Nghiên cứu tạo chế phẩm vi sinh dạng lỏng kích thích sinh trưởng thực vật

Xác định thành phần môi trường đồng nuôi cấy thích hợp cho các chủng vi khuẩn sinh trưởng và sinh chất kích thích sinh trưởng thực vật .... Xác định thành phần môi trường đồng nuôi cấy t

TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

Giới thiệu về một số nhóm vi sinh vật ứng dụng trong sản xuất phân vi sinh

1.1.1 Khái niệm chung về vi sinh vật

Vi sinh vật là những sinh vật có kích thước rất nhỏ, bao gồm vi khuẩn, virus, nấm, tảo và động vật nguyên sinh, có thể là đơn bào hoặc đa bào, nhân sơ hoặc nhân thực Chúng chỉ có thể được quan sát qua kính hiển vi (Nguyễn Lân Dũng, 2010).

Bacillus là trực khuẩn Gram dương, tế bào hình que thẳng, kích thước 0,5

– 2,5 àm x 1,2 – 10 àm và thường được xếp thành từng cặp hoặc chuỗi, cú đầu tròn (Huỳnh Ngọc Thanh Tâm và Huỳnh Văn Thịnh, 2020)

Năm 2019, kết quả nghiên cứu của Hoàng Kim Toản và cộng sự cho thấy

Bacillus sp làm tăng tỷ lệ nảy mầm của hạt, tăng chiều cao cây, tăng số lượng nốt sần và tăng năng suất thực thu (26,8%)

Bacillus licheniformis và Bacillus velezensis, được thu hồi từ đất vùng rễ của đồng bằng sông Hằng Ấn Độ, đã chứng minh khả năng tăng cường đáng kể chỉ số năng suất của cây lúa Điều này cho thấy các chủng vi khuẩn này có tiềm năng lớn để phát triển thành chế phẩm hoặc phân bón sinh học, nhằm nâng cao năng suất lúa trong điều kiện đồng ruộng tại Uttar Pradesh, Ấn Độ (Devi et al., 2023).

Nghiên cứu của Ajuna và cộng sự (2023) đã chỉ ra rằng các enzyme thủy phân từ các loại Bacillus như chitinase, β-1,3-glucanase, protease, lipase, amylase và cellulase có tiềm năng lớn trong việc kiểm soát sinh học các mầm bệnh thực vật và côn trùng gây hại.

Nghiên cứu của Karthika (2020) đã chỉ ra rằng Bacillus cereus có khả năng ức chế hiệu quả mầm bệnh Fusarium oxysporum và Alternaria solani, hai loại mầm bệnh gây hại cho cây cà chua, với Fusarium oxysporum gây bệnh héo rũ và Alternaria solani gây bệnh đốm vòng.

Bacillus subtilis là một vi khuẩn có khả năng thúc đẩy sự phát triển của thực vật và bảo vệ đậu phộng khỏi bệnh thối rễ do Fusarium spp gây ra (Li et al., 2023).

Azotobacter sp là một loại vi khuẩn hiếu khí, sống tự do trong đất và không sinh bào tử, thuộc nhóm Gram âm Khi còn non, tế bào có hình dạng que với kích thước khoảng 2,0 – 7,0 x 10 – 2,5 µm, thường đứng riêng lẻ hoặc xếp thành từng đụn chồng chất và có khả năng di động Tuy nhiên, khi trưởng thành, tế bào Azotobacter mất khả năng di động, kích thước thu nhỏ lại và chuyển sang hình dạng giống như hình cầu.

Azotobacter, theo nghiên cứu của Theo Hindersah và cộng sự (2020), có khả năng thúc đẩy sự sinh trưởng của thực vật và thường được sử dụng làm phân bón sinh học, chất kích thích sinh học và chất bảo vệ sinh học Loại vi khuẩn này kích thích sự phát triển của thực vật thông qua việc tổng hợp các hormone thực vật như IAA, cytokinins và gibberellins.

Azotobacter là sản sinh exopolysaccharide và bảo vệ thực vật.

Phân bón vi sinh vật

1.2.1 Khái niệm phân bón vi sinh vật

Phân bón vi sinh vật là chế phẩm chứa mật độ vi sinh vật hữu ích đạt trên

Phân vi sinh chứa ít nhất 10^6 CFU/g, được sản xuất từ vi sinh vật có khả năng tạo ra các chất dinh dưỡng thiết yếu như N, P, K cho cây trồng Quá trình hoạt động của các vi sinh vật này trong đất giúp nâng cao năng suất và chất lượng nông sản Đặc biệt, phân vi sinh đảm bảo an toàn cho con người, động vật và môi trường, không gây tác động tiêu cực nào.

Bảng 1.1 Một số giống vi sinh vật sử dụng trong sản xuất phân vi sinh ở

Việt Nam (Nguyễn Minh Hưng, 2007)

Giống vi sinh vật Hoạt tính sinh học chính Số loài sử dụng trong sản xuất

Acetobacter Cố định nitơ tự do 2

Achromobacter Hòa tan lân khó tan 2

Aerobacter Cố định nitơ tự do 2

Agrobacterium Hòa tan lân khó tan, kích thích sinh trưởng 2

Anthobacter Kích thích sinh trưởng 2

Aspergillus Hòa tan lân khó tan 2

Azospirillum Cố định nitơ tự do 2

Azotobacter Cố định nitơ tự do 4

Azotomonas Cố định nitơ tự do 2

Bacillus Cố định nitơ tự do 2

Bacillus Hòa tan lân khó tan 4

Clostridium Cố định nitơ tự do 3

Chlorobium Cố định nitơ tự do 2

Frankia Cố định nitơ tự do 2

Flavobacterium Kích thích sinh trưởng 2

Klebsilla Cố định nitơ tự do 2

Methanobacterium Cố định nitơ tự do 2

Pseudomonas Cố định nitơ tự do 2

Pseudomonas Hòa tan lân khó tan 4

Penicillium Hòa tan lân khó tan 2

Rhizobium Cố định nitơ tự do 300

Rhodospirillum Cố định nitơ tự do 4

Pisolithus Cố định nitơ tự do 6

Serratia Hòa tan lân khó tan 2

1.2.2 Tác dụng của phân vi sinh

Phân bón vi sinh chứa các vi sinh vật hữu ích và cung cấp mùn hữu cơ cho đất, giúp bổ sung lượng mùn đã bị khoáng hóa Nhờ đó, phân bón vi sinh hỗ trợ đất duy trì các đặc tính lý, hóa và sinh học tốt nhất.

Phân bón vi sinh chứa các chất dinh dưỡng được chiết xuất từ nguyên liệu hữu cơ, đồng thời cũng được tổng hợp và chuyển hóa nhờ hoạt động của các vi sinh vật cố định đạm và vi sinh vật chuyển hóa lân Những vi sinh vật này được cấy vào sản phẩm trong quá trình sản xuất, góp phần nâng cao hiệu quả dinh dưỡng cho cây trồng.

Phân hữu cơ vi sinh đóng vai trò quan trọng trong việc tăng cường thành phần mùn hữu cơ trong đất, nhờ vào sự hoạt động của các vi sinh vật phân giải cellulose.

Việc sử dụng nguyên liệu hữu cơ dư thừa và công nghệ sinh học để sản xuất phân bón sẽ giúp giảm thiểu ô nhiễm môi trường, đồng thời tận dụng nguồn tài nguyên sẵn có một cách hiệu quả.

1.2.3 Chế phẩm phân vi sinh dạng lỏng Ở Việt Nam, năm 2022, Nguyễn Thanh Ngân và Ngô Thanh Phong nghiên cứu tạo chế phẩm nitơ sinh học lỏng chứa vi khuẩn Burkholderia kururiensis có khả năng cung cấp 50% lượng nitơ hóa học cần thiết cho sinh trưởng, phát triển và tăng năng suất lúa

Trên thị trường phân vi sinh dạng lỏng toàn cầu hiện nay, một số chế phẩm nổi bật bao gồm phân bón Bio Gold lỏng, được chế tạo từ các chủng vi sinh vật đặc biệt.

Azotobacter chroococcum và Rhizobbacteria là hai loại vi khuẩn có khả năng thúc đẩy sinh trưởng thực vật hiệu quả (Công ty Bio Power Lanka, Sri Lanka) Phân bón Bio Phos dạng lỏng, chứa vi khuẩn hòa tan phospho Bacillus megaterium, được sản xuất bởi Công ty Indogulf bioag, Ấn Độ Phân bón Revive (Bio.,) là sản phẩm dựa trên các chủng vi khuẩn cố định đạm như Azotobacter chroococcum, Acetobacter aurantius, và Bacillus megaterium var phosphaticum từ Công ty Nico Orgo, Hoa Kỳ Ngoài ra, phân tổng hợp K-Sol chứa B coagulans, trong khi phân bón P-Sol là loại phân hòa tan phosphate với Bacillus megaterium và Bacillus coagulans Cuối cùng, phân bón N-Fix chuyên dụng cho việc cố định đạm chứa A chroococcum và Azospirillum lipoferum (Allouzi et al., 2022).

1.2.4 Tình hình sản xuất, sử dụng phân vi sinh trên thế giới và ở Việt Nam 1.2.4.1 Trên thế giới

Phân bón vi sinh đầu tiên, mang tên Nitragin, được sản xuất bởi Noble Hiltner tại Đức vào năm 1896 và sau đó được phát triển tại nhiều quốc gia khác như Mỹ (1896), Canada (1905), Nga (1907), Anh (1910) và Thụy Điển (1914) Nhiều quốc gia trên thế giới đã nghiên cứu và áp dụng phân bón vi sinh trong nhiều năm để nâng cao năng suất cây trồng và bảo vệ môi trường.

Năm 2020, việc kết hợp phân bón vi sinh và hữu cơ đã giúp cải thiện chất lượng đất đen ở Trung Quốc, giảm mật độ khối đất và tăng năng suất cây trồng (Qu et al., 2020) Đến năm 2021, phân bón vi sinh hỗn hợp đã chứng minh khả năng tăng chiều cao, số lượng quả và năng suất xơ vải tại vùng bông Tân Cương, nơi sản xuất bông lớn nhất Trung Quốc (Bo et al., 2021) Năm 2023, nghiên cứu của GAN và cộng sự đã chỉ ra rằng phân bón vi sinh có thể tăng năng suất hạt ngô trung bình 13% ở Trung Quốc, bất chấp các yếu tố biến động như khí hậu và điều kiện đất đai.

Năm 2017, Sednev đã ứng dụng Bacillus megatherium var Phosphatcum để sản xuất phân bón vi sinh, nhằm nâng cao khả năng cung cấp photpho cho cây trồng và hoạt động của phosphatase Chế phẩm này đã được sử dụng phổ biến tại Liên Xô và các nước Đông Âu cho cây lúa mì, ngô và lúa nước, mang lại kết quả tăng sản lượng từ 5-10% so với đối chứng.

Hiện nay, Việt Nam đang bảo tồn và lưu trữ hơn 10.000 chủng vi sinh vật tại các cơ sở như Bảo tàng giống vi sinh vật VTCC và Viện Công nghệ thực phẩm.

Hà Nội, Viện Bảo vệ thực vật, Viện Thổ nhưỡng Nông hóa,…

Các chủng vi sinh vật quan trọng trong sản xuất phân bón tại Việt Nam bao gồm vi sinh vật kích thích sinh trưởng thực vật như Pseudomonas fluorescens và Azotobacter chroococcum, cùng với các vi sinh vật cố định đạm như Rhizobium (R leguminosarum), Bradyrhizobium (B jaoinicum) và Frankia Những vi sinh vật này đóng vai trò then chốt trong việc cải thiện năng suất cây trồng và tăng cường sức khỏe đất.

(F.alni), Azotobacter (A.chroococcum, A.vinelendii), Azospirillum (A.lipoferum); vi sinh vật hòa tan lân khó tan: Bacillus megaterium, B.circulans, B subtilis,…

Hầu hết vi sinh vật dùng để sản xuất phân vi sinh gắn liền với rễ cây và vùng đất xung quanh Phân hữu cơ vi sinh Bioroot đã được nghiên cứu và ứng dụng tại vùng rau chuyên canh Long An từ năm 2012 đến 2015, trong khuôn khổ đề tài “Xây dựng mô hình sản xuất rau an toàn đạt chứng nhận VietGAP” tại ba huyện Cần Đước, Cần Giuộc và Đức Hòa.

1.2.5 Nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn Bacillus và Azotobacter trong sản xuất phân vi sinh

1.2.5.1 Ứng dụng vi khuẩn Bacillus và Azotobacter trong sản xuất phân vi sinh sinh chất kích thích sinh trưởng ở thực vật

Năm 1997, Malik và cộng sự đã sử dụng các vi khuẩn Bacillus,

Azotobacter, Azospirillium, Acetobacter và Pseudomonas đã được nghiên cứu trên cây lúa nước, cho thấy rằng sự hiện diện của các vi khuẩn này giúp cây lúa phát triển tốt hơn so với nhóm đối chứng Ngoài ra, khả năng tổng hợp IAA của chúng cũng thúc đẩy sự phát triển của rễ, giúp cây dễ dàng hấp thụ nước và chất khoáng hơn.

Các nghiên cứu sản xuất sinh khối vi sinh vật bằng phương pháp đồng nuôi cấy các chủng vi sinh vật

Đồng nuôi cấy các vi sinh vật với khả năng trao đổi chất đa dạng, như sản xuất hormone thực vật, cố định nitơ và sử dụng photpho, có thể cải thiện khả năng sinh trưởng và phát triển của thực vật, đồng thời tăng cường khả năng bảo vệ chống lại mầm bệnh (Bagheri et al., 2022).

Phương pháp nuôi cấy đơn chủng không phải là lựa chọn tối ưu cho sản xuất chế phẩm phân bón với nhiều chủng vi sinh vật (VSV) do những nhược điểm như phải thực hiện nhiều mẻ nuôi, sử dụng nhiều loại môi trường và thiết bị lên men, dẫn đến tăng chi phí và thời gian Việc đồng nuôi cấy các chủng VSV có khả năng tương thích có thể khắc phục những nhược điểm này, đồng thời kích thích sự tương tác giữa các VSV, giúp chuyển hoá vật chất qua các con đường trao đổi chất mới, từ đó nâng cao năng lực sinh học của chúng.

Quá trình đồng nuôi cấy vi sinh vật (VSV) có thể được áp dụng hiệu quả trong sản xuất chế phẩm vi sinh cho xử lý sinh học, như phân bón vi sinh và chế phẩm xử lý môi trường Việc này yêu cầu sự tác động hiệp đồng của các VSV để xử lý các thành phần phức tạp trong tự nhiên, bao gồm nguồn gốc hữu cơ và vô cơ Tuy nhiên, để đảm bảo hiệu quả của quá trình đồng nuôi cấy, cần xem xét nhiều yêu cầu đặc biệt, như tối ưu hóa điều kiện môi trường và phi sinh học (pH, oxy hòa tan, ) nhằm tránh sự cạnh tranh giữa các loài vi sinh vật và ngăn chặn sự phát triển quá mức của một loài so với các loài khác.

Rojas và cộng sự (2001) đã cho thấy khi sử dụng hỗn hợp vi khuẩn

Phyllobacter sp (vi khuẩn cố định N2) và Bacillus licheniformis (vi khuẩn hòa tan phosphate) đã cho thấy sự gia tăng đáng kể trong khả năng cố định nitơ và độ hòa tan phosphate so với các mẫu nuôi riêng lẻ Khi cấy rừng ngập mặn nhân tạo, hỗn hợp vi khuẩn này hoạt động hiệu quả hơn, dẫn đến sự phát triển mạnh mẽ hơn của lá.

Trong một thí nghiệm chậu do El-Komy (2005) thực hiện, cây lúa mì được cấy Bacillus megaterium và Azospirillum lipoferum dưới dạng cấy đơn lẻ và hỗn hợp Kết quả cho thấy, lúa mì được cấy hỗn hợp có trọng lượng khô của chồi cao hơn, đồng thời năng suất nitơ tổng số và hàm lượng phospho trong chồi cũng tăng đáng kể.

37 và 53% so với cây được cấy đơn lẻ A lipoferum

Bagheri et al., 2022 nhấn mạnh rằng việc đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn

Azospirillum oryzae và Bacillus velezensis, hai loại vi khuẩn thúc đẩy sinh trưởng, đã cải thiện khả năng sản xuất IAA, phân giải phosphate và hoạt động của enzyme, từ đó nâng cao sự phát triển của cây trồng Sự kết hợp các vi khuẩn này cho thấy tính hiệu quả cao hơn so với việc sử dụng từng loại vi khuẩn riêng lẻ.

Vào năm 2023, Octarya đã tiến hành đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn Bacillus paramycoides và Aspergillus fumigatus trong môi trường lỏng nhằm kiểm tra hoạt tính kháng nấm Kết quả cho thấy dịch lên men từ sự đồng nuôi cấy này đạt được hoạt tính kháng nấm cao nhất.

Arashida và cộng sự (2019) đã tiến hành nghiên cứu cho thấy việc đồng nuôi cấy Rhodopseudomonas palustris với Bacillus subtilis trong môi trường thiếu nitơ dẫn đến sự xuất hiện của quá trình cố định đạm trong điều kiện hiếu khí.

MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Mục tiêu nghiên cứu

Chế phẩm vi sinh vật đa chủng dạng lỏng đã được phát triển và bước đầu xác định ảnh hưởng của nó đến sự sinh trưởng và phát triển của một số loài thực vật trong giai đoạn nảy mầm hạt và giai đoạn cây con trong bầu đất.

Nội dung nghiên cứu

Xác định khả năng đối kháng lẫn nhau của các chủng vi khuẩn

Xác định môi trường đồng nuôi cấy thích hợp để các chủng trong tổ hợp vi khuẩn

Lên men sản xuất sinh khối vi khuẩn ở qui mô pilot tạo chế phẩm vi sinh dạng lỏng

Chế phẩm vi sinh dạng lỏng có ảnh hưởng tích cực đến khả năng nảy mầm của hạt và sự sinh trưởng của cây con trong giai đoạn trồng trong bầu đất Việc sử dụng chế phẩm này giúp cải thiện độ ẩm và dinh dưỡng của đất, từ đó thúc đẩy quá trình nảy mầm và phát triển của cây con Nghiên cứu cho thấy rằng các vi sinh vật có lợi trong chế phẩm không chỉ tăng cường sức sống của hạt giống mà còn nâng cao khả năng chống chịu của cây con trước các điều kiện bất lợi.

Vật liệu nghiên cứu

Các chủng vi sinh vật của phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh – Hóa sinh, Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, trường Đại học Lâm nghiệp, gồm

- Ba chủng Bacillus sp gồm: Bacillus subtilis Bs2; Bacillus megaterium Bm12; Bacillus licheniformis Bl8 đã được xác định có khả năng sinh enzyme ngoại bào (cellulase, amylase, pectinase, protease)

Chủng Azotobacter AZT7, khi được nuôi cấy trong môi trường Ashby lỏng, có khả năng sinh ra IAA với nồng độ 12,87 µg/ml, đồng thời cố định 3,32 mg/l nitơ và sản sinh enzyme phân giải lân với hoạt tính phosphatase.

Các chủng VSV sử dụng trong nghiên cứu đã được định danh bằng sinh học phân tử và xác định một số đặc tính sinh hóa

2.3.2 Hóa chất, thiết bị, dụng cụ

Trong phòng thí nghiệm của Bộ môn Vi sinh – Hóa sinh, Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, trường Đại học Lâm nghiệp, các hóa chất, thiết bị và dụng cụ được sử dụng chủ yếu là sản phẩm từ Việt Nam, Trung Quốc, Đức, Pháp và Mỹ.

Các hóa chất khác: bột đậu tương, cám ngô, cám gạo, mật rỉ đường,….

Các môi trường dùng trong nghiên cứu

Bảng 2.1 Môi trường LB để nuôi cấy, giữ giống

Bảng 2.2 Môi trường Ashby manitol agar

Bảng 2.3 Môi trường King’B lỏng để lên men nhân sinh khối các chủng vi khuẩn

Bảng 2.4 Môi trường Nutrients Browrh để lên men nhân sinh khối các chủng vi khuẩn

Bảng 2.5 Môi trường bột đậu tương để lên men nhân sinh khối các chủng vi khuẩn

Bảng 2.6 Môi trường 1 để lên men thể tích 20L

Nước cất Dẫn đến 1 lít pH = 6,5 – 7

Bảng 2.7 Môi trường 2 để lên men thể tích 20L

Nước cất Dẫn đến 1 lít pH = 6,5 – 7

Bảng 2.8 Môi trường 3 để lên men thể tích 20L

Nước cất Dẫn đến 1 lít pH = 6,5 – 7

Phương pháp nghiên cứu

2.5.1 Xác định khả năng đối kháng nhau của các chủng vi khuẩn

Các chủng vi khuẩn được sử dụng làm giống trong nghiên cứu cần phải được kiểm tra độ thuần và xác định các đặc điểm hình dạng khuẩn lạc cũng như hình dạng tế bào khi nuôi cấy trên cùng một loại môi trường.

Xác định khả năng đối kháng lẫn nhau của các chủng vi khuẩn:

Phương pháp cấy kẻ vạch trên đĩa petri với môi trường LB agar được sử dụng để xác định sự đối kháng giữa các chủng vi sinh vật Nghiên cứu của Johnson et al (1959) đã chỉ ra rằng phương pháp này hiệu quả trong việc phát hiện mối quan hệ cạnh tranh giữa các chủng vi khuẩn.

Nghiên cứu đã tiến hành đánh giá hoạt tính đối kháng lẫn nhau của các chủng VSV bằng phương pháp kẻ vạch trên đĩa thạch (3 chủng trong 1 đĩa)

2.5.2 Xác định thành phần môi trường đồng nuôi cấy thích hợp cho các chủng vi khuẩn sinh trưởng và sinh chất kích thích sinh trưởng thực vật

Trong sản xuất phân bón đa chủng, có hai phương pháp chính: đầu tiên là nuôi cấy đơn chủng qua nhiều mẻ, sau đó trộn đều các dịch nuôi cấy chứa vi sinh vật đơn chủng vào một giá thể để tạo ra chế phẩm Phương pháp thứ hai là đồng nuôi cấy nhiều chủng vi sinh vật trong cùng một môi trường.

Thí nghiệm đồng nuôi cấy các chủng VSV được thực hiện theo phương pháp của Okolie và cộng sự (2018)

Các chủng B subtilis Bs2, B licheniformis Bl8, B megaterium Bm1 và

Azotobacter AZT7 trên môi trường LB agar được nhân sinh khối riêng rẽ trong môi trường LB lỏng trong 24h, ở nhiệt độ thích hợp cho từng chủng: các chủng

Bacillus sp nuôi ở 37°C, chủng Azotobacter AZT7 nuôi ở 30°C

Sau 24 giờ nuôi cấy, mật độ tế bào của mỗi chủng đạt giá trị OD600nm từ 0,6 đến 0,8, được sử dụng làm dịch giống vi khuẩn để cấy vào các công thức môi trường đồng nuôi cấy.

Dịch sinh khối riêng rẽ của từng chủng được sử dụng làm giống để cấy vào các công thức môi trường đồng nuôi cấy trong nghiên cứu (MT1, MT2 và MT3) Tỷ lệ dịch giống của mỗi chủng được áp dụng với ba nghiệm thức tương ứng cho mỗi môi trường là 0,5%, 1% và 2%.

Các công thức môi trường dinh dưỡng lỏng có nồng độ khoáng chất gồm:

- MT1: môi trường King’B: Peptone 20g/l; K2HPO4 1,5g/l; MgSO4

- MT2: Glucose 5g/l; bột đậu tương 10g/l; K2HPO4 2g/l; MgSO4.7H2O 1g/l; NaCl 1g/l; CaCl2 0,05g/l

- MT3 (Môi trường Nutrients Browth cải tiến): Peptone 5g/l; Cao nấm men 2g/l; NaCl 5g/l; K2HPO4 1g/l; MgSO4.7H2O 0,5g/l; Glycerol 5ml/l

Môi trường đồng nuôi cấy vô trùng được chứa trong các bình tam giác 250 ml Sau khi cấy tổ hợp 4 chủng vi khuẩn, các bình này được đặt trong máy lắc với tốc độ 150 vòng/phút và nhiệt độ 28°C trong 72 giờ.

Sau 72 giờ nuôi cấy, các bình chứa sinh khối vi sinh vật được thu thập để xác định mật độ tế bào của từng chủng vi khuẩn trong tổ hợp Đồng thời, nồng độ IAA và hoạt tính enzyme ngoại bào như cellulase và amylase cũng được phân tích trong dịch nuôi cấy.

2.5.2.1 Xác định mật độ tế bào

Sau 2 tuần, tiến hành đánh giá sự tồn tại tế bào của từng chủng vi sinh vật trong chế phẩm bằng kỹ thuật phân lập trở lại các chủng vi sinh vật sau khi pha loãng tới hạn và cấy trải trên môi trường LB agar

- Xác định số lượng tế bào tương ứng với từng loại VSV theo công thức:

Trong đó: N: số tế bào trong 1 ml dịch mẫu

C: Tổng số khuẩn lạc đến trên các đĩa n: Số lượng đĩa đếm

V: Thể tích dịch mẫu (ml) cho vào mẫu đĩa f: Độ pha loãng

2.5.2.2 Xác định khả năng sinh IAA Để xác định hàm lượng IAA được sinh ra, hút 1ml dịch nuôi và 2ml thuốc thử Salkowashi Sự sản sinh IAA trong nuôi trường nuôi được thể hiện bằng sự xuất hiện màu hồng trong dịch phản ứng Cường độ màu của phản ứng được đo mật độ quang ở bước sóng 530 nm và nồng độ IAA được xác định dựa vào đồ thị chuẩn IAA Đường chuẩn IAA được chuẩn bị bằng cách vẽ độ hấp thụ ở 530 nm so với nồng độ dung dịch IAA và lượng IAA do chế phẩm được ngoại suy từ đường chuẩn (Glickmann và Dessaux, 1995)

Chuẩn bị đệm phosphate (200ml), gồm 2 loại dung dịch: dung dịch A:

KH2PO4 0,136 g/100 ml nước cất; dung dịch B: K2HPO4 0,174 g/100 ml nước cất Lấy 39 ml dung dịch A + 61 ml dung dịch B, dẫn nước cất vừa đủ 200ml, điều chỉnh pH = 7

Để chuẩn bị thuốc thử Salkowski, đầu tiên hòa tan 110,6 ml H2SO4 (98%) trong nước cất cho đủ 200 ml, sau đó để nguội trong 12 giờ để thu được dung dịch H2SO4 đậm đặc với nồng độ 10,8M Tiếp theo, cân 0,9 g FeCl3 và cho vào 200 ml dung dịch H2SO4 10,8M đã chuẩn bị, từ đó tạo ra thuốc thử Salkowski.

Xây dựng đường chuẩn IAA:

Hòa tan 1,6 mg IAA trong 10ml dung dịch đệm phosphate có nồng độ 160 mg/l Tiếp theo, tiến hành pha loãng để tạo ra các nồng độ 0 àg/ml và 5 àg/ml.

10 àg/ml, 16 àg/ml, 20 àg/ml, 40 àg/ml, 80 àg/ml

- Lấy 4 ml thuốc thử cho vào các ống nghiệm có nồng độ IAA khác nhau (bảng 2.9) có thể tích 2ml, mỗi nồng độ lặp lại 3 lần

- Để 10 phút trong tối ở nhiệt độ phòng để phản ứng xảy ra hoàn toàn, sau đó tiến hành OD530nm

Dựa trên kết quả đo OD530nm, chúng ta có thể xác định phương trình và đồ thị chuẩn cho dung dịch IAA Từ phương trình đường chuẩn này, nồng độ IAA trong môi trường dinh dưỡng sẽ được xác định một cách chính xác.

Bảng 2.9 Xây dựng đồ thị chuẩn IAA

Nồng độ IAA (àg/ml)

Dung dịch đệm phosphate (ml)

Hình 2.1 Đồ thị chuẩn về mối tương quan tuyến tính giữa trị số

OD 530nm và nồng độ IAA (àg/ml)

Phương trình tương quan giữa hàm lượng IAA và trị số OD530nm là: y = 0,0163x + 0,0167; Trong đú: x: nồng độ IAA (àg/ml), y: trị số OD530nm

Môi trường dinh dưỡng được thu dịch nuôi cấy và li tâm ở 8000 vòng/phút trong

Trong 4 phút, tiến hành lấy dịch trong để đo lượng IAA thông qua phản ứng màu với thuốc thử Salkowski Cường độ màu sau đó được xác định bằng máy so màu ở bước sóng 530nm.

2.5.2.3 Xác định hoạt tính cellulase và amylase

Phân tích khả năng phân giải cellulose của chế phẩm chứa vi sinh vật (VSV) được thực hiện bằng phương pháp cấy đục lỗ trên môi trường CMC 0,1% trong đĩa petri Để phát hiện vùng phân giải CMC của vi khuẩn, đĩa petri được nhuộm với thuốc thử Congo red 0,1% trong 30 phút, sau đó rửa bằng dung dịch NaCl 1M Những chủng vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose sẽ tạo ra vùng hào quang (halo zone) xung quanh lỗ đục.

Để xác định hoạt tính amylase, các môi trường dinh dưỡng được phối trộn với các chủng vi sinh vật và cấy trên môi trường có 0,1% tinh bột Sau 30 phút nhuộm đĩa petri bằng thuốc thử Lugol và rửa với dung dịch NaCl 1M, hoạt tính amylase được xác định qua sự xuất hiện vòng ức chế xung quanh thỏi thạch.

2.5.3 Lên men sản xuất sinh khối vi khuẩn tạo chế phẩm phân vi sinh dạng lỏng y = 0.0163x + 0.0167 R² = 0.9909

Nồng độ IAA (àg/ml)

2.5.3.1 Lên men ở qui mô 5L nhờ thiết bị lên men Labfors 5