Khóa luận tốt nghiệp Sư phạm Sinh học: Nghiên cứu sự ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy in vitro đến hàm lượng hoạt chất sinh học của cây gai ma vương (Tribulus terrestris L.)

Các thí nghiệm ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng lên sự sinh trưởng và hàm lượng hoạt chat sinh học trong cây Gai ma vương...--- 27 2.3.2.. Cùng với khoa học công nghệ phát trién, ngành

BỘ GIÁO ĐỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỎ CHÍ MINH

E2 LL os

TRAN THANH THUC

HAM LƯỢNG HOAT CHAT SINH HOC CUA

CAY GAI MA VUONG

(TRIBULUS TERRESTRIS L.)

KHOA LUAN TOT NGHIEP DAI HOC

NGANH SƯ PHAM SINH HOC

TP HO CHÍ MINH - 2023

BỘ GIÁO ĐỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỎ CHÍ MINH

to LL os

TRAN THANH THUC

(TRIBULUS TERRESTRIS L.)

KHOA LUAN TOT NGHIEP DAI HOC

NGANH SƯ PHAM SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DAN KHOA HOC

TS Trần Thị Tường Linh

CN Thái Lâm Ngọc Bảo Trâm

TP HÒ CHÍ MINH - 2023

LOL CAM ON

Đề hoàn thành khoá luận tốt nghiệp “Nghién cứu sự ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy in vitro đến hàm lượng hoạt chat sinh học của cây Gai ma vương (Tribulus terrestris L.)` tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc đến:

Cô TS Trần Thị Tường Linh đã giảng dạy, truyền đạt kiến thức cùng những kinh nghiệm quý báu Trong quá trình thực hiện đề tài, cô luôn tận tình hướng dẫn, chỉ ra những điểm sai sót và cho lời khuyên hữu ích Cô luôn động viên, chia sẻ va giúp đỡ tôi khi gặp những khó khăn trong quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu này.

Thay ThS Quách Văn Toàn Em, cô ThS Nguyễn Thị Thanh Tâm, cô Nguyễn Thị

Nga và cô Ha Thị Bé Tư đã luôn động viên và tạo điều kiện tốt nhất giúp tôi hoàn thành

nghiên cứu nay.

Ban chủ nhiệm khoa Sinh học, cùng quý Thảy, quý Cô trong khoa đã giảng đạy,truyền đạt kiến thức chuyên môn, kinh nghiệm và tạo mọi điều kiện giúp tôi hoàn thành

nghiên cứu.

Chị CN Thái Lâm Ngọc Bảo Trâm đã truyền đạt kiến thức cùng những kinh

nghiệm quý báu, hỗ trợ và cùng thực hiện đề tài với tôi.

Bạn Hoàng Thị Mỹ Ngọc và em Lý Quang Thiện đã đồng hành cùng tôi trong quá

trình thực địa thu mẫu và thực hiện đề tài ở phòng thí nghiệm.

Các bạn khóa 45 đã nhiệt tình giúp đỡ chúng tôi trong quá trình thực hiện đề tài.Cuối cùng, con xin cảm ơn sâu sắc đến gia đình, cha mẹ, anh chị em đã luôn làmhậu phương vững chắc, luôn động viên, day bảo dé tôi có được sự trưởng thành như

ngày hôm nay.

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 28 tháng 4 năm 2023

Tác giả

Tran Thanh Thức

MỤC LỤC

le (i0 -s3 s‡sä‡*+:'ÃẲẢẢ3£ỶŸỶÝÝÝỶỶÝỶÝ I

DANH MỤC BẢNG -.2-52-22222221122112221271117211721122111 1121172172171 ce I

DANE RAY 6 HIN iris cnc II

DANH MỤC CHỮ VIET TẮTT -2-722©2e£2Sxt2SEEcSEEZ2EEEcEEEzvrrzrrrsrrrsree Vv

Ol ie 6

I LÝ DO CHỌN DE TÀI 2 S56 SE 21112111 11 1171071111111 111121 2.11 6

II MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU - :-222222222222222222222222222112217211221 e2 7

TEE: NODIDUING INGHIEIN GUNG io siicssscsssscccsssssasscasscssnannsannssansassnarrcannannanscannaasae 7

IV PHAM VI NGHIÊN CU ccccccccssesssessesssesseesueesueesveesveessesscenncenneenncenesenesenes 7

CHƯNG; TRÔNG QUANG ca nenneoarentoirniarrenroeearoeeerertsarterntertieattesnies §

1.1 Đặc điểm thực vật học loài Gai ma VƯƠIHE:::tt:i2201121102116111031123112311231133359335953885 8

1.1.1 Vị trí trong bang hệ thống phân loại - 552 2222022122222 §

11D 9:7 (0000100: "ỸÝÝÝÝ“ ớớớ ÔOÔỒ §

1.1.3 Phân bó ¿22222202 22222221122112211211221112117211721122102212210221022112 002 1x2 9

[/1.4 Thành phôn(RBRINDBciaoeuiicio boss iiicii022110420122106a005) 9

UNS CONG GUNG canganatianiitiitititia51114113311611353113818368631383388518858588388335853983438188 10 1.1.6 Cong trình nghiên cứu trong Và ngoải nước ác se se 10

l6 o.oo o:44 11

I5] Riana yp fa nin BH TAGE cca sccosaczcszcs sszesccesecauss ces cavuessscatecersessesnsconseersesvecsnsatn II

521V öHIIOIVD VU sec c6 0 66281005500621112418155821032141231102821084191310113213/0139035 11432100 12

1.2.2.1, nh aaa 12

bi nẽ -.-‹œ& L 12

1.3 Sinh trưởng và phát triển của thực vật, s2 2s St 2222221112211 ccee 13

1.3.1 Giai đoạn sinh trưởng phat trién sinh đưỡng -2-.s¿- 13

1.3.2 Sự nảy mam của HRÙ::iszicccccszcc2z225622213221035122211551155316518851155818218851856888836858 13

1.3.2.1 Sự biến đơi hĩa sinh, sinh lí trong sự nảy mâm của HAỄ, 13

1.3.2.2 Anh hưởng của điều kiện ngoại cảnh đối với sự nay mam 14

1.3.3 Sự phát triển cây con 0 S0 SH TH ng H021 re l4

1.3.4 Anh hưởng của ánh sáng đến sinh trưởng của thực vật 15

1.3.5 Cơng trình nghiên cứu trong va ngoải NUGC Qe eects ceteeteeeeeeeeeees 16

1.4 Chiét xuat hop chất từ thực Vat ooo ececcceccsseseesessecseesessessecseeeteecesesseeetseeenvens 17

1.4.1 Kĩ thuật chiết tách hợp chất hữu co từ thực Vat c.ccccceecssecsessseeseeseeeoees 17

1.4.1.1 Xử lí mẫu CAY occ ees ccceceseeesneesnsesncesncesncesncssscssecsnecsnecsneennecnseanecens 17

1.4.1.2 Dung mơi dé chiết tach hợp chat ra khỏi mau cây 17

) AUUS RE thiaat BiBB tao ARI ccs nassecsacosancaseasscasacaaarcainaisvasacaascainaisoans 17

ALMA; Tina mẫu CRAG sce sssscsssassazsssvasszssscaserasasssssassssestssssseaasescsesesisoas 18

1.4.2 Điều kiện anh hướng qua trình tách chiẾt -.-:-55:552 5222252226 18

1.4.2.1 Những yếu tố thuộc về thành phan, cau tạo của nguyên liệu 18

1.4.2.2 Các yếu tổ thuộc về dung mơi co cv s20 se, 19

1.4.2.3 Các yếu tố thuộc về kĩ thuật ¿- 55c 26c St nên se, 19

1.4.3 Dinh danh các loại hợp chất tự nhiên 522522c2czccczscczrrrzeee 20

II;4:4::ĐITBIIORE:::-:::.::c2i:c2200201020102:0620162100202845166139238045166569216938148:49549943138338459353 20

1.4.5 Cơng trình nghiên cứu trong và ngồi nước - sec sex 21

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU e 24

2.1 Thời gian và địa điêm nghiên cứu 22 222222222Z2EEcEEcrxcrrrcrrrcree 24

A01, RO | DUNTsạsx2gi05g1551093121597153138703316123123318878138815878830337382033563451884195481848883785315 24

2.1.2 Địa điểm sáu HH2 errrrrrrree 24

D2 VGC nghiên CỨNoospioooosniinioiiiiiiiitiigi1811143146131631388163158588658833855383585888 24

2.2.1 Nguồn nguyên liệu nuơi cấy - 2-22 222221222112 22122222 2222222 ee 24

2.2.1.1 Nguồn mẫu hat Gai ma vương -2-27+222seccxercxxcrxecrrecrr 24

22.1.2 Nguồn nguyên liệu lì VERO sscsisscssscisosssessssasseaassasssssoseassesssssiesaseessvan 24

2.2.1.3 Nguồn mẫu định tính và định Di cố ốốốố n 25

2.2.2 Dung cu, thiết bi, hóa chất nghiên cứu -2- 22cczccczcczzcce 25

2.2.2.1 Thiết bị và dụng cụ -. 2-2222 122v 21221022111 11 11 12 25

Ñ;7009/HDNIEHSELnii0130512111000110912111311121061191017110642181/001010111112101200121320012001211078 26

2.3.iPhương pháp nghiên CỨU::::::::::::cococcoicoiioioiiiigtiii011231203113180130331836113388 26

2.3.1 Phương pháp nuôi cay in vitro loài Gai ma vương 26

2.3.1.1 Vô trùng hạt Gai ma vương bằng sodium hypochlorite 26

2.3.1.2 Các thí nghiệm ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng lên sự sinh trưởng

và hàm lượng hoạt chat sinh học trong cây Gai ma vương - 27

2.3.2 Phương pháp định tính và định lượng hàm lượng hoạt chất sinh học của

GIaIiTT8'VƯỚTE:.:c-:ii2ic0:t620002106201621166119431443163339218641183135433451843535448645318488943864815438545493g3:3 27

2.3.2.1 Phương pháp xử lí mẫu cây Gai ma vương - -5-c55-: 27

2.3.2.2 Phương pháp điều chế cao methanol - : .:::2: 25222225226 28

2.3.2.3 Phương pháp định tính thành phần hoạt chat sinh học 28

2.3.2.4 Phuong pháp định lượng thành phan hoạt chất sinh học 29

3:3:3 CHÍ tiêu về sự dinh HÔNG sis sss cascassscasncenssssnansnsancanasaanscansaiisannecavsconssss 31

2.3.3.1 Phuong pháp xác định các chỉ tiêu về nảy mam của hạt Gai ma vương

2.3.3.2 Phương pháp xác định các chỉ tiêu vẻ rễ của cây Gai ma vương 31

2.3.3.3 Phương pháp xác định các chỉ tiêu về thân của cây Gai ma vương 32

2.3.3.4 Phương pháp xác định các chỉ tiêu về lá của cây Gai ma vương 32

2.3.3.5 Phương pháp xác định các chỉ tiêu vẻ khối lượng của cây Gai ma

NƯƠNHE:ii::c2::122102112212123113111850535481g55623g6435E383625g63385331314138353395311385363305543393369ãg501:g3536 35a 5u4:e 32

2.3.4 Phương pháp đánh giá và xử lí số liệu ¿-5s2S22222scrzscrrsvee 33

CHƯƠNG 3: KET QUA VÀ THẢO LUẬN 222 CS 2E 21 2xx eccxee 34

3.1 Anh hưởng của thời gian chiếu sáng lên các chỉ tiêu nảy mam của hạt loài Gai

ma vương trong điều kiện im vifrØ 55c 2622 t2 11221121125112117111211 211121112111 34

3.2 Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng lên sinh trưởng của cây Gai ma vươngtrong GiGU KiGN At VETO 0n ¿¡4ñ141414 37

3.2.1 Anh hưởng của thời gian chiếu sáng lên chi tiêu về rễ cây Gai ma vương

trong Gi@u KiGM i VINO - 37

3.2.2 Anh hưởng của thời gian chiếu sáng lên chỉ tiêu về thân cây Gai ma vương UUn111151100 00.18 ÔÒ 4I 3.2.3 Ảnh hướng của thời gian chiều sáng lên chỉ tiêu về lá cây Gai ma vương trong 101851200 000 8 45

3.2.4 Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng lên khối lượng cây Gai ma vương 910101851200) VITO 8 4§

3.3 Định tính và định lượng các hoạt chất trong cây Gai ma vương 56

3.3.1 Định tinh các hoạt chat trong cây Gai ma vương 56

3.3.2 Định lượng các hoạt chất trong cây Gai ma Vương - «+ 59

KẾT DUAN VÀ KIEN NGHĨ essiiscisosciccsseacssccscassssiseosssctcsosssarssasanersscaiasrnnsssaineen 63

TÀI LIỆU THAM KHẢO - 222-2222 222222222222EE22EE22E22112211221172122c22xcee 65

PHU LUC

ĐANH MỤC BANG Bảng 2.1 Thiết bị và dụng cụ str dụng trong quá trình thực hiện dé tài 25

Bang 2.2 Thanh phan hóa chất có trong môi trường MS (Murashige va Skoog,

2 À Ă Đ.Đ 26

Big 29: Bo inphiônni THỨ Gissaoaokieingiioidioiidtitditigaiiiitbii438483880008108 27

Bang 3.1 Tỉ lệ nay mam và thời gian nay mam của hạt loài Gai ma vương trong

các điều kiện thời gian chiếu sáng khác nhau trong điều kiện in vifro 34

Bang 3.2 Số rễ và chiêu dai rễ của cây Gai ma vương trong các điều kiện thời gian

chiều sáng khác nhau sau 3 tháng nuôi cay trong điều kiện int vizo 37

Bang 3.3 Chiêu cao thân của cây Gai ma vương trong các điều kiện thời gian

chiếu sáng khác nhau qua 3 tháng nuôi cấy trong điều kiện ứn vifro 4]

Bang 3.4 Dường kính thân của cây Gai ma vương trong các điều kiện thời gian

chiếu sáng khác nhau sau 3 tháng nuôi cấy trong điều kiện in wizø 4I

Bang 3.5 Số lá của cây Gai ma vương trong các điều kiện thời gian chiếu sáng

khác nhau qua 3 tháng nuôi cấy trong điều kiện in yiro -©75cc2c2sz-ec 45

Bảng 3.6 Khối lượng tươi và khối lượng khô của cây Gai ma vương trong các

điều kiện thời gian chiều sáng khác nhau sau 3 tháng nuôi cấy trong điều kiện in

VÌ ĐỮ ktic4100411041316115445545164659335659068055365548555658481853503906335333546553558453853558908830365848583858383851508856615 48

Bang 3.7 Dinh lượng hàm lượng polyphenol trong cây Gai ma vương 59 Bang 3.8 Dinh lượng ham lượng flavonoid trong cây Gai ma vuong 61 Bang 3.9 Dinh lượng ham lượng tannin trong cây Gai ma vương 62

Hình 3.2 Thời gian nảy mam của hạt loài Gai ma vương trong các điều kiện thời

gian chiều sáng khác nhau trong điều kiện ft rifrø 5-555cccscccscccce-e.c 35

Hình 3.3 Số rễ của cây Gai ma vương trong các điều kiện thời gian chiều sáng

khác nhau trong điều kiện in vitro sau 3 tháng nuôi cấy .c-cccccccscccsee 38

Hình 3.4 So sánh số rễ của cây Gai ma vương trong các điều kiện thời gian chiều

sáng khác nhau sau 3 tháng nuôi cấy 2 2++s2©+xz+EEzcEEEcEEEErErxrrrxrrrxrrrrecre 39

Hình 3.5 Chiều dai rễ của cây Gai ma vương trong các điều kiện thời gian chiếu

sáng khác nhau trong điều kiện int wifrØ - 22 26c +2SE+32EEE2EEEzEEE2ES21.eE 40

Hình 3.6 So sánh chiều đài rễ của cây Gai ma vương trong các điều kiện thời gian

chiêu sang khác nhau sau 3 thang nuôi cây án 40

Hình 3.7 Chiều cao thân cây Gai ma vương trong các điều kiện thời gian chiếusáng khác nhau qua 3 tháng trong điều kiện in vif70 5c 522cc 43

Hình 3.8 Dường kính thân cây Gai ma vương trong các điều kiện thời gian chiếusáng khác nhau trong điều kiện im 1if7Ø ả c c 201211121121122112 21122112 111 cá 44

Hình 3.9 Màu sắc cây Gai ma vương trong các điều kiện thời gian chiếu sáng

khác nhau sau 3 tháng nuôi cấy - 2: 2-22 231221112111221122112222211221072112210 211 c0 44

Hình 3.10 Số lá cây Gai ma vương trong các điều kiện thời gian chiếu sáng khácnhau qua 3 tháng trong điều kiện fn 1if/Ø - 22 2s 22 222222122122212221222212 2122 xe 47

Hình 3.11 Kích thước và hình đạng lá cây Gai ma vương trong các điều kiện thờigian chiếu sáng khác nhau sau 3 tháng nuôi cấy 2 2¿+22222222zrrcsrecre 47

Hình 3.12 Khối lượng tươi của cây Gai ma vương trong các điều kiện thời gianchiếu sáng khác nhau sau 3 tháng trong điều kiện in wifrø 22-22s25ccsceccsee 50

Hình 3.13 Khối lượng khô của cây Gai ma vương trong các điều kiện thời gian

chiếu sáng khác nhau sau 3 tháng trong điều kiện ữ1 rữrø -ccc5ccccccSsccse2 50

Hình 3.14 Cây Gai ma vương được nuôi cay ở điều kiện chiếu sáng 10 giờ sáng

trong “1185157877 51

Hình 3.15 Cây Gai ma vương được nuôi cay ở điều kiện chiếu sáng 12 giờ sáng

trong:điều ASW [-:UFOIi:cii:ci:c2iicsii2211621123512313633153316333553563328356835833368358885833365358563835323356358 51

Hình 3.16 Cây Gai ma vương được nuôi cấy ở điều kiện chiều sáng 14 giờ sáng

trong:điBu KIÊN E-'UĂFOI::c:i::c:ccicsi:23224231235123136351535163535535635358556335885363358565833363558885835523358358 52

Hình 3.17 Cay Gai ma vương được nuôi cấy ở điều kiện chiều sáng 16 giờ sáng

f6BE:000iI1EDI)NIDIWDEissscicciec20712000210921001119201620741903218821722001218121012314234130333183219820024001270 52

Hình 3.18 Cay Gai ma vương được nuôi cấy ở điều kiện chiếu sáng 18 giờ sáng

trong điều kiện At Vif7Ø 2 0c 2t 2t 21 2t ng ng ng ng n1 2110211121101101111211110 236 53

Hình 3.19 Cây Gai ma vương được nuôi cấy ở điều kiện chiếu sáng 20 giờ sáng

trong GiGU KiGM 0/0 1086 1 54

Hình 3.20 Cây Gai ma vương được nuôi cấy 1 tháng tuôi ở các điều kiện chiều sáng trong điều kiện int wiØ à cc sec, SS Hình 3.21 Cây Gai ma vương được nuôi cấy 2 tháng tuôi ở các điều kiện chiều sáng trong điều KiỆn int VÙfØ - c St s02 22222112 11211021072112 1111121121012 01 1x cveu 55 Hình 3.22 Cây Gai ma vương được nuôi cấy 3 tháng tudi ở các điều kiện chiều sdng trong GiGu KiGm int ViEKO ẽ 55

Hình 3.23 Kết quả định tinh nhóm phenolic trong mẫu cây non loai Gai ma vương Hình 3.24 Kết quả định tính nhóm phenolic trong mẫu cây trưởng thành loài Gai HÌNIVHOĐE).52:.22:-:52:122:222:232:322225116215121282163373123353215321341132333612221324133312214321419322922130352215521320:5 56 Hình 3.25 Kết quả định tính saponin trong mẫu cây loài Gai ma vương 57

Hình 3.26 Kết qua định tinh ankaloid trong mẫu cây loài Gai ma vuong 57

Hình 3.27 Kết quả định tính terpenoid trong mau cây loài Gai ma vương 58

Hình 3.28 Kết quả định tinh tannin trong mẫu cây loài Gai ma vương 58

Hình 3.29 Kết quả định tinh glycoside trong mẫu cây loài Gai ma vuong 59

Hình 3.30 Dé thị chuẩn hàm lượng polyphenol trong mẫu cây loài Gai ma vương

Hình 3.31 Kết quả định lượng polyphenol trong mẫu cây loài Gai ma vương 60

Hình 3.32 Đô thị chuân hàm lượng flavonoid trong mẫu cây loài Gai ma vương

Hình 3.33 Kết quả định lượng flavonoid trong mẫu cây loài Gai ma vương 61

Hình 3.34 Kết quả định lượng tannin trong mẫu cây loài Gai ma vương 62

IAA Indole-3-acetic acid

IBA Indole-3-butyric acid

Môi trường MS Môi trường Murashige và Skoog

MỞ ĐÀU

I LÝ DO CHỌN DE TÀILoài Gai ma vương (Tribulus terrestris L.) còn có tên khác là Quỷ kiến sau, Bach tật lê, thuộc họ Gai chống (Zygophyllaceae) là loài cây thân thảo hằng năm mọc bd

lan, phân nhánh nhiều Thuộc nhóm cây ưa sáng, chịu được khô han, ở các vùng nhiệt

đới và cận nhiệt đới của châu Á, châu Phi và vùng ôn đới với nhiệt độ ấp áp của châu

Âu Gai ma vương và các sản phâm của nó được sử dụng rộng rãi trong y học cô truyền

dé điều trị các bệnh khác nhau về hệ tiết niệu, tiêu hoá, tuần hoan, sinh duc, Hon thenữa, các chiết xuất của Gai ma vương đang được sử dung dé nghiên cứu và bước đầu

chứng minh khả năng loại bỏ tận gốc, khả năng chống viêm, khả nang chống oxy hoá

và ching ung thu, chống lại sự tăng sinh tế bao ung thư [1] Các công dụng của loài Gai

ma vương được gây ra bởi thành phần và các hợp chất sinh học chứa trong nó Thành

phan và hoạt tính sinh học của Gai ma vương có liên quan chặt chẽ đến nguồn gốc của

thực vật cụ thé là điều kiện sinh trưởng bao gồm điều kiện khí hậu, chất lượng đất vàthời kì thu hoạch [2] Trong các dé tài nghiên cứu về hàm lượng hoạt chat sinh học trongloài Gai ma vương ở các vùng khác nhau đã chứng minh, thành phần và hàm lượng hoạt

chất sinh học của Gai ma vương là khác nhau ở các vùng khác nhau, các điều kiện sinh

trưởng khác nhau.

Cùng với khoa học công nghệ phát trién, ngành công nghệ sinh học đã và đang

được khang định trong tương lai, trong đó, nuôi cấy in vitro ngày càng được sử dụngnhiều với các nghiên cứu về điều kiện môi trường ảnh hướng đến việc sinh trưởng và

hàm lượng các chất trong thực vật Trong điều kiện in vitro, những yếu tô tác động đến

sự sinh trưởng của thực vật được điều khiến thích hợp đề thực vật sinh trưởng và pháttrién tôi đa Việc nghiên cứu sự ảnh hưởng của các yếu tố khác nhau đối với sự sinh

trưởng và phát triển của cây được thực hiện nhằm xác định được các điều kiện và yếu

tố môi trường phù hợp nhất cho nuôi cay thực vat

Nhằm nghiên cứu về sự anh hường của các điều kiện chiếu sáng trong nuôi cay in

vitro khác nhau lên sự sinh trưởng thành phan và ham lượng hoạt chất sinh học trong

Gai ma vương với tác động của các điều kiện chiếu sáng khác nhau trong môi trườngnuôi cấy Từ đó xác định được các điều kiện chiếu sáng trong nuôi cây in vitro thíchhợp nhất cho sự sinh trưởng va ting sự tích luy về thành phan và hàm lượng các hoạt

chat sinh học của Gai ma vương trong điều kiện nuôi cay in vitro, dé tài “Nghiên cứu

sự ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy in vitro đến hàm lượng hoạt chat sinh

học của cây Gai ma vương (Tribulus terrestris L.)” được thực hiện.

Il MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Xác định được sự ảnh hưởng của một số thời gian chiếu sáng trong nuôi cấy invitro đến sự nảy mâm va sinh trưởng của cây Gai ma vương (Tribulus terrestris L.)

Bước dau, xác định được thành phan, hàm lượng hoạt chất sinh học trong cây non

vả cây trưởng thành loài Gai ma vương (Tribulus terrestris L.) ở ngoài tự nhiên.

II NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Sự nay mam và sinh trưởng của cây Gai ma vương (Tribulus terrestris L.) ở các

điều kiện thời gian chiếu sáng khác nhau trong 3 tháng nuôi cấy.

Định tính và định lượng các hoạt chất sinh học (polyphenol, tannin, flavonoid,

alkaloid, terpenoid, saponin, glycoside) trong cây non và cây trưởng thành loài Gai ma

vương (Tribulus terrestris L ) & ngoài tự nhiên.

IV PHẠM VI NGHIÊN CỨUTrong giới hạn của dé tài chỉ nghiên cứu ảnh hưởng của các mức thời gian chiều sáng khác nhau dén sự sinh trướng của cây Gai ma vương (Tribulus terrestris L.) (6

nghiệm thức: 10 giờ sáng, 12 giờ sang, 14 giờ sáng, 16 giờ sáng, 18 giờ sáng, 20 giờ

sáng) trong điều kiện in vitro

Xác định thành phần, hàm lượng hoạt chất sinh học trong cây non và cây trưởng

thành loài Gai ma vương (Tribulus terrestris L.) ở ngoài tự nhiên.

CHƯƠNG 1: TONG QUAN

1.1 Đặc điểm thực vật hoc loài Gai ma vương 1.1.1 Vị trí trong bảng hệ thông phân loại

Loài Gai ma vương hay còn gọi là Bach tật lê, Thích tật lê, Gai sầu, Gai yết hầu

có vị trí trong sinh giới như sau:

Giới: Thực vật - Plantae

Ngành: Mộc lan - Magnoliophyta

Lớp: Mộc lan - Magnoliopsida

Phân lớp: Hoa hồng — Rosidae

Bộ: Quỷ kiến sau - Zygophyllales

Ho: Quy kiến sau — Zygophyllaceae

Chi: Quy kiến sâu — Tribulus

Loài: Gai ma vương — Tribulus terrestris L 1753

Tén đồng đanh: 7 lanuginosus L 1753 [3]

Hình 1.1 Loài Gai ma vương (Tribulus terrestris L.)

1.1.2 Đặc điểm thực vật học Theo Phạm Hoàng Hộ mô tả, loài Gai ma vương là loải co nằm, đa niên, có lông

trắng nằm [4] Đỗ Tất Lợi đã mô tả đây là loài cỏ bò lan trên mặt đất Lá mọc đối dai 2

- 3 em, kép lông chim, 5 đến 6 đôi lá chét đều nhau phủ lông trắng mịn ở mặt dưới Hoavàng, mọc riêng lẻ ở kẽ lá Hoa phân hóa dai - trang, dai 5, trang 5, 10 nhị bầu 5 6 Hoa

nở vào mila hè tháng 5 - 7, quả từ thang 8 - 9 Quả nhỏ, khô, gồm 5 vỏ cứng trên có gai,

đưới lớp vỏ dày là hạt có phôi không nội nhũ [Š].

1.1.3 Phân bé

Loài Gai ma vương là cây ua sáng, chịu được khô hạn, thường mọc thành đám nhỏ

trên các bãi cát ven biên, phân bé từ vĩ độ 35°N đến 47°B, ở các vùng nhiệt đới và cận

nhiệt đới của châu Á, châu Phi và vùng ôn đới với nhiệt độ ấm áp của châu Âu |6] Ở Việt Nam, mọc hoang đại ở những vùng đất khô, dat cát doc vùng ven biên, ven sông các tỉnh Quảng Bình, Quảng Trị, Thừa Thiên - Huế, Đà Nẵng, Phú Yên, Bình Thuận và các tỉnh miền Nam nước ta.

1.1.4 Thành phan hoá học

Hàm lượng chất khô và chất hữu cơ của Gai ma vương là 932 g/kg và 811 g/kg.

Trong đó:

Ham lượng protein thô là 156,25 g/kg.

Hàm lượng chat xơ trung tính là 467 g/kg.

Hàm lượng chất xơ không tan trong acid là 374 g/kg.

Nitrogen không hoà tan trong acid là 14 g/kg [7].

Nhiều hợp chất với nhiều loại hoạt tính sinh học và cau trúc hoá học đã được xác định trong chiết xuất của Gai ma vương Đến hiện nay, có hơn 70 hợp chất khác nhau

đã được tìm thấy trong Gai ma vương bao gồm: khoảng 15 loại hợp chất furostanol

saponins, khoảng 13 loại hợp chat spirostanol saponins; khoảng 3 loại hợp chất cinnamic

acid amides; khoảng 4 loại hợp chất dan xuất quinic acid; khoảng 16 loại hợp chấtflavonoids; khoảng 8 loại hợp chat alkaloids; khoảng 5 loại hợp chat amides và

lignanamides; khoảng 5 loại hợp chat acid béo va ester acid béo, khoáng 2 loại hợp chat

phytosterols; khoảng 5 loại các hợp chất khác

Thành phần và hoạt tính sinh học của Gai ma vương có liên quan chặt chẽ đến

nguồn gốc của thực vật cụ the là điều kiện sinh trưởng bao gom điều kiện khí hau, chất

lượng đất, thời kì thu hoạch Các nghiên cứu đã cho thấy có sự chênh lệch lớn về sự có

mặt và hảm lượng các hoạt chất (đặc biệt là ham lượng furostanol và spirostanol

saponoside, được coi là những hoạt chất chủ yếu liên quan đến tác dụng điều trị) ở các

mau thu khác nhau của Gai ma vương [2].

1.1.5 Công dung

Cây Gai ma vương hoặc các sản phẩm của nó được sử dụng rộng rãi trong y học

cô truyền dé điều trị các bệnh khác nhau như sau:

Hệ tiết niệu: có tác dụng lợi tiêu điều trị rồi loạn tiết niệu, tiểu đêm nhiều lần, tiểu

tiện không thông, tiêu buốt và các bệnh vẻ thin, chống sỏi niệu.

Hệ tim mạch: kích thích lưu thông máu, hạ huyết áp điều trị tăng huyết áp, điều trị rỗi loan tim mạch, có hiệu qua trong điều trị cơn đau thắt ngực bang cách làm giãn mạch vành và cải thiện tuần hoàn tim.

Hệ tiêu hoá: điều trị rối loạn tiêu hoá

Hệ sinh dục: kích thích tinh dục, chữa liệt đương, xuất tỉnh sớm ở nam giới, kích

thích sinh tinh.

Ngoàải ra, Gai ma vương còn có tác dụng tây giun san, giảm thâm, khử trùng và

chống viêm, chữa bệnh gout, điều trị bệnh phong, các bệnh da vảy và bệnh vay nên,giảm đau đo thấp khớp, chữa gan bị suy nhược, tức ngực, viêm tuyến vú, làm sáng mắtđiều trị viêm kết mạc cấp, và Gai ma vương được báo cáo là có hoạt tính kháng khuẩn

[8].

Hon thé nữa, các chiết xuất của Gai ma vương đang được sử dung dé nghiên cứu

và bước đầu chứng minh khả năng loại bỏ tận gốc, khả năng chong viêm, khả năng

chống oxy hoá và chống ung thư chong lại sự tăng sinh tế bảo ung thư [1]

1.1.6 Công trình nghiên cứu trong và ngoài nước

Amr Amin và cộng sự (2006) đã nghiên cứu “Hiệu ứng bảo vệ của cây gai ma

vương trong điều trị bệnh tiêu đường", chiết xuất Gai ma vương được thử nghiệm làmgiảm đáng kê mức độ ALT va creatinine trong huyết thanh (P <0,05) ở nhóm bệnh nhân

tiêu đường và hạ mức MDA trong gan (P <0.05) ở bệnh nhân tiêu đường và (P <0.01) nhóm nondiabetic Mặt khác, mức độ GSH giảm trong gan đã tăng lên đáng kê (P <0,01)

ở chuột dai thao đường được điều trị bằng Gai ma vương Kiém tra mô bệnh học chothay sự phục hồi đáng kê của gan trong điều trị chuột bằng thảo mộc Điều tra này chothấy rằng tác dụng bảo vệ của Gai ma vương với chuột tiêu đường do STZ gây ra có thểđược thực hiện thông qua cách ức chế oxy hóa {9}

Firas A AL-BAYATI và cộng sự (2008) đã nghiên cứu “Hoạt động khang khuân

và kháng nắm của các bộ phận khác nhau của cây Gai ma vương mọc ở Iraq” đã đưa rakết quả như sau: Hoạt động kháng khuẩn của chiết xuất hữu cơ trong dung dịch nước từ

qua, lá va rễ cây Gai ma vương Tribulus terrestris L., đã được kiêm tra chong lại 11 loài

vi sinh vật gây bệnh và không gây bệnh Chiết xuất hiệu quả nhất chống lại cả vi khuẩn

gram âm và gram đương Ngoài ra, từ chiết xuất của cùng một bộ phận thực vật đã thé

hiện hoạt tính kháng nam [10]

Nghiên cứu “Sinh tông hợp các hat nano bạc từ Tribulus terrestris L và hoạt động

kháng khuan” được V Gopinath và cộng sự (2012) thực hiện Trong nghiên cứu này

phân thân quả của cây Gai ma vương chính là đối tượng được nghiên cứu, chiết xuất

thân, quả khô được trộn với bạc nitrat dé tông hợp các hạt nano bạc Các hoạt chất thực

vat có trong cây có tác dung cho sự khử nhanh chóng của ion bạc (Ag”) thành các hạt

nano bạc kim loại (Ag”) Đặc tính khang khuẩn của các hat nano tông hợp được quan

sát băng phương pháp Kirby - Bauer với các vi khuẩn đa kháng thuốc được phân lập

trên lâm sang như Streptococcus pyogens, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli,

Bacillus subtilis va Staphylococcus aureus [TT].

Saurabh Chhatre va cộng sự (2014) đã đưa ra công trình nghiên cứu “Téng quan

vẻ thực thể học của loài Gai ma vương”, trong đó có hoạt động dược lực học của Gai

ma vương về hoạt động lợi tiểu, kích thích tinh dục, chồng ung thư, điều hoà miễn dich,

chống đái tháo đường, chất tăng cường hấp thụ, hạ lipid máu, điều trị các bệnh tim,

chống trầm cam, âu lo, bảo vệ gan, chống viêm, giảm dau, chống co thắt, chống ungthư, kháng khuẩn, tây giun san, điệt bọ gậy va chồng dị ứng [12]

1.2 Nuôi cấy in vitro Trong điều kiện in vitro, những yếu tổ tác động đến sự sinh trưởng của thực vật

được điều khién thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển tối đa của thực vật Dé có

thẻ điều khién sự sinh trưởng và phát triển của thực vật theo hướng mong muốn, người

ta đã điều chỉnh các yếu tổ trong nuôi cay in vitro

1.2.1 Thanh phan hoá học

Trong môi trường các mudi khoáng được chia thành các nguyên tô vi lượng và đa

lượng:

Các chất dinh dưỡng đa lượng bao gôm sáu nguyên tố: nitrogen (N), phosphorus(P), potassium (K), calcium (Ca), magnesium (Mg) và sulphur (S) tồn tại dưới dạngmuối khoáng, là thành phan của các môi trường dinh duéng khác nhau Tat ca các

nguyên tô này là rat can thiệt cho sinh trưởng của mô va tế bao thực vật.

do sự có mặt của đường trong môi trường, tuy vậy ánh sáng lại cần thiết cho một số quá

trình liên quan đến phát sinh hình thái cây Tùy từng mục đích nuôi cấy mà yêu cầu về

cường độ và thời gian chiều sáng khác nhau Thông thường, trong phòng nuôi cấy, người

ta thường sử dụng ánh sáng huỳnh quang chiếu sáng 12 - 16 giờ/ngày với cường độ

2000 lux [13].

Trong các nghiên cứu về hoá thực vật, các hoạt chất sinh học bị ảnh hưởng trực

tiếp và gián tiếp bởi cường độ ánh sáng, có thẻ là nhân tô hạn chế hoặc thúc day sự tăng

trưởng của các hợp chất sinh học trong cây Cường độ ánh sáng cao được sử đụng dé

tao ra quá trình sinh tông hợp hoạt tính sinh học của cây Tuy nhiên khi sử dung cường

độ ánh sáng cao, cần cân bang với nhiệt độ trong môi trường nuôi cấy, nêu cường độ

ánh sáng quá cao sẽ gây ra dư thừa ánh sáng [14].

Ánh sáng trên dàn nuôi phải là loại ánh sáng có phổ gần như ánh sáng tự nhiên

(230 - 780 nm) Các loại đèn huỳnh quang ánh sáng trắng nói chung đều đáp ứng đượcyêu cầu trên Cũng có những phát hiện cho thấy ánh sáng vùng cận tím (350 - 400 nm)

có tác dụng kích thích sinh trưởng của thực vật nói chung, trong đó có cả cây nuôi cay

in vitro Có hai cách bố trí nguồn sáng: cách thứ nhất, trực tiếp trên mỗi tang của giá

hoặc tú nuôi cay, đèn mắc song song với mặt phăng cần chiếu sáng: cách thức hai, bêncạnh, dén mắc vuông góc với mặt phang cần chiếu sang

điều chỉnh ôn định duy tri trong khoảng từ 22 - 25°C

Nhiệt độ ảnh hưởng đến tốc độ các phản ứng sinh hoá dién ra trong quá trình nảy

mam va hô hap của hạt Khi mam xuất hiện thì nhiệt độ anh hưởng đến sự sinh trưởng

của mầm Nhiệt độ thích hợp cho sự nảy mam của đa số thực vật khoảng 25 - 28°C [15].

Su căng thăng về nhiệt độ cũng là một trong những yếu tố được sử dung điều chỉnh điều kiện nuôi cay dé gây ảnh hưởng đến hàm lượng hoạt chất sinh học của cây Trong điều kiện nhiệt độ tăng trưởng đưởi mức tối ưu (15°C), cho thay mức độ phenolic tăng

lên các hợp chất, như một chiến lược thích ứng với căng thăng lạnh Khi nhiệt độ tăngcao lên 35°C, các nghiên cứu cũng cho thay nồng độ phenol và ascorbic acid (vitamin

C) cũng đã tăng lên trong thực vật [14].

1.3 Sinh trưởng và phát triển của thực vật

1.3.1 Giai đoạn sinh trưởng phát triển sinh dưỡngSinh trưởng là sự tạo mới các yếu tố cầu trúc một cách không thuận nghịch của tế

bảo, mô; toàn cây va kết quả dẫn đến sự tăng vẻ số lượng, kích thước, thé tích sinh khối

của chúng Nói chung, sinh trưởng là sự tăng trưởng về mặt lượng.

Phát triển là quá trình biến đổi về chất bên trong tế bao, mô va toàn cây dé dẫn đến

sự thay đôi về hình thái và chức năng của chúng Nói chung, phát triển là phạm trù biến

đổi ve chat

Trong giai đoạn sinh trưởng phát triên sinh dưỡng hoạt động sinh trưởng va phát

triển của các cơ quan đỉnh dưỡng (rễ, thân, lá) là ưu thế

1.3.2 Sự nảy mam của hạt

Sự nảy mam của hat có thé xem là bắt đầu của quá trình sinh trưởng, phát triển của

cây Từ hạt đang ngủ nghỉ chuyên sang trạng thái nảy mầm là cá một quá trình biến đôisâu sắc và nhanh chóng về hoá sinh va sinh lí xảy ra trong hạt

1.3.2.1 Sự biến đối hóa sinh, sinh lí trong sự nảy mam của hạt

Dặc trưng nhất của các biến đổi hóa sinh trong khi nảy mam là sự tăng đột ngột

hoạt động thuỷ phân xảy ra trong hat, Kết quả là tỉnh bột bị thuỷ phân thành đường làmnguyên liệu cho hô hap và tăng áp suất thâm thấu trong hat.

Biến đôi sinh lí đặc trưng nhất trong quá trình nay mam là hô hấp Ngay sau khi

hat hút nước, hoạt tính của các enzim hô hap tăng lên mạnh, làm cường độ hô hap củahạt tăng lên rất nhanh Việc tăng hô hap đã giúp cây có đủ năng lượng cần thiết cho sự

nảy mam, Trong quá trình nảy mam có sự thay đổi cân bằng hormone Sự cân bằng

hormone điều chỉnh quá trình nay mầm là cân bằng GA/ABA

1.3.2.2 Anh hưởn ig của điêu kiện ngoại cảnh đổi với sự nảy mam

Hat giống nằm trong trạng thái được bảo vệ nhiều, trong khi đó cây con rất dé bj

tôn thương Hạt giống chỉ trở nên có khả nang phản ứng với các tín hiệu môi trường khi

chúng đã phá vỡ trạng thái ngủ đông Do đó, sự nảy mầm chịu sự kiểm soát chặt chẽcủa môi trường, bao gồm tác động cua nước, oxy, nhiệt độ và ánh sáng [16]

Nhiệt độ: giới hạn nhiệt độ cho sự nay mam phụ thuộc vào các loại hạt khác nhau.

Nhiệt độ thích cho sự nảy mam của đa số thực vật khoảng 25 - 28°C, với các cây nhiệt đới khoảng 30 - 35°C Nhiệt độ ảnh hưởng đến tốc độ các phản ứng hoá sinh diễn ra

trong quá trình nảy mầm và hô hấp của hạt Khi mầm xuất hiện thì nhiệt độ ảnh hưởng

đến sự sinh trưởng của mầm.

Hàm lượng nước trong hạt: Nước là điều kiện rat quan trọng cho sự nảy mam Khi

hạt hút nước đạt ham lượng 50 - 70% thì hạt bat đầu phát động sinh trưởng và nảy mam

Nước là dung môi cho các phản ứng hoá sinh trong hat đang nảy mam va là điều kiện

cần thiết cho hô hap của hat, cho quá trình sinh trưởng của mầm Ngâm hạt vào nước là biện pháp đầu tiên trong kĩ thuật ngâm ủ hạt giống [15].

Ánh sáng: trong số tat cả các tế bào cảm quang, phytochrome đóng vai trò nội bật

nhất dé thúc day sự nảy mam của hạt trong điều kiện ánh sáng thuận lợi và đồng thời

cũng có thé ngăn chặn sự nảy mam khi điều kiện ánh sáng đưới mức tối ưu, không thuậnlợi cho việc nảy mam [17]

Anh hưởng kết hợp của ảnh sáng và nhiệt độ đến nay mam: ánh sáng là cần thiết

đề kích thích sự nay mam của hat nhung điều đó là không đú, can phải xử lý lạnh và ướt

dé phá vỡ trạng thái ngủ đông của hạt Hạt trong môi trường lạnh nảy mam nặng hơnnhưng nảy mầm kém hiệu quả hơn hạt trong môi trường ấm [18] PhyA cảm nhận ảnhsáng ngăn can sự nay mam và tạo điều kiện cho hạt ngủ nghỉ khi hạt trong môi trườnglạnh và ánh sáng yếu trong khi phyB có vai trò quan trọng thúc day sự nảy mam trongmôi trường lạnh [18] Do đó, việc tích hợp các điều kiện cảm ứng ánh sáng vả nhiệt độ

thích hợp sẽ cho phép thực vật phát triển một cách thuận lợi.

1.3.3 Sự phát triển cây conSau khi nảy mầm, cây con có thể gặp nhiều môi trường khác nhau Trường hợp

cực đoan nhất là bóng tôi và thực vật bậc cao đã phát triển một chiến lược đẻ tôn tại

trong vải ngày trong tình huống này bằng cách sống từ nguồn dự trữ hạt giống của chúng(sự phát triển bị hủy hoại) Chiến lược phát triển này được đặc trưng bởi sự kéo dài

nhanh chóng của trụ dưới lá mầm dang phát triển duy trì móc ở đỉnh, ức chế sự mở rộng

của lá mam va ức chế sự hình thành lá [19] Chiến lược này tối đa hóa cơ hội dé cây con

nhanh chóng tiếp cận bẻ mặt đất, nơi quá trình khử sẽ được bắt đầu.

Khi có ánh sáng, các phytochromes và cryptochromes chủ yếu kiểm soát giai đoạnkhử vàng lá bang cách ức chế sự kéo dài của trụ dưới lá mam, bắt đầu phát trién lục lap,

thúc day sự mở rộng của lá mam và bắt đầu sự phát triển của lá dé cho phép cây con bắt

đầu quá trình quang hợp của nó [19]

Các phototropin cũng đóng một vai trò quan trọng trong giai đoạn phát triển này

bởi vì một khi trồi lên khỏi đất, cây con có thé phải hướng sự phát triển của nó đến một nơi thuận lợi hơn (có ánh sáng tốt hơn) [20] Các phototropin làm trung gian ức chế

nhanh nhưng thoáng qua sự kéo dai của trụ dưới lá mam và sau đó rat quan trọng để

hướng sự phát trién theo hướng anh sang định hướng [20], [21] Bằng cách điều chỉnh

tốc độ tăng trưởng của trụ đưới lá mam và ức chế phan ứng hap dẫn của trụ đưới lá mam,

hai loại té bao cảm quang anh hướng đến khả năng hướng sáng của cây con [22], [23],

[24 [25].

1.3.4 Anh hưởng của ánh sáng đến sinh trướng của thực vật

Tín hiệu môi trường có anh hưởng rất lớn đến sự tăng trưởng và phát triển của thực

vật Trong số các yếu tô môi trường, quan trọng nhất là ánh sáng Ánh sáng không phải

chỉ là nguồn năng lượng cho quang hợp mà con là nhân tố kích thích điều hòa nhiều quátrình phát triển, từ hạt nảy mam đến khi bắt đầu ra hoa Nói chung, những phản ứng phụ

thuộc vào ánh sáng được gọi là phát quang.

Ánh sáng đỏ và đỏ xa được cảm nhận bằng cách sử dụng họ phytochrome của tế

bảo cảm quang thực vật Các sắc tố thực vật riêng lẻ thê hiện cả hai vai trò độc nhất và

chồng chéo trong suốt vòng đời của thực vat, điều chỉnh một loạt các quá trình phát triển

từ hạt nay mam đến thời điềm phát triển sinh sản [26]

Ánh sáng ảnh hưởng đến cây trồng chủ yếu theo hai cách Thứ nhất, trong quátrình quang hợp và cách khác là trong phát triển cây trồng Trong toàn bộ đời sống củacây, bắt đầu từ khi nảy mầm vả kết thúc ở tạo hạt giống, tất cả các quá trình này đều bịảnh hưởng bởi ánh sáng Thông thường ánh sáng tác động đến điều tiết sự ra rễ và cả

sự phát triển của chỏi, ảnh hưởng đến hướng của lá và đôi khi ảnh hưởng đến cảnh của

cây [27].

1.3.5 Công trình nghiên cứu trong và ngoài nước

Năm 2010, G Petkov da tiến hành nghiên cứu xem xét ảnh hưởng của vi tảo đến

sự nảy mam của hạt loài Gai ma vương (Tribulus terrestris L.), kết quả được ghi nhận

lại, trong các môi trường của thí nghiệm, các vi tảo phát triển mạnh, ở tất cả các thínghiệm, những hạt giống đầu tiên nay mam đúng 3 ngày sau khi chúng được gieo Trên

90% số hạt nay mầm sau 7 - 9 ngày, riêng một số hạt nảy mam sau 20 ngày Bên trong,

trên thành chậu xuất hiện keo xanh do vi tảo va sau đó đáng ké là rêu cũng xuất hiện

Đối với hạt từ Pazardzhik, tỉ lệ nảy mầm là 31 + 12 % (74 hạt) Hạt giống được thu thập

từ thiên nhiên, bờ Biên Den, Zarevo, đã nảy mam 7/10 trong một thí nghiệm [28].

Năm 2019, Enik Akhiriana và cộng sự đã thực hiện thí nghiệm nghiên cứu “Anh hưởng của nước dừa va IAA đổi với sự sinh trưởng của loài Gai ma vương (Tribulus

terrestris L.) trong điều kiện in vitro Kết quả cho thay sự kết hợp của 150 mL/L nướcdừa và 0,25 ppm IAA cho chiều cao chôi, thời gian ra rễ và số lượng rễ cao nhất Bồ

sung nước đừa với nông độ 150 mL/L riêng lẻ cho kết quá tốt nhất về thời gian xuất hiện chồi, số chdi, số lá trong khi nông độ [AA 0,25 ppm độc lập cho số lá cao nhất Kết

quả phân tích hồi quy cho thấy số lượng rễ có tương quan thuận với chiều cao chôi, số

choi và số lá [29].

Năm 2020, Cao Thị Mỹ đã nghiên cứu khả năng nảy mầm và sinh trưởng của cây

Gai ma vương (Tribulus terrestris L.) ở giai đoạn vườn ươm đã kết luận, sự nảy mamcủa hạt cây Gai ma vương tốt nhất khi xử lí hạt với nước am tỉ lệ 2 sôi : 3 lạnh trong 8giờ trên giá thê đất cát của xã Phú Lạc, huyện Tuy Phong, tỉnh Bình Thuận; sự sinhtrưởng của cây Gai ma vương trong giai đoạn vườn ươm tốt nhất ở nghiệm thức đối

chứng (nước máy) không cần bón phân; chat lượng nảy mầm cia cây Gai ma vương tốt

nhất là trên giá thê dat cát của xã Phú Lac, huyện Tuy Phong, tinh Binh Thuận; thời gian

nảy mam nhanh nhất là ở các nghiệm thức xử lí hat với nước ấm 2 sôi : 3 lạnh trong 8

giờ [30].

Năm 2022, Lê Nguyễn Thu Ngàn và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của các

chất điều hòa sinh trưởng IBA vả BA lên sự nảy mam của hat Gai ma vuong (Tribulus

terrestris L.) trong điều kiện in vitro Sự nảy mam trong điều kiện in vitro của hat Gai

ma vương thích hợp trong các điều kiện môi trường có bê sung chat kích thích sinh

trưởng với nông độ thích hợp nhất là: bô sung IBA 1,0 mg/L cho tỉ lệ nảy mam là 100%,

SỐ ngày nảy mam trung bình là 2,60 ngày, số lá đầu tiên trung bình là 3,80 lá, bỗ sung

BA 2.0 mg/L cho ti lệ nay mam là 86,67%, số ngày nay mam trung bình là 2,54 ngày,

số lá đầu tiên trung bình là 2,85 lá, b6 sung 0,25 mg/L IBA va 0,5 mg/L BA cho tỉ lệ

nay mam trung bình là 100%, số ngày nay mam trung bình là 2,67 ngày số lá trung bình

là 4,33 lá [31]

1.4 Chiết xuất hợp chất từ thực vật

1.4.1 Kĩ thuật chiết tách hợp chất hữu cơ từ thực vật 1.4.1.1 Xử lí mẫu cây

Mẫu cây thu hái về được rửa sạch với nước, dé ráo, làm khô tự nhiên trong mát có

quạt hoặc nơi thoáng gid.

Muốn khảo sát cây khô thì ngay khi cây còn tươi nên sắc nhuyễn, rồi rãi ra phơi

khô ở nhiệt độ phòng hoặc say trong lò say ở 60 - 80°C Quá trình nay cần tránh không

để cây chồng đồng dén nén lên nhau có thé phát sinh nam mốc, bằng cách thường xuyênđảo trộn cây Nếu không có 16 say, có thé phơi khô nhờ ánh sang, tuy nhiên cần tránh

phơi dưới ánh nắng mặt trời gay gắt vì tia tử ngoại (UV).

Mẫu cây sau khi phơi khô cần được xay nghiền thành bột Quá trình nghiền làmpha vỡ màng tế bao thực vật, giúp cho dung môi dễ thắm vào bột cây dé tách hết các

hợp chất ra khỏi cây [32].

1.4.1.2 Dung môi để chiết tách hợp chất ra khỏi mẫu cây

Do cấu tạo hoá học của cây cỏ hoặc sinh khối thường là những chất đại phân tửtương đối tro, không hòa tan trong dung môi hữu cơ, vì thé việc khảo sát hợp chất tự

nhiên nghĩa là chiết lấy và khảo sát các chất biến dưỡng thứ cấp có lượng phân tử nhỏ

Các hợp chất tự nhiên có mức độ phân cực khác nhau nên khi chiết những hợpchất có trong cây có thể sử dụng lần lượt bằng các dung môi có tính phân cực tăng dầnhoặc chiết một lần lấy tất cả các loại hợp chất bằng cách sử đụng dung môi vạn năngmetanol (có thé chiết hau hết các loại hợp chất tự nhiên)

Nguyên tắc tong quát là lựa chọn dung môi và quy trình phù hợp đề chiết tách hợpchất ra khỏi mẫu cây, điều này tùy thuộc vào đặc tính của chất biến dưỡng thứ cấp cótrong cây mà người khảo sát mong muốn cô lập [32]

1.4.1.3 Kĩ thuật chiết ngâm dam

Kĩ thuật ngâm dâm không doi hỏi thiết bị phức tạp, có thé dé dang thao tác với

một lượng lớn mẫu cây Bột cây được ngâm trong bình chứa bằng thuỷ tinh hoặc bằng

thép không ri, bình có nắp đậy Tránh sử dung bình bằng nhựa vi dung môi hữu cơ có

thé hoa tan một ít nhựa, gây nhằm lẫn là hợp chat có chứa trong cây

Dung môi được rót vào bình cho đến xấp xắp bê mặt của bột cây Giữ yên ở nhiệt

độ phòng trong một đêm hoặc một ngày, dé cho dung môi xuyên thấm vao cấu trúc tếbảo thực vật và hoa tan các hợp chat tự nhiên Sau đó, dung chiết được lọc ngang qua

một tờ giấy lọc, thu hồi dung môi sẽ được cao chiết Tiếp theo, rót dung môi mới vào bình chứa bột cây và tiếp tục quá trình chiết thêm một sé lần nữa cho đến khi chiết kiệt

mẫu cây.

Mỗi lần ngâm dung môi, chỉ cần 24 giờ là đủ, vì với một lượng dung môi có định

trong bình, mẫu chat chỉ hoa tan vào dung môi đến đạt mức bão hoa, không thé hoà tan thêm được nhiều hơn nữa, có ngâm lâu hơn chỉ mat thời gian Quy tắc chiết là chiết nhiều lần, mỗi lần một ít lượng dung môi.

Dung môi sau khi được thu hỏi, được làm khan nước bằng các chất làm khan vàđược tiếp tục sử dụng đẻ chiết các lần sau [32]

1.4.1.4 Lam khô mẫu chất

Sau khi làm chiết mẫu cây bằng dung môi, lọc, thu hôi dung môi có được cao Cao

chiết này can được sấy khô vì các lý do sau: các hợp chat ở trong cao ở trạng thái khô

sẽ ôn định, bèn chắc hơn; dé tính đúng thu suất của cao chiết so với lượng cây khô ban

đầu: dé tiếp tục tinh chế cao bang sắc ký cột, dé đo các số liệu phô dé dang va khôngkhó khăn trong việc giải đoán cấu trúc

Say khô bằng khí tro trong máy cô quay chân không: Khi cô quay chân không đếnlúc mẫu đã khô hoàn toàn, cho một luồng khí trơ, ví dụ như khí nitrogen đi vào máynay, đi nhé nhẹ từ đầu trên của máy cô quay (tại đầu trên cia máy, chỗ đóng - mở ápsuất dé tạo chân không cho máy, có một ống dé châm dung dịch vào bình cô quay mà

không cần tắt ngưng máy, cho khí vào bằng ngõ này) Nếu không có khí nitrogen, có

thê dé mẫu lâu hơn trong máy cô quay vẫn hoạt động [32]

1.4.2 Điều kiện ảnh hưởng quá trình tách chiết

1.4.2.1 Những yếu tổ thuộc về thành phan, cau tạo của nguyén liệu

Màng tế bào: có nhiều ảnh hưởng đến quá trình khuếch tán Khi còn sống, đó lànơi xuất hiện quá trình trao đổi chất có tính chọn lọc Khi chết, đó là sự xuất hiện củacác hiện tượng khuếch tán, thầm thấu, thâm tích Màng té bảo có cau trúc không ônđịnh, có thé được thay đổi tính chất vật lí và thành phần hoá học dé đáp ứng với các

chức nang Đối với nguyên liệu thực tế non hay mềm mỏng như co cây, hoa lá, thành

phân của tế bảo chủ yếu là cellulose Cellulose có tính chất không tan trong nước và

không tan trong môi trường khác, bèn vững ở nhiệt độ cao, có tinh chất dẻo dai Đôi với

loại nguyên liệu nảy, môi trường dé thắm vào được liệu, đo đó chỉ cần xay thô Nếu xaynhuyễn, dé kéo theo nhiều tạp chất vào dịch chiết xuất Đối với nguyên liệu gia, chắc

chắn như hat, gỗ, v6, thì tế bào trở nên day dặn Do đó với những nguyên liệu già, rắn

chắc, nên xay nhỏ, tạo điều kiện cho môi trường dé thắm ướt, chat tan dé khuếch tán

vào môi trường.

Chất nguyên sinh: có tính chất bán thắm, có nghĩa là chỉ thấm đối với dung môi

mà không cho chat tan đi qua Do đó, dé chiết xuất các chất tan trong tế bào, người ta

phải tìm cách loại bỏ các chất nguyên sinh bằng cách làm đông vón chúng băng nhiệt

(say hoặc phơi khô) hoặc bằng cần (hơi hoặc côn nóng) [33]

1.4.2.2 Các yếu tổ thuộc về dung môi

Một số yếu tố của dung môi có ảnh hướng đến quá trình chiết xuất là: độ phân cực,

độ căng, sức căng bẻ mặt.

Độ phân cực: Nói chung dung môi ít phân cực, dé hòa tan các chất không phân cực và khó hòa tan các chất có nhiều nhóm phân cực Ngược lại, tính phân cực mạnh thì

dé hòa tan các chất có nhiều nhóm phân cực và khó hòa tan các chat ít phân cực

Độ nhớt, sức căng bê mat: Nói chung, dung môi có độ nhớt cảng thấp hoặc có sứccăng bẻ mặt càng nhỏ thì dung môi càng dé thấm vào nguyên liệu, tạo điều kiện thuậnlợi cho quá trình chiết xuất và ngược lại [33]

1.4.2.3 Các yếu tô thuộc vẻ kĩ thuậtNhiệt độ chiết xuất: Theo công thức tính hệ số khuếch tán của Einstein, khi tăngnhiệt độ thì hệ số khuếch tán cũng tăng, do đó theo định luật Fick, lượng chất khuếch

tán cũng tăng theo Hơn nữa, khi nhiệt độ tăng lên thì độ nhớt của môi trường giảm, do

đó sẽ tạo ra điều kiện thuận lợi cho quá trình chiết xuất Tuy nhiên khi tăng nhiệt độ sẽgây bất lợi cho quá trình chiết xuất trong một số trường hợp, vì vậy tùy vào từng trường

hợp cụ thê mà lựa chọn nhiệt độ thích hợp (tùy thuộc vào các yêu tố như nguyên liệu,

dung môi, phương pháp chiết xuất)

Thời gian chiết xuất: Khi bắt đầu chiết xuất, các chất phân tử lượng nhỏ (thường

là hoạt chất) sẽ được hòa tan và khuếch tán vào dung môi trước sau đó mới đến các chất

có phân tử lượng lớn (thường là tạp chất như nhựa, keo, ) Do đó, nếu thời gian chiết

xuất ngắn sẽ không chiết được hết các hoạt chất trong nguyên liệu, nhưng nếu thời gian

chiết đải quá, dịch chiết sẽ bị lẫn nhiều tạp chất, gây bắt lợi cho quá trình tỉnh chế và

bảo quản Tóm tắt lai, cần phải lựa chon thời gian chiết xuất dé phù hợp với thành phan

của nguyên liệu, dung môi, phương pháp chiết xuất,

Độ mịn của dược liệu: Khi nguyên liệu với kích thước quá thô, dung môi sẽ khó

thám ướt, hoạt chất khó chiết xuất vào dung môi Khi độ mịn nguyên liệu tăng lên, bẻ

mặt tiếp xúc giữa nguyên liệu và dung môi cũng tăng lên; theo định luật Fick, lượng

chất khuếch tán vào dung môi tăng lên, do đó thời gian chiết xuấtTuy nhiên trong thực

tế néu xay nguyên liệu quá mịn cũng sẽ gây ra một số bat lợi cho quá trình chiết xuất

Khudy trộn: khi dung môi tiếp xúc với nguyên liệu, dung môi sẽ thắm vào nguyên liệu hòa tan chất tan, chất tan sẽ khuếch tán từ nguyên liệu vào dung môi qua màng tế

bảo Sau một thời gian khuếch tán, nông độ chất tan trong dung môi tăng và trong tế bảo

giảm dan, tốc độ khuếch tán sẽ giảm dan Đến lúc nào đó sẽ xảy ra quá trình cân bằng

giữa hai bên, vì vậy nếu không có sự khuấy trộn quá trình khuếch tán sẽ rất chậm Do

đó dé tăng cường tốc độ khuếch tán, người ta thực hiện việc khuấy trộn [33].

1.4.3 Dinh danh các loại hợp chất tự nhiên

Từ mau cây, sử dụng những kĩ thuật chiết tách khác nhau dé có được cao chiết toàn phần hoặc các loại cao có tính phân cực khác nhau Áp dụng phương pháp phân

tích sơ bộ về hoá - thực vật dé biết trong cao chiết có thê chứa các loại hợp chất tự nhiên

nào Sau đó, cần tiến hành xác định sự hiện điện của các loại hợp chất tự nhiên nói trên

bằng những phương pháp cụ thé hon, đề có thé chọn các biện pháp xử lí thích hợp nhằm

cô lập các hợp chất tỉnh chất

Các nhóm hợp chất thực vật được xác định như là phenolic, tannin, flavonoid,alkaloid, terpenoid saponin, glycoside, đê xác định được các hợp chất, người ta sửdung các loại thuốc thử cho từng loại hợp chất khác nhau đề có thẻ xác định sự hiệnđiện của các loại hợp chất thực vật có trong mẫu thử

1.4.4 Định lượng

Việc định lượng các hợp chất tự nhiên trong thực vật được các nghiên cứu tiềnhành bằng việc xác định hàm lượng tông hoặc xác định hàm lượng của một hợp chất cụ

thé bang các phương pháp định lượng khác nhau Đôi với việc xác định ham lượng tong

của các hợp chất tự nhiên trong thực vật, người ta thường xác định hàm lượng phenol

tông, hàm lượng tanin tông và hàm lượng flavonoid tông.

21 1.4.5 Công trình nghiên cứu trong và ngoài nước

I Kostova & D Dinchev (2005) đã nghiên cứu “Saponin trong Tribulus terrestris

L - hóa học vả hoạt tính sinh học” đã kết luận hàm lượng cao của saponin steroid là một

tính năng đặc trưng của loại cây này Các hợp chất được tìm thấy như tigogenin,

neotigogenin, gitogenin, neogitogenin, hecogenin, neohecogenin, diosgenin,

chlorogenin, ruscogenin thuộc nhóm saponin furostanol và spirostanol, một vai loại

Sarsasapogenin thường được tim thay trong cây Bốn hợp chat saponin sulphat hóa thuộc

loại tigogenin va diosgenin cũng được phân lập Các lượng đường của furostanol cô lập

và spisaponin rostanol la oligosaccharid, chứa 2 - 4 loại đường khác nhau - glucose,

rhamnose, galactose va xylose Chiết xuất các saponin đã được tìm thay có các hoạt tính

được lý khác nhau [34 ].

Dragomir Dinchey va cộng sự (2007) so sánh sự hiện diện của steroidal saponins trong Tribulus terrestris L từ các vùng địa lí khác nhau Các saponin steroid được coi

là yếu tố chịu trách nhiệm cho hoạt động sinh học của các sản phẩm có nguồn gốc từ

thực vật này Hoạt tính phụ thuộc vào nòng độ và thành phan của saponin hoạt động, do

đó chịu ảnh hưởng của nguôn gốc địa lí của nguyên liệu thực vật Kết qua cho thấy sự

khác biệt rõ rệt về hàm lượng của các hợp chat này tủy thuộc vào khu vực lay mau, phan

thực vật được nghiên cứu và giai đoạn phát triển của cây [35).

Nguyễn Thế Chiến và cộng sự (2008) đã tiến hành phân lập tribulosin, một

spirostanol saponin từ cao n - butanol cây Bach tật lê (Tribulus terrestris L.) bằngphương pháp sắc kí Kết qua thu được trubulosin (TLBS) dưới dang bột không màu,

không tan trong EtOAc, CHCl, tan ít trong MeOH, tan nhiều trong hỗn hợp

CHCh-McOH (1:1), điểm tan chảy mp = 303 - 305°C [36].

Bùi Dinh Thạch và cộng sự (201 1) đưa ra kết quả đề tài “Diéu tra và xác định hàm

lượng hoạt tính chất tribulosin trong cây Tat lê (Tribulus terrestris L.) phan bố ở Việt

Nam” Tác giả nhận định hàm lượng Tribulosin trung bình của cây Tat lẻ đạt 0,058

mg/g Ham lượng Tribulosin cao nhất dat 0,083 mg/g (Đà Nẵng) và thấp nhất đạt 0,044

mg/g (Phú Yên) Mẫu có số hiệu PN1 (Đà Nẵng 1) thu ở vùng ven biên thuộc quận Sơn

Trà và Ngũ Hành Sơn, thành phố Đà Nẵng có hàm lượng Tribulosin cao nhất (0,189

mg/g) [37]

Noori Mitra và cộng sự (2012) đã nghiên cứu về “Hop chat Flavonoid trong

Tribulus terrestris L.” Kết qua cho thay chrysin chỉ được xác định trong qua, không có

ở rễ và lá Ngoải ra flavone C and C-/O-glycosides không được tìm thay trong lá va quả, trong khi rễ có cả flavonoid sulphates va aglycones ngoài flavone C and C-/O-glycosides

[38].

Phạm Minh Duy và Nguyễn Thị Quỳnh (2014) đã nghiên cứu “Sự tăng trưởng và

tích lũy lignan của cây điệp hạ châu ding (Phyllanthus amarus (Schum & Thonn.))

nuôi cay quang tự dưỡng đưới anh hưởng của cường độ ánh sáng và thời gian chiều sáng, đã kết luận, cường độ ánh sáng và thời gian chiều sáng có tác động rõ rệt lên sự tăng trưởng của cây điệp hạ châu đẳng nuôi cấy in vitro quang tự đưỡng Điều kiện

cường độ ánh sáng 160 pmol m? s” và thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày giúp cây diệp

hạ châu dang tang trưởng tốt nhất Anh sáng cũng làm thay đôi sự tích lũy hợp chat thứ cấp trong cây điệp hạ châu dang nuôi cấy in vitro Hàm lượng phyllanthin, hypophyllanthin và niranthin cao nhất khi cây nuôi cấy đưới cường độ ánh sáng 80 umol

-*È ~

ms! và thời gian chiều sáng 12 gid/ngay [39].

Aimin Li và cộng sự (2016) đã nghiên cứu “Anh hưởng của cường độ ánh sáng

đến đặc điểm quang hợp của lá và sự tích lũy flavonoid trong Lithocarpus litseifolius(Hance) Chun (Họ Fagaceae)”, kết quả cho thay hàm lượng flavone cao nhất ở lá có

lưới che 60% ánh sáng và thấp nhất ở lá có lưới che 20% ánh sáng Một phân tích toàn

điện chỉ ra rằng việc che bóng thích hợp có thé tạo ra khả năng chịu bóng ở lá của L.

litseifolius, giúp thúc đây sự tích tu flavonoid trong cây này, nên trồng ở vi trí bóng mát

để tăng hàm lượng flavone trong lá [40].

Chang Ha Park và cộng sự (2019) đã nghiên cứu “Ảnh hưởng của đèn đi-ốt phát quang đến sự tích tụ glucosinolate và hợp chat phenolic trong cải dau đang nảy mam

(Brassica napus L.) đã ghi nhận sự tích lũy tông hợp chat phenolic cao nhất ở thực vậtđược chiều xạ bằng ánh sáng xanh (3.81 + 0,08 mg/g khô trọng lượng), cao hơn 1,33lần so với mức thấp nhất ở thực vật được chiếu xạ bằng ánh sáng đỏ (2,87 + 0,05 mg/gkhô trọng lượng ) Những kết quả nay chứng minh rang ánh sáng đi-ốt phát quang(LED) mau đỏ phù hợp với sự phát triển của mam và ánh sáng LED màu xanh lam có

hiệu quả trong việc tăng sự tích tụ glucosinolate và phenolics trong mam B napus [41].

Nguyễn Van Ay và cộng sự (2019) đã nghiên cứu “Anh hưởng của điều kiện ánh

sáng và thời gian sinh trưởng lên hàm lượng một số hợp chất trong cây mã đề (Plantago

major), đã kết luận thời gian sinh trưởng va cường độ ánh sáng có ảnh hưởng lớn đếnhàm lượng các hợp chat trong cây mã đề Trong đó, cây 4 tháng tuổi có hàm lượng

phenolic, tanin va flavonoid tông (lần lượt là 6,58, 9,03 va 5,98 mg/g TLK) cao hơn ở

cây 6 tháng tuôi (lần lượt là 2,88, 2,79 va 4,98 mg/g TLK) Cây mã đề trong ở điều kiệnánh sáng 75% có hàm lượng các hợp chat phenolic, tanin va flavonoid tong (lần lượt là

7,92, 4,25 và 6,74 mg/g TLK) cao nhất so với các nghiệm thức còn lại [42].

Gai ma vương là một loài có giá trị về được liệu cao, chứa nhiều hoạt chất sinh

học, hiện nay loài Gai ma vương đang được nghiên cứu và sử dụng ngày càng nhiều,

tuy nhiên các nghiên cứu đề tăng sinh khôi cũng như thành phần và hàm lượng hoạt chất

sinh học trong cây Gai ma vương vẫn chưa được thực hiện nhiều cả trong và ngoài nước.

Vì thể, việc nghiên cứu sự ảnh hướng của các điều kiện nuôi, trồng là một điều cần thiết

dé tăng sản lượng và chất lượng của cây Gai ma vương phục vụ cho nhu cầu sử dụng

ngày cảng tăng của xã hội.

2.2 Vật liệu nghiên cứu

2.2.1 Nguồn nguyên liệu nuôi cấy2.2.1.1, Nguồn mau hat Gai ma vuong

Thu mẫu: Tiến hành thu quả loài Gai ma vương tại thôn Lạc Tri, xã Phú Lạc, huyện

Tuy Phong, tinh Bình Thuận Chọn quả chín, màu xanh hơi vàng, khi chạm vào quả dé

rụng vả tách thành 5 mảnh quả rời nhau.

2.6:1:: Nguồn nguyên liệu in vitro

Nguyên liệu in vitro là các hạt chac của cây Gai ma vương đã được bóc vỏ hạt.

: `

Hình 2.2 Quả loài Gai ma vương Hình 2.3 Hạt loài Gai ma vương

2.2 3 Nguồn mau định tính và định lượngThu mẫu: tiến hành thu mẫu cây con và cây trưởng thành loài Gai ma vương tại

thôn Lạc Tri, xã Phú Lạc, huyện Tuy Phong, tinh Bình Thuận Chọn cây con khoảng 1

1,5 tháng tuôi, chiều cao khoảng 7 10 cm; cây trưởng thành có chiều dài khoảng |

Pheu thủy tinh

Muông cân hóa chat

Nôi hap vô trùng

Giấy nhôm, thun,

Máy cô quay Đũa thủy tinh

= e| 2 < ©° œ>

œ -_= «|<

= | © -_ - BI | ứ

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp nuôi cấy in vitro loài Gai ma vương2.3.1.1 V6 trùng hat Gai ma vương bằng sodium hypochloriteLua chon cac hat chắc, còn nguyên võ hạt, không bị tôn thương, tiền hành vô trùngtheo các bước:

27 Ngâm hạt trong nước xà phòng 2 - 3 phút.

Rửa sạch dưới vòi nước chảy.

Khi đưa vào tủ cay: khử trùng bề mặt với côn 70° trong 30 giây Rửa lại 5 lần với

nước cất đã hấp vô trùng

Ngâm và lắc hat trong sodium hypochlorite 1% trong thời gian 1 phút.

Rua lại 5 lần với nước cất vô tring va tiền hanh cấy mẫu.

2.3.1.2 Các thí nghiệm ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng lên sự sinh trưởng

và ham lượng hoạt chất sinh học trong cây Gai ma vương

Hạt Gai ma vương sau khi được vô trùng sẽ được cấy vào môi trường MS với hàm

lượng đa lượng giảm 1/2 và được nuôi cấy trong các điều kiện thời gian chiều sáng khác nhau đề khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng lên sự nảy mầm, sinh trưởng và hàm lượng hoạt chất sinh học trong cây Gai ma vương Thời gian nuôi cấy in vitro là 3

tháng.

Mẫu được cấy trên môi trường đã được khử trùng ở 1,4 atm, 121°C.

pH của môi trường là 5,8, hàm lượng agar là 7g/L và hàm lượng dudng là 30g/L.

Nhiệt độ phòng nuôi là: 25 - 28°C Cường độ ánh sáng 2000 lux.

2.3.2 Phương pháp định tính và định lượng hàm lượng hoạt chất sinh học

của Gai ma vuong

2.3.2.1 Phương pháp xử li mau cây Gai ma vương

Mẫu cây được thu day đủ các bộ phận, khi cây còn tươi, cân khối lượng và sau đó

gói mẫu thành các gói nhỏ bang giấy báo Say mau trong tủ sấy trong khoảng nhiệt độ

từ 50 - 60°C Cân mẫu sau 24 giờ và tiếp tục sấy Quá trình say kết thúc khi khối lượngmẫu ở mỗi gói không thay đôi giữa hai lần cần liên tiếp Lúc này, mẫu đạt trạng thái khô

hoàn toàn.

Mẫu khi khô hoản toàn được bảo quản trong điều kiện khô thoáng ở phòng thí

nghiệm.

2.3.2.2 Phương pháp điều chế cao methanol

Quy trình tạo cao methanol được tiễn hành theo phương pháp của Nguyễn Kim

Phi Phụng (2007).

Mẫu cây sau khi khô sẽ được đem xay thành bột mịn.

Ngâm 10g bột cây trong 100ml dung dich methanol 96% (ti lệ 1:10) Sau 48 giờ,

địch chiết được lọc qua giấy lọc đề loại cặn.

Dịch chiết được thu hồi dung môi bang hệ thống cô quay ở nhiệt độ 50°C và áp

suất 17Smbar Sau khi dich chiết đuôi gần hết dung môi, rót dịch chiết ra một cốc thuỷtinh va dé bay hơi tự nhiên Khi dung môi đã bơi hơi hoan toàn, cao chiết methanol thô

được thu và bảo quan cao trong tôi ở nhiệt độ thấp (4°C)

Phân bột cây còn lại tiếp tục được ngâm trong dung dịch methanol 96% với cùng

tỉ lệ trên.

Quá trình chiết lặp lại 3 lần dé đảm bảo quá trình chiết diễn ra triệt dé.

2.3.2.3 Phương pháp định tính thành phân hoạt chất sinh học Xác định sự hiện điện của các nhóm hợp chất thực vật có trong dich chiết theo quy trình của Tambe and Bhambar (2014) có cải tiền.

Nhóm phenolic (Flavonoid và Polyphenol): cho 2 mL dich chiết cho vào ống

nghiệm, 2 - 3 giọt FeCh 1% Nếu dung dịch xuất hiện kết tủa mau xanh đen, chứng tỏ

địch chiết chứa hợp chất của phenolic Hoặc tác dụng với NaOH 10%, dịch chiết biếnđổi về màu sắc: đậm lên hoặc đổi màu, chứng tỏ địch chiết chứa hợp chất của phenolic

Tannin: thực hiện phản ứng ferric chloride, cho 2 mL địch chiết vào ông nghiệm, thêm vào 3-5 giọt chi acetate 10% Nếu dung dịch có xuất hiện kết tủa, chứng to dịch

chiết chứa hợp chất tannin

Alkaloid: cho 3 mL dịch chiết phán ứng với 5 - 10 giọt thuốc thử Dragendoff đềgây kết tủa hoàn toàn Nếu trong địch chiết chứa hợp chất của alkaloid thì dung dịch sẽxuất hiện kết tủa màu cam đỏ hoặc kết tủa mau tím đen/ giọt dau đen dưới day ống

Saponin: Phan ứng tao bọt: lay 5 mL dich chiết nước cho vào ông nghiệm, dùng

ngón tay cái bịt chặt miệng ống nghiệm va lắc mạnh theo chiều đọc trong | phút (khoảng

20 — 30 lần lắc) Dé yên ông nghiệm và quan sát cột bọt theo thời gian (15, 30, 60 phút)

va đánh giá kết quả Thời gian cột bọt ton tại cảng lâu, phan ứng càng đương tính rõ với

saponin.

Glycoside: thực hiện phan ứng với acid phosphoric đậm đặc: Cho Can vào ống

nghiệm sau đó bd sung | mL aceton và H3PO, dam đặc, lac déu, dun cach thủy 1Š phút

dé nguội, néu dung dịch chuyên sang màu vàng, chứng tỏ có sự hiện diện của glycoside.

2.3.2.4 Phương pháp định lượng thành phân hoạt chất sinh học

Định lượng các hợp chất trong dịch chiết cũng được thực hiện theo phương pháp của Tambe and Bhambar (2014) có cải tiến.

Hàm lượng phenolic tong: Nong độ phenolic tông trong mẫu mã dé được xác định

theo phương pháp Folin-Ciocalteu như sau: Hỗn hợp phản ứng bao gồm 1 mL dịch chiết

va 9 mL nước cất cho vào bình định mức 25 mL; thêm | mL thuốc thử Folin-Ciocalteu

vào hồn hợp và lắc đều; sau 5 phút, thêm 10 ml dung địch NaxCOs 35%; sau đó thêm

nước cất dé dung dich vừa đủ 25 mL; ủ mẫu trong 90 phút ở nhiệt độ phòng Thực hiệnphan ứng của các dung dịch chuân của gallic acid (nồng độ 20, 40, 40, 60, 80 và 100

g/mL) tương tự như mẫu địch chiết, Sau khi ủ, tiến hành độ hap thụ đối với dung dịch

dich chiết va dung dich chất chuẩn ở bước sóng 550 nm

Xây dựng đồ thị chuẩn

Gallic acid được sử đụng làm chất chuẩn trong định lượng phenolic tông số Cân

chính xác 0,1 + 0,0001g Gallic acid, hòa tan và thêm nước cất tới vạch trong bình định

mức 100 mL thu được dung dich gallic acid có nồng độ 1000 mg/L Pha đường chuân

ở các nông độ 100, 200, 300, 400 và 500 mg/L Lần lượt hút 0,1 mL chuan Gallic acid

ở các nồng độ cho vào các ống nghiệm khác nhau Mỗi ống nghiệm thêm vào 0,1 mLthuốc thử Folin-Ciocalteu, dé yên trong 5 phút rồi thêm vào 0,3 mL dung dịch NaxCO;20% lắc đều sau đó thêm 4,5mL nước cất Dé yên trong 60 phút rồi đem so màu ở bước

sóng 735 nm Dựng đô thị biểu điễn mối tương quan giữa nông độ Gallic acid và độ hap

thu tương ứng.

Dịch chiết được tiền hành tương tự chất chuan (pha loãng khi độ hap thu vượt quáđường chuẩn) Nước cất được sử dụng làm mẫu trắng Hàm lượng phenolic tông số đượcxác định băng công thức sau (Singh, 2017):

TPC: hàm lượng phenolic tông số (mg GAE/g);

C: nong độ Gallic acid được xác định dựa vào đô thị chuẩn (mg/mL);

V: thé tích dich chiết thu được (mL);

m: khôi lượng mau lá đem chiết (g);

£: hệ số pha loãng của dịch chiết.

Ham lượng flavonoid: Hàm lượng flavonoid được xác định thông qua phan ứng

màu với các muỗi kim loại Thường thấy nhất là các phản ứng với Al** , đây là kim loại tạo phức màu mạnh, ben và không độc hại AI?* liên kết với nhóm ketone ở C4 và các

nhóm hydroxyl liền ké ở C5 hoặc Có trong cau trúc của flavone hay flavanol dé tạo

thành phức hợp có màu Độ hap thu của phức hợp này được ghi nhận bang thiết bị quang

pho hap thu phân tử thông qua phan ứng CH:COOK - AICI dé tiến hành định lượng

flavonoid.

Xây dựng đồ thị chuẩn

Quercetin được sử dụng làm chất chuân trong định lượng flanonoid tông số Cân

chính xác 5 mg Quercetin hòa tan trong 10 mL ethanol 70%, sau đó pha loãng thành các

nông độ khác nhau: 30, 60, 90,120 và 150 mg/L Lan lượt hút 0.5 mL các dung dich

chuẩn Quercetin đã pha loãng ở các nông độ cho vào các ống nghiệm khác nhau, thêm 1,5 mL ethanol 96%, dé yên trong 5 phút sau đó thêm 0,1 mL nhôm clorua (AICH)

10%, lắc đều dé yên trong 6 phút Tiếp tục thêm 0.1 mL CH:COOK LM va 2,8 mLnước cất vào Sau khi ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút, độ hấp thụ của hỗn hợp phảnứng được đo ở bước sóng 430 nm bằng thiết bị UV - Vis Dựng đồ thị biểu diễn mỗitương quan giữa nông độ Gallic acid và độ hap thu tương ứng

Dịch chiết được tiền hanh tương tự chất chuẩn (pha loãng khi độ hấp thu vượtquá đường chuẩn) Ethanol được sử dụng làm mẫu trắng Hàm lượng flavonoid tổng sốđược xác định bằng công thức sau:

€ (mg/mL) XV (mL) X Ƒ

TFC = TT Trong đó:

TFC: hàm lượng flavonoid tông số (mg QE/g);

Cc: nông độ Quercetin được xác định dựa vào đỗ thị chuan (mg/mL);

V: thẻ tích địch chiết thu được (mL);

m: khối lượng mẫu lá đem chiết (g):

f: hệ số pha loãng của dich chiết

Hàm lượng tanin: Chuan bị KMnO;¿ 0,1N bằng cách cân 3,16g KMnO¿ cho vào

cốc 250 mL, thêm nước và đun nhẹ, khuấy đều cho đến khi tan hết, thêm nước cho đủ

| L Indigo carmine 6 g được hỏa tan trong 500 mL nước cat đã khử ion bằng cách đun

nóng, sau khi dé nguội thêm 50 mL H2SOx 95 - 97%, định mức đến vạch | L bằng nước

khử ion, nếu có cặn thì lọc trước khi sử dụng

Mẫu trang: Cho 775 mL nước khử và 25 ml dung dich Indigo carmine.

Dịch chiết: Cho 25 mL dich chiết đã lọc vào bình erlen 1L cùng với 25mL dung

dich Indigo carmine và 750 mL nước khử Chuan độ cả mẫu thử và mẫu trắng bằng

KMnO¿ 0,1N cho đến khi dung địch chuyền từ màu xanh lam sang màu xanh lục và khi

chuyển sang mau vàng rom thì kết thúc.

Hàm lượng tannin được xác định theo công thức sau:

tanin trong | ml 0, | N KMnOg; m — lượng mẫu (g); 250 — thé tích chiết xuất (mL)

2.3.3 Chỉ tiêu về sự sinh trưởng

2.3.3.1 Phương pháp xác định các chỉ tiêu về nảy mâm của hạt Gai ma vươngChỉ tiêu theo dõi: tỉ lệ nảy mam của hạt và thời gian nảy mam

Tỉ lệ nay mam được tính bằng tông số hạt nảy mầm của nghiệm thức trên tông số

hạt cấy vào môi trường: (2 số mẫu nảy chỗi / E số mẫu cấy ban đầu) x 100 (%)

Thời gian nay mầm được tính từ thời gian hạt được cấy vào môi trường đến thờigian hat nay mam Tiến hành quan sát mỗi ngày sau khi cấy, ghi nhận số ngày nảy mamcủa các nghiệm thức Thời gian nảy mầm trung bình của nghiệm thức: số ngày nảymam của hạt trong nghiệm thức / E hạt trong nghiệm thức (ngày)

2.3.3.2 Phương pháp xác định các chí tiêu về ré của cây Gai ma vương

Chi tiều theo dõi: số rễ và chiều dai rễ

Số rễ được tính bằng cách đếm số rễ của các cây trong nghiệm thức Số rễ trung

bình của nghiệm thức: E số rễ trong nghiệm thức / 2 số cây trong nghiệm thức (rể)

Chiêu dai rễ được tinh từ gốc cây đến đầu rễ Chiều dai rễ trung bình của nghiệm thức: © chiều dai rễ trong nghiệm thức / E số cây trong nghiệm thức (cm).

2.3.3.3 Phương pháp xác định các chỉ tiêu về thân của cây Gai ma vương

Chỉ tiêu theo dõi: chiều cao than, đường kinh thân

Chiều cao cây được tính từ gốc cây đến góc chỏi ngọn Tiến hành do mỗi thángmột lần vao một ngảy cô định Chiều cao thân trung bình của nghiệm thức: chiều caothân trong nghiệm thức / E số cây trong nghiệm thức (em)

Tăng trưởng chiều cao: AH = Host - Hà

Trong đó: Ha: Chiều cao thân cây đo lần thứ n

Ha«¡: Chiều cao thân cây đo lần thứ n+]

Đường kính thân cây dùng thước kẹp có đơn vị đo là 0,05 mm dé đo Vị trí đo cách

gốc cây là 3 em Đường kính thân trung bình của nghiệm thức: š đường kính thân củacác cây trong nghiệm thức / E số cây trong nghiệm thức (mm)

2.3.3.4 Phương pháp xác định các chỉ tiêu về lá của cây Gai ma vương Chỉ tiêu theo dõi: số lá

Số lá được tính bằng cách đếm số lá của các cây trong nghiệm thức Số lá trungbình của nghiệm thức: Ð số lá trong nghiệm thức / E số cây trong nghiệm thức (lá).

Tăng trưởng số lá: AL = Last - LaTrong đó: La: Số lá đếm được lần thứ n

Lati: Số lá đếm được lần thứ n+1

2.3.3.5 Phương pháp xác định các chỉ tiêu về khối lượng của cây Gai ma

VIưỚng

Chỉ tiêu theo dõi: khối lượng tươi, khối lượng khô

Khối lượng tươi của cây được tính bằng cách cân khối lượng cây ngay sau khi vừa

thu từ bình nuôi Khối lượng tươi trung bình của nghiệm thức: © khối lượng tươi củacây trong nghiệm thức / ¥ số cây trong nghiệm thức (g)

Khối lượng khô của cây được tính bằng cách cân khối lượng khô của cây sau khi

say khô và có khối lượng không đôi Khối lượng khô trung bình của nghiệm thức: Ekhối lượng khô của cây trong nghiệm thức / Š số cây trong nghiệm thức (g)

2.3.4 Phương pháp đánh giá và xử lí số liệu Dùng toán thông kê dé xử lí các số liệu thu được và ứng đụng thong kê toán học trong sinh học, sử dụng phần mêm Excel 2016 và Statgraphics 18 dé xử li các số liệu

thu được.