên rễ cây lúa (Vũ và Nguyễn 2009) Hai chủng nấm nội sinh không gây bệnh F oxysporum Fo162 và V5W2, được phân lập từ cây Cà chua và cây Chuối, có khả năng hạn chế sự phát triển của tuyến trùng Radopholus similis trên rễ cây Chuối, đồng thời mang lại ảnh hưởng tích cực lâu dài đến sự sinh trưởng và phát triển của cây (Vũ 2007) Ngoài ra, dịch lọc nuôi cấy từ nấm nội sinh Penicillium citrinum EF.DC.08, phân lập từ rễ cây Hồ tiêu, cũng cho thấy khả năng gây tử vong cho một số loại tuyến trùng.
94,67% tuyến trùng Meloidogyne incognita gây bệnh chết nhanh và chết chậm cho cây Hồ tiêu (Trần và Nguyễn 2021) Hai nấm nội sinh Epicoccum sp và Pseuderotium sp được phân lập từ cây Bưởi (Citrus maxima) cho thấy khả năng kháng khuẩn mạnh đối với Escherichia coli, Staphylococcus aureus và Streptococcus faecalis, với hoạt tính cao nhất ở chiết xuất bằng dung môi ethyl acetat (Võ et al 2015) Từ mẫu lá và thân cây Nghệ vàng (Curcuma longa), đã xác định được 4 chủng nấm nội sinh là Fusarium solani, Fusarium sp., Trichoderma atroviride và F oxysporum, trong đó chiết xuất MeOH của F oxysporum ức chế 56,46% sự phát triển của Botrytis cinerea gây thối xám trên rau quả (Nguyễn et al 2016) Cuối cùng, sàng lọc nấm nội sinh từ cây Cao su (Hevea brasiliensis) đã phát hiện chủng nấm Penicillium oxalicum NC5 có khả năng kháng nấm rất mạnh đối với các loài Phytopythium sp1.
Phytopythium sp2., Pythium sp., Phytophthora nicotianae và Phytophthora heveae (Đàm et al 2018) Nghiên cứu nấm nội sinh trên cây Dừa cạn
Nghiên cứu về Catharanthus roseus và Hoàng cầm râu (Scutallaria barbata) đã thu được 48 chủng nấm nội sinh từ rễ, chồi và lá của hai loài cây này, thuộc các chi Clasdosporium, Corunespora và Albifimbra Tuy nhiên, tiềm năng ứng dụng của các chủng nấm này vẫn chưa được nghiên cứu đầy đủ (Giang et al 2021).
Nghiên cứu về bệnh hại lá bạch đàn
Qui mô trồng rừng bạch đàn trên thế giới đang gia tăng, tuy nhiên, các rừng trồng này đang phải đối mặt với nhiều dịch bệnh do nấm, côn trùng, vi khuẩn và virus gây ra Bệnh hại lá bạch đàn, do nhiều loài nấm gây ra, đã dẫn đến tình trạng chết hàng loạt ở các rừng trồng bạch đàn ở Úc, New Zealand, Nam Phi, Brazil và Ấn Độ Cụ thể, tại Úc, bệnh đốm lá do nấm Aulographina eucalypti đã gây ra đại dịch ở rừng Eucalyptus nitens vào năm 1974, làm rụng lá hoàn toàn và gây thiệt hại lớn Các bệnh này thường xảy ra ở các rừng trồng bạch đàn đơn dòng hơn là rừng hỗn giao Nấm Mycosphaerella nubilosa đã gây ra tình trạng rụng lá lên tới 90% ở các rừng E globulus và E nitens tại Tasmania Tại New Zealand, một loài nấm thuộc chi Mycospharella đã gây dịch bệnh trên diện tích 1000 ha rừng E delegatensis, trong khi ở Nam Phi, nấm Mycosphaerella juvenis cũng gây hại cho rừng E globulus.
E nitens (Crous và Wingfield 1996) Ngoài ra loài nấm Cylindrocladium gây ra dịch bệnh cháy lá, tàn rụi đối với các rừng trồng bạch đàn non ở Braxin (Ferreira 1989), ở Ấn Độ (Sharma et al 1995), ở Nam Phi (Crous 1991) và ở Việt Nam (Old và Yuan 1994) Loài nấm gây bệnh rỉ sắt Puccinia psidii cũng gây dịch bệnh ở các rừng trồng bạch đàn ở Braxin (Ferreira 1989)
Nấm Cryptosporiopsis eucalypti Sankaran & B.Sutton là tác nhân gây bệnh đốm lá, khô ngọn và loét thân trên nhiều loài bạch đàn, đặc biệt phổ biến ở các nước vùng nhiệt đới ẩm như Indonesia, Brazil, Thái Lan, Việt Nam, Lào, Nhật Bản, Trung Quốc, Sri Lanka, Hawaii và New Zealand Loài nấm này cũng gây hại tại Úc, Ấn Độ và Mỹ, sản sinh ra một lượng lớn bào tử từ túi bào tử trên lá và ngọn bạch đàn bị nhiễm bệnh, dẫn đến hiện tượng lá chết và rụng Nấm có thể tồn tại trong thân cây bạch đàn dưới dạng bệnh loét trong mùa khô, nhưng sẽ bùng phát trở lại trong điều kiện ẩm ướt và nhiệt độ thích hợp (20-25°C), gây bệnh cho lá và ngọn cây.
Các nhà khoa học trên thế giới đã tiến hành khảo nghiệm các loài bạch đàn nhằm chọn giống kháng bệnh Tại Úc, loài Eucalyptus pellita được phát hiện có khả năng kháng bệnh cháy lá do nấm Cylindrocladium reteaudii gây ra (Blum et al 1992) Ở Ấn Độ, Viện nghiên cứu Lâm nghiệp Kerala cũng tìm ra loài E brassiana kháng bệnh tương tự (Sharma et al 1999) Tại Brazil, bệnh loét thân bạch đàn do nấm Cryphonectria gây hại nghiêm trọng, nhưng dòng bạch đàn lai giữa E grandis và E urophylla cho thấy khả năng kháng bệnh rất cao (Old et al 2003) Ở Nam Phi, các dòng lai bạch đàn cũng được khảo nghiệm để tìm ra giống kháng bệnh loét thân do nấm.
Coniothyrium zuluense gây ra, kết quả chỉ ra các dòng lai giữa E grandis x E camaldulensis và E grandis x E urophylla có khả năng kháng bệnh rất cao
Nghiên cứu về bệnh hại bạch đàn lai ở Việt Nam đã được thực hiện từ nhiều năm trước, với một nghiên cứu quan trọng vào năm 2016 của Phạm Quang Thu, trong đó tổng hợp được 28 loài sinh vật gây bệnh Hai loài chính được xác định là Cryptosporiopsis eucalypti, gây bệnh đốm lá, và Calonectria quiqueseptata, gây bệnh cháy lá Cả hai loài nấm này cũng là những tác nhân gây hại chủ yếu trong các khu rừng trồng Bạch đàn trắng và Bạch đàn urô.
Bệnh đốm lá bạch đàn, do nấm C eucalypti gây ra, đã xuất hiện ở Việt Nam từ đầu những năm 1990 và thường xuyên xảy ra ở các rừng trồng bạch đàn, đặc biệt tại Đông Nam Bộ và miền Trung Theo nghiên cứu, khoảng 50% diện tích rừng bạch đàn tại Việt Nam bị ảnh hưởng bởi bệnh này với mức độ khác nhau Nấm C eucalypti được coi là một trong những loài nấm gây hại nguy hiểm nhất cho rừng bạch đàn, gây ra triệu chứng đốm lá, làm lá rụng và có thể dẫn đến sự khô héo của cành và ngọn Triệu chứng này xuất hiện ở hầu hết các loài bạch đàn, với tỷ lệ và mức độ bệnh khác nhau Bạch đàn trắng và một số dòng bạch đàn lai như U6, W5 thường bị bệnh nặng nhất ở những vùng có lượng mưa cao Nấm C eucalypti phát triển mạnh trên những khu vực có lượng mưa trung bình hàng năm cao.
Loài nấm này ảnh hưởng rõ rệt đến bạch đàn ở Việt Nam, đặc biệt tại các vùng ẩm ướt với nhiệt độ trung bình tháng trên 20°C và lượng mưa hàng năm vượt quá 2000 mm, thường xảy ra trong và sau mùa mưa (Booth et al 2000; Phạm Quang Thu 2005).
Nấm C eucalypti có đặc điểm nổi bật với quả thể hình chén màu nâu đen xuất hiện trên các tổ chức bị bệnh Quả thể này thường nằm sâu trong mô lá, nơi hình thành các đám bào tử vô tính có màu vàng nhạt hoặc trắng vàng Bào tử vô tính của nấm có hình dạng trứng, với một đầu bằng và một đầu hơi tròn Kích thước của bào tử nấm cũng là một yếu tố quan trọng trong việc nhận diện loài.
C eucalypti dao động tương đối lớn, đường kính bào tử giao động từ 2,34 –
7,02 àm, trong khi đú chiều dài bào tử giao động từ 7,02 – 21,06 àm Sợi nấm
C eucalypi lúc đầu có màu trắng, sau đó chuyển màu trắng ghi hoặc màu nâu trắng, một số mẫu chuyển màu nâu đen Sau khi sợi nấm phủ kín bề mặt đĩa Petri, môi trường chuyển từ màu trắng vàng (màu của môi trường PDA) sang màu nâu nhạt đến nâu đậm, một số mẫu chuyển sang màu nâu đen (Phạm Quang Thu 2005) Đã có một số công trình nghiên cứu khảo nghiệm để chọn ra các giống/dòng bạch đàn kháng bệnh đốm lá gây ra bởi nấm C eucalypti: Đề tài
Nghiên cứu chọn giống cây trồng kháng bệnh và có năng suất cao cho một số loài bạch đàn và keo đã được thực hiện trong giai đoạn 2001-2005 Tiếp theo, đề tài nghiên cứu chọn các dòng keo và bạch đàn chống chịu bệnh với năng suất cao cho trồng rừng kinh tế đã được triển khai từ năm 2006.
Năm 2010, 17 khu khảo nghiệm bạch đàn đã được thiết lập tại nhiều vùng trên cả nước như Đồng Nai, Bình Dương, Bình Phước, Huế và Vĩnh Phúc Qua quá trình nghiên cứu, các dòng bạch đàn trắng SM16, SM23, SM7, EF24, EF39 và EF55 đã được chọn lọc nhờ vào khả năng sinh trưởng nhanh và tính chống chịu bệnh Những dòng này đã được công nhận là giống tiến bộ kỹ thuật (Nguyễn Hoàng Nghĩa, 2010).
Nghiên cứu về việc chọn tạo giống Bạch đàn trắng (Eucalyptus camaldulensis) kháng bệnh đốm lá (Cryptosporiopsis eucalypti) đã thu được 60 chủng nấm bệnh, trong đó chủng DN1 có khả năng gây bệnh cao nhất Đề tài xác định được 2 mồi SSR (EMBRA28 và EMBRA45) cùng 5 mồi RAPD (UBC143, OPA15, OPD20, OPG13 và OPM02) có đoạn ADN phân ly liên quan đến tính trạng kháng bệnh đốm lá Ba chỉ thị phân tử KBCr1, KBCr3 và KBCr6 được chọn vì có liên kết gần với locus kháng bệnh, với khoảng cách lần lượt là 6,2 cM, 15,5 cM và 5,8 cM Quy trình sử dụng chỉ thị phân tử để xác định các dòng/cây Bạch đàn trắng kháng bệnh đốm lá đã được xây dựng (Trần Thanh Trăng 2012).
Kết quả đánh giá tình trạng bệnh đốm lá ở một số dòng bạch đàn tại Phú Thọ cho thấy 16 trong 18 dòng bạch đàn từ tuổi 2 bị bệnh cháy lá, đốm lá và khô chồi ngọn với mức độ khác nhau Dòng PN14 và U6 có sinh trưởng kém nhất và bị bệnh nặng nhất, với PN14 có tỷ lệ bị bệnh 100% và mức độ bệnh dao động từ 2 - 4 Dòng U6 tuổi 3 tại Phù Ninh cũng ghi nhận tỷ lệ bệnh 100% với mức độ rất nặng 3,86 Trong số các dòng, có bốn dòng bị bệnh trung bình và mười dòng bị bệnh nhẹ, trong khi dòng TTKT7 tuổi 2 tại xã Bảo Thanh và dòng PN10 tuổi 4 tại xã Trạm Thản chưa ghi nhận bị bệnh (Trần Anh Tuấn et al 2022).
Nghiên cứu về phòng trừ bệnh đốm lá bạch đàn đã chỉ ra rằng hai loại thuốc hóa học Zineb và Chlorothalonil có khả năng ức chế nấm gây bệnh hiệu quả Ngoài ra, các loại thuốc sinh học như Cytosinpeptidemycin từ xạ khuẩn và Oligo chitosan từ xác động vật cũng cho thấy khả năng chống lại nấm C eucalypti Bên cạnh đó, nghiên cứu còn xác định được bốn giống bạch đàn tiềm năng là DH32-29, H1, PN108 và một giống khác.
PN3d có khả năng chống chịu rất mạnh với nấm C eucalypti và 8 giống (DH32-
Các giống cây trồng 13, NC3, PNCTW, DH32-26, DH32-27, QY23, U16 và PN24 thể hiện khả năng chống chịu tốt, trong khi hai giống PN52 và U6 lại nhạy cảm với bệnh đốm lá (Bùi Đức Giang et al 2021).
MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 Mục tiêu nghiên cứu
Mục tiêu tổng quát
Chọn lọc các chủng nấm nội sinh có khả năng kháng nấm gây bệnh cho cây bạch đàn lai là nền tảng quan trọng để phát triển chế phẩm vi sinh vật và thuốc bảo vệ thực vật sinh học.
Mục tiêu cụ thể
Phân lập được các chủng nấm nội sinh cây bạch đàn lai
Tuyển chọn được một số chủng nấm nội sinh có hoạt tính kháng nấm
Cryptosporiopsis eucalypti gây bệnh đốm lá bạch đàn lai
Xác định được tên loài cho một số chủng nấm nội sinh tiềm năng.
Nội dung nghiên cứu
Phân lập các chủng nấm nội sinh từ cây bạch đàn lai
Sàng lọc các chủng nấm nội sinh có hoạt tính kháng nấm
Cryptosporiopsis eucalypti là một loại nấm nội sinh có khả năng ức chế các nấm gây bệnh Nghiên cứu này đánh giá hiệu lực của dịch nuôi cấy nấm nội sinh trong việc ngăn chặn sự phát triển của nấm gây bệnh Đồng thời, việc định danh các chủng nấm nội sinh với hoạt tính kháng nấm cũng được thực hiện để xác định tiềm năng ứng dụng trong nông nghiệp.
Vật liệu, hóa chất, các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
Các chủng nấm nội sinh mới được phân lập từ cây bạch đàn lai đã được thuần khiết và bảo quản trong phòng thí nghiệm tại Trung tâm Nghiên cứu Bảo vệ rừng.
Chủng nấm Cryptosporiopsis eucalypti gây bệnh đốm lá bạch đàn lai được Trung tâm Nghiên cứu Bảo vệ rừng cung cấp
2.3.2 Hóa chất, thiết bị, dụng cụ
Các hóa chất dùng để phân lập và nuôi cấy nấm trong nghiên cứu tại Trung tâm Nghiên cứu Bảo vệ rừng, Viện Khoa học Lâm nghiệp, là những hóa chất phổ biến và thông dụng, được lưu trữ và bảo quản cẩn thận trong phòng thí nghiệm.
The extraction of DNA and the execution of PCR reactions for fungal strains involve the use of the Quick-DNA Fungal/Bacterial Miniprep kit from Zymo Research (USA) and e-Tag DNA polymerase from SolGent (South Korea).
Trong nghiên cứu, các thiết bị được sử dụng bao gồm tủ cấy, tủ định ôn, tủ lạnh, máy lắc ổn nhiệt, nồi hấp khử trùng, máy đo pH, cân điện tử, cùng hệ thống máy móc để tách DNA nấm và thực hiện phản ứng PCR, lò vi sóng, bếp điện và kính hiển vi quang học, tất cả đều có sẵn tại Trung tâm Nghiên cứu Bảo vệ rừng, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam.
Trong công tác nghiên cứu, các dụng cụ thiết yếu bao gồm ống nghiệm, ống Eppendorf, ống Falcon, giá đựng ống nghiệm, đũa thủy tinh, que cấy, pipet thường, pipetman, cốc đong, bình tam giác với nhiều dung tích khác nhau, đĩa Petri, đèn cồn và một số dụng cụ hỗ trợ khác Những công cụ này đóng vai trò quan trọng trong việc thực hiện thí nghiệm và phân tích kết quả.
Đối tượng, phạm vi nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu của đề tài là các chủng nấm nội sinh phân lập được từ các cây bạch đàn lai trên rừng trồng tại tỉnh Phú Thọ.
Phương pháp nghiên cứu
2.5.1 Phương pháp phân lập các chủng nấm nội sinh từ cây bạch đàn lai
Tiến hành khảo sát thực địa tại các khu rừng trồng bạch đàn lai ở Phú Thọ nhằm đánh giá tình hình bệnh hại, đặc biệt là bệnh đốm lá Các cây bạch đàn lai được chọn ngẫu nhiên, bao gồm cả cây khỏe mạnh và cây có triệu chứng bệnh, với 20 cây chủ được lựa chọn để thu mẫu Mẫu lá ở giai đoạn bánh tẻ và cành non được thu bằng kéo cắt cành, sau đó được bảo quản trong túi nilon tiệt trùng ở nhiệt độ 4 độ C.
Để xử lý các mẫu bạch đàn lai trước khi phân lập, chúng tôi đã thực hiện theo phương pháp của Nguyễn Mạnh Hà et al (2020) và Đặng Như Quỳnh et al (2023) Các mẫu lá và cành non được rửa sạch dưới vòi nước, sau đó khử trùng bề mặt bằng dung dịch NaOCl 2% trong 3 phút, tiếp theo là dung dịch ethanol 70% trong 1 phút, và rửa lại bằng nước cất tiệt trùng ba lần, mỗi lần 15 giây Sau khi khử trùng, mẫu được làm khô và cắt nhỏ (5 x 5 mm cho lá, dài 5 mm cho cành non) bằng dụng cụ vô trùng, rồi đặt lên đĩa thạch PDA có kháng sinh (100 mg/L streptomycin) Các đĩa thạch được ủ ở 25°C trong 7 đến 10 ngày cho đến khi hệ sợi nấm xuất hiện Nấm nội sinh được thuần hóa bằng cách cấy đỉnh sinh trưởng hoặc cấy đơn bào tử sang đĩa thạch PDA mới, thực hiện nhiều lần cấy truyền cho đến khi thu được chủng nấm hoàn toàn thuần khiết Các chủng nấm thuần khiết được mã hóa và bảo quản trong ống thạch nghiêng.
4 o C để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo
2.5.2 Phương pháp sàng lọc các chủng nấm nội sinh có hoạt tính kháng nấm gây bệnh
Hoạt tính kháng nấm gây bệnh của các chủng nấm nội sinh được sàng lọc theo phương pháp nuôi cấy đối kháng trên môi trường PDA (Nguyễn Mạnh
Nghiên cứu của Hà et al (2020) đã thực hiện thí nghiệm cấy các chủng nấm nội sinh và nấm gây bệnh trên đĩa thạch PDA, với đối chứng là đĩa thạch không chứa nấm nội sinh Các đĩa thạch được ủ ở nhiệt độ 25°C và theo dõi sự phát triển của sợi nấm gây bệnh trong vòng 10 ngày Đường kính sinh trưởng của hệ sợi nấm gây bệnh trên các đĩa thí nghiệm và đối chứng được đo lường, với mỗi chủng nấm nội sinh được thử nghiệm lặp lại 5 lần Hiệu quả ức chế sự phát triển của nấm gây bệnh bởi nấm nội sinh được tính toán theo công thức cụ thể.
Trong đó: MGI là hiệu lực ức chế sự phát triển hệ sợi của nấm gây bệnh;
R là bán kính xuyên tâm hệ sợi nấm gây bệnh ở đĩa đối chứng (mm); r là bán kính xuyên tâm hệ sợi nấm gây bệnh ở đĩa thử nghiệm (mm)
2.5.3 Phương pháp đánh giá hiệu lực ức chế nấm gây bệnh của dịch nuôi cấy nấm nội sinh
Hiệu lực ức chế nấm gây bệnh của dịch nuôi cấy nấm nội sinh được đánh giá thông qua phương pháp thử nghiệm dịch lọc nuôi cấy, theo nghiên cứu của Nguyễn Mạnh Hà và cộng sự.
Các chủng nấm nội sinh tiềm năng đã được nuôi cấy trong môi trường lỏng PDB trong 2 tuần ở 25 oC với tốc độ lắc 150 vòng/phút, cho thấy hiệu quả ức chế cao đối với nấm gây bệnh Sau đó, dung dịch huyền phù được lọc qua màng lọc 0,45 µm Dịch lọc này được phối trộn với môi trường PDA theo tỉ lệ 1:1 sau khi PDA đã được hấp khử trùng và để nguội.
Để tiến hành thí nghiệm, bổ sung 100mg/L streptomycin sulfate vào hỗn hợp dung dịch ở nhiệt độ 50 o C trước khi chuyển vào đĩa Petri Đối với công thức đối chứng, dịch lọc nuôi cấy nấm được thay thế bằng nước cất tiệt trùng Sau đó, cấy các chủng nấm gây bệnh vào giữa các đĩa thạch và ủ ở 25 o C trong 10 ngày Mỗi chủng nấm nội sinh được thử nghiệm với 5 lần lặp lại để đánh giá hiệu lực ức chế sự phát triển hệ sợi của nấm gây bệnh bởi dịch lọc nuôi cấy của nấm nội sinh.
2.5.4 Phương pháp định danh các chủng nấm nội sinh có hoạt tính kháng nấm gây bệnh
Nuôi cấy các chủng nấm nội sinh trên môi trường PDB và lọc dung dịch nuôi cấy qua màng Miracloth giúp thu hệ sợi nấm và tách chiết ADN Để giám định hoạt tính kháng nấm của các chủng nấm nội sinh, chúng tôi sử dụng kết quả giải trình tự gen internal transcribed spacer (ITS) Bộ gen của nấm được tách chiết bằng bộ kit Quick-DNA Fungal/Bacterial Miniprep từ Zymo Research, Mỹ, và sau đó khuếch đại trình tự bằng phản ứng PCR với cặp mồi phù hợp.
PCR được thực hiện với các mồi ITS1F (CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA) và ITS4 (TCCTCCGCTTATTGATATGC) trên thiết bị C1000 Touch TM Thermal Cycler (Bio-Rad, Mỹ) Chương trình nhiệt được thiết lập với pha biến tính ở 95 o C trong 3 phút, sau đó là 35 chu kỳ, bao gồm giai đoạn biến tính ở 95 o C trong 1 phút và giai đoạn bắt cặp của các mồi.
58 o C trong 30 giây và giai đoạn kéo dài đoạn khuếch đại ở 72 o C trong 1 phút
Quá trình khuếch đại DNA diễn ra trong 30 giây ở nhiệt độ 72 oC trong 10 phút Sản phẩm PCR sau đó được điện di trên gel agarose 1% và được giải trình tự bằng kỹ thuật Sanger Các chuỗi ADN hoàn chỉnh sẽ được so sánh với cơ sở dữ liệu GenBank tại NCBI (https://ncbi.nlm.nih.gov) thông qua giao diện tìm kiếm BLAST.
2.5.5 Phương pháp phân tích, xử lý số liệu
Hiệu lực ức chế nấm gây bệnh của các chủng nấm nội sinh được đánh giá thông qua phương pháp phân tích thống kê ANOVA, kết hợp với hàm hậu kiểm định Tukey để so sánh các giá trị trung bình Dữ liệu được xử lý bằng phần mềm SPSS phiên bản 27.