TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÂM NGHIỆP KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NĂM HỌC 2023 – 2024 ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VÀ XÁC ĐỊNH LÀM LƯỢNG MỘT SỐ HỢP CHẤT TRONG
TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
Tổng quan về đông trùng hạ thảo
Trên thế giới, có hơn 1.200 loài nấm gây bệnh cho côn trùng, chủ yếu thuộc ngành Ascomycota và Deuteromycetes, trong khi một số ít thuộc các ngành Zygomycota, Chytridiomycota, Oomycota và Basidiomycota Đông trùng hạ thảo (Cordyceps) là một trong những chi nấm lớn, gây bệnh cho sâu non, sâu trưởng thành và nhộng của nhiều loài côn trùng, bao gồm cả nhện và kiến.
Tên gọi “Đông trùng hạ thảo” có nguồn gốc từ cao nguyên Tây Tạng, Trung Quốc, nơi diễn ra quá trình sinh trưởng độc đáo của một loài sâu bướm Những con sâu bướm này sống ở độ sâu khoảng 15cm dưới mặt đất, trên các dãy núi cao từ 3000-5000m Vào cuối mùa thu và đầu mùa đông, chúng bị ký sinh bởi một loại nấm, dẫn đến cái chết của sâu Đến đầu mùa hè, khi nhiệt độ ấm lên, nấm bắt đầu sinh sản hữu tính, tạo ra quả thể mọc lên từ xác sâu bướm, có hình dạng giống như thực vật.
Ngày nay, với sự phát triển của khoa học, các nhà nghiên cứu đã làm rõ cơ chế lây nhiễm của nấm Cordyceps, loài nấm ký sinh trên côn trùng, ấu trùng, nhện và kiến Quá trình xâm nhập và phát triển của chúng chủ yếu diễn ra vào mùa đông, khi điều kiện nhiệt độ và độ ẩm thuận lợi Bào tử nấm bám vào bên ngoài hoặc đi vào cơ thể ký chủ qua đường tiêu hóa Khi bám bên ngoài, bào tử nấm nảy mầm thành hệ sợi, tiết ra enzyme như lipase, chitinase và protease để phá vỡ vỏ ngoài của ký chủ Sau khi xâm nhập, hệ sợi nấm hút dinh dưỡng, sinh trưởng mạnh mẽ và cuối cùng gây chết ký chủ Đến mùa hè, khi nhiệt độ tăng, quá trình sinh trưởng của ký chủ ngừng lại, nấm tiếp tục phát triển và phát tán bào tử ra môi trường.
1.1.1 Đặc điểm sinh học của nấm Đông trùng hạ thảo
Nấm Cordyceps có hơn 750 loài khác nhau, chủ yếu phân bố ở các nước châu Á như Hàn Quốc, Nhật Bản, Nepal, Trung Quốc và Ấn Độ (Olatunji và cs., 2018) Trong số này, khoảng 78 loài đã được xác định dựa trên loại ký chủ và hình dạng quả thể Tuy nhiên, chỉ một số ít loài trong số đó được lựa chọn để sử dụng làm dược liệu.
Ophiocordyceps sinensis và C militaris là hai loài nấm được nghiên cứu nhiều nhất về chiết xuất và sản xuất nhờ vào giá trị dược liệu và kinh tế cao của chúng Các loài khác như C Sobolifera, C Liangshanensis và C Cicadicola cũng có tiềm năng, nhưng chưa được nghiên cứu sâu.
Ophiocordyceps sinensis và Cordyceps militaris
Theo vị trí phân loại khoa học, chi Đông trùng hạ thảo thuộc:
Giới : Fungi Ngành : Ascomycota Lớp :Sordariomycetes
Hình 1.1: Đông trùng hạ thảo ngoài tự nhiên
Ophiocordyceps sinensis, trước đây được biết đến với tên gọi Cordyceps sinensis, là một loại nấm ký sinh trên ấu trùng của một số loài bướm đêm thuộc họ Hepiadidae Loại nấm này chủ yếu sống ở những vùng đồng cỏ có độ cao trên 3.500 mét (11.500 ft), đặc biệt là trên cao nguyên Thanh Tạng (Thanh Hải-Tây Tạng) và khu vực Himalaya ở Bhutan, Ấn Độ và Nepal.
Cordyceps militaris, lần đầu tiên được Carl Linnaeus mô tả vào năm 1753 với tên gọi ban đầu là Clavaria militaris, là một loài điển hình thuộc chi Cordyceps Loài nấm này phân bố rộng rãi từ vùng cận nhiệt đới đến ôn đới trên toàn cầu, bao gồm cả khu vực Bắc.
Loài Cordyceps được nghiên cứu kỹ lưỡng nhất hiện nay, phân bố rộng rãi ở Mỹ, Nam Mỹ, Châu Âu và Châu Á Sự đa dạng về hình thái và khả năng thích nghi của loài này với nhiều sinh cảnh khác nhau có thể là nguyên nhân chính giúp chúng tồn tại ở nhiều vùng địa lý và sinh thái khác nhau trên thế giới.
1.1.2 Đặc điểm hình thái của nấm Cordyceps militaris
Cordyceps militaris là một loại nấm ký sinh trên bướm và sâu bướm, phát triển từ bào tử xâm nhập vào cơ thể côn trùng Khi hình thành quả thể, nấm tạo ra hai phần: phần ký chủ và phần quả thể Quả thể có màu cam hoặc vàng sẫm, vàng nhạt, với chiều dài từ 4-10 cm và đường kính 0,2-0,5 cm, có hình dáng xương đòn hoặc hình mác, đầu quả thể nhọn hoặc bán cầu Phần ký chủ, bao gồm bướm và sâu bướm, trở nên cứng lại do sự xâm nhiễm của hệ sợi nấm, có chiều dài khoảng 3-5 cm.
1.1.3 Thành phần hóa học và tác dụng sinh học của Cordyceps militaris
Nấm Cordyceps, đặc biệt là loài Ophiocordyceps sinensis, đã được sử dụng như một loại thuốc quý tại Trung Quốc từ khoảng 3000 năm trước Ngoài ra, C militaris cũng nổi bật với các hợp chất sinh học tương tự và có hoạt động sinh học đa dạng hơn O sinensis Nghiên cứu chỉ ra rằng C militaris mang lại nhiều lợi ích sức khỏe, bao gồm tăng cường năng lượng, kích thích hệ miễn dịch, chống ung thư, chống oxy hóa, kháng viêm, kháng khuẩn và virus, điều hòa đường huyết và lipid máu, cũng như bảo vệ hệ thần kinh.
Nấm đông trùng hạ thảo chứa nhiều hợp chất có giá trị sinh học, được nghiên cứu và chiết xuất bởi nhóm tác giả Karol và Jan (Jerzy, Lazur và Muszynska, 2021) Theo bảng 1.1, ngoài hai hoạt chất chính là Cordycepin và Adenosine, nấm còn chứa các hợp chất quan trọng khác như D-mannitol, Ergothioneine, GABA, Lovastatin và nhiều vitamin khác với hàm lượng đáng kể.
Kết quả phân tích cũng cho thấy sự hiện diện của các hợp chất có hoạt tính sinh học và chất dinh dưỡng có trong C militaris như: Axit γ-aminobutyric
GABA, Ergothioneine, glycolipids such as cerebroside, glycoproteins like lectins, and D-mannitol (found in cordycepic acid) are essential compounds Additionally, xanthophylls, which include carotenoids like lutein and zeaxanthin, sterols such as ergosterol, and statins like lovastatin play significant roles in health The presence of phenolic compounds, including phenolic acids and flavonoids, along with vitamins and minerals like magnesium, potassium, selenium, and sulfur, further contributes to their nutritional value.
Bảng 1.1 Hàm lượng một số hợp chất có hoạt tính sinh học và chất dinh dưỡng có trong nấm Đông trùng hạ thảo C militaris
Hợp chất có hoạt tính sinh học
Vitamin A 100 mg/kg 96 mg/kg
Vitamin E 1,3 mg/kg 3,6 mg/kg
Vitamin B2 0,32 mg/kg 0,16 mg/kg
Vitamin b3 15,2 mg/kg 4,9 mg/kg
Magie 3414 mg/kg 4227 mg/kg
Sulfur 2558 mg/kg 5088 mg/kg
Potassium 12,182 mg/kg 15,938 mg/kg
Selenium CT1 > CT3 > ĐC.
Hàm lượng glucose có ảnh hưởng lớn đến tốc độ phát triển của hệ sợi nấm Trong môi trường không có glucose, tốc độ phát triển hệ sợi rất kém và không đồng đều Khi bổ sung 10 g/l glucose ở CT1, tốc độ phát triển được cải thiện rõ rệt CT2 với 20 g/l glucose đạt tốc độ phát triển và năng suất cao nhất Ngược lại, CT3 với hàm lượng glucose cao lại cho tốc độ phát triển thấp hơn CT2, có thể do lượng glucose cao gây ức chế sự phát triển của hệ sợi nấm Do đó, CT2 với 20 g/l glucose là môi trường tối ưu cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.1.2 Ảnh hưởng của hàm lượng pepton đến năng suất thu sinh khối hệ sợi
Nồng độ glucose 20g/L mang lại kết quả tối ưu cho sự phát triển sinh khối của hệ sợi, do đó có thể được áp dụng thay thế vào thành phần môi trường trong thí nghiệm này.
Bảng 3.2 Ảnh hưởng của hàm lượng pepton đến năng suất thu sinh khối hệ sợi
Khối lượng sinh khối hệ sợi khô trung bình (g/L) Đặc điểm hệ sợi nấm Sau 3 ngày
Pellet to, mật đọ pellet thấp
Pellet tròn đều, to vừa, mật độ pellet cao
Pellet tròn đều, to vừa, mật độ pellet cao
Pellet tròn đều, to vừa, mật độ pellet cao
Hình 3.2 Hệ sợi nấm ở môi trường CT2 sau 3, 4 và 5 ngày nuôi cấy trong
CT2 sau 3 ngày CT2 sau 4 ngày CT2 sau 5 ngày
Thí nghiệm cho thấy bốn công thức nuôi cấy đạt nồng độ sinh khối dao động từ 17,6 ± 0,90 g/l đến 22,6 ± 0,68 g/l vào ngày nuôi cấy thứ 5 Mẫu có hàm lượng pepton 0 g/l cho kết quả thấp nhất là 17,6 g/l Mẫu CT2 với 5 g/l pepton cho khối lượng sinh khối hệ sợi khô trung bình cao hơn đáng kể so với ba môi trường còn lại vào ngày thứ 4 và thứ 5, đạt 22,6 ± 0,68 g/l Môi trường CT3 đạt 19,47 ± 0,73 g/l, trong khi CT1 đạt 18,32 ± 0,41 g/l.
3.1.3 Ảnh hưởng của hàm lượng cao nấm men đến năng suất thu sinh khối hệ sợi
Kết quả tối ưu từ các thí nghiệm trước (glucose 20g/l; pepton 5g/l) đã được áp dụng để thay thế vào thành phần môi trường trong thí nghiệm này Kết quả cụ thể được trình bày trong bảng 3.3.
Bảng 3.3 Ảnh hưởng của hàm lượng cao nấm men đến năng suất thu sinh khối hệ sợi
Khối lượng sinh khối hệ sợi khô trung bình (g/L) Đặc điểm hệ sợi nấm Sau 3 ngày
Pellet to, mật đọ pellet thấp
Pellet tròn đều, to vừa, mật độ pellet cao
Pellet tròn đều, to vừa, mật độ pellet cao
Pellet có hình dạng tròn đều, kích thước vừa phải và mật độ cao Kết quả thí nghiệm cho thấy CT2 đạt tốc độ phát triển hệ sợi cao nhất với khối lượng sinh khối khô trung bình là 25,3 ± 1,12 g/l Tiếp theo là CT3, CT1 và ĐC với khối lượng sinh khối khô trung bình lần lượt là 23,16 ± 0,95 g/L; 21,7 ± 1,01 g/L và 18,30 ± 0,69 g/L Tốc độ sinh trưởng hệ sợi của CT1 và CT3 khá đồng đều trong suốt thời gian theo dõi Ngược lại, môi trường ĐC có tốc độ phát triển hệ sợi thấp nhất và mật độ pellet cũng như khối lượng sinh khối khô kém hơn rõ rệt so với ba môi trường còn lại.
Trong 3 ngày, tốc độ phát triển sinh khối hệ sợi được sắp xếp theo thứ tự: CT2 > CT3 > CT1 > ĐC Điều này cho thấy môi trường CT2 với hàm lượng 5g/l nấm men cao là lựa chọn tối ưu cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.1.4 Ảnh hưởng của hàm lượng KH 2 PO 4 đến năng suất thu sinh khối hệ sợi
Kết quả tối ưu từ các thí nghiệm trước (glucose 20g/l; pepton 5g/l; cao nấm men 5g/l) đã được áp dụng vào thành phần môi trường trong thí nghiệm này Kết quả thu được được trình bày trong bảng dưới đây.
Bảng 3.4 Ảnh hưởng của hàm lượng KH 2 PO 4 đến năng suất thu sinh khối hệ sợi
Khối lượng sinh khối hệ sợi khô trung bình (g/L) Đặc điểm hệ sợi nấm
Pellet tròn đều, to vừa, mật độ pellet cao
Pellet tròn đều, to vừa, mật độ pellet cao
Pellet tròn đều, to vừa, mật độ pellet cao
Pellet tròn đều, to vừa, mật độ pellet cao
Hình 3.3 Hệ sợi nấm ở môi trường CT1, CT2, CT3 sau 5 ngày nuôi cấy
CT1 sau 5 ngày CT2 sau 5 ngày CT3 sau 5 ngày
Cả 4 môi trường thí nghiệm đều cho kết quả tốt, tốc độ phát triển hệ sợi đều cao và đều đạt lượng sinh khối tối đa vào ngày nuôi cấy thứ 5, pellet đều và mật độ pellet cao Tốc độ phát triển cũng như lượng sinh khối đạt được vào ngày thứ 5 cho kết quả tăng dần ở công thức ĐC đến CT2 và giảm nhẹ ở CT2 Trong đó tốc độ phát triển hệ sợi nấm ở CT2 cho kết quả cao nhất
Thí nghiệm cho thấy hàm lượng KH2PO4 ảnh hưởng đến sự phát triển của hệ sợi nấm, mặc dù kết quả thu được không có sự khác biệt rõ rệt.
3.1.5 Ảnh hưởng của hàm lượng MgSO 4 ã7H 2 O đến năng suất thu sinh khối hệ sợi
Kết quả tốt nhất thu được ở các thí nghiệm trên (glucose 20g/l; pepton
5g/l, cao nấm men 5g/l, KH2PO4 0,5 g/l) được áp dụng thay thế vào thành phần môi trường ở thí nghiệm này Kết quả của thí nghiệm được thể hiện qua bảng sau
Bảng 3.5 Ảnh hưởng của hàm lượng MgSO 4 ã7H 2 O đến năng suất thu sinh khối hệ sợi
Khối lượng sinh khối hệ sợi khô trung bình (g/L) Đặc điểm hệ sợi nấm Sau 3 ngày
Pellet tròn đều, to vừa, mật độ pellet cao
Pellet tròn đều, to vừa, mật độ pellet cao
Pellet tròn đều, to vừa, mật độ pellet cao
Pellet tròn đều, to vừa, mật độ pellet cao
Thí nghiệm với nguồn khoáng MgSO4·7H2O cho thấy khả năng phát triển hệ sợi ở bốn môi trường không có nhiều sự khác biệt Tất cả các môi trường đều đạt tối đa sinh khối vào ngày nuôi cấy thứ 5, với pellet có đặc điểm tốt Trong đó, môi trường CT1 có chỉ số sinh trưởng cao nhất là 26,47 ± 0,90 g/l, trong khi CT3 có khối lượng sinh khối thấp nhất là 24,69 ± 1,01 g/l Kết quả cho thấy sự ảnh hưởng của MgSO4·7H2O đến tốc độ phát triển và khối lượng sinh khối tại các thời điểm khác nhau, tuy nhiên, sự khác biệt không lớn và cả bốn thí nghiệm đều cho khả năng phát triển hệ sợi tốt.
3.1.6 Ảnh hưởng của hàm lượng khoai tây đến sinh năng suất thu sinh khối hệ sợi
Kết quả tốt nhất từ các thí nghiệm trước đó (glucose 20g/l; pepton 5g/l; cao nấm men 5g/l; KH2PO4 0,5 g/l; MgSO4·7H2O 0,25 g/l) đã được áp dụng vào thành phần môi trường trong thí nghiệm này Kết quả của thí nghiệm được trình bày trong bảng dưới đây.
Bảng 3.6 Ảnh hưởng của hàm lượng khoai tâyđến năng suất thu sinh khối hệ sợi
Khối lượng sinh khối hệ sợi khô trung bình (g/L) Đặc điểm hệ sợi nấm Sau
Pellet nhỏ, mật độ pellet cao
Pellet tròn đều, to vừa, mật độ pellet cao
Pellet tròn đều, to vừa, mật độ pellet cao
Pellet tròn đều, to vừa, mật độ pellet cao
Các môi trường thí nghiệm đều cho thấy tốc độ phát triển hệ sợi cao, đạt lượng sinh khối ấn tượng vào ngày nuôi cấy thứ 5 với pellet đều và mật độ pellet cao Sự khác biệt về khối lượng sinh khối hệ sợi giữa CT1, CT2 và CT3 không đáng kể ở các thời điểm khác nhau Tuy nhiên, công thức môi trường ĐC lại có những đặc điểm riêng biệt cần được xem xét.
Nghiên cứu cho thấy rằng môi trường không chứa khoai tây (0 g/l) dẫn đến tốc độ phát triển và khối lượng sinh khối hệ sợi thấp hơn đáng kể so với các công thức khác Sự hiện diện của dịch chiết khoai tây có ảnh hưởng tích cực đến khả năng phát triển của hệ sợi nấm Khi bổ sung dịch chiết khoai tây, tốc độ phát triển của hệ sợi tăng lên nhờ vào hàm lượng dinh dưỡng dồi dào trong dịch chiết này Cụ thể, môi trường CT2 với 100 g/L khoai tây mang lại khả năng phát triển hệ sợi tốt nhất, đạt khối lượng sinh khối khô trung bình là 26,31 ± 1,02 g/l.
3.1.7 Ảnh hưởng của hàm lượng vitamin đến năng suất thu sinh khối hệ sợi
Kết quả hàm lượng Cordycepin và Adenosine trong hệ sợi nấm Đông trùng hạ thảo C militaris thu hồi ở các thời điểm khác nhau
Cách thu thập mẫu và quy trình chuẩn bị mẫu phân tích được nêu rõ trong phần phương pháp nghiên cứu Kết quả phân tích hàm lượng Cordycepin và Adenosine được trình bày trong bảng dưới đây.
Bảng 3.9 Hàm lượng cordycepin và adenosine qua các thời điểm nuôi cấy
Phân tích trên máy HPLC cho thấy hàm lượng cordycepin tăng dần theo thời gian nuôi cấy, từ 0,591 mg/g ở ngày thứ 5 lên 1,032 mg/g ở ngày thứ 15 và đạt 2,068 mg/g ở ngày thứ 25 Trong khi đó, hàm lượng adenosine lại giảm dần, từ 0,528 mg/g ở ngày thứ 5 xuống 0,473 mg/g ở ngày thứ 15 và chỉ còn 0,285 mg/g ở ngày thứ 25.
Theo một nghiên cứu của Lei Huang và cộng sự (2009) thực hiện xác định phân tích hàm lượng cordycepin và adenosine ở C militaris và O sinensis
Nghiên cứu được thực hiện trong môi trường nuôi cấy với thành phần gồm 35g/l sucrose, 5g/l pepton, 2,5 g/l cao nấm men, 0,5 g/l MgSO4, 1 g/l KH2PO4 và 0,05 g/l vitamin B1 Sau một tuần nuôi cấy, kết quả phân tích bằng HPLC cho thấy hàm lượng cordycepin đạt 0,9040 ± 0,02 mg/g và adenosine đạt 1,592 ± 0,03 mg/g trong hệ sợi nấm.
Kết quả nghiên cứu cho thấy hàm lượng adenosine và cordycepin có sự thay đổi rõ rệt theo thời gian nuôi cấy Sự biến đổi này thể hiện mối quan hệ tỉ lệ nghịch giữa hai chất, với adenosine là tiền chất của cordycepin Qua quá trình nuôi cấy, adenosine dần được chuyển hóa thành cordycepin, dẫn đến hàm lượng adenosine giảm và hàm lượng cordycepin tăng lên Thời gian nuôi cấy càng dài thì hàm lượng adenosine càng thấp và hàm lượng cordycepin càng cao.