Khóa luận tốt nghiệp Nông học: Xác định nồng độ chất điều hòa sinh trưởng và giá thể phù hợp đối với quá trình nhân giống in vitro và thuần dưỡng cây hồng hạc (Philodendron billietiae)

TÓM TẮTĐề tài nghiên cứu “Xác định nồng độ chất điều hòa sinh trưởng và giá thé phùhợp đối với quá trình nhân giống in vitro và thuần dưỡng cây Hồng Hạc Philodendronbillietiae” đã được t

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NONG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA NÔNG HỌC

Fi 2 2 ok ok ok

KHOA LUAN TOT NGHIEP

XÁC ĐỊNH NONG ĐỘ CHAT DIEU HÒA SINH TRUONG VA

GIA THE PHU HOP DOI VOI QUA TRINH NHAN GIONG

IN VITRO VA THUAN DUONG CAY HONG HAC

XÁC ĐỊNH NONG ĐỘ CHAT DIEU HÒA SINH TRUONG VÀ GIÁ THẺ PHÙ HỢP ĐÓI VỚI QUÁ TRÌNH NHÂN GIÓNG

IN VITRO VÀ THUẦN DƯỠNG CÂY HÒNG HẠC

(Philodendron billietiae)

Tac gia

NGUYEN THANH THONG

Khóa luận được đệ trình dé đáp ứng yêu cầu

LỜI CẢM ƠN

Con xin cảm ơn Ba Mẹ và Gia Đình luôn bên cạnh, tin tưởng và ủng hộ con trong

suốt thời gian qua

Em xin gửi lời cảm ơn đến Ban Giám Hiệu Trường Đại học Nông Lâm Thành

phố Hồ Chi Minh đã tạo điều kiện, cơ hội môi trường dé học tập và rèn luyện

Em xin gửi lời cảm ơn đến tat ca các Thầy Cô Khoa Nông học đã giảng day và

tạo điều kiện cho em học tập rèn luyện Những kiến thức mà Thầy Cô đã dạy sẽ là hành

trang cho các chặng đường phía trước.

Em xin tran trọng gửi lời cảm ơn đến Thay Bùi Minh Trí và Thầy Nguyễn Cao

Kiệt, đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt

Xin chân thành cảm ơn!

Tp Hồ Chí Minh, thang 8 năm 2023

Sinh Viên

Nguyễn Thành Thông

il

TÓM TẮT

Đề tài nghiên cứu “Xác định nồng độ chất điều hòa sinh trưởng và giá thé phùhợp đối với quá trình nhân giống in vitro và thuần dưỡng cây Hồng Hạc (Philodendronbillietiae)” đã được tiễn hành tại phòng cấy mô thuộc Khu thực nghiệm Bộ môn Sinh lý

- Sinh hóa Khoa Nông học, Trường Dai học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh từtháng 02/2023 đến tháng 08/2023 Mục tiêu của nghiên cứu là xác định được nồng độ

BA va NAA thích hợp cho sự nhân chéi của cây Hồng Hạc, xác định được nồng độ

NAA thích hợp cho việc hình thành rễ của cây Hồng Hạc và xác định được giá thể phù

hợp cho sinh trưởng của cây Hông Hạc ở giai đoạn vườn ươm.

Nghiên cứu đã tiến hành 3 thí nghiệm Thí nghiệm 1 là thí nghiệm nhân chồi,được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, hai yếu tố gồm 9 nghiệm thức và 3 lần lặplại Yếu tố B là yếu tố nồng độ BA ở các mức: 1,0 mg/L; 2,0 mg/L và 3,0 mg/L Yếu tố

N là yếu tố nồng độ NAA ở các mức là 0,1 mg/L; 0,2 mg/L và 0,3 mg/L Thí nghiệm 2

là thí nghiệm hình thành rễ, được bó trí theo kiểu hoàn toản ngẫu nhiên, 1 yếu tố gồm 6nghiệm thức va 3 lần lặp lại Yếu tố nồng độ NAA ở các mức là 0,0 mg/L; 0,1 mg/L;

0,2 mg/L; 0,3 mg/L; 0,4 mg/L và 0,5 mg/L Thí nghiệm 3 là thí nghiệm khảo sát các loại

giá thé, được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, 1 yêu tố với 4 nghiệm thức và 3 lầnlặp lại Yếu tố giá thể khảo sát là giá thé Mun dừa, Trau và Phân bò với tỷ lệ Trấu : Phân

bò : Mụn dừa lần lượt là: (50 : 50 : 0), (40 : 40 : 20), (30 : 30 : 40) và (20 : 20 : 60)

Kết quả thí nghiệm đạt được là ở môi trường MS bổ sung nồng độ BA 1,0 mg/L

va NAA 0,1 mg/L cho kết quả nhân chồi tốt nhất với số chéi là 13,95 chéi và chiều caochổi là 1,59 em Môi trường MS bé sung nồng độ NAA 0,3 mg/L là tốt nhất cho quátrình tạo rễ với số rễ là 4,07 và chiều dài rễ là 3,97 cm Giá thé phù hợp nhất dé chuyềncây Hồng Hac in vitro ra ngoài vườn ươm là giá thể Trấu : Phân bò : Mun dita với tỷ lệphối trộn (20 : 20 : 60) cho tỷ lệ sống cao nhất đạt 97,77%

MỤC LỤC

Trang TTFEHH?TÍSbiti6612560125561021E219455036555515865E85355853.0-434545568455658953.3Ẹ4ãGE5E65555 53v s3582EESE350848L56 58 3508548105 i

Yêu cÂÙU 2-52-5221 2122122122121122121121121121111211111111111111111111111111111111 11c rreg 2

%8 | neChương! TÙNG DUAN TATE ncucceancnnaemennmenmeonmemananens 4

1.1 Giới thiệu về cây Hồng Hac - 2-2-5252 S222S22122EE2E221221212212123 2121212 xe 4

BDTV ĐT sen se asenativon omen tons cise socal eo senso cre iene igtTgmgniguiosgegrsaiixioe dỗ 4

1.1.2 Ngun géc lich 0 4 51.1.3 Đặc điểm hình thái cây Hồng Hac cccccccessessssscessssssesseessssssessssseeseesseeneeseeneessees 51.1.4 Điều kiện sinh trưởng, phát trién cây Hồng Hạc 2-22 ©522225522222£: 61.2 Tình hình phát triển hoa, cây kiếng trên thế giới và ở Việt Nam - 61.2.1 Tình hình phát triển hoa, cây kiểng trên thế giới -2 22©2222z+25z225z+: 61.2.2 Tình hình phát triển hoa, cây kiếng ở Việt Nam 22©52 522 +S2E+2zz2z22se2 7L3 Sư lược về nuối cây rổ 16 WO sc ccsernccsensynnzermertensioienvennyesenistomieietevemniiaomernienee 8

1.3.2 Sự phát triển ngành nuôi cấy mô - 2 2 2222EE+2EZ2EEZEEE2EE22E22E222222222xee 81.3.2.1 Sự phát triển ngành nuôi cấy mô trên thế giới - eeceeeeeeeeneeeees §1.3.2.2 Sự phát triển ngành nuôi cấy mô ở Việt Nam -2- 2 2¿22222z+22z2zzzzx2 101.3.3 Lợi ích của phương pháp nhân giống bằng nuôi cấy mô - 1]1.3.4 Cơ sở của nuôi cây mô tế bào thực vật 2 2+2+22+E22E22E2222222122222222 22-2, 12

1V

1.3.4.1 Tính toàn năng của tế bào -2¿- 2222222122122122122112112711211211211211 2121 cze 121.3.4.2 Sự phân hóa và phản phân hóa của tế bảo 2 2¿252222222222z+zzzzzzzzxz 12

1.3.5 Các nhóm chất điều hòa sử dụng trong thí nghiệm 2 222 22z55z552£- 13

I6 13 1.3.5.2 Cytokinin 8 14

1.3.6 Các bước chính trong nuôi cây mô tế bao thực vật -2225z25z55z5522 151.4 Một số giá thé sử dụng trong thí nghiệm 2-22 2©2222EE2EE22EZ2EE22E222EZE222zzz 16

152) Lại Viet NHĨsesniseiisnses015555 034656453 4536083355555E482)N16ES00LS3À3883i603GS804/5G5003835NG885889 18

Chương 2 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - 20

2.1 Ni dung thi nghi6m 0110157 — 20

2.2 Thời gian va địa điểm thí nghiệm 2- 2 2 2S2E£+E22E2E22EZE2E2E22222222222 2e 20

HS 171010 rff†? ng TaaeseaeenoantnoniotratggtgA SEGDSGELAAEGEL-EEGSNEEE00000000 202A, Vat Liệu: CHỪNG BIỂ srssesnsseeslssobirtiobetnEi ĐIGSGIĐ0190DR2HS9480550190Đ9E-SAEEHRGISERSSBDESDJNSSSGSHEI40/0288 21

2.4.1 Mẫu giống 2-2: 2-2122 21221221221221221221211111121111211121112121212122121 xe 212.4.2 Môi trường nuôi cấy trong thí nghiệm - 2-22 ©22222222E+2EEZ2E2+222z2z2zze 212.4.3 Thiết bi, dụng cụ và hóa chất 2+ 2+ Ss+SSS2E22E921211211211211211211211 21221 x62 23E : ee 23

2AB.2) DUNG lỔ Ùksxixáss6ss6y 65151 61366856155800550683310065633305813558955I6E05351SSEE43ESS.004G34138801E900ERSEES2UGGHA5535 23

2.4.3.3 Hóa chất - ccc 222tr Hee 23

AeA WAU CU RBG ssccscsgescsesossdicgdlldisodtkiibadbibdloagsuzosEokEuzai3iii0.i8diididt-ickooisigExSEBssedbdossoziErn die 23 2.5 Phone ph ap tht 18 W1 CMe ois sss vssenecesenvesumnssrasenersnnssantaa ssi erinsaseumemrieimnaeeny 24

2.5.1 Thí nghiệm 1: Anh hưởng của nồng độ BA va NAA đến sự hình thành chéi của

cây Hồng Hae int Vi//O 2-©52©52222222222122512212232211221211211221121122121121121211 1e re 24P0 N0) 24

2:3:L:2 Cach thre CHỜ HIỂU assess bán n6 Hưng g0 11011 Sik IS EH.43àSSãS48SAERSESESSELEXEEGSXA138 13-85: 8840148388 25

2.5.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến sự hình thành rễ của cây Hồng

170/77 20— 25

2.5.2.1 BO tri thi mghi@mr ec 4 ẢẢ 25

25.2.2, Cách thức thực W161) ccccccsesscceeussersssacsecsreseesmewnsensvenimcneverenwercienareneeviuas 26

2.5.2.3 Cac chỉ tiêu và phương pháp theo dõi - ceeecsceeeseeecneescseeseneeaens 27

2.5.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của 4 loại giá thé lên sự phát triển của cây Hồng Hạc

TT COSI VUOT ƯỚHLsssxz66s6564616ã6630i6108gc6g508HGGS64GGSI2G04GE44GGESEN:3EiS6251GSSG(GEAEGSLcSGiGGgBESGGI080G208020 27

PT Nhi 0)0000)0)(20 NT nu 27

2.9.3.2 Cách thức thực hẲiỆN các nebiiiiinELYES111111 115111536 5001595121011410081012518 28 2.5.3.3 Các chỉ tiêu theo dõi và phương pháp theo dõi eee eects 28

2.6 Phương pháp xử lý và thống kê số liệu -2¿2©++22++22++EE+ztz+zzz+zrzzzex 29Chương5 KẾT GUÁ VA THA Ti A exeneeanedineodidobsdistigktgbdss64kipagssgse 303.1 Ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến quá trình nhân chồi của cây Hồng Hạc 303.2 Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến quá trình tạo rễ của cây Hồng Hạc 383.3 Ảnh hưởng của các loại giá thể lên sự sinh trưởng của cây Hồng Hạc giai đoạn

3.4 Từ các kết quả thông qua ba thí nghiệm, đề tài xin đề xuất một quy trình nhân

giống cây Hồng Hặạc 2-2252 222222222122122112212211211211271121121111111211211 2112121 xe 47KET LUẬN VÀ DE NGHỊ - 2-5 ©s++seEeeereerxerrerrxerrerrserserrsrrserrerrsrree 48TÁI LIƑU THIÊN BAA ueneneenaeeeinainianinirdiinniangtdikdgiiodingiikdiiitinbgSNdiLS00828688 49

VI

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIET TAT

ANOVA Analysis of variance (Phân tích Phuong sai)

BA 6 - Benzyladenine

Ctv Cong tac vién

IAA 3 - Indole acetic acid

IBA Indole - 3 - butyric acid

Lt Lan lặp lại

MS Murashige va Skoog

NAA 1 - Naphthalene acetic acid

NSC Ngày sau cay

DANH SÁCH CÁC BANG

Bảng 2.1 Thành phan môi trường MS được sử dụng trong thí nghiệm 22Bảng 2.2 Mã hóa các nghiệm thức tương ứng với các nồng độ BA và NAA sử dụngtrong thí nghiệm tao chồi cây Hồng Hặạc - 2-22 2 ©2222222ESE2EE22E2EEzEEzzzzszev 24Bảng 2.4 Nồng độ NAA sử dụng tương ứng với 6 nghiệm thức trong thí nghiệm đánh

giá sự hình HH! TỔ neeeesernekanieorkinietpDASithv2S060180003012003948500000110S51000450130/29014000003983809700180 26

Bảng 2.6 Số lượng cây/nghiệm thức và tổng số cây của thí nghiệm đề đánh giá hiệuquả của 4 loại giá thỂ 2-22 ©222222222221223122122122112211211221221121121121121121 211 11c 27Bang 3.1 Anh hưởng của nồng độ BA và NAA đến thời điểm hình thành chéi (NSC)gia cñy Tông Hạo ft VD ea 30Bảng 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến số chồi (chéi) cây Hồng Hạc tạisầu: Thi điểnH Khiếu A nc eens american inanneshasanlBang 3.3 Anh huong cua nồng độ BA va NAA đến chiều cao chéi (cm) Hồng Hạc tạicặc thời điểm Sc) | 1 ee 34Bang 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ BA va NAA đến số lá (lá) của cụm chéi Hồng Hạcgiai đoạn in vitro ở các thời điểm khác nhau -©22©5225sc222zsezscsssszscssce-. 36Bảng 3.5 Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến chiều cao cây, số lá và số rễ của cây

Hồng Hạc in vitro tại các thời điểm khác nhau 52-52 222SS£S22E£2E£E2Ez£E£EzErxcrxee 39Bang 3.6 Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến chiều chiều dài rễ của cây Hồng Hạc invitro ở thời điểm tuần thứ 4 sau trồng, -2-22-52222222222222212232212212211221 2222 re 41Bảng 3.8 Ảnh hưởng của các loại giá thể đến tỷ lệ xuất vườn của cây Hồng Hạc giai

COAT WOT UI OID sce ngntoik th ah GR wsnnaes sean Sã8S0L3530888088SSE)AlGGBSERbGS813%:T0B83ICEBi3Sg230883540530352-083gi.gh4msei 45

Bang 3.9 Lược toán hiệu quả kinh tế trồng 1000 bau Hồng Hac (đồng) 46

Vili

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Sơ đồ bồ tri thí nghiệm 2: 22222222E2+2E22EE22EE222E22222223222222222e 24Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2 - 2-2 2+SS+SE+SE2EE2EE2EE22E22E225221223223222222222e2 26Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 3 2-2: 2 2S+SS22E£EE#2E2EE22E22E2212322122322122222Xe2 28Hình 3.1 Cụm chồi Hồng Hạc ở tuần thứ 4 sau cấy -2 -zc-5s5cs s. .-3Hình 3.2 Cây Hồng Hạc ở tuần thứ 4 sau cấy 22-22- 55222222 ccErcrrerrrerrrree 42Hình 3.3 Tỷ lệ (%) sống của cây Hồng Hạc ở tuần thứ 4 sau trồng 43Hình 3.4 Cây Hồng Hac sau 4 tuần trồng trên 4 loại giá thé khác nhau 45

GIỚI THIỆU

Đặt vấn đề

Ngày nay, khi kinh tế xã hội phát triển, cuộc sống của mỗi người dan ngày càngnâng cao thì con người không chỉ đòi hỏi ăn ngon, mặc đẹp mả còn có nhu cầu thưởngthức, hưởng thụ Trồng hoa kiếng nói chung và kiếng lá nói riêng là một nhu cầu khôngthê thiếu nhằm trang trí nhà cửa, tạo cảnh đẹp góp phần làm nâng cao chất lượng cuộc

sông.

Hoa kiếng không những là một nhu cầu tinh thần của người dân, mà còn là cơ sở

cho một ngành nông nghiệp, đã trở thành một loại hang hóa đặc biệt, tạo công ăn việc

làm cho hàng ngàn lao động, mang lại lợi nhuận cao góp phan vao việc tăng trưởng kinh

tế Sản xuất hoa kiêng mang đặc điểm thâm canh với cường độ cao trên cùng diện tích

đất, cho phép sử dụng hiệu quả đất đai, thu hút nhiều nguồn vốn đa dạng trong nhân dân.Đặc biệt nhu cầu tiêu thụ hoa kiếng các loại từ các nhà hàng, khách sạn, cơ quan công

sở, các công trình xây dựng mới cũng góp phần thúc đây mạnh phát triển ngành hoakiếng

Cây kiểng lá rất phong phú về mau sắc và chủng loại, bao gồm những loại cây có

bộ lá đẹp, nhiều màu sắc và có tuổi thọ cao Ưu điểm của kiếng lá là nhỏ gọn, khôngchiếm nhiều diện tích, không đòi hỏi khat khe các điều kiện môi trường cũng như kỹ

thuật chăm sóc mà vân có thê tạo nên được vẻ đẹp và sự sang trọng.

Cây kiếng lá bao gồm nhiều giống khác nhau như: Hồng Hạc, Hồng Ngân, PhúQuý, Vạn Lộc, Thiên Nga Mỗi loại kiếng lá sở hữu một vẻ đẹp riêng nhờ bộ lá độc đáocủa mình Trong đó, cây kiếng lá Hồng Hạc là một giống kiểng lá mới thuộc họ Ráy(Araceae), với đặc điểm có bộ lá đẹp, sức sống tốt, đễ chăm sóc, thích hợp cho việc

trang trí trong nhà cũng như sân vườn.

Dé tạo ra một lượng cây đáp ứng nhu cau thị trường, khâu nhân giống luôn đượcchú trọng Tuy nhiên, các nhà vườn thường nhân giống cây Hồng Hạc theo phương pháptruyền thống, đó là kích thích các chồi bên phát triển từ đó chiết và chăm sóc thành cây

1

mới Với cách nhân giống này cây Hồng Hạc được tạo ra rất chậm, không đáp ứng đủnhu cầu thị trường Do đó, cây giống còn được nhập từ các nước như Thái Lan, Brazil,

Costa Rica Chính vì vậy giá thành của cây khá cao trên thị trường, giá cây giống Hồng

Hạc có thé giao động từ 80 đến 100 nghìn cho một cây con, cây trưởng thành có thé lênđến vài triệu hoặc vài chục triệu tùy vào kích thước của cây

Dé góp phan dam bao số lượng cây giống Hồng Hạc cho thị trường trong nước,cung cấp đủ nguồn giống tốt cho sản xuất quy mô lớn, các nhà vườn cần có sự đổi mớitrong qui trình nhân giống Một trong những giải pháp triển vọng trong quá trình nhângiống dang được các nhà nghiên cứu quan tâm đó là áp dụng kỹ thuật nuôi cay mô và tếbảo thực vật trong công tác nhân giống Giải pháp này có thé tao ra các cây giống đồngnhất, có chất lượng tốt với số lượng lớn trong thời gian ngắn Song cách nhân giống nàylại chưa được nhân rộng và chưa áp dụng dé nhân giống cây Hồng Hac

Từ những ly do trên, đề tai nghiên cứu “Xác định nồng độ chất điều hòa sinhtrưởng và giá thé phù hợp đối với quá trình nhân giống in vitro và thuần dưỡng câyHồng Hạc (Philodendron billietiae)” được thực hiện

Pha chế hóa chất chính xác đúng nồng độ thí nghiệm

Bồ trí thí nghiệm phù hợp với quy phạm thí nghiệm trong phòng

Tạo được cây Hồng hac hoàn chỉnh, đồng nhất, sinh trưởng tốt, có giá trị thươngphẩm

Ghi nhận được hình ảnh các giai đoạn trong quá trình nuôi cấy

Giới hạn đề tài

Đề tài thực hiện nuôi cấy cây Hồng Hac in vitro thuộc giống Hồng Hạc cam ởgiai đoạn nhân nhanh chồi, tạo rễ tại phòng nuôi cay mô, tỷ lệ sống và xuất vườn trên

từng loại giá thể giai đoạn vườn ươm tại Khu thực nghiệm Bộ môn Sinh lý - Sinh hóa,

khoa Nông học, Trường Dai học Nông Lâm Thành phé Hồ Chí Minh từ tháng 2 năm

2023 đến tháng 8 năm 2023

Chương 1

TONG QUAN TAI LIEU

1.1 Giới thiệu về cây Hồng Hạc

Loai: Philodendron billietiae

Hinh 1.1 Cay Héng Hac

(Nguén: MOW Garden)

1.1.2 Nguồn góc lịch sử

Chi Philodendron nỗi tiéng trong giới cây cảnh, phô biến như cây có tán lá rộng,

dễ trồng, và hữu ích cho việc trang trí nội thất, cảnh quan ở vùng khí hậu âm áp Nhiềuloài được cho là có khả năng leo tốt với rễ trên không, một số khác có lá mọc thành cụm

và một số có thé đạt kích thước khổng 16 Chi Philodendron có khoảng 700 loài, baogồm nhiều giống lai và giống cây trồng đã được chọn lọc (Croat, 1990)

Philodendron billietiae lần đầu tiên được phát hiện vào năm 1981 trong rừngmưa nhiệt đới của vùng đất thấp ở Guiana - Pháp Cây ở trong tình trạng không bị sâubệnh, hình dạng của lá có sự đặc biệt Mẫu cây sống đã được thu thập và đưa đến trồngtại nhà kính của Vườn Bách thảo Quốc gia Bi Sau khi trồng được hai năm, cây bắt đầu

ra hoa và được chứng minh là một loài chưa được mô tả Vào tháng 2 năm 1993, tác giả

đã phát hiện ra một cây trưởng thành đang ra hoa Loài này được Croat mô tả khoa học

lần đầu tiên vào năm 1995 (Croat, 1995)

1.1.3 Đặc điểm hình thái cây Hồng Hạc

Kiéng lá Hồng hac được xem là một trong những dòng kiếng lá được ưa chuộngtrong giới chơi cây trong nhà, cây có những chiếc lá mọc thắng, cuống lá xòe rộng Mỗichiếc lá được che bởi một lá bắc màu xanh lá đến màu cam nhạt Đặc điểm của lá bắcnày là phần lớn không có gân và nhanh chóng rụng Đối với cây non, các lóng đài và rễ

có màu nâu tía trong khi ở cây trưởng thành, các lóng ngắn hơn và lá mọc thành cụmgần đỉnh thân, thân cây cũng dày hơn và tạo thành nhiều màng lưới tại vị trí đốt cây.Cuống lá trưởng thành có màu vàng cam, đặc biệt khi cây phát triển đưới ánh sáng mạnh.Cụm hoa tự mọc thành chùm 2 - 5 cái ở nách lá và mỗi cái được bao bọc bởi một lá bắcmàu lục nhạt Trong canh tác, giai đoạn bat đầu ra hoa dién ra vào tháng 12 và kéo daihai hoặc ba tháng Lúc nở hoa, đài hoa xanh thường nở muộn trong ngày và có thé chỉ

nở trong 12 giờ Phiến mo có màu trắng bên trong, ống của phiến có màu đỏ hoa cà Bênngoài bề mặt của mo và gân giữa của phiến lá cho thấy một số những chấm nhỏ mau tia

thường là do các mật hoa ngoại lai (Billiet, 1996).

1.1.4 Điều kiện sinh trưởng, phát triển cây Hồng Hạc

Cây Hồng Hạc sinh trưởng và phát triển tốt ở nhiệt độ 20 - 25°C với nhiệt độ banđêm tối thiểu là 18°C Cây phát triển tốt nhất ở nơi có đủ ánh sáng nhưng tránh ánh sángmặt trời trực tiếp Phân hữu cơ phải được giữ âm quanh năm và không được dé khô hoàntoàn Nước được cung cấp thường xuyên từ tháng 4 đến tháng 10 nhưng phải tránh ngậpúng Cây trồng trong chậu cần có sự hỗ trợ của một cây chống hoặc cây sào phủ rêu âm.Phân bón lỏng có thé được cung cap trong mùa hè va mùa thu Vào năm thứ hai, việcthay chậu diễn ra vào tháng 4 Khi được trồng trong điều kiện tốt, cây phát triển chỉ bốn

lá mới mỗi năm (Billiet, 1996)

1.2 Tình hình phát triển hoa, cây kiếng trên thế giới và ở Việt Nam

1.2.1 Tình hình phát triển hoa, cây kiểng trên thé giới

Theo Đỗ Đình Thục (2019), diện tích trồng hoa, cây kiếng trên thế giới ngày càngtang Chỉ tính riêng giá tri sản lượng hoa thế giới đã đạt trên 20 ty USD Các nước cógiá trị sản lượng hoa lớn nhất là Nhật Bản 3,731 tỷ USD, Mỹ khoảng 3,270 tỷ USD,riêng Hà Lan là nước trồng hoa hàng đầu thế giới với khoảng 1.500 trang trại trồng hoa

có tổng diện tích gần 10 nghìn ha, trồng gần 4.000 loài hoa khác nhau, sản xuất khoảng1,7 ty bông hoa và 600 triệu chậu hoa cảnh mỗi năm, trong đó khoảng 70% là dé xuấtkhẩu

Giá trị xuất khâu hoa cây cảnh của thế giới hàng năm đều tăng lên Trong đó thịtrường hoa cây cảnh Hà Lan chiếm gần 50% Các nước như Colombia, Tây Ban Nha,Kenia, Ecuado, Đức, Canada, Pháp, Mỹ, Israel có doanh thu từ xuất khâu hoa trên 100triệu USD mỗi năm Tỷ lệ tăng hàng năm của thị trường xuất khâu hoa thế giới là trên

10%.

Diện tích phát triển cây kiếng lá ngày cảng mở rộng Kiéng lá ở Thai Lan đượctrồng để xuất khẩu sang thị trường Nhật, Mỹ, Thụy Điền, Ý kiểng lá dùng để trang tri

đi kèm với hoa, hoặc chưng trong nhà, ngoài vườn tạo không gian xanh tự nhiên Quy

mô mỗi nhà vườn khoảng 5 - 10 ha Theo tính toán của người trồng kiếng lá, mỗi nămmột cây có thể cho 12 lá, giá xuất khẩu là 6 bath/1 lá (tương đương 45.000 VND) Nhưvậy, doanh số xuất khẩu hàng năm của họ có thê đạt 1 tỷ đồng/ha

1.2.2 Tình hình phát triển hoa, cây kiếng ở Việt Nam

Theo số liệu điều tra (Viện nghiên cứu rau quả, 2021), hiện cả nước có khoảng45.000 ha hoa, cây kiếng, thu nhập bình quân trên cả nước là 520 triệu đồng/ha/năm.Như vậy so với năm 2000, diện tích hoa, cây kiếng năm 2020 đã tăng 6,6 lần, giá trị sảnlượng tăng 27,5 lần (đạt 23.400 tỷ đồng, trong đó xuất khâu x4p xi 80 triệu USD), mứctăng giá trị thu nhập/ha là 2,1 lần (đã có nhiều mô hình đạt 1,5 tỷ đến 2,5 tỷđồng/ha/năm) Tốc độ tăng trưởng này là rất cao so với các ngành nông nghiệp khác

Tại Thành Phố Hồ Chí Minh, hiện đối với ngành nông nghiệp, diện tích sản xuấthoa, cây kiếng trên địa bàn Thành phố từ năm 2016 - 2020 đạt 2.510 ha (vượt 12% sovới chỉ tiêu kế hoạch đề ra là 2.250 ha) Tuy nhiên, 2 năm 2020 - 2021, dịch bệnh Covid

- 19 diễn ra phức tạp, kéo theo tình hình sản xuất, tiêu thụ hoa cây kiếng bị giảm theo

(Dinh Mạnh Hiệp, 2020).

Từ năm 2016 đến nay, nhu cầu hoa cây kiếng bình quân tăng khoảng 15%/năm.Đây được xem là tiền đề cho việc phát triển trồng hoa, cây kiếng thành hàng hóa lớn.Sản xuất, kinh doanh trồng hoa, cây kiếng hiện đã trở thành ngành có tiềm năng lớn vàphát triển tại nhiều địa phương Diện tích sản xuất hoa, cây kiếng trên địa bàn Thànhphố đến năm 2022 tăng mạnh Giá trị sản xuất hoa, cây kiếng bình quân đạt khoảng 1 tỷđồng/ha/năm (Lê Thị Thúy Ai, 2020)

Về công tác sưu tập, nhập nội, chọn tạo và nhân giống hoa kiếng tại Trung tâmCông nghệ sinh học thành phố Hồ Chi Minh, sưu tập được 5 giống kiếng lá, 8 giống lanrừng, 2 giống hoa nền mới Từ khi thực hiện chương trình đến nay, Trung tâm đã sưutập và tuyên chon 212 giống hoa, cây kiểng các loại, trong đó, có 84 giống kiếng lá, 17giống hoa nền, 75 giống lan Dendrobium, 1 giống lan Mokara, 5 giống lan Cattleya va

30 giống lan rừng Trong đó, các giống kiếng lá mới gồm Thiên long, Hồng hạc, Vạnlộc, Thiên phú, Huyết long, Tuyết trắng, Hạnh phúc, Ái hồng, Má hồng đào đang đượcthực hiện nhân giống bằng kỹ thuật in vitro (Trung tâm Công nghệ Sinh học thành phố

Hồ Chí Minh, 2020)

1.3 Sơ lược về nuôi cấy mô tế bào

1.3.1 Khái niệm

Nuôi cay mô tế bào thực vật là phương pháp nuôi cấy in vitro mô hoặc tế bào đã

tach rời khỏi cơ thé thực vật trong môi trường thích hợp dé chúng trở lại trạng thái chưa

phân hóa có khả năng phân chia tế bào và biệt hóa thành mô, cơ quan, phát triển thànhcây con mới Tất cả mọi tế bào của một cơ thể thực vật đều có tính toàn năng, nghĩa làchứa bộ gen y hệt nhau Do đó, tất cả các tế bào của một cơ thé đề có khả năng tổng hợpnhững loại protein - enzym giống nhau và nếu tế bào được nuôi dưỡng trong môi trườngthích hợp đều có thé phát triển thành cây nguyên ven đặc trưng cho loài và ra hoa, kếtquả bình thường (Nguyễn Quang Thạch, 2009)

1.3.2 Sự phát triển ngành nuôi cấy mô

1.3.2.1 Sự phát triển ngành nuôi cấy mô trên thế giới

Theo Nguyễn Đức Lượng (2006), lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật gắn liềnvới những sự kiện nổi bật như sau:

Năm 1902, Haberlandt là người đầu tiên đưa giả thuyết của Schleiden vàSchwann vào thực nghiệm dé chứng minh tính tồn thế của tế bào, nhưng ông đã thất bại

trong nuôi cây các tê bào đã phân hóa tách từ lá một sô cây một lá mâm.

Năm 1922, Kotte và Robbins đã thành công trong việc lặp lại thí nghiệm của Haberlandt với đỉnh sinh trưởng tách từ rễ của của một cây hòa thảo trong môi trường

lỏng chứa muối khoáng va glucose Chỉ tồn tại một thời gian sau đó chậm dan và ngừng

lại.

Năm 1934, White đã thành công trong việc phát hiện ra sự sống vô hạn của việcnuôi cấy tế bảo rễ cà chua trên môi trường lỏng chứa muối khoáng, glucose, dịch chiếtnam men Sau đó chứng minh có thé thay thé nước chiết nấm men bằng hỗn hợp loại

vitamin B: Thiamin (Bì), Pyridoxin (Be), Nicotinic acid.

Năm 1935, Thimann đã phát hiện ra Auxin (IAA) trong mô thực vật Nhiều nhànghiên cứu đã sử dụng IAA cùng các vitamin bổ sung vào môi trương nuôi cấy đã thuđược kết quả tốt

Năm 1939, cùng với Nobercourt, Gautheret đã thành công trong việc duy trì sự

sinh trưởng trong thời gian dai của mô sẹo cà rốt (Daucus carota) trên môi trường rắn

bằng thạch

Những năm 1940, nhiều chất điều hoà sinh trưởng thuộc nhóm IAA được tônghợp thành công và được sử dụng nhiều trong nuôi cấy kết quả cho thấy chất này có tácdụng kích thích tạo mô sẹo, phân chia tế bào

Năm 1948, Steward xác nhận tác dụng của nước dừa trên mô sẹo cả rot Trongthời gian này nhiều chat sinh trưởng nhân tạo đã được nghiên cứu và tổng hợp thành

công như: a-Naphthalene acetic acid (NAA), 2,4 Dichlorphenoxy acetic acid (2,4D).

Nhiều tác giả nhận thấy cùng nước dita, NAA va 2,4D đã giúp tao mô seo, gây phânchia tế bào ở nhiều đối tượng thực vật mà trước đó rất khó nuôi cấy

Năm 1951, Skoog và Miller đã phát hiện ra các hợp chất có thể điều khiển sựnhân chdi

Năm 1955, Skoog đã tìm ra chất điều hòa sinh trưởng trong dịch chiết cai be là 6

- furfurylaminopurine và đặt tên là Kinetin, có tác dụng kích thích sự phân bao.

Năm 1956, Murashige và Skoog đã cải tiên môi trường cây đánh dâu một bước tiễn trong kỹ thuật nuôi cây mô làm cơ sở cho việc nuôi cây nhiều loại cây và vẫn còn

được sử dụng cho đến nay

Năm 1957, Skoog va Miller công bố các kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của tỷ

lệ Kinetin/Auxin trong môi trường nuôi cấy đối với sự hình thành cơ quan của mô sẹothuốc lá Khi giảm thấp tỉ lệ Cytokinin/Auxin, mô sẹo có khuynh hướng phát trién rễ.Ngược lại thì dẫn đến khuynh hướng tạo chồi ở mô sẹo Hiện tượng này được xác nhậntrên nhiều cây khác nhau và đóng góp rất lớn vào sự điều khiến sinh trưởng, phát triểncủa mô tế bảo trong nuôi cấy

Năm 1959, Melchers và Becgman đã nuôi liên tục các tế bào đơn trong bình códung tích khá lớn bằng cách sục khí liên tục và thỉnh thoảng thu hoạch tế bào, thêm dung

dịch dinh dưỡng mới.

Năm 1960, Bergman công bố có thé dung phương pháp loc đơn giản dé thu đượchầu hết là tế bào đơn mà không phải là dính cụm Các tế bào đơn có thể gieo trên môi

9

trường, tiếp tục phân chia và tiếp tục tái tạo lại mô sẹo Cùng với kỹ thuật gieo tế bàocủa Bergman, nhiều tác giả khác đã thành công trong việc tạo cây hoàn chỉnh từ tế bảo,

chứng minh được tính toàn thé của tế bao

Năm 1960, Cooking (Anh) công bồ có thé dùng men Cellulose dé phân hủy vỏCellulose của tế bảo thực vật, kết quả thu được các tế bảo không có vỏ bọc gọi là

Vào năm 2020, Rossa và ctv đã thực hiện vi nhân giống Bucephalandra sp Kếtqua cho thay rằng môi trường MS bồ sung 2 mg/L BA cho kết quả tạo chồi tốt nhất Môitrường MS bồ sung 2 mg/L BA, 1 mg/L Thidiazuron là môi trường tối ưu dé nhân chéi

và các chồi tạo rễ tốt trên môi trường MS bồ sung 2 mg/L IBA

Năm 2021, Rittirat va ctv đã tiến hành nghiên cứu về thidiazuron tạo ra sự táisinh thực vật với tan số cao từ các mẫu chéi của A barteri var nana

Hiện nay, nuôi cay mô thực vật được ứng dụng và phát triển mạnh mẽ trong việcnhân giống, chọn tạo giống, vào việc sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học va

vào nghiên cứu lý luận di truyền thực vật bậc cao.

1.3.2.2 Sự phát triển ngành nuôi cấy mô ở Việt Nam

Nuôi cấy mô thực vật du nhập vào Việt Nam từ năm 1960 ở miền Nam và đầunhững năm 1970 ở miền Bắc, nhưng chỉ bắt đầu chú trọng từ năm 1975 Phòng thínghiệm nuôi cay mô tế bào dau tiên được xây dựng tại Viện Sinh học, Viện Khoa họcViệt Nam do Lê Thị Muội khởi xướng (Trần Văn Minh, 2005)

Bước đầu phòng tập trung nghiên cứu các phương pháp nghiên cứu cơ bản trong

điêu kiện Việt Nam, như nuôi cây bao phân, nuôi cây mô sẹo và Protoplast Và đã thành

công khi nuôi cay bao phan lúa và thuốc lá được công bố vào năm 1978 (Lê Thi Muội

va ctv, 1997).

Từ giữa 1980 đến nay, hướng nghiên cứu ứng dụng nuôi cay mô tế bao thực vật

phát triển mạnh Nhưng kết quả đáng khích lệ đã đạt được trong lĩnh vực vi nhân giống

khoai tây Một số kết quả bước đầu đã được ghi nhận trong lĩnh vực chọn dòng tế bảokháng bệnh, chọn dòng chịu muối, chịu mat nước Nuôi cay bao phan dé tao dòng thuần

đã được ứng dụng nhiều tại Viện Công nghệ Sinh học và Di truyền giống Nông nghiệp.Nuôi cấy các cây được liệu quý để bảo tồn nguồn gen và tạo các dòng tế bào có hàmlượng sinh học quan trọng cũng đã và đang được phát triển (Lê Xuân Thám, 1980)

Năm 2020, Trung tâm Ứng dụng và Đổi mới sáng tao Vĩnh Phúc đã ứng dụngthành công công nghệ nuôi cây mô tế bào dùng dé cứu sống phôi mam của Lan Hạc vàHoang Thao của Tam Đảo Đây là 2 loại lan đặc hữu của Vườn Quốc gia Tam Dao,được đưa vào Sách đỏ, có nguy cơ tuyệt chủng Nhờ ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô,

từ mẫu quả lan thu thập được tại vườn quốc gia, nhóm nghiên cứu của Trung tâm đã

thực hiện kỹ thuật vào mẫu, tiến hành lưu giữ và bảo tồn 2 giống cây này trong phòng

thí nghiệm công nghệ sinh học tại Trung tâm (Sở Khoa Học và Công Nghệ Vĩnh Phúc,

2020).

1.3.3 Lợi ích của phương pháp nhân giống bằng nuôi cấy mô

Theo Bùi Bá Bồng (1995), lợi ích của phương pháp nhân giống bằng nuôi cấy

mô như sau:

— Tạo ra các cây con đồng nhất và giống như cây mẹ

— Nhân một số lượng cây con lớn từ một cá thể ban đầu trong một thời gian ngắn

— Tạo ra các cây con sạch bệnh.

— Không chiếm nhiều diện tích, không bị ảnh hưởng bởi thời tiết, điều kiện ngoại

cảnh.

— Một giống cây quý có thé được nhân ra nhanh chóng dé đưa vào sản xuất

— Việc trao đôi giống quốc tế các nguồn gen sạch bệnh nuôi trong ống nghiệm được

thực hiện dé dàng.

11

— Thông qua nuôi cay mô có thé ứng dụng việc chuyên gen cho những thực vật bậccao dé chọn tạo giống mới theo yêu cầu sản xuất.

1.3.4 Cơ sở của nuôi cấy mô tế bào thực vật

1.3.4.1 Tính toàn năng của tế bào

Haberlandt (1902) lần đầu tiên cho rằng bất kỳ tế bào của một cơ thê sinh vật đabào đều có kha năng tiềm tàng dé phát triển thành một cá thé hoàn chỉnh Đó là tính toànnăng của tê bảo.

Hay nói cách khác, “tính toàn năng của tế bào thực vật” nghĩa là tế bảo có khảnăng tái sinh thành cây hoàn chỉnh từ một khối mô hoặc tế bào ban đầu Đặc tính nàyđược sử dụng rộng rãi trong nuôi cay mô tế bào thực vật, mô và cơ quan thực vật haynuôi cay tế bào trần trên các môi trường nhân tao in vitro Trong điều kiện thích hop(môi trường có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thích hợp), những tế bào nay sẽ đượckích thích để phân hóa, phát sinh hình thái, tái sinh phôi hoặc phát sinh cơ quan và sau

cùng là thành cơ quan hoàn chỉnh.

1.3.4.2 Sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào

Cơ thể thực vật trưởng thành là một chính thê thống nhất bao gồm nhiều cơ quanchức năng khác nhau, được hình thành từ nhiều loại tế bào khác nhau Tuy nhiên tat cảcác loại tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào ban đầu (tế bảo hợp tử) Ở giai đoạn đầutiên, tế bao hợp tử tiếp tục phân chia thành nhiều tế bao phôi sinh chưa mang chức năngriêng biệt (chuyên hóa) Sau đó từ các tế bào phôi sinh nay chúng tiếp tục được biến đổi

thành các tê bào chuyên hóa đặc hiệu cho các mô, cơ quan có chức năng khác nhau.

Sự phan phân hóa tế bao là sự chuyền hóa các tế bào phôi sinh thành các tế bào

mô chuyên hóa, đảm nhận các chức năng khác nhau và trong một số trường hợp cầnthiết, ở điều kiện thích hợp, các tế bào có thé trở về hình dang tế bao phôi sinh và phânchia mạnh mẽ, quá trình này gọi là phản phân hóa tế bảo

Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một quá trình hoạt hóa, ức chếcác gene Trong quá trình phát triển cá thể, có một số gene được hoạt hóa (mà vốn trướcnay bi ức ché) dé cho ra tính trang mới, còn một số gene khác bị đình chi hoạt động

Điều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc phân tử DNA củamỗi tế bào, điều này khiến quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật được hài hòa.

Mặc khác, khi tế bào nằm trong một khối mô của cơ thê thường bị ức chế bởi các

tế bào xung quanh Khi tách riêng từng tế bào hoặc giảm kích thước của khối mô sẽ tạo

điêu kiện thuận lợi cho sự hoạt hóa các gene của tê bào.

Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật là kết quả củaquá trình phân hóa và phản phân hóa tế bao (Bùi Bá Bing, 1995)

1.3.5 Các nhóm chất điều hòa sử dụng trong thí nghiệm

Bùi Trang Việt (2002) cho rằng: các chất điều hòa sinh trưởng là những chất có

bản chất hóa học khác nhau nhưng có tác dụng điều tiết các quá trình sinh trưởng, phát

triển của cây Các chất này gồm các Phytohormone và chất điều hòa sinh trưởng tônghợp Về đại cương, các chất này được chia làm hai nhóm có tác dụng đối kháng về sinh

lý Các chất kích thích sinh trưởng và các chất ức chế sinh trưởng Trong nuôi cấy in

vitro, thường sử dụng hai nhóm chính có vai trò cơ bản là Auxin va Cytokinin.

1.3.5.1 Auxin

Auxin là một chất có nhân Indole, có công thức hóa học là CioH9O2N Auxin tựnhiên được tìm thấy nhiều ở thực vật là Indole Acetic Acid (IAA) IAA có dẫn xuất là

1 - Naphthalene Acetic Acid (NAA) và 2.4 - Dichlorophenoxyl Acetic Acid (2,4 - D).

NAA duoc Went và Thimann phát hiện năm 1937 và là một Auxin nhân tạo có hoạt tinh

mạnh hơn Auxin tự nhiên IAA Trong cây IAA tập trung nhiều trong các mô non (chi,

lá đang phát triển), trong hạt, trong hạt nảy mam

Vai trò của Auxin

Auxin có vai trò điêu hoa quan trọng trong việc kìm hãm sự phat triên của choi

bên (duy trì hiện tượng ưu thế ngọn)

Auxin gây tính hướng động của cây (hướng quang và hướng dia).

Auxin kích thích quá trình tăng trưởng nhờ tác dụng kéo giãn tế bào Sự kéo tếbảo điễn ra đồng thời trên hai trục (trục ngang và trục dọc) Nhờ vào tác dụng này mà

Auxin giúp tăng diện tích lá, tăng đường kính và chiều dài cành, thân, rễ; làm củ, quảphinh to ra.

Auxin kích thích sự tăng trưởng của qua, ngăn ngừa hiện tượng rụng lá, quả, kích

thích sự ra rễ

Ứng dụng

Auxin kích thích sự ra rễ đặc biệt là rễ bất định trên cành giâm, cành chiết và trên

mô nuôi cấy Trong nuôi cay mô, Auxin (IBA, NAA) cũng có tác dụng tạo rễ tốt

Tang đậu quả, tăng sinh trưởng của qua va tao quả không hạt, người ta xử lý Auxin dưới dạng NAA 20 ppm, 2,4 - Dichlorophenoxyl Acetic Acid (2,4 - D) 10 ppm

cho một số cây trồng như cà chua, cam, chanh

Dé kéo dai sự chín của quả và dùng bảo quản quả lâu, sử dụng dung dịch NAA

— Isopentenyladenine (IPA), Cytokinin tự nhiên và các chat tổng hợp

Cytokinin thường gap là Kinetin và 6 - Benzyl Aminopurin (BA) Cytokinin được

vận chuyên từ mô phân sinh đỉnh rễ (là nơi tổng hợp nhiều Cytokinin trong cây) Do đó,Cytokinin có hàm lượng cao nhất ở phôi, quả non, rễ

Vai trò của Cytokinin

Trong giai đoạn đầu của phát sinh phôi soma, sự có mặt của Auxin là rất cần thiết

dé kích thích sự phân bào, nhưng giai đoạn sau phôi phải được nuôi cấy trên môi trường

có Cytokinin dé biệt hóa chéi Cytokinin cùng Auxin điều tiết chu trình tế bào, kíchthích sự phân chia tế bào một cách mạnh mẽ

Nếu Auxin/Cytokinin > 1: kích thích ra rễ; Auxin/Cytokinin < 1: kích thích hìnhthành chồi; Auxin/Cytokinin = 1: kích thích hình thành mô sẹo

Ứng dụng

Cytokinin kích thích sự phát triển mầm hoa

Cytokinin cảm ứng hình thành chỗi cây từ mô sẹo nuôi cấy, duy trì sự trẻ hóa củacác cơ quan và loại bỏ ưu thế ngọn cũng như hạn chế sự phát triển của rễ

Cytokinin được sử dụng chủ yếu trong nuôi cấy mô thực vật: TDZ (Thiazuron),

BA (6 - Benzylaminopurine), Kinetin (6 - Furfuryl Amino Purine) và Cytokinin tự nhiên

trong nước dừa được ứng dụng rộng rãi trong môi trường tạo chéi in vitro

1.3.6 Các bước chính trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

Theo Nguyễn Văn Ây (2019) nuôi cấy mô gồm 5 giai đoạn:

Giai đoạn 1: Chuẩn bị cây làm vật liệu ban dầu

Chon cây mẹ dé lay mẫu thường là cây ưu việt, khỏe mạnh, đảm bảo sạch bệnh

và có giá trị kinh tế cao Chọn cơ quan dé lay mẫu thường là chồi non, đoạn thân, đoạnthân có chồi ngủ, hoa non, lá non, mô được chọn dé nuôi cây mô là các mô có khảnăng tai sinh cao, sạch bệnh, giữ được các đặc tinh sinh học quý của cây mẹ va ôn định.Tùy vào điều kiện mà giai đoạn này có thé kéo dài từ 3 - 6 tháng

Giai đoạn 2: Khử trùng mẫu (nuôi cấy khởi động)

Là giai đoạn khử trùng đưa mẫu vào nuô cấy in vitro Trong nuôi cấy mô, khửtrùng mẫu cấy là rất quan trọng nhằm đảm bảo mẫu cấy không bị nhiễm khuẩn, tỷ lệsống cao, mẫu tồn tại và sinh trưởng tốt Thông thường sử dụng phương pháp nhiệt, lọc,hóa chất, dé khử trùng mẫu cấy

Giai đoạn 3: Nhân nhanh chồi

Đây là giai đoạn quan trọng trong nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôicay mô và tế bào thực vật nhằm mục đích tăng sinh khối thé nhân giống Vật liệu nuôicấy là các thé chỗồi, môi trường nuôi cấy thường giống môi trường tạo thể chdi , đôi khinồng độ chất sinh trưởng giảm thấp cho phù hợp với quá trình nhân giống kéo dài Điềukiện nuôi cấy thích hợp giúp cho quá trình tăng sinh diễn ra nhanh

Giai đoạn 4: Tao cây hoàn chỉnh

15

Đây là giai đoạn cây con hoàn chỉnh có day đủ lá, thân, rễ dé chuẩn bị chuyên ravườn ươm Cây con phải khỏe mạnh để năng cao sức sống khi ra môi trường bìnhthường Các chất có tác dụng tạo chỗi được loại bỏ, thay vào đó là các chất kích thíchquá trình tạo rễ Điều kiện nuôi cấy khác với điều kiện tự nhiên bên ngoài, đây là một

15 bước làm thích nghỉ trước khi tách ra khỏi điều kiện in vitro Sự ra rễ phụ thuộc vàonhiều yêu tổ, hàm lượng Auxin nội sinh, tỷ lệ C/N, ánh sáng, sự trẻ hoa của mau, kiểu

di truyền

Giai đoạn 5: Thich ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên

Dé đưa cây từ ông nghiệm ra vườn ươm với tỷ lệ sống cao, cây sinh trưởng tốtcần đảm bảo một số yêu cầu về tiêu chuẩn hình thái nhất định như số lá, số rễ, chiều caocây Cây con đã ra rễ được lấy khỏi ống nghiệm, rửa sạch agar và được đặt trong chậunơi có bóng râm, độ âm cao, cường độ chiếu sáng thấp Sau khoảng 2 tuần, cây đã bắtđầu thích nghi với điều kiện bên ngoài, lúc này có thể tăng cường độ chiếu sáng và hạ

am độ

1.4 Một số giá thể sử dụng trong thí nghiệm

1.4.1 Mụn dừa

Mun dừa là loại giá thé phổ biến được sử dụng rộng rãi ở hầu hết các loại cây

trồng vì nó khá rẻ tiền Mụn dừa là phụ phẩm vỏ dừa được xây ra hay đánh tơi được sử

dụng lại để làm giá thể Mụn xo dita không chứa mam cỏ dai hay mam bệnh va có nhiềutác dụng: phủ bề mặt chóng nóng chóng xói mòn, khả năng giữ nước cao, kích thích rễ

ra nhiều (Trương Thị Cam Nhung, 2016), ngoài thi trường hiện nay có ban các mun xơ

dừa đã được xử lý và có thể sử dụng trực tiếp

1.4.2 Trấu

Trấu là lớp vỏ ngoài cùng của hạt lúa và được tách ra trong quá trình xay xát.Trong vỏ trâu chứa khoảng 75% chất hữu cơ dé bay hơi sẽ cháy trong quá trình đốt vakhoảng 25% còn lại chuyên thành tro Chất hữu cơ chủ yêu gồm xenlulozo, lignin vàhemi - xenlulozo (90%), ngoài ra có thêm thành phần khác như hợp chất nitơ và vô cơ.Lignin chiếm khoảng 35 - 40% (Đinh Thị Tú Trinh, 2011)

1.4.3 Phan bò

Phân bò được sử dụng khi đã ủ hoai, có khả năng giữ âm tốt, dé phân hủy vàthường bón lót cho cây trồng hoặc trộn với các thành phần khác làm giá thể Cần phải ủphân bò thật kĩ trước khi sử dụng dé diệt trừ mam móng sâu bệnh, hạt cỏ dai, côn trùng.Phân bò sau khi ủ chứa mùn, muối khoáng, một phần chất hữu cơ chưa phân hủy, sảnphẩm trung gian của quá trình phân hủy có một lượng enzin, chất kích thích và các loại

vi sinh vật đo đó rất tốt cho cây trồng (Trần Diễm Mi, 2015)

1.5 Các nghiên cứu về nuôi cây mô đối với cây kiếng lá

1.5.1 Trên thế giới

Mariani va ctv (2011) đã tiến hành nhân giống in vitro Aglaonema var Cochin

bằng cách sử dung các chồi bên Kết quả cho thấy với 2 chéi ban dau sau 5 lần cấychuyên (10 tuần) trên môi trường MS có bồ sung 1,5 mg/L TDZ và 3 mg/L BAP có théthu được 1000 chéi mới Cây con ra rễ và phát triển trên môi trường MS có chứa 3 mg/L

IBA.

Haddad và ctv (2012) đã tiến hành nhân giống in vitro cây rang 6 phụng bằngphương pháp nuôi cấy bao tử Kết qua cho thấy sau hai tháng kể từ khi bắt đầu nuôi cấytrên môi trường nhân giống, bảo tử có hiện tượng ngậm nước và thé giao tử đã đượchình thành, chiều dài, chiều rộng, chiều cao thé giao tử trung bình đều tăng Giá trị đạtcao nhất 2,64 cm (chiều rộng), 9,28 cm (chiều đài), 2,81 cm (chiều cao) đã được thunhận khi bé sung 3,0 mg/L Ki và 0,1 mg/L NAA

Liew va ctv (2012) đã nghiên cứu tao mô seo từ lá cây aglaonema var Lipstik.

Kết quả cho thấy sau 16 tuần nuôi cấy trên môi trường MS bồ sung 5 mg/L IAA kết hợpvới 5 mg/l BAP hoặc 8 mg/L IAA kết hợp với 5 mg/L BAP thì có sự hình thành mô sẹovới màu sắc rất rõ ràng, có hình cầu với kết cấu bở

Palomeque và ctv (2019) đã đánh giá sự hình thành vô trùng của Monstera acuminata Koch và Monstera deliciosa Liebm từ 14 và cảm ứng hình thành cơ quan in

vitro của M Acuminata K từ thân của chéi non Tat cả các mẫu M Deliciosa ở cả hainghiệm thức, được nuôi cấy trong môi trường được bồ sung chất bảo quản nuôi cay môthực vật và các quy trình khử trùng khác nhau, đều sống sót, không bị ô nhiễm và hơn

17

80% hoạt tính tế bào được bảo tồn cho đến 49 ngày tuổi nuôi cấy Ở 35 ngày nuôi cấy,khử trùng trong Tween-20 + 20% Ethanol + 2,5% NaCIO, và cay mẫu trong môi trường

MS được bổ sung | mg/1 BAP, 0,5 mg/1 IAA và 0,1 mg/1 NAA, 7 chéi mới của thânđược tao ra Monstera deliciosa đã cho thay kha năng thích nghi với điều kiện in vitrocao hơn.

Rittirat và ctv (2021) đã tiến hành nghiên cứu về thidiazuron tạo ra sự tái sinhthực vật với tần số cao từ các mẫu chéi của A barteri var nana Kết quả cho thay rằngcác mẫu chéi ngọn được cắt từ cây con 90 ngày tuổi được nuôi cấy trên môi trường MS

bồ sung 7,0 mg/L TDZ cho tần suất hình thành chồi cao nhất (100%), số chéi tối đa(4,50 chồi/mẫu), chiều dài chéi (9,50 mm), số lá (16,75 lá /mẫu), chiều dai lá (13,22mm), chiều rộng lá (6,58 mm), hiệu suất ra rễ 100% và số lượng rễ (25,25 rễ/mẫu) sovới các môi trường bồ sung BAP hay kinetin Sau đó các cây con tái sinh hoàn chỉnh sẽđược trồng vào các chậu đất sét nhỏ chứa bông khoáng trong điều kiện nhà kính với tỷ

lệ sống 100% và phát triển mạnh mẽ mà không có bat thường nào về hình thái

1.5.2 Tại Việt Nam

Nguyễn Thị Hồng Vân (2007) đã nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống invitro cây Trạng nguyên, tiến hành nuôi cấy chỗồi ngọn và đốt thân trên môi trường MS

bồ sung BA 0,5 mg/l dé tao cum chéi Thi nghiệm đạt được 43,33 chồi/cụm Nuôi câylớp cắt ngang long thân va lá in vitro trên môi trường MS bồ sung BA ở hai nồng độ 0,8

- 1,0 mg/L và NAA ở các nồng độ 0,0 - 0,1 - 0,3 mg/L (đối với long thân) BA ở hainồng độ 0,8 - 1,0 mg/L va NAA ở hai nồng độ 0,1 - 0,3 mg/L (đối với mẫu lá) Chi tạo

rễ trên môi trường MS 1⁄3 Tỷ lệ sống sót của cây con ngoài vườn ươm là 60%

Nguyễn Văn Hiếu va ctv (2009) đã tiến hành nhân giống ba loại kiếng lá Lan ý

Mỹ, Dứa Diệp phúc và Lục dé đỏ từ đốt thân Kết quả cho thấy tỷ lệ mẫu sống vô trùngcao nhất với javel 1⁄2 Sự tạo chéi tốt nhất trên môi trường MS bồ sung BA 1,5 mg/L(Dứa diệp phúc), còn đối với cây Lục đề đỏ thì môi trường thích hợp cho sự hình thành

mô seo là MS bồ sung BA 5,0 mg/L kết hop NAA 0,1 mg/L

Pham Thi Thu Hang va ctv (2013) đã nghiên cứu nhân nhanh cay trầu bà cánh

phượng (Philodendron xanadu) Kết quả cho thay Môi trường tối ưu cho sự phát sinh

tạo chồi ban đầu cũng như nhân nhanh chéi là MS + 4 mg/L BA + 30g/1 đường + 6,5g/L agar với hệ số nhân chdi là 5,01, sau 4 tuần nuôi cấy với chiều cao trung bình là

0,95cm và số lá/chồi trung bình là 3,29 lá Môi trường có bồ sung than hoạt tính ở nồng

độ 1 g/L là môi trường tốt nhất cho sự ra rễ với tỷ lệ ra rễ là 100%, số rễ trung bình đạt9,22 rễ, chiều dài rễ 6,77 cm

Lê Văn Tường Huân (2015) đã nghiên cứu tái sinh cây từ mẫu cuống lá trongđiều kiện in vitro ở Kim phát tài Kết quả cho thay khử trùng mẫu Kim phát tài lay ngoàiđiều kiện tự nhiên bang dung dịch HgCl 0,1% trong thời gian 23 phút là thích hợp nhấttrong các khoảng thời gian thăm dò, cho tỷ lệ mẫu sống đạt 64,53% Môi trường MS có

có 3% sucrose, 0,8% agar và bổ sung 4 mg/L BA kết hợp với 0,1 mg/L NAA là môitrường tốt nhất cho tái sinh cây từ mẫu cuống lá của cây Kim phát tài trong điều kiện in

vitro.

Phạm Thị Thu Hiền (2022) đã nghiên cứu ảnh hưởng của nano bạc đến hiệu qua

tạo mẫu sạch và khả năng tái sinh chồi của cây Trầu bà thanh xuân (Philodendron

selloum) trong điều kiện in vitro Kết quả nghiên cứu cho thấy, việc sử dụng nano bạcvới nồng độ 150 ppm trong thời gian 40 phút có thé thay thé hiệu quả các chất khử trùngkhác trong nhân giống in vitro cây Trầu bà thanh xuân Bên cạnh đó, việc bố sung 6ppm nano bạc vào môi trường nuôi cấy còn có tác dụng kích thích sự phát sinh chồi, sựtăng trưởng và phát triển của chồi, hệ số nhân chồi đạt kết quả cao nhất

19

Chương 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nội dung thí nghiệm

Đề tài gồm 2 nội dung

Nội dung 1: Gồm 2 thí nghiệm được thực hiện trong phòng thí nghiệm mang tính

Nội dung 2: Gồm | thi nghiệm được thực hiện trong vườn ươm

Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của tỷ lệ phối trộn giá thé lên sự phát triển của câyHồng Hạc giai đoạn vườn ươm

2.2 Thời gian và địa điểm thí nghiệm

Đề tài được thực hiện bắt đầu từ tháng 1 năm 2023 đến tháng 8 năm 2023 tạiPhòng thực nghiệm nuôi cấy mô và Vườn ươm thuộc Khu thực nghiệm Bộ môn Sinh lý

- Sinh hóa, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

2.3 Điều kiện thí nghiệm

Nội dung 1: Được thực hiện tại phòng cay mô thuộc Khu thực nghiệm Bộ mônSinh lý - Sinh hóa, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

Điều kiện tại phòng nuôi cay mô

— Cường độ chiếu sáng: 2500 + 500 lux

— Thời gian chiếu sáng: 16 h/ngay

— Âm độ trung bình: 55%

— Nhiệt độ phòng nuôi cấy mô: 25°C + 2°C

Nội dung 2: Được thực hiện tại Vườn ươm Bộ môn Sinh lý - Sinh hóa.

Điều kiện tại vườn ươm:

— Mái che làm bằng vật liệu nhựa PE (Israel)

— Nhiệt độ: Cao nhất 35°C/Thấp nhất 24°C

— Ánh sáng nhẹ: 2500 lux

2.4 Vật liệu thí nghiệm

2.4.1 Mẫu giống

Mau Hồng Hạc sử dụng là cụm chồi Hồng Hạc in vitro được cung cấp tại cơ sở

nuôi cấy mô tư nhân địa chỉ 125 đường Thạnh Xuân 21, Thạnh Xuân, Quận 12, Thànhphó Hồ Chí Minh

2.4.2 Môi trường nuôi cấy trong thí nghiệm

Môi trường nuôi cấy cơ bản dùng trong thí nghiệm nuôi cấy in vitro là môi trường

MS (Murashige và Skoog, 1962) Môi trường bồ sung thêm 30 g/L đường, 7 g/L argar

và chất điều hòa sinh trưởng tùy theo thí nghiệm Môi trường nuôi cấy được điều chỉnh

về pH 5,8 Môi trường được hấp khử trùng ở 121°C, 1 atm trong 20 phút Thể tích môitrường: phân phối 50 mL/chai tam giác

21

Bảng 2.1 Thành phần môi trường MS được sử dụng trong thí nghiệm

KI 0,83

Vi luong

Na2MO4 0,25 CoCl›.6HzO 0,025 CuSO4.5H20 0,025 Na2EDTA.2H20 37,3 FeSO4.7H20 27,8

Myo-Inositol 100

Glycine 2,0 Vitamin Pyridoxine HC] 0,5

Nicotine acid 0,5 Thiamine HCl 0,1

2.4.3 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất

2.4.3.1 Thiết bị

Tủ cấy vô trùng (Việt Nam)

Nồi hấp khử trùng Tomy SS - 325 (Nhật)

May đo pH của Hana H98118 (Romania)

Cân điện tử EJ - 323A (Nhật)

Điện thoại chụp ảnh

2.4.3.2 Dụng cụ

Kéo, kẹp, dao cấy, đĩa, đèn cồn, ống đong 500 mL

Chai thủy tinh dé nuôi cây dung tích 250 mL

Cốc thủy tinh (50 mL, 250 mL, 1000 mL)

Binh xỊt Bình Minh 5L

Bao tay, túi bầu giá thể có kích thước 6 x 12 em

2.4.3.3 Hóa chất

Chất điều hòa sinh trưởng bé sung thuộc hãng Duchefa Biochemie: 6 - benzyle

amino purine (BA), 1 - Naphthalene acetic acid (NAA)

Cén 70°, cồn 96° (Việt Nam)

2.4.3.4 Vật liệu khác

Giá thé được sử dụng trong thí nghiệm:

Mụn dừa: Trước khi trồng cần phải xử lý bằng cách ngâm mụn dừa với nước sạchtrong vòng 2 - 3 ngày xả 1 lần Thực hiện lặp lại 3 lần

Trấu, Phân bò: Được xử lý với chế phẩm sinh học nam Trichoderma bằng cách

ủ trong vòng 10 ngày.

23

2.5 Phương pháp thí nghiệm

2.5.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến sự hình thành chồi

> ^ À :

của cây Hong Hac in vitro.

Mục tiêu: Xác định được nồng độ BA va NAA tốt nhất đến sự nhân nhanh chồi

của cây Hong Hac in vitro.

BINI | B2N1 | B3NI | B3N3 | B3N3 | B2N2 | B3N2 | B3NI | BIN3

B3N2 | BIN2 | B3N3 | B3N2 | BIN2 | B2NI | B2N3 | BIN2 | BINI

B2N3 | BIN3 | B2N2 | B2N3 | BINI | BIN3 | B3NI | B2NI | B2N2

Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1

BA và NAA với các nồng độ khác nhau.

2.5.1.3 Các chỉ tiêu và phương pháp theo dõi

Việc theo dõi đánh giá quá trình hình thành chồi được thực hiện 7 ngày/lần kéodài liên tục trong 4 tuần Trên mỗi ô cơ sở tiễn hành đo tất cả 15 mẫu:

— Thời điểm xuất hiện chồi (NSC): Thời điểm 50% số mẫu cấy xuất hiện chi

— Chiều cao của chéi (cm): Dùng thước chia vạch đo chiều cao của chéi, đo từ điểm

phân chéi đến đỉnh chồi cao nhất

— Số chồi/mẫu (chéi): Tổng số chồi đếm được/tổng số mẫu đếm

— Số lá/mẫu (1á): Tổng số lá đếm được/tổng số mẫu đếm

2.5.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến sự hình thành rễ của cây

Bảng 2.4 Nồng độ NAA sử dụng tương ứng với 6 nghiệm thức trong thí nghiệm đánh

giá sự hình thành rễ

Nghiệm thức Nồng độ NAA (mg/L)

N0 0,0

NI 0,1 N2 0,2

N3 0,3 N4 0,4

Mẫu cấy: là các cụm chỗi đã được chon từ thí nghiệm 1 va cấy qua môi trường

MS không bồ sung chất điều hòa sinh trưởng trong thời gian 3 tuần, các chéi trong cụm

chôi sẽ được tách ra va cắt thành các chôi mới có chiêu cao 1 em được cây vào bình tam

giác có chứa môi trường MS có bổ sung NAA ở các mức: 0,0 mg/L; 0,1 mg/L; 0,2 mg/L;

0,3 mg/L; 0,4 mg/L và 0,5 mg/L.

2.5.2.3 Các chỉ tiêu và phương pháp theo dõi

Việc theo dõi đánh giá quá trình hình thành rễ được thực hiện 7 ngày/lần kéo dài

liên tục trong 4 tuần Trên mỗi ô cơ sở tiến hành đo tất cả 15 mẫu:

— Số rễ/cây (rễ): Tổng (số rễ/cây)/ Tổng số cây khảo sát

— Chiều đài rễ (cm): Dùng thước chia vạch đo chiều dài rễ dài nhất, đo từ điểmphân rễ đến chóp rễ Ghi nhận ở thời điểm tuần thứ 4 sau cấy

— Chiều cao chổi (cm): Dùng thước chia vạch đo chiều cao của chéi, do từ điểmphân chéi đến đỉnh chồi cao nhất

— Số lá/mẫu (1á): Tổng số lá đếm được/tổng số mẫu đếm

2.5.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của 4 loại giá thể lên sự phát triển của cây Hồng

Hạc giai đoạn vườn ươm.

Mục tiêu: Xác định được giá thé cho tỷ lệ sống cao, phù hợp với sự sinh trưởng va pháttriển của cây Hồng Hac từ in vitro

2.5.3.1 Bồ trí thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên bao gồm 4 nghiệm thức với 3 lần

lặp lại.

Bảng 2.6 Số lượng cây/nghiệm thức và tông số cây của thí nghiệm dé đánh giá hiệu qua

của 4 loại giá thể

Nghiệm ¬ Số cây/nghiệm Tổng số

Giá thê thức thức cây

Cây con Hồng Hạc nuôi cấy in vitro từ thí nghiệm 2 đồng đều về chiều cao và số

rễ đạt chiều cao khoảng 3 cm được trồng trên bầu giá thể gồm trấu : phân bò : mụn dừa

ở các mức tỷ lệ: (50 : 50 : 0), (40 : 40 : 20), (30 : 30 : 40) và (20 : 20 : 60).

Việc Tưới nước được thực hiện vào buéi sáng và chiều bằng bình tưới có vòi

phun nhẹ, tưới vừa ướt không quá đẫm

2.5.3.3 Các chỉ tiêu theo dõi và phương pháp theo dõi

Theo dõi tỷ lệ sống và sự sinh trưởng của cây Hồng Hạc giai đoạn vườn ươm ởthời điểm tuần thứ 4 sau trồng Tiến hành đo 5 cây/ô cơ sở với các chỉ tiêu:

— _ Tỷ lệ sống của cây (%): Tông số mẫu cây còn séng/téng số mẫu cây con đã trồng

x 100.

— Chiều cao cây (cm): Dùng thước có vạch chia do từ điểm phân nhánh đến phanđỉnh sinh trưởng cao nhất

— Số lá/cây (14): Đếm số lá phát sinh trên mỗi cây

— Số rễ/cây (rễ): Đếm rễ phát sinh trên mỗi cây

— Tỷ lệ xuất vườn: Số cây đủ điều kiện xuất vườn/ tông số cây thí nghiệm (cây đủđiều kiện xuất vườn là cây đạt chiều cao khoảng 6 em, có từ 6 — 8 lá thật, sinhtrưởng tốt, khỏe mạnh, không bị sâu bệnh hai).

— Hiệu quả kinh tế: Tổng thu, tổng chị, lợi nhuận, tỷ suất lợi nhuận.

+

-E

+

+

Tổng thu (đồng/1000 bau): Tổng số cây xuất vườn x giá bán

Tổng chi (đồng/1000 bau): Cây con + giá thé + công lao động

Lợi nhuận (đồng/1000 bầu): Tổng thu - tông chi

Tỷ xuất lợi nhuận (lần): Lợi nhuận/tông chi phí

2.6 Phương pháp xử lý và thống kê số liệu

Số liệu được nhập thông qua mã QR code dựa trên Google Form, kết quả đượctính trung bình bằng phần mềm Excel 2016 và phân tích phương sai (ANOVA), trắcnghiệm phân hang Duncan trên phần mềm R 4.0.2 ở mức ý nghĩa 0,01 hoặc 0,05

29

Chương 3

KET QUA VÀ THẢO LUẬN

3.1 Ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến quá trình nhân chéi của cây Hồng

Hạc

Auxin la hormone đâu tiên được tìm ra, chúng anh hưởng tới sự tăng sinh của tê

bào, Cytokinin là dẫn xuất của adenine, đây là hormone liên quan chủ yếu đến sự phân

chia tế bào, sự thay đổi ưu thế ngọn, phân hóa chồi trong nuôi cấy mô

Auxin và cytokinin tương tác lẫn nhau theo một cách thức phức tạp và khác biệt

dé kiêm soát khả năng sinh trưởng của thực vat (Jones and Ljung, 2011) Khi kết hợp

BA là chất điều hòa sinh trưởng nhóm cytokinin va NAA là chất điều hòa sinh trưởngnhóm auxin với tỷ lệ auxin/cytokinin thấp sẽ kích thích sự hình thành chổi non và khởiphát sự tạo mới mô phân sinh ngọn chồi từ nhu mô

Bảng 3.1 Anh hưởng của nồng độ BA và NAA đến thời điểm hình thành chồi (NSC)

của cây Hong Hac in vitro

Nong độ BA (mg/L)

Nong độ NAA (mg/L) ï 5 5 Trung bình (N)

0,1 5,67 5.33 4,33 $11 0,2 6,00 5.33 4,67 5.33 0,3 6,00 5.33 5,00 5,44