Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Phân tích đa dạng di truyền của các quần thể hồ tiêu (Piper nigrum L.) bằng hình thái học và chỉ thị phân tử SSR

Tổng số 15 quan thégiống Hồ tiêu được thu thập từ tỉnh Bình Phước và tỉnh Gia Lai đã được sử dụng đểnghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền dựa trên các đặc điểm hình thái học và chỉ thịSS

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM

33k 3k3 33k 3K 3k 3k 3K 3K 3K 3k 3 3k 3 3K 3k 3k 3k 3K 3K 3k 2k

NGUYÊN CHÍNH VIỆT

PHAN TÍCH DA DẠNG DI TRUYEN CUA CÁC QUAN THE

HO TIỂU (Piper nigrum L.) BANG HÌNH THÁI HỌC

VA CHỈ THI PHAN TU SSR

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HOC

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 06/2022

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM

33k 3k3 33k 3K 3k 3k 3K 3K 3K 3k 3 3k 3 3K 3k 3k 3k 3K 3K 3k 2k

NGUYÊN CHÍNH VIỆT

PHAN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYEN CUA CÁC QUAN THE

HO TIỂU (Piper nigrum L.) BẰNG HINH THÁI HỌC

VÀ CHI THI PHAN TU SSR

Chuyên ngành : Công nghệ sinh hoc

PHAN TÍCH DA DANG DI TRUYEN CUA CAC QUAN THE

HO TIEU (Piper nigrum L.) BANG HINH THAI HOC

VÀ CHỈ THI PHAN TU SSR

NGUYEN CHINH VIET

Hội đồng cham luận văn:

1 Chủ tịch: TS BÙI MINH TRÍ

Trường Đại học Nông Lâm TP HCM

2 Thư ký: TS PHAN ĐẶNG THÁI PHƯƠNG

Trường Đại học Nông Lâm TP HCM

3 Phản biện 1: TS HUYNH VĂN BIẾT

Trường Đại học Nông Lâm TP HCM

4 Phản biện 2: TS NGUYÊN HỮU ĐỨC

Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp HCM

5 Ủy viên: TS DO ĐĂNG GIAP

Viện Sinh học nhiệt đới

Tốt nghiệp Đại học ngành công nghệ sinh học, hệ chính quy tại Học viện

Nông nghiệp Hà Nội năm 2010.

Tháng 09 năm 2018 theo học Cao học ngành Công nghệ Sinh học tại

Trường Đại học Nông Lâm, Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh

Địa chỉ liên lạc: khu phố 4, phường Tiến Thành, thành phố Đồng Xoài,

tỉnh Bình Phước.

Điện thoại: 0972325579 Email: chinhviet.bio@gmail.com

il

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là nghiên cứu của tôi, các sô liệu, kêt quả nêu trong luận

văn là trung thực và không sử dụng sô liệu nghiên cứu cùa các công trình nghiên cứu khác

Ký tên

Nguyễn Chính Việt

11

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu Trường ĐạiHọc Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, Khoa Khoa học Sinh học, Viện Nghiên cứu Côngnghệ Sinh học và Môi Trường, Ban Quản lý Khu Nông nghiệp Ứng dụng Côngnghệ Cao tỉnh Bình Phước và Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển cây Hồ tiêu tỉnhGia Lai, hợp tác xã tiêu sạch huyện Lộc Ninh đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi

hoàn thành luận văn.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến thầy TS Phạm Đức Toàn đã luôn chỉdạy, giúp đỡ, hướng dẫn và chia sẻ rất nhiều kinh nghiệm quý báu cho tôi trongsuốt quá trình thực hiện luận văn

Bên cạnh đó, tôi xin gửi lời cảm ơn đến quý Thầy Cô của Khoa Khoa học

Sinh học, Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường đã dạy dỗ và

truyền đạt những kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tập tại trường

Xin chân thành cảm ơn Thầy chủ nhiệm TS Nguyễn Vũ Phong và các bạn

trong lớp Cao học CNSH 2018 đã luôn giúp đỡ, động viên và sát cánh cùng tôi

trong suốt quá trình học tập tại trường

Không thể thiếu sự giúp đỡ hết minh của ThS Trần Thị Kim Thoại,ThS Phạm Thị Hồng Phi, Kỹ sư Trương Quang Toản và tập thể lab sinh họcphân tử, bộ môn sinh học phân tử- công nghệ gen và tế bào- Viện nghiên cứuCNSH và môi trường đã giúp tôi hoàn thành luận văn.

Và cuối cùng nhưng rất quan trọng, con xin cảm ơn gia đình đã luôn tintưởng, động viên, là nguồn động lực cho tôi vượt qua được mọi trở ngại và khókhăn.

Tp Hồ Chí Minh ngày tháng năm 2022

Nguyễn Chính Việt

1V

TÓM TAT

Đề tài nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền của 15 quần thể giống Hồ tiêu(Piper nigrum L.) bằng hình thái học và chỉ thị phân tử SSR Tổng số 15 quan thégiống Hồ tiêu được thu thập từ tỉnh Bình Phước và tỉnh Gia Lai đã được sử dụng đểnghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền dựa trên các đặc điểm hình thái học và chỉ thịSSR Kết quả cho thấy các quần thể giống Hồ tiêu nghiên cứu có sự đa dạng di

truyền ở mức cao Sử dụng 11 chỉ thi SSR đã khuếch đại 42 đoạn khuếch đại, trung

bình 3,82 band/ primer, kích thước đoạn khuếch dai từ 200 đến 450 bp, tỷ lệ đa hình100% Khoảng cách di truyền giữa các quan thé Hồ tiêu dao động từ 0,29 đến 0,9

Ở khoảng cách di truyền trung bình 0,46, tổng số 15 quần thể giống Hồ tiêu đượcchia làm 9 nhóm Chỉ số PIC dao động từ 0,281 đến 0,661 Các quan thé giống sửdụng trong nghiên cứu có đặc điểm chung: lá già màu xanh, lá non màu xanh nhạt,

lá có kiều gân campylodromous Trái tiêu không có cuống, đính theo hình xoắn trênmột trục gọi là gié trái Có 14 quần thê có gié trái dạng gié đơn, quần thể giống TK

có gié trái gồm các gié phụ đính trên một trục chính Kiéu hình lá dao động từ hìnhmũi mác, hình tim, hình elip hoặc hình trứng; mép lá phẳng hoặc gợn sóng Năngsuất hạt tiêu đen biến động từ 1,14 đến 3,34 kg/trụ Kết quả nghiên cứu này gópphần cung cấp thêm các dữ liệu về đa hình cây hồ tiêu, và cũng là thông tin hữu íchcho các nghiên cứu tiếp theo trên cây hồ tiêu

Từ khóa: Hồ tiêu, đa dạng di truyền, khoảng cách di truyền, Simple

sequence repeats (SSR), polymorphism information content (PIC).

Genetic diversity of 15 pepper populations (Piper nigrum L.) were analyzed

using morphology and SSR molecularmarkers A total of 15 pepper populations

shwed high levels of genetic diversity using 11 SSR 11 SSR markers, with 42

bands, an average of 3.82 band/primer, molecular bands size from 200 to 450 bp,

100 % of polymorphic band The genetic distance among 15 pepper populations ranges from 0.29 to 0.9 At an average genetic distance of 0.46, fifteen pepper populations were divided into 9 groups The PIC ranges from 0.281 to 0.661 The

15 pepper populations in this study had common characteristics: maturity green leaves, light blue young leaves, campylodromous tendoned leaves, stalkless peppers, attached in a twisted shape on an axis called fruit beams There were 14 populations with single fruit clusters, the TK populations with fruit beams consisting of bunches of widows attached on a spindle Leaf-shaped patterns range from the shape of the nose, heart shape, ellipse or egg shape; flat or wavy leaf edges Black pepper yields range from 1.14 to 3.34 kg/pillar The results of this study contribute to providing more data about polymorphism of peppers, and are also useful information for further studies on peppers.

Key words: pepper, genetic diversity, genetic distance, Simple sequence

repeats (SSR), polymorphism information content (PIC).

VI

MỤC LỤCTrang tựa

Tramh Chuan he i

LÝ 1ÍCH/Gá:HHẤTĨ scssosiisissii9sessbg0tastoeicictöSGSS0EE4030599991321353845 9835969 600s99X692230311000538000g 1 I/01:@81T: 08T N:iese-saseeeecassessoasa.ddoueiauiojozsdikirsosalinlisfbslgdlrarrionEgtglzsiigigoiigldrdztiisKtzgdzzngiimddooild22030-0m 11 G1 CAI Of caseenesanerennnsavenenswaxenter neuen ena nanan nD EEE 1V

TO tat <€@65ØŒỠŒCŒ€ỤBÓBỠỖẼỠẼẶ Á M

PUD AREA a 0S cố ah ee ees VI

CL on vil

Dam sach chit viét tat 0 0 cccccccccccssessessessesseeseeseesssesssssessesistsesetstsiessnssessnssesstsseeeees x

Danh sách CAC BA TH secsonsasvenesszsnsoussssecexees serve osweavannnnemnsiws SE3SSUS00KE9S0438E0411103848248288EESSE XI

Ue Poke DI IS | Eee nee eesti eerteer ete ee eee se eere ti eoeetee nee er mene cee seen crete cee etet tt erecta et seen 9

1.6 Phân bón cho cây Hồ tiêu 2-22 22222SE22E2EE2EE22E1221225122122122212212222 2e 91.7 Nhu cầu nước và tưới nước cho cây Hồ tiêu -2- 22 2222222522 101.8 Các phương pháp nghiên cứu đa dang di truyền 2 2222222222222: 10

1.8.1 Cac chi thi himh 8 10

L822) Cae Chi th -ISOZTVTfbg:xit2tg6x 56261000 L01651824GIGGt2SSSSRESEEREHGRERESIGHAB3EGEAN38đBGEHSISESG„SEERSS& 11 18:35 Cae chỉ tHỊ DNAs cere cre eee eee me ee 11

1.8.4 Kỹ thuật dựa trên PCR dùng môi đặc hiêu: SSR (Mierosatellites) 12

VI

1.9 Tình hình nghiên cứu đa dang di truyền cây Hồ tiêu trong và ngoài nước 17

1.9.1 Tình hình nghiên cứu ñgöài HƯỚE ‹.:c::ccscsccssceirn 022 0-s6 G Lá 6 6114314414481165563882 lữ1.9.2 Tình hình nghiên cứu đa dang di truyền cây Hồ tiêu trong nước 19Chương 2 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 205.1, Thời gian, địa HIẾM ca-eeeeesessesninirrisiiniriitknitorevorikoevggiS00nAEV000010700040100030000/095+ 20

2.1.1 (U83 ái iu 20

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu ¿2222222 2222E22E2E2E22E223223123221123121221221.22xxe 202.2 Vật liệu, thiết bị và hóa chất thí nghiệm -2- 22 ©2++22++2z++tz++zzzzex 202.2.1 Vat Liu 0n) iu ĐI ‹«£ä-gŒœA H Ả ÔÒỎ 20

2.2.2 Hóa chất và thiết bị thí nghiệm - 22 2-©222S222E22E22212232221221222222xee 25

2.3 Phuong phap nghién 0à 11 22

2.3.1 Phương pháp thực hiện nội dung 1: Đánh giá sự đa dang di truyền các

quan thé giống Hồ tiêu dựa trên các các đặc điểm hình thái học 222.3.2 Phương pháp thực hiện nội dung 2: Đánh giá sự đa dang di truyền các

quan thé giống Hồ tiêu bằng chỉ thị phân tử SSR - - 24Chương 3 KET QUA VÀ THẢO LUẬN . 2-scs+cccreeeerreecsee 293.1 KET QUA HÌNH THÁI HỌC - 2 ©S+S2+E££E£EE+EEEEEEEEEEeEErErrerrrer 293.1.1 Kết quả của các tính trạng hình thái - 22 22222+2E2z+2E2Ezzz+zzzzzzzzze 293.1.2 Kết quả của các tính trạng nông học -¿2222+2z+2E+2E2E+zEzzxzxzzxees 373.2 Kết quả đánh giá sự đa dạng di truyền các quần thê giống hồ bằng chỉ thị

THẬN: SSR innnsesnontooigLi1G81400386402381603.23838iL01838303183363483⁄4855883025830,380806555.568086.8:40 38

3.2.1 Kết quả li trích DÌNA 22522 2S22E22E22E223123121121121121121121121121211212 2e 383.2.2 Kết qua per với chỉ thị SSR -2-©22©222S2E22E22E212121221221221221222 22 e2 383.2.3 Kết qua phân tích mối quan hệ di truyền của 15 quan thé giống Hồ tiêu

dựa trên 11 chỉ thị SST - - 2 22221123221 123231 1152111151111 8211 key 4l3.2.4 Khoảng cách di truyền giữa các quan thé giống Hồ tiêu dựa trên 11 chi

thị SSR 222c2222212221122211122111222111222222121 2e 42

3.2.5 Kết quả phân tích mối quan hệ di truyền của 15 giống Hồ tiêu dựa trên

11 chỉ thị SSR và đặc điểm hình thái học - 2 =2s+zezzzzzEzzxzzezs 45

Vill

KET TH N K L VI TH sxegỹieeeoroioertiiioctiigrihagtatGrosiliBtGt08G00G00001000n0ã 47

TÀI LIEU THAM KKHẢO 5- <5° 5s S<£s£Ss£SeES£Es£EeEsersexsrserserersersrre 49

PHI Hee ttrreaaggrdrotrrtrgttiogstdtortoiatetetthiotigaeroaanstassarssst 52

1X

DANH SÁCH CHU VIET TAT

Global Posittion System

expected heterozygosity observed homozygosity

Viện nghiên cứu gia vi Ấn ĐộViện Nghiên cứu Tài nguyên Di truyền Thực vật Quốc tế

Inter Simple Sequence Repeat Nucleotid

Numerical Taxonomy System Polymerase Chain Reaction polymorphism information content

PCR isolation of microsatellite arrays

Random Amplified Polymorphic DNA Simple sequence repeats

Unweighted Pair Group Method with Arithmetici

DANH SÁCH CAC BANG

Bảng 1.1 Khuyến cáo lượng phân bón cho cây Hồ tiêu 2- 225522522: 9Bang 2.1 Danh sách 15 quan thé giống Hồ tiêu sử dung trong nghiên cứu 20

Bảng 2.2 Danh sách và trình tự 11 primer SSR được sử dụng trong nghiên cứu 26

Bang 2.3 Chu trình nhiệt tối ưu trong phản ứng PCR cho 11 primer 27Bảng 2.4 Thanh phần phan ứng PCR 2: 2-52 2S22E2SESE22E£ZE£EzEzEzzxezez 57Bang 3.1 Đặc điểm hình thái của 15 quan thé giống Hồ tiêu 3 5Bảng 3.2 Các chỉ tiêu nông học của 15 quan thé giống Hồ tiêu 37Bảng 3.2 Các chỉ tiêu nông học của 15 quan thé giống Hồ tiêu (tiếp theo) 38Bảng 3.3 Các chỉ số đa hình của 11 primer trên 15 quan thé giống Hồ tiêu 39Bang 3.4 Khoảng cách di truyền giữa các quan thé giống Hồ tiêu (Piper nigrum)

đa trên L1 Chit SSbsssesaanebeiotsiotodlasitsbyiattssgb4t4gta0i8xi3380010036008ngpaaii 44

XI

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 1.1 Trao đổi chéo không ngang bang Vùng đen và xám là microsatellite 13Hình 1.2 Cơ chế “trượt = slippage” trong quá trình tái sinh DNA 14Hình 1.3 Phát hiện microsatellites từ DNA genome - 55-2 5<c+c+<c<sc+x 15Hình 3.1 Đặc điểm lá va trái của 15 giống Hồ tiêu -2-22- 52552552552 34Hình 3.2 DNA tổng số của 13 mẫu giống Hồ tiêu đại diện sau điện di 38Hình 3.3 Sản phâm PCR-SSR với primer BPssr 29 của các mẫu giống Hồ tiêu 41Hình 3.4 Cây phân nhóm di truyền 15 quan thể giống Hồ tiêu dựa trên phương

pháp phân nhóm UPGMA từ kết quả của 11 primer SSR 42

xI

MỞ ĐẦU

Đặt vấn đề

Gia vị là một thành phần quan trọng của thực phẩm cho con người trên toànthé giới ké từ thời xa xưa Trong số các loại gia vị, Hồ tiêu (Piper nigrum L.), làloại gia vị được sử dụng rộng rãi nhất trên thế giới và được gọi là vua của các loàigia vị (Nair KP, 2011).

Hiện nay Hồ tiêu Việt Nam đã khẳng định được vị trí của mình trên thịtrường thế giới, là một nước đứng đầu về xuất khâu Hồ tiêu với trên 80 nước bạnhàng Theo tong cuc Hai quan, nam 2020 Viét Nam xuất khâu 285.292 tan hạt tiêu,trị giá 660,57 triệu USD, giá trung bình 2.315,4 USD/tan Là tỉnh có diện tích lớnnhất cả nước, đóng góp một tỷ trọng lớn về xuất khâu Hồ tiêu, Bình Phước hiện có15.890 ha diện tích trồng Hồ tiêu, trong đó có 14.675 ha cho sản phẩm, san lượng28.217 tấn (niên giám thống kê 2020) chiếm 11,76% tổng sản lượng toàn quốc.Ngành sản xuất Hồ tiêu Bình Phước nói riêng, cả nước nói chung vẫn còn gặp nhiềukhó khăn về công tác nghiên cứu chọn tạo, cải tiền giống dam bảo chất lượng

Mặc dù có tầm quan trọng về thương mại và sức khỏe, nhưng có rất ít nghiêncứu về đa dạng di truyền sử dụng chỉ thị phân tử trên cây Hồ tiêu mà nguyên nhânchủ yếu là do những hạn chế về nguồn gen (Raghavan va ctv, 2010) Do đó, Hồ tiêuchưa được cải tiến giống thông qua can thiệp vào bộ gen Trong khi các chỉ thịDNA được phát triển sẽ day nhanh các nghiên cứu cơ bản như xây dựng ban đồ ditruyền, lập bản d6 di truyền, so sánh bộ gen và cuối cùng là nhân giống phân tử, từ

đó giống được cải tiến (Ren và ctv, 2005; Yang L và ctv, 2014)

Trong số các chỉ thị dựa trên DNA, thì SSR là các chỉ thị được các nhànghiên cứu đánh giá cao nhờ vào các ưu điểm của chúng như khả năng tái tạo, tínhchất đa allel, là chỉ thị đồng trội và xuất hiện khắp bộ gen (Varshney và ctv, 2005)

Nghiên cứu của Kumari và ctv (2019) đã nghiên cứu và ứng dụng chỉ thị

SSR trên cây Hồ tiêu Các chỉ thị SSR đa hình được xác định trong nghiên cứu này

có thể được sử dụng trực tiếp dé phân tích đa dạng và nghiên cứu di truyền, tiến hóacho cây Hồ tiêu Đó là lý do đề tài “Phân tích da dạng di truyền của các quan thể

Ho tiêu (Piper nigrum L.) bang hình thai hoc và chi thị phân tử SSR” được thực

hiện.

Mục tiêu nghiên cứu

Nghiên cứu nhằm đánh giá phân nhóm đa dạng di truyền của các quần thêgiống Hồ tiêu (gồm 15 giống Hồ tiêu) được trồng trên địa bàn tỉnh Bình Phước vàtại Trung tâm nghiên cứu và phát triển cây Hồ tiêu tỉnh Gia Lai bằng hình thái học

và chỉ thị SSR Từ đó làm nguồn dữ liệu cơ bản cho công tác chọn giống và bảo tồnnguồn gen cây Hồ tiêu

Nội dung nghiên cứu

Đề tài nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền các quan thể Hồ tiêu trồng trênđịa bàn tỉnh Bình Phước va tại Trung tâm nghiên cứu và phát triển cây Hồ tiêu tinh

Gia Lai tập trung vào các nội dung chính sau đây:

Nội dung 1: Đánh giá sự đa dạng di truyền các quần thể Hồ tiêu dựa trên cácđặc điểm hình thái học

Nội dung 2: Đánh giá sự đa dạng di truyền các quần thể hồ bằng chỉ thị phân

tử SSR.

Chương 1

TỎNG QUAN

1.1 Lịch sử phát triển Hồ tiêu ở Việt Nam

Ở Việt Nam, cây Hồ tiêu mọc hoang được tìm thấy từ trước thế kỷ XVI,nhưng đến thế kỷ XVII mới được đưa vào trồng (Chevalier, 1925; Phan Hữu Trinh

và ctv, 1988) Đến cuối thế ky XIX, Hồ tiêu được trồng với diện tích tương đối khá

ở Phú Quốc, Hòn Chồng và Hà Tiên (Kiên Giang), chủ yếu do người Hoa gốc ở đảoHải Nam theo Mạc Cửu di cư vào Hà Tiên Cũng trong khoảng thời gian này và đầuthế kỷ XX, cây Hồ tiêu theo chân các chủ đồn điền người Pháp phát triển lên BìnhLong, Bà Rịa-Vũng Tau, Quang Tri và Quang Nam.

Trước những năm 1975, cả nước chi có khoảng 500 ha Hồ tiêu với san lượngước chừng 500 tan Sau năm 1975, nhất là từ 1983 đến năm 1990, do giá hạt tiêutrên thị trường thế giới tăng cao, cây Hồ tiêu được chú ý mở rộng diện tích, chủ yếuvùng Đông Nam Bộ và Tây Nguyên, đạt gần 9.200 ha (FAO, 2000) Trong khoảngthời gian 1991-1995 giá Hồ tiêu giảm mạnh, diện tích trồng Hồ tiêu giảm theo, daođộng trong khoảng 6.500-8.800 ha Từ năm 1996, các nước sản xuất tiêu chính nhưIndonesia, Malaysia, Brazil mat mùa tiêu vì khô han, tiêu dùng nội địa tăng cao ởmột số nước sản xuất Hồ tiêu truyền thong như An Độ, Sri Lanka, gia Hồ tiêu xuấtkhẩu tăng liên tục từ 2.000 USD/tan lên 4.000 USD/tan vào khoảng giữa năm 1997-

1999, có lúc lên đến 6.000 USD/tan, tạo cơ hội thuận lợi cho Việt Nam phát triểnsản xuất Hồ tiêu

Từ năm 1997, diện tích Hồ tiêu cả nước tăng liên tục, từ 9.800 ha lên 52.500

ha (2004), tăng gấp hơn năm lần Sản xuất Hồ tiêu tập trung và tăng nhanh nhất ởvùng Đông Nam Bộ, năm 1997 là 5.893 ha, đến 2004 đạt 26.900 ha (chiếm 51,3%tổng diện tích Hồ tiêu cả nước), chỉ riêng tỉnh Bình Phước đã đạt diện tích 13.500

ha Hồ tiêu mới phát triển ở Tây Nguyên sau năm 1975, song đến năm 2004 diệntích trồng Hồ tiêu ở vùng này đã vượt 17.980 ha, Đăk Lăk vươn lên đứng hàng thứhai trong số 18 tinh có trồng nhiều Hồ tiêu với hơn 11.000 ha.

Năng suất tiêu hầu như không tăng và có sự sai khác lớn giữa các vùng vàtinh có trồng tiêu Năng suất bình quân năm 1997 dat 2,08 tan/ha, đến năm 2004cũng chi đạt 2,22 tan/ha

Sản lượng Hồ tiêu cả nước tăng nhanh chủ yếu do diện tích thu hoạch tăng,

từ 13.700 tấn trong năm 1997 tăng lên gan 96.000 tan trong nam 2004 Tuy nhién,kim ngạch xuất khẩu Hồ tiêu của Việt Nam trong giai đoạn 2000-2005 không tăng,dao động trong khoảng 120-130 triệu USD/năm, chủ yêu do giá Hồ tiêu giảm mạnh

và ở mức thấp kê từ năm 2000

Diện tích Hồ tiêu cả nước đến năm 2019 là khoảng 130.000 ha, theo ước tínhcủa Tổng cục Thống kê, xuất khẩu Hồ tiêu 6 tháng nửa đầu năm 2019 đạt 176,8nghìn tấn, trị giá 452,1 triệu USD, tăng 34,96% về lượng nhưng lại giảm 0,12% về

tri giá so với cùng kỳ năm 2018.

1.2 Các vùng trồng tiêu chính ở Việt Nam

Ở Đông Nam Bộ, chỉ riêng hai tinh Bình Phước va Bà Ria-Ving Tàu, ba tỉnhvùng Tây Nguyên có diện tích Hồ tiêu lớn là Đăk Lăk, Gia Lai và Đăk Nông, tỉnh

có điện tích lớn Hồ tiêu ở Bắc Trung Bộ là Quảng Trị và ở Duyên hải Nam Trung

Bộ là Bình Thuận.

Riêng Bình Phước từ năm 2003 diện tích Hồ tiêu của tỉnh khoảng 14.195 ha,trong đó diện tích thu hoạch 8.350 ha, sản lượng đạt 19.010 tan Đến năm 2004 diệntích Hồ tiêu giảm 4,4% (13.571ha), nhưng diện tích thu hoạch tăng 19,6% (10.389ha) trong năm 2004 do các vườn tiêu mới trồng trong khoảng 1997-2002 đã cho thuhoạch, sản lượng tăng 23,7% (24.933 tan) so với năm 2003 Nguyên nhân giảm diệntích là do giá Hồ tiêu nằm ở mức thấp trong các năm gan đây và ngược lại giá vật tư

và công lao động tăng nhiều, ngoài ra sâu bệnh hại cũng là một nguyên nhân gópphần làm giảm diện tích Hồ tiêu của tỉnh, đến năm 2009 còn 10.863 ha Năm 2019Bình Phước có 17.199 ha diện tích trồng Hồ tiêu, trong đó có 15.039 ha cho sản

phẩm, sản lượng 29.945 tấn Các địa phương tập trung nhiều Hồ tiêu bao gồmhuyện Lộc Nình, Bù Đốp, Hớn Quản và huyện Bù Gia Mập (niên giám thống kê

2019).

1.3 Giống Hồ tiêu

Các giống Hồ tiêu trồng có thé có nguồn gốc từ các giống Hồ tiêu mọchoang, được thuần hoá và tuyển chọn qua rất nhiều đời trong khoảng thời gian dai.Trong số hơn 100 giống Hồ tiêu được biết đến, có một số giống đã và dang dan mat

đi trong sản xuất bởi nhiều lý do, chang han bị loại bỏ vì nhiễm nặng sâu bệnh hại,nhất là bệnh chết nhanh, chết chậm và tuyến trùng, các giống Hồ tiêu bản địa dầndần được thay thế bằng một vài giống Hồ tiêu cao sản trong sản xuất đại trà

Ravindran (1991; trích dẫn bởi Ravindran và ctv., 2000) và Ravindran và

ctv (1997) đã tiến hành phân tích hợp phan chính (principal component analysis) déphân định nhóm giống Hồ tiêu, xác định được tám hợp phần chính bao gồm:

1 Chỉ số kích thước lá, chiều dài lá, chiều rộng lá

Độ dày lá, độ dày biểu bì đưới lá, độ dày biéu bì trên lá

Tỉ lệ chiều dai lá/chiều dai gié, chiều dài gié, chiều dai cuống gié

Chiều đài và chiều rộng tế bao bảo vệ (guard cell)

7 Tần suất khí không và mật độ diệp lục

8 Hình dạng lá ở cành cho quả và hình dang lá ở cành bò (dây lươn)

Trong 51 giống được phân tích, kết quả cho thấy có 28 giống nằm chung một

nhóm, và điêu đáng lưu ý là Panniyur 1 năm vào một nhóm riêng.

Kết quả điều tra trong sản xuất được tiến hành bởi IISR cho thấy chỉ riêng ở Ấn

Độ đã có 38 giống Hồ tiêu được trồng phố biến và 63 giống khác được phát hiện (IISR,

1997).

Viện Nghiên cứu Gia vị Ấn Độ (IISR) tiến hành chương trình tuyển chọn vàlai tạo giống Hồ tiêu từ năm 1953 với mục đích chọn tạo được các giống Hồ tiêu cókhả năng cho năng suất cao và kháng được sâu bệnh Viện đã đưa vào sản xuấtgiống Hồ tiêu lai Panniyur-1 cho năng suất cao và chống chịu tốt bệnh chết nhanh

và đang khu vực hoá hai giống Panniyur-2 và Panniyur-3 Hiện IISR đang trồng bảoquản và theo dõi tập đoàn 2.300 ký hiệu giống bao gồm cả 940 ký hiệu tiêu hoangđại (IISR, 2005).

Ở Indonesia, bên cạnh giống Bangka cho năng suất cao và được trồng phôbiến, còn có giống Belangtoeng cho năng suất trung bình, ba giống chống chịu tốtbệnh chết nhanh là BanJarmasin, Duantebei và Merefin, và hai giống chọn lọc chonăng suất cao được phố biến trong sản xuất giữa thập niên 1990 là Natar 1 và Natar 2

Ở Việt Nam, giống Hồ tiêu được trồng trong sản xuất hiện nay là các giống

Hồ tiêu nhập nội, với đặc điểm nhân giống vô tính nên quần thể giống không phongphú như một số nước khác, mỗi vùng trồng tiêu chính thường chỉ có vài ba giốngphổ biến Theo Phan Hữu Trinh và ctv (1988) cây Hồ tiêu được đưa vào canh táctương đối quy mô ở vùng Hà Tiên nước ta vào đầu thế kỷ thứ 19, sau đó được trồng

ở nhiều vùng Đông Nam Bộ và Bắc Trung Bộ, vùng Hồ tiêu chủ yếu ở tỉnh QuảngTrị là các vùng có độ cao so với mặt biển dưới 100 m Các giống Hồ tiêu được trồngtrong thời gian này chủ yếu là các giống có nguồn gốc từ Campuchia và một sốgiống địa phương không rõ nguồn gốc

Năm 1947, giống Lada Belangtoeng có nguồn gốc Indonesia được nhập vàonước ta từ Madagascar, được xem là giống có nhiều triển vọng và có khả năngchống bệnh thối rễ (Phan Hữu Trinh và ctv., 1988)

Theo Trần Văn Hoà (2001) các giống Hồ tiêu có triển vọng phát triển ở nước

ta gồm giống Sẻ địa phương vùng Đông Nam Bộ, các giống nhập từ Campuchia qua

đường Hà Tiên là Sréchéa, Kamchay, Kampot, Kep, giống Lada Belangtoeng từIndonesia và Panniyur-1 từ An Độ.

Các giống Hồ tiêu được trồng phô biến trong sản xuất hiện nay chủ yếu donông dân tự chọn lọc từ nguồn giống địa phương hoặc du nhập từ địa phương khác,giống thường mang tên địa phương có trồng nhiều hoặc xuất xứ từ địa phương, dovậy có khi một giống Hồ tiêu được mang nhiều tên khác nhau, nhiều giống/dòngtiêu khác nhau lại mang cùng một tên Nhìn chung, các giống được trồng phô biến

có thể phân thành ba nhóm dựa trên các đặc tính hình thái, chủ yếu là kích cỡ lá:

1) Tiêu lá nhỏ còn gọi là tiêu Sẻ, gồm phần lớn các giống Hồ tiêu đượctrồng phổ biến ở nhiều địa phương, trong đó có các giống: Vĩnh Linh (Quảng Trị),Tiêu Sơn (Gia Lai), Di Linh (Lâm Đồng), Sẻ Dat đỏ (Bà Rịa-Vũng Tàu), Phú Quốc(Kiên Giang), Nam Vang (nhập nội từ Campuchia, gồm ba giống Kamchay, Kep và

Kampot).

2) Tiêu lá trung bình gồm chủ yếu các giống Hồ tiêu nhập nội từMadagascar, Ấn Độ và Indonesia như: Lada Belangtoeng, Karimunda, Panniyur và

Kuching.

3) Tiêu lá lớn còn gọi là tiêu Trâu như các giống Sẻ mỡ, Trâu Dat đỏ (Đồng

Nai, Bà Rịa-Vũng Tàu).

Trong số các giống trên, giống Lada Belangtoeng được trồng phô biến nhất,đặc biệt là ở Đông Nam Bộ và Tây Nguyên (Phan Quốc Sung, 2000) Có thé một số

giông Hồ tiêu có tên gọi khác nhau ở một sô địa phương có nguôn gôc từ giông Lada Belangtoeng.

1.4 Điều kiện sinh thái cây Hồ tiêu

i) Khí hậu

- Phân bố địa lý

Hồ tiêu được trồng nhiều Châu Á-Thái Bình Dương, Hồ tiêu được trồngnhiều ở Ấn Độ, Hai Nam, ở Brazil va Madagascar Yêu cầu đặc trưng về mặt khíhậu của cây Hồ tiêu là lượng mưa khá, nhiệt độ không thay đổi nhiều, 4m độ cao,

độ dài ngày không chênh lệch nhiều giữa các mùa trong năm

- Lượng mưa

Hồ tiêu thích hợp trong điều kiện mưa đều, lượng mưa hàng năm trongkhoảng 1.000-3.000mm, tuy cây Hồ tiêu vẫn sinh trưởng và phát triển bình thườngtrong vùng ít mưa nhưng phân bố đều Phân bố lượng mưa, tình trạng thoát nước vakhả năng giữ âm của đất đóng vai trò quan trọng đối với cây Hồ tiêu hơn là tổnglượng mưa Lượng mưa khá là điều thuận lợi nếu đất thoát nước tốt, ngược lại tiêu

dễ bị bệnh Khô hạn cũng là một yếu tố giới hạn sinh trưởng và phát triển của cây

Hồ tiêu (Phan Quốc Sủng, 2000)

Khí hậu nóng âm là điều kiện thích hợp cho sinh trưởng và phát triển của cây

Hồ tiêu nhưng 4m độ cao liên tục lại hạn chế sinh trưởng cây Hồ tiêu và tạo điềukiện cho sâu bệnh phát sinh Cây Hồ tiêu chịu được ẩm độ khoảng 63% trong mùa

khô và 98% trong mùa mưa (Sadanandan, 2000).

- Anh sáng

Tiêu là cây ưa bóng trong giai đoạn cây con, ánh sáng tán xạ thích hợp cho

yêu cầu sinh trưởng, phát dục và phân hoá mầm hoa Giai đoạn tiêu ra hoa đậu quả,nuôi quá đến khi quả chín cây Hồ tiêu cần nhiều ánh sáng (Chevalier, 1925; PhanHữu Trinh và ctv., 1988; Phan Quốc Sủng, 2000) Việc có đủ ánh sáng trong giaiđoạn nuôi quả giúp giảm rụng qua non và tăng dung trọng hạt tiêu (Yau and Azmil,

1989).

ii) Dat trồng tiêu

Theo Phan Hữu trinh va ctv (1988), Phan Quốc Sung (2000) đất thích hợp

cho cây Hồ tiêu cân có các đặc tính:

- lý tính: tầng đất canh tác trên 80cm, có mực nước ngầm sâu trên 2m, tơixốp, có khả năng giữ nước tốt, thành phần cơ giới từ nhẹ đến trung bình, dễ thoát

nước vào mùa mưa;

- hoá tính: pH 5,5-6,5, tối thiểu 4,5 nhưng cần bón vôi dé nâng lên trên 5,giàu N, K và Mg, kha năng trao đổi cation ở mức 20-30 meq/100g dat, tỉ lệ C/N ởtầng đất canh tác cao (15-25)

1.5 Trụ tiêu

Trụ tiêu là nơi để cây Hồ tiêu leo bám trong suốt quá trình sinh trưởng pháttriển nên trụ tiêu đóng vai trò quyết định trong đời sống cây Hồ tiêu và chỉ phí chotrụ tiêu chiếm tỉ trọng lớn nhất trong chỉ phí thiết lập vườn tiêu mới

Tại những vùng trồng tiêu lâu đời ở Việt Nam nông dân thường ưa sử dụngtrụ gỗ vì cho rằng tiêu leo bám dé dang, không bị cạnh tranh về nước, dinh dưỡng,ánh sáng như khi trồng trụ sống và không bị nóng làm tiêu tàn lụi sớm như khi trồngvới trụ bê-tông hoặc bồn gạch xây Tuy vậy, thực tế sản xuất hiện nay cho thấy tiêu

có thể đạt được năng suất cao trên tất cả các loại trụ, miễn là có chế độ chăm sócphù hợp Các loại trụ sống rất phong phú như vông, keo dậu, lồng mức, đỗ quyên,muỗng cườm và gòn

1.6 Phân bón cho cây Hồ tiêu

Bảng 1.1 Khuyến cáo lượng phân bón cho cây Hồ tiêu

Phân chuồng N P20s KzOTuôi cây

(kg/trụ) (g/trụ) (g/trụ) (g/trụ)

Năm thứ 1 10-20 60 30 60 Năm thứ 2 15-20 120 50 120 Năm thứ 3 15-20 190 80 360

Nguôn: Trần Văn Hoà (2001)Theo Tran Văn Hoà (2001), lượng phân bón tùy thuộc vào dat, giống và tuôi

cây, trong đó phân hữu cơ đóng vai trò quan trọng và tỷ lệ NPK phù hợp cho cây

Hồ tiêu là (2:1:4) Lượng phân khoáng có thé chia 4 lần bón Lần 1 giúp cây phụchồi sau thu hoạch, lần 2 giúp thúc quá trình phân hóa mầm hoa (sau khi vào mùamưa nửa tháng), lần 3 và 4 nhằm tăng đậu qua và nuôi qua (xem bảng 1.1).

1.7 Nhu cầu nước và tưới nước cho cây Hồ tiêu

Hồ tiêu là loại cây thân leo có bộ rễ nông và phân bố hẹp nên rất man cảmvới nhu cầu nước tưới Thiếu nước tưới trong mùa khô hay bị úng nước trong mùamưa đều làm cho tiêu sinh trưởng kém, năng suất thấp hoặc bị chết

Một nghiên cứu về tưới nhỏ giọt, chu kỳ 3 ngày/lần, lượng nước tưới

280-320 lit/tru/thang là phù hợp nhất cho tiêu Sẻ 4-5 năm tuổi, trồng với khoảng cach

thích hợp.

1.8 Các phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền

Sự khác nhau về di truyền của các cá thé trong cùng một giống (hay giữa cácgiống trong cùng một loài) có thé biểu hiện hay không biểu hiện thành những tinhtrạng bên ngoài Người ta thường tìm kiếm những dấu hiệu dé nhận ra được sự khácnhau về di truyền giữa các cá thé (hoặc giữa các giống), gọi là những chỉ thị (BùiChí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004)

1.8.1 Các chỉ thị hình thái

Sự đa dạng di truyền có thể phát hiện dựa vào các biểu hiện hình thái Gen

thé hiện bản chất di truyền sẽ được liên kết với một tính trạng hình thái nào đó màngười ta có thé đo đếm được — gen đó có thé xem như chi thị Tuy nhiên, số chỉ thịhình thái hiện diện trong tự nhiên cũng rat ít, không thỏa mãn yêu cau của nhiềuchương trình chọn giống và chỉ có quy mô hình thái (cơ quan) hoặc ở giai đoạn pháttriển đặc biệt của cá thê thể

10

Sự thé hiện các chỉ thị hình thái bị ảnh hưởng bởi điều kiện môi trường, điềunày làm cho chỉ thị hình thái kém thu hút trong cải tiến giống cây trồng

1.8.2 Các chỉ thị isozyme

Isozyme là các dang protein có cùng đặc tính xúc tác nhưng lại có sự khácnhau khi chạy điện di Kỹ thuật điện di được dùng để đo sự đi động của phân tửprotein trong một khoảng thời gian nhất định, trên điện trường đồng nhất Cácprotein đột biến khác nhau về điện tích sẽ có sự di chuyền khác nhau nên có thểphát hiện sự khác nhau giữa chúng bằng kỹ thuật điện di Nhờ kỹ thuật điện di nay,cùng lúc có thé phân tích nhiều cá thể của một quan thé nào đó dé đánh giá chínhxác số phần trăm dị hợp tử của một gen nhất định, đánh giá sự đa dạng giữa cácnhóm sinh vật theo các protein được quan sát Với sự phát triển của kỹ thuật điện di,người ta có thé chân đoán được một phần nào sự biến dị ở mức độ DNA

Tuy việc áp dụng chỉ thị isozyme đã làm thay đổi việc nghiên cứu đa dạng di

truyền theo chiều hướng thuận lợi hơn do đây là chỉ thị rẻ tiền, nhanh và vật liệu có

thé sử dụng trong một thời gian dài nhưng số chỉ thị quá ít, không thỏa mãn cho nhucầu nghiên cứu

1.8.3 Các chỉ thị DNA

Có thé nói rằng ké từ khi con người biết đến sự hiện diện của gene và khiWatson va Crick phát minh ra cấu trúc của chuỗi DNA năm 1955, các kỹ thuật sinhhoc phân tử được phat minh ngày cảng nhiều và càng ngảy càng tỏ ra là công cụ đắclực cho công tác nghiên cứu khoa học do sỐ lượng chỉ thị nhiều hơn hắn so với 2loại chỉ thị trên, độ tin cậy cao hơn và thuận tiện hơn nhiều

Những lợi ích của chỉ thị phân tử DNA so với chỉ thị hình thái và chỉ thị isozyme:

— Do lường trực tiếp các vật liệu di truyền.

— Có nhiều chỉ thị trong quan thể

— Do lường không chi phối ảnh hưởng môi trường và ảnh hưởng có tính chatphát triển

11

1.8.4 Kỹ thuật dựa trên PCR dùng mồi đặc hiêu: SSR (Microsatellites)

Bộ gen của vi sinh vật nhân thật chứa 3 loại chuỗi DNA lặp là DNA satellite,

minisatellites va microsatellites Các chuỗi lặp nằm theo hàng (tandem) và có kíchthước rất khác nhau Trong số các chuỗi lặp đơn giản này, microsatellite là mộtmarker di truyền quan trọng, thường được sử dụng trong nghiên cứu da dạng

Microsatellite (còn được gọi là các chuỗi lặp đơn giản = simple sequencerepeats (SSRs), các chuỗi lặp liền kề ngắn = short tandem repeats (STRs) hay các

đoạn đa hình chuỗi đơn giản = simple sequence length polymorphisms (SSLPs) lànhóm các chuỗi DNA đơn giản lặp lại nhỏ nhất Microsatellite là các chuỗi lặp, tùytheo tác giả, 1-5, 1-6 hoặc 2- 8 nts.

Các chuỗi lặp thường đơn giản, bao gồm 2, 3, 4 nucleotid (gọi là di-, tri-, andtetranucleotide repeats) Một vi dụ phổ biến của microsatellite là 1 day chuỗi lặp 2dinucleotide (CA)n, trong đó n là tổng số chuỗi lặp nam trong phạm vi từ 10 — 100

Cac marker nay thường tạo ra mức đa hình cao trong nội bộ loài và giữa các loài,đặc biệt khi số chuỗi lặp n bằng 10 hoặc lớn hơn

Microsatelite là một trong các marker phân tử được sử dụng rộng rãi nhất vì

nó có một đặc điểm quan trọng là có tốc độ đột biến cao hơn các phần khác của bộ

gene.

a) Phân loại microsatellite

Cac microsatellite được phân loại theo loại chuỗi lặp như sau:

- Microsatellite hoàn hảo: gồm các chuỗi lặp đều đặn chăng hạn

Ở một locus microsatellite đồng hợp tử, số các chuỗi lặp giống nhau Ở mộtlocus microsatellite di hợp tử, số các chuỗi lặp khác nhau Nhìn chung tại một locusmicrosatellite của một quan thé đa allelle thì microsatellite của mỗi allele sẽ khácnhau về số chuỗi lặp Đây là đặc điểm di truyền quan trọng của microsatellite làmcho nó trở thành một marker cực kỳ hữu hiệu trong việc phân biệt các cá thé của 1quan thé dẫn đến SSR được ưa thích trong nghiên cứu di truyền quan thé va tộiphạm học.

c) Cơ chế tạo đột biến của microsatellite

Tốc độ đột biến của microsatellite cao hơn nhiều so với các vùng khác của

bộ gen, nằm trong phạm vi từ 107 đến 10° /locus/thé hệ Một số các cơ chế gây ratốc độ đột biến cao của microsatellite là: lỗi trong quá trình tái tổ hợp, trao đổi chéokhông ngang bằng, trượt (slippage) của DNA polymerase trong quá trình tái sinh và

sửa chữa DNA.

Lỗi trong quá trình tái tổ hợp Đây không phải là cơ chế chủ yếu vì người ta đãphát hiện tốc độ đột biến microsattelte trong đương nhau ở chủng vi khuẩn E Coli

có hệ thống tái tổ hợp và chủng không có hệ thống tái tổ hợp

Hậu quả là sau khi trao đổi chéo, một nhiễm sắc thé sẽ có một satellite dai hơn cònnhiễm sắc thé kia sẽ có microsatellite ngắn hơn (xem hình 1.1)

- Trượt (slippage) của DNA polymerase trong qua trình tai sinh và sửa chữa

DNA Đây cũng là một cơ chế quan trọng Trong quá trình tái sinh và sửa chữaDNA, một sợi tạm thời tách khỏi sợi kia và nhanh chóng tái hợp nhưng ở một vi trí

khác dẫn tới lỗi ghép cặp bazơ Hậu quả là | allele sẽ tăng số chuỗi lặp nếu lỗi xuấthiện ở sợi thứ (sợi tương đồng) hoặc giảm số chuỗi lặp nếu lỗi xuất hiện ở sợi chủ.Mặc dù cơ chế trượt của DNA polymerase khá phô biến nhưng hậu quả thường chỉdẫn tới sự thêm hay giảm số lượng chuỗi lặp của microsatellite (có nghĩa là đoạnthêm hay giảm ngắn hơn nhiều so với hậu quả gây ra bởi cơ chế trao đổi chéokhông ngang bằng) (Hình 1.2)

Hình 1.2 Cơ chế “trượt = slippage” trong quá trình tái sinh

DNA Gia sử phân tử DNA gốc có 5 chuỗi lặp (hộp nhọn) Cơ

chế “trượt” có thé dẫn tới hình thành các allele mới với 6 hoặc 4

chuỗi lặp phụ thuộc sợi chứa lỗi trượt

Phân bé của microsatellite

Trên một bộ genome, microsatellite phân bố không đều vì tần số của chúngkhác nhau giữa vùng mã hóa va vùng không mã hóa Do tốc độ đột biến cao nênvùng mã hóa có mật độ microsatellite thấp hơn so với vùng không mã hóa Người ta

đã chứng minh rang, các microsatellite với chuỗi lặp là 3 hoặc 6 bp tồn tại với mật

độ tương đương ở vùng mã hóa và không mã hóa Tuy nhiên, các microsatellite vớichuỗi lặp không phải là bội số của 3 thì tồn tại chủ yếu ở vùng không mã hóa

14

d) Vai trò chức năng cua microsatellite

Các nghiên cứu trên thực vật cho thấy, áp lực chọn lọc tác động khác nhau

lên vùng 5’UTR, vùng mã hóa và 3’UTR.

Tần số thay đổi theo đơn vị phân loại (theo nghĩa số lượng tuyệt đối các locimicrosatellite va motif của chuỗi lặp) Ở thực vật, tan số microsatellite cao ở thựcvật có bộ gen nhỏ (vd 0.85% ở cây Arabidopsis) và thấp hơn ở cây có bộ gen lớn(vd 0.37% ở ngô) Tan số = 1.07% ở nhiễm sắc thé 22 của người va 0.21% ở tuyếntrùng Caernorhabditis elegans.

e) Trình tự phân tích microsatellite

Thực hiện một phân tích microsatellite không đơn giản như đối với các phântích dùng mỗi ngẫu nhiên hoặc ISSR Có nhiều kỹ thuật microsatellite khác nhaunhưng phô biến nhất là PCR sử dụng 2 môi F và R được thiết kế ở một locus bảothủ ở 2 phía của của microsatellite Như vậy cặp môi này có thé được áp dụng chomọi cá thể của loài và tạo ra sản phẩm PCR có kích thước khác nhau nếumicrosatellite của các cá thé là khác nhau (hình 1.3) Tuy nhiên dé có được bộ mỗithích hợp không hề dé dang vi microsatellite phải được phân lập trướ

Hình 1.3 Phát hiện microsatellites từ DNA genome Hai môi F và R (mũi

tên xám) được thiết kế ở 2 bên vùng microsatellite Nếu không có

microsatellite thì có sản phẩm 100 bp Giả sử có một microsatellite với

chuỗi lặp CA và n = 8 (dài 16 bp) thì sản phẩm PCR có kích thước = 116

Các bước chính trong phân tích microsatellite bao gồm:

1 Xây dung thư viện microsatellite

2 Xác định loci microsatellite duy nhất

3 Xác định vùng thích hợp dé thiết kế mỗi

lộ

2:

6.

Thử PCR

Đánh giá và diễn giải các băng

Đánh giá sản pham PCR tao sự đa hình

Xây dựng thư viện microsatellite Đây là bước phức tạp, tốn công sức nhất Các

bước cụ thê gôm:

PCR.

Li trích DNA genomic

Cat san pham DNA genome bang RE

Điện di sản phẩm cắt bang agarose nồng độ thấp (khoảng 0.7%) Chọn vùngđiện di chứa các băng trong khoảng 300 — 700 bp Tinh chiết các băng khỏi

gel agarose.

Clone các băng (dùng TA vector hoặc adapter) vào E.coli.

Chọn lọc các clone (+, có khả nang chứa microsatellite) bang Southen blotvới dò chứa các chuỗi lặp

Giải trình tự các clon +.

Sau khi đã biết trình tự các clone, các mỗi đặc hiệu sẽ được thiết kế và thử

Vì xây dựng thư viện microsatellite theo phương pháp truyền thống rất tốncông sức (có thê mất 1 tháng đề hoàn thành), hơn nữa năng suất lại không cao nên

đã có nhiều kỹ thuật khác được áp dụng Chang hạn, trong một kỹ thuật gọi làPIMA (PCR isolation of microsatellite arrays), thay vì cắt sản phẩm DNA genome

va clone, người ta thực hiện RAPD dùng moi ngau nhién Cac san pham RAPD

duoc clone va kiểm tra bằng môi đặc hiệu chuỗi lặp và môi đặc hiệu vector Kỹ

thuật PIMA dựa trên cơ sở là các sản phẩm RAPD thường chứa nhiều microsatellitehơn các sản pham cắt ngẫu nhiên Kỹ thuật PIMA có thé giảm thời gian xuống còn

1 tuần

Microsattelite: ưu điểm chính

— Là marker đồng trội phù hợp cho phân tích di truyền quan thé đối với các sinhvật giao phối

16

— Có thé tự động hóa nếu mỗi được gan nhãn huỳnh quang và được phân tích trên

máy sequencer tự động.

— Nếu bộ moi đã được lựa chọn thì việc áp dụng tương đối dễ dàng

e Microsattelite: nhược điểm chính

— Như đã trình bày, việc xây dựng thư viện microsattelite và chọn lựa môi thíchhợp là cực kỳ tốn kém công sức và tiền bạc

— Các sản phâm PCR trong phân tích microsatellite thường có kích thước nhỏ(một vài trăm bp) và chênh lêch kích thước nhiều khi không nhiều dẫn tới phảiđiện đi agarose nồng độ cao (~3 %) hoặc điện di polyacrylamide hoặc phân tíchdùng máy sequencer tự động (đắt)

1.9 Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền cây Hồ tiêu trong và ngoài nước1.9.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Pradeepkumar và ctv (2001) đã khảo sát sự đa dạng di truyền giữa 22 giống

Hồ tiêu thuộc dong piper nigrum thu thập được từ miền nam An Độ và hai dònghoang dai là P Jongum và P colubrium bằng kỹ thuật RAPD Trong số 34 mồi sửdụng, có 24 môi cho kết quả tốt, 5 mồi trong 24 mồi cho các băng đồng hình, số cònlại cho các băng đa hình Tổng băng thu được từ 22 giống piper nigrum là 327 và có

11 băng đồng hình Kết quả đánh giá cho thấy mức tương đồng kiểu gen giữa cácgiống từ 0,11 đến 0,66

Shi Jiang va ctv (2009), đã sử dụng 20 mỗi RAPD để danh giá đa dang ditruyền giữa loài cây Hồ tiêu (Pepper); cây thảo được KAVA với ho hàng hoang daicủa chúng Kết quả 20 mỗi khuếch đại được 175 băng, trong đó có 20 băng đa hình(12%) Cây phân nhóm đã nhóm 28 mẫu thành sáu nhóm với hệ số tương đồng là0,36, trong đó có 6 nguồn Kava thành lập một nhóm, từ đó chỉ ra rằng Kava có mối

quan hệ xa với Pepper và họ hàng hoang dã của nó.

Salim Khan va ctv (2010) đã sử dung 8 mỗi RAPD dé đánh giá da dạngDNA chiết tách từ hạt Hồ tiêu Kết quả có 5 trong 8 môi nghiên cứ cho da hình cao

và có thé được sử dụng dé phan biét cac mau san pham hat Hồ tiêu được bày bánngoài thị trường là sản phẩm trong nước hay nhập ngoại

17

Remmia va ctv (2010), nghiên cứu sử dung 15 mỗi RAPD và 9 cặp méi SSR

để đánh giá đa dạng di truyền 20 mẫu giống Hồ tiêu Kết quả cho thấy các chỉ thịSSR cho kết quả đánh giá phân loại hình kiểu gen vượt trội so với chỉ thị RADP.Jiang Y và Liu JP (2011) nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền các giống Hồ tiêuthu từ dao Hai Nam, Trung Quốc sử dụng các chỉ thị ISSR Kết quả khuếch đại trên

74 cây Hồ tiêu, tạo ra 248 vạch băng, trong đó có 247 dải đa hình (99,60%) Mức

độ đa dạng di truyền giữa Piper spp ở Hải Nam là cao, với chỉ số thông tin trungbình của Shannon (I) là 0,283 và da dang di truyền trung bình của Nei (H) là 0,194

Hệ số tương đồng di truyền (GS) dao động từ 0,548 đến 0,976 Và khoảng cách ditruyền trong loài đao động từ 0,104 đến 0,28

Anupama và ctv (2015) nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền các loài thuộcchi Hồ tiêu trên cơ sở chỉ thi SSR 16 SSR đã được sử dụng dé đánh giá cho 23 loàiPiper, Có 6 chỉ thị đa hình tạo ra 48 alen Số lượng alen trên mỗi locus thu được vớimỗi chỉ thị thay đổi từ 4 đến 11 alen với trung bình 8 alen trên một locus Gia triPIC của mỗi chỉ thị khác nhau cho tat cả các locus SSR va nằm trong khoảng từ0,15 đến 0,32 Phân nhóm tạo ra với đữ liệu SSR đã chia 23 loài Piper thành tamnhóm, ba trong số đó được chia thành các cum phụ Các chỉ thi SSR ở P nigrum L.phân định rõ ràng sự đa dạng giữa các loài Ấn Độ và các giống Hồ tiêu ngoại Do

đó những chỉ thị này có thé được sử dụng một cách hiệu quả dé nghiên cứu đa dạng

di truyền của chi Piper trên các loài

Kumari và ctv (2019) đã thực hiện nghiên cứu đặc điểm microsatellite trên

bộ gene kết quả đánh giá cho thấy có tổng số 69.126 SSR được xác định từ trình tựtrên bộ gen của cây Hồ tiêu Tần số SSR là 158 SSR/1 MB, một SSR có độ dài 6,3

kb SSR có nhiều motif khác nhau, trong đó dạng dinucleotide là phố biến nhất(48,6%), tiếp theo là trinucleotide (23,7%) và lặp hỗn hợp (20,62%) Một bộ 85SSR đã được sử dụng và đã khuếch đại được 74 trình tự có kích thước mong đợi Sửdụng 50 SSR trong 80 SSR dé đánh giá đa dang di truyền của 30 loại dòng Hồ tiêucho thấy 4 nhóm khác biệt

18

Hơn nữa, chức nang cross species transferability của SSR đã phân được 9loài tiêu khác nhau Các SSR được xác định có thể ứng dụng trong các loài khácthuộc chi Piper mà chưa biết về bộ gen của chúng.

1.9.2 Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền cây Hồ tiêu trong nước

Các nghiên cứu về cây về kỹ thuật canh tác, phân bón, thổ nhưỡng và phòngchống bệnh hại cho cây Hồ tiêu đã được đầu tư và chú trọng trong những năm gầnđây, tuy nhiên các nghiên cứu chuyên sâu về sinh học phân tử: đánh giá đa dạng ditruyền phân tử, sự phát sinh loài hay ứng dụng chọn giống phân tử trên cây Hồ tiêuthì rất hạn chế và ít được báo cáo

Huỳnh Chan Khôn (2006) thực hiện nghiên cứu sử dụng 19 mỗi RAPD déđánh giá đa dạng di truyền của 11 giống Hồ tiêu sưu tập tại Vũng tàu Kết quả chothay có 4 trong 19 môi rapd nghiên cứu là cho sản phâm khuếch đại trên ca 11giống giá trị tương đồng từ số liêu băng khuếch đại giữa các giống Hồ tiêu biếnthiên từ 0,34 đến 0,97

Nguyễn Văn An và Nguyễn Tăng Tôn (2012) nghiên cứu đánh giá đan dạng

di truyền hình thái của 20 giống Hồ tiêu được trồng ở các tỉnh phía nam Kết quảcho thấy ở mức khoảng cách đa dạng trung bình 8,17, hai giống Hồ tiêu nghiên cứuđược chia làm 3 nhóm chính Trong đó có mười cặp giống Hồ tiêu có quan hệ ditruyền với nhau và khá gần gũi và 38 cặp giống có quan hệ di truyền khác nhau dựatrên khoảng cách di truyền của đặc điềm hình thái

Nguyễn Thị Huyền Trang và ctv (2021) nghiên cứu mối quan hệ di truyềncủa các giống tiêu ở Tây Nguyên và vùng Nam Bộ dựa trên so sánh trình tự genrbcL của các giống tiêu thu thập được với đữ liệu ngân hàng gen NCBI Kết quảcho thấy các giống Việt Nam có nhiều thay đổi về trình tự nucleotide ở gen rbcL sovới các giống chau A 15 giống tiêu nghiên cứu được chia làm 2 nhóm chính, trong

đó nhóm II có nhiều đột biến quan trọng xây ra ở vị trí nucleotide 59282 và 59295.Khoảng cách di truyền giữa nhóm II với các giống tiêu Châu Á (0,024 + 0,005) caohơn khoảng cách di truyền nhóm I (0,001 + 0,001)

19

Chương 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thời gian, địa điểm

2.1.1 Thời gian nghiên cứu

Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 8/2020 đến tháng 3/2022

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu

Đề tài thực hiện việc đánh giá một số chỉ tiêu hình thái và chỉ tiêu nông họccủa 15 quan thé giống Hồ tiêu trồng tại các nông hộ lựa chọn trên địa bàn tinh BinhPhước và tại Trung tâm nghiên cứu và phát triển cây Hồ tiêu tỉnh Gia Lai

Các nội dung liên quan tới sinh học phân tử được thực hiện tại Viện nghiên

cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường — Trường Dai học Nông Lâm Tp Hồ Chí

Minh

2.2 Vật liệu, thiết bị và hóa chất thí nghiệm

2.2.1 Vật liệu nghiên cứu

Tổng số 15 quan thé giống Hồ tiêu (5 cá thé/quan thé) tương ứng với 15giống Hồ tiêu được trồng ở các hộ dân trên địa bàn các huyện/ thị xã thuộc tỉnhBình Phước bao gồm: Thành Phố Đồng Xoài; huyện Lộc Ninh và trồng tại Trungtâm nghiên cứu và phát triển cây Hồ tiêu tỉnh Gia Lai (bảng 2.1)

Bảng 2.1 Danh sách 15 quần thê giống Hồ tiêu sử dụng trong nghiên cứu

TT Tên giông địa Ký hiện Nơi thu Tọa độ Tuoi giông

N: 13°57°58,2”

E: 107°52754,8”’

N: 13°57°56,7”’ E: 107°52’53,3”’

2.2.2 Hóa chất và thiết bị thí nghiệm

2.2.2.1 Hóa chất

a) hóa chất li trích DNA:

dung dịch li trích Buffer CTAB (4% w /v cTAB; NaCl 1,4 M; 100 mM

Tris-HCl, pH 8; EDM 20 mM; PVP 2% và 0,1% v / v b-mercaptoethanol); chloroform:

iso-amyl alcohol (24: 1); Isopropanol; Ethanol va dung dich TE.

c) Hóa chat PCR:

- MyTaqMix, 2x (Meridian Bioscience Inc., Mỹ)

- Primer SSR dựa theo nghiên cứu được công bố của tác gia (Kumari va

ctv, 2019)

c) Hóa chất dùng trong điện di:

Hóa chất dùng trong điện di gồm: thang chuẩn DNA Ikb và 100bp(HyperLadder 1kb và HyperLadder 100bp, Meridian Bioscience Inc., Mỹ); thuốc

nhuộm - Midori Green Nucleic Acid Staining Solution (Bulldog Bio, Mỹ); dung dịch đệm TBE (1X): Boric acid (Merk, Đức), Ethylenediaminetera acetic acid (Sigma, Mỹ), Tris Base (Merk, Đức)

2.2.2.2 Thiét bi thi nghiém:

a) Thiết bị do đếm các chỉ tiêu nông học, hình thái ngoài dong ruộng:

Thước lase; kính ngắm; máy định vi GPS; thước kẹp, tuoc day

b) Thiết bị phân tích phòng thí nghiệm:

Đề tài sử dụng các thiết bị phòng thí nghiệm Sinh học phân tử thuộc bộ mônsinh học phân tử công nghệ gen và tế bào- Viện nghiên cứu công nghệ sinh học vàmôi trường- trường đại học Nông Lâm TPHCM.

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp thực hiện nội dung 1: Đánh giá sự đa dạng di truyền cácquần thể giống Hồ tiêu dựa trên các các đặc điểm hình thái học

Các đặc điểm hình thái học được đánh giá theo tiêu chí hướng dẫn bởi ViệnTài Nguyên di truyền thực vật Quốc tế

22

a) Đánh giá các đặc điểm hình thái học của các quần thể giống Hồ tiêu

(1) Chiều cao cây (cm): chiều cao của cây xác định tương ứng chiều cao trụ tiêu đãphủ tán Do 5 trụ sau đó lấy giá trị trung bình

(2) Đường kính tán (cm): Do và lay giá trị trung bình 2 đường thang vuông góc(3) Chiều dài lá: Do chiều dai 5 lá/ trụ; đo 5 trụ/ quan thé sau đó lấy giá trị trung

bình

(4) Chiều rộng lá: Do chiều dai 5 lá/ trụ; đo 5 trụ/ quan thé sau đó lấy giá trị trungbình

(5) Hình dang lá: Quan sát xác định hình dang (oval, elipe )

(6): Kiều gân lá: Quan sát dé xác định kiểu gân: chân chim, xương cá

(7): Màu sắc lá non: Quan sát bằng cảm quan

(8): Mau sắc lá già: Quan sát bằng cảm quan

b) Đánh giá các đặc điểm nông học của cacquan thể giống Hồ tiêu

(1) Số gié/ cành cấp 1: đếm số gié/ cành cấp 1/trụ, đếm 5 trụ / quan thé va lay kết

(8) Dung trọng hat (g/l): Phơi khô hạt tiêu đến độ âm khoảng 12%, dùng ống dong

thé tích 1 lít để đong, sau đó đem cân khối lượng hạt tiêu vừa đong ta được dungtrọng hạt.

(9) Tỷ lệ hạt tươi/ hạt khô: Phơi khô Ikg hạt tiêu tươi đến độ 4m khoảng 12%, cânkhối lượng hạt tiêu khô thu được, tính tỷ lệ

Tiến hành xử lý các số liệu liên quan tới các chỉ tiêu hình thái học bằng phầnmềm Excel và phân tích số liệu

2.3.2 Phương pháp thực hiện nội dung 2: Đánh giá sự đa dạng di truyền cácquần thể giống Hồ tiêu bằng chỉ thị phân tử SSR

a) Phương pháp tách chiết DNA

DNA các mẫu lá tiêu được phân lập theo quy trinh (Doyle và Doyle, 1990)

có chỉnh sữa: 5 g mô lá tươi được nghiền 600u1 dung dich li trích Buffer CTAB

(4% w/v cTAB; NaCl 1,4M; 100 mM Tris-HCl, pH 8; EDM 20 mM; PVP 2% và 0,1% v / v b-mercaptoethanol).

Ủ mẫu ở 60°C trong 30 phút, sau đó ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút ởnhiệt độ phòng.

Hút 400 il nổi sang tube mới, thêm 400 pl chloroform: iso-amyl alcohol (24:1) lắc đều và ly tâm ở 10000 vòng / phút trong 5 phút ở nhiệt độ phòng

Hút 300 ul nổi sang tube mới, thêm 300 pl chloroform: iso-amyl alcohol (24:1) lắc đều và ly tâm ở 10000 vòng / phút trong 5 phút ở nhiệt độ phòng

Hút 200 pl nỗi sang tube mới, thêm 120 pl Isopropanol, lắc đều và ủ ở -20°Ctrong 30 phút, sau đó ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút.

Đồ bỏ dịch nổi, thêm 400 pl Ethanol 70°, ly tâm 12000 vong/phut trong 3phút, thực hiện lại lần 2, sau đó đồ bỏ dịch nỗi, phơi khô Thêm 50 ul TE và bảo

quản ở tủ đông -20°C.

b) Phương pháp kiểm tra DNA

Phương pháp định tính DNA bằng điện di

Cách tiến hành:

24

- Pha gel agarose với nồng độ 1%: Cân 0,125 g agarose cho vào 12,5 mldung dịch TAE 0,5 X Dun sôi bang lò Viba ở bước sóng 650 W cho đến khiagarose tan hoàn toàn Dé nguội đến khoảng 60°C.

- Đồ gel, chờ agarose đông

- Load mẫu vào các giếng với tỷ lệ 10 uL loading dye thuốc nhuộm va 5 plDNA mẫu

- Chạy điện di ở điều kiện 80 V, 100 mA, thời gian 20 phút

Cho gel vào máy GelDoc đọc kết qua Nếu mẫu có DNA thì băng DNA sẽphát sáng dưới dạng vạch trên gel điện di Độ tập trung và độ đậm nhạt của băng

điện đi phản ánh độ tinh sạch và nồng độ cao hay thấp của mẫu DNA

Phương pháp định lượng DNA bằng quang phổ kế

- Giá trị ODaso/ODaso = 1,8 đến 2,2 thì dịch trích DNA được coi là tinh sạch

- Hàm lượng DNA được tính theo công thức:

DNA (ng/uL) = [(62.9 * OD260nm) — (36 * OD280nm)] * Độ pha loãng

DNA sau khi tach chiết và kiểm tra định tinh, định lượng sé được được phaloãng trong nước cất vô trùng đến nồng độ 15 ng /uL Bảo quản ở 4° C dé dùng choviệc chạy PCR với mỗi SSR

c) Thực hiện PCR- SSR

Để giúp quan sát rõ các vạch băng khuếch đại trên kết quả PCR-SSR, đề tài

kế thừa 11 chỉ thị SSR có kích thước đoạn khuếch đại có độ lớn từ 200-450bp trong

nghiên cứu của Kumari và cộng sự năm 2019, (bảng 2.2).

5 mau DNA tương ứng 5 cá thé/ quần thê giống được chạy PCR lần lượt với

11 primer SSR Tổng 15 quan thể tương ứng với 825 phan ứng, thí nghiệm bố tríkhông lặp lại.

Phản ứng PCR thể tích 20ul bao gồm 15ng DNA, 10 pl MyTaq Mix 2X, 0,5

ul primer F, 0,5 HÌ primer R và 8 wl nước khử ion (bang 2.4).

Chu trình nhiệt phản ứng PCR-SSR của 11 primer đã được tôi ưu hóa tai

Viện nghiên cứu công nghệ sinh học và môi trường- trường đại học Nông Lâm

TPHCM Nhiệt độ bat cặp tối ưu cho 11 primer là 55°c (Bảng 2.3)

25

Bảng 2.2 Danh sách và trình tự 11 primer SSR được sử dụng trong nghiên

cứu (Kumari va cộng sự năm 2019)

SSR Kích thước

T Prim Forward primer Reverse primer 7

moti đoạn khuêch