Độ nhạy phát hiện ToBRFV trong các mẫu thực địa sử dụng khuếch đại RT-RPA kết hợp với CRISPR-Cas12a một bước...17 3.1.5... Các spacers này được sử dụng làm mẫu để sản xuất RNA dẫn đường
GIỚI THIỆU
Tổng quan về virus nâu gân
Tomato Brown Rugose Fruit Virus (ToBRFV) là một loại virus RNA thuộc chi Tobamovirus ToBRFV có bộ gen RNA đơn sợi dương dài khoảng 6.4kb (Zhang và ctv,
Virus này có hình dạng que và được bảo vệ bởi lớp protein capsid, giúp bảo vệ bộ gen RNA khỏi các tác động môi trường như nhiệt độ cao, tia UV và hóa chất khử trùng thông thường Nhờ đó, virus có khả năng tồn tại lâu dài trong các điều kiện khắc nghiệt.
ToBRFV lần đầu tiên được phát hiện ở Jordan vào năm 2015 và đã lan rộng ra ít nhất
Virus gây hại cho cà chua đã lây lan đến 35 quốc gia, ảnh hưởng nghiêm trọng đến sản lượng và chất lượng của cây trồng này (Zhang và ctv, 2022; Salem và ctv, 2021) Đặc biệt, virus có khả năng vượt qua các gen kháng Tm-22, làm tăng nguy cơ nhiễm bệnh cho cây cà chua (Hak và ctv, 2021).
Bệnh do virus ToBRFV gây ra những triệu chứng đặc trưng như quả biến dạng và đốm nâu trên vỏ, ảnh hưởng nghiêm trọng đến sự phát triển của cây và giảm tỷ lệ ra quả, dẫn đến tổn thất lớn về năng suất Do đó, việc nghiên cứu và phát triển các biện pháp chẩn đoán và kiểm soát hiệu quả là cần thiết để giảm thiểu tác động của virus này.
Tổng quan về phương pháp CRISPR – Cas
CRISPR-Cas là một công nghệ chỉnh sửa gen tiên tiến, được phát triển dựa trên hệ miễn dịch thích nghi của vi khuẩn, giúp phát hiện và tiêu diệt DNA của virus.
Công nghệ CRISPR-Cas đã cách mạng hóa các phương pháp truyền thống trong lĩnh vực công nghệ sinh học vi sinh, nông nghiệp và y học Với khả năng chỉnh sửa gen chính xác, CRISPR-Cas mở ra nhiều ứng dụng tiềm năng trong nghiên cứu cơ bản cũng như ứng dụng thực tiễn.
Phương pháp CRISPR-Cas hoạt động dựa trên cơ chế miễn dịch thích nghi của vi khuẩn, giúp bảo vệ chúng khỏi sự tấn công của phế bào (bacteriophage).
Khi một phế bào tiêm DNA vào vi khuẩn, hệ thống CRISPR ghi nhớ DNA ngoại lai bằng cách chèn các đoạn DNA này vào vùng CRISPR trong bộ gen của vi khuẩn, từ đó tạo thành các bản sao lưu để nhận diện và phản ứng với các tác nhân xâm nhập trong tương lai.
Các spacers được sử dụng để sản xuất RNA dẫn đường (gRNA) khi phế bào hoặc DNA ngoại lai xuất hiện trở lại gRNA kết hợp với protein Cas9, tạo thành phức hợp có khả năng nhận diện và tác động lên DNA mục tiêu Qua sự bổ sung base, gRNA định vị chuỗi DNA cần xử lý và hướng dẫn Cas9 cắt DNA tại vị trí xác định, ngăn ngừa phế bào sao chép và bảo vệ tế bào vi khuẩn khỏi sự xâm lấn Quy trình này đã được cải tiến và ứng dụng trong kỹ thuật chỉnh sửa gen, cho phép can thiệp chính xác vào bộ gen của nhiều loài sinh vật, phục vụ cho nghiên cứu, y học, nông nghiệp và chẩn đoán bệnh.
Hệ thống CRISPR-Cas9 là công nghệ endonuclease được dẫn đường bởi RNA, cho phép thiết kế và chỉnh sửa gene trong tế bào động vật Các trình tự CRISPR bao gồm các đoạn lặp lại không liên tục, được phân chia bởi các trình tự spacer, tương đương với trình tự plasmid và virus mà vi khuẩn và cổ khuẩn đã tiếp nhận Các spacer thường liên kết với các gene protein bảo tồn cao, được gọi là cas gene.
Hệ thống CRISPR-Cas của vi khuẩn, đặc biệt là protein Cas9, là một phương pháp nghiên cứu quan trọng Các đoạn CRISPR được phiên mã thành tiền-crRNA, chứa đầy đủ các đoạn lặp lại và trình tự của tác nhân xâm nhập đã bị chuyển hóa (Deltcheva và ctv, 2011).
CRISPR-Cas9 bao gồm hai thành phần chính: RNA dẫn đường (gRNA) và endonuclease RNA dẫn đường Cas9 thực hiện việc cắt đứt DNA tại vị trí mục tiêu, sau đó tiến hành chỉnh sửa gen thông qua gắn kết đầu không đồng dạng hoặc sửa đổi đồng dạng trực tiếp (HDR).
CRISPR – Cas9 là một công nghệ chỉnh sửa gene mạnh mẽ và dễ sử dụng, cho phép chỉnh sửa bất kỳ gene mục tiêu nào (Jinek và cộng sự, 2012) Hệ thống này còn có khả năng nhắm đến nhiều gene đồng thời thông qua việc sử dụng nhiều gRNA (Cong và cộng sự, 2013; Mali và cộng sự, 2013b).
Cas12a, trước đây được gọi là Cpf1, là một hệ thống CRISPR-Cas thuộc loại V lớp 2, được phát hiện vào năm 2015 bởi Zetsche và cộng sự Hệ thống này có hai vùng nuclease RuvC có khả năng xếp chồng lên nhau, đóng vai trò như vùng hoạt hóa Chỉ những đột biến xảy ra ở vùng cấu trúc của Cas12a RuvC mới có thể tạo ra Cas12a hoạt động, trong khi các đột biến khác dẫn đến trạng thái bất hoạt của Cas12a (Cas12a chết).
Khác với hệ thống CRISPR-Cas9, Cas12a không cần tracrRNA để hình thành và thuần thục crRNA, và nó nhận biết trình tự PAM nhiều T thay vì nhiều G Một số nhà nghiên cứu cho rằng cơ chế cắt của Cas12a phụ thuộc hoàn toàn vào protein của nó, và sự thay đổi của thyamine trong trình tự PAM có thể làm giảm khả năng nhận biết Đặc biệt, đối với việc nhận diện ssDNA mục tiêu, Cas12a không cần sự dẫn đường của trình tự PAM.
Cas12a có khả năng phân cắt sợi DNA mục tiêu và không phải mục tiêu dựa trên vùng RuvC đơn, với sự nhận biết đặc hiệu từ một spacer dài hơn Nghiên cứu gần đây cho thấy Cas12a có thể phân cắt không đặc hiệu các ssDNA sau khi nhận diện dsDNA hoặc ssDNA mục tiêu.
Gene trực giao Cas12a với hoạt động DNAse hiệu quả hiện nay bao gồm N ew Francis (Fn), Lachnospiraceae bacteria (Lb) và Acidaminococus sp (As) Các sản phẩm phân cắt ssDNA không đặc hiệu được đánh dấu huỳnh quang, hoạt động như chỉ thị cho việc dò tìm nuclease CRISPR Gần đây, một chuỗi các phương pháp chỉ thị mới được phát triển, trong đó có "HOMLES" (Li và ctv, 2019).
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Chuẩn bị mẫu
Một chủng virus ToBRFV từ Iran (mã số P557566.1) đã được sử dụng để lây nhiễm cơ học cho cây cà chua (Solanum lycopersicum) ở giai đoạn bốn tuần tuổi Để chuẩn bị mẫu lây nhiễm, khoảng 100 mg mô thực vật đông lạnh bị nhiễm bệnh được nghiền nhỏ và hòa tan trong dung dịch đệm phosphate pH 7.4, được pha chế từ 3.1 g NaH2PO4.H2O và 10.9 g NaH2PO4 dạng khan Dịch chiết virus sau đó được thoa lên bề mặt lá phía trên bằng tăm bông, kết hợp với bột carborundum để hỗ trợ lây nhiễm Các điều kiện môi trường trong buồng sinh trưởng được thiết lập với chu kỳ chiếu sáng 12 giờ ngày và 12 giờ đêm, cùng với nhiệt độ ổn định ở mức 25°C.
Một lượng nhỏ mẫu khoảng 100 mg được thu thập từ các lá ở tầng trên chưa qua cấy truyền sau 10 ngày từ khi tiến hành cấy chuyền (DPI) Các mẫu này được tinh sạch bằng 1 ml dung dịch RNX-Plus đã làm lạnh theo hướng dẫn của nhà sản xuất Sau đó, các mẫu tinh sạch được pha loãng thành các nồng độ khác nhau RNA được chiết tách (400 ng) được sử dụng để tổng hợp cDNA thông qua Bộ Kit Tổng hợp cDNA của SinaClon, tuân thủ đầy đủ chỉ dẫn từ nhà sản xuất Sản phẩm cDNA được bảo quản ở -80°C cho các phân tích tiếp theo Kiểm tra sự hiện diện của virus trong cây đã cấy chuyền được thực hiện bằng phương pháp RT-PCR kết hợp với phân tích điện di gel để xác nhận.
Chuẩn bị crRNA và mồi
Phương pháp phát hiện virus ToBRFV sử dụng hệ thống CRISPR – Cas12a thông qua việc thiết kế các mồi RT – RPA tại vùng gen mã hóa protein vỏ, với trình tự PAM (TTTV) được xác định để tối ưu hóa hoạt động của Cas12a Các đầu dò DNA sợi đơn (ssDNA) mang nhãn fluorescein và chất dập tắt ánh sáng tối được chế tạo để đảm bảo độ nhạy cao cho phản ứng Đồng thời, crRNA tương thích với Cas12a được tổng hợp từ nucleotide thứ 47 đến 55 trong vùng mục tiêu Đối với Cas9, phương pháp tập trung vào thiết kế các phân tử ssDNA tạo ra "cổng" lai hóa ổn định ở 37°C, sử dụng các đoạn "toehold" làm điểm khởi đầu tương tác với DNA từ amplicon mục tiêu Quy trình chuẩn bị "cổng" bắt đầu bằng việc xử lý ba sợi DNA qua đun nóng ở 95°C và làm nguội từ từ về 25°C, với các trình tự cần thiết đã được chi tiết hóa trong bảng 2.1.
Bảng 2.1 Trình tự cDNA của crRNA và mồi
ToBRFV synthetic post strand biotin
TCTTGAGATAATCGAGATG Cas9 gRNA to detect
AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGG ACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACGTT TACAATGGTCCTCTGCACCTATAGTGAGTCGTATTAGCGC ToBRFV beacon 1
Phản ứng sử dụng hệ thống CRISPR được thực hiện trong một dung dịch có thể tích
Dung dịch phản ứng bao gồm 20 µL đệm TAE 1X (pH 8.5, Invitrogen), 0.05% Tween 20 (Merck), và 12.5 mM MgCl₂ (Merck) DNA amplicon của ToBRFV được trộn với 2 µL dịch chiết từ mỗi mẫu lá cây nhiễm bệnh Các "cổng" lai hóa được thêm vào dung dịch với nồng độ cuối cùng là 200 nM Phản ứng được thực hiện ở nhiệt độ 37°C trong một giờ bằng máy trộn nhiệt Eppendorf để đạt hiệu quả phát hiện tối ưu.
Các crRNA được tổng hợp thông qua phiên mã in vitro bằng bộ kit TranscriptAid T7 High Yield Transcription (Thermo) và mẫu DNA từ IDT Sau khi tổng hợp, crRNA được tinh sạch bằng cột ly tâm RNA Clean and Concentrator (Zymo) và nồng độ được xác định bằng thiết bị quang phổ NanoDrop.
Khuếch đại đoạn gen virus bằng RT-RPA
Bộ kit TwistAmp Basic (TwistDX) được sử dụng để khuếch đại genome virus mục tiêu qua phản ứng RT-RPA, tuân thủ hướng dẫn của nhà sản xuất Quy trình thực nghiệm bao gồm việc sử dụng mồi xuôi và mồi ngược với nồng độ phù hợp.
Trong quy trình thí nghiệm, 500 nM và 500 U enzyme RevertAid (Thermo Fisher Scientific) được kết hợp với 50 U chất ức chế RNase (Thermo Fisher Scientific) trong 29.5 µL dung dịch đệm, điều chỉnh tổng thể tích lên 43.4 µL bằng nước không chứa RNase Viên nén phản ứng từ bộ TwistAmp Basic được hòa tan trong hỗn hợp này, sau đó bổ sung 2 µL RNA tổng số thu được từ cây (hoặc 4 µL dịch chiết không qua quá trình tinh sạch RNA) cho mỗi phản ứng Để khởi động phản ứng, 280 mM acetate magiê được thêm vào hệ thống, sau đó ủ ở 40˚C trong 5 phút, tiếp theo là thao tác lắc trộn và ly tâm ngắn để đảm bảo đồng nhất, rồi tiếp tục ủ thêm 25 phút Phương pháp này giúp tối ưu hóa và nâng cao hiệu quả của quá trình khuếch đại genome mong muốn.
Phản ứng và quy trình chẩn đoán của CRISPR – Cas12a
Hệ thống CRISPR-Cas12a được thiết lập bằng cách sử dụng 50 nM enzyme Cas12a từ vi khuẩn L bacterium (NEB) và 62,5 nM crRNA Quá trình này được ủ trong 30 phút ở nhiệt độ phòng với dung dịch đệm NEBuffer 2.1, bao gồm 10 mM tris-HCl, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl và 100 µg/mL BSA (pH 7.9; NEB) Sau đó, hỗn hợp được chuyển vào đĩa MicroAmp Fast 96 giếng để tiếp tục thí nghiệm.
Trong nghiên cứu này, 2 µL mẫu DNA được khuếch đại và thêm vào 17 µL hỗn hợp ribonucleoprotein CRISPR – Cas12a cùng với 500 nM đầu dò ssDNA gắn nhãn fluorescein – dập tắt (TTATT), tạo thành tổng thể 20 µL Phản ứng được duy trì ở nhiệt độ 37°C trong 1 giờ, trong thời gian này, tín hiệu huỳnh quang xanh được đo mỗi 5 phút bằng hệ thống máy PCR thời gian thực QuantStudio 3 (Thermo Fisher Scientific), với bước sóng kích thích và phát xạ lần lượt là 470/15 nm và 520/15 nm Để khảo sát phát hiện đa mục tiêu, mỗi loại crRNA riêng biệt được đưa vào từng giếng phản ứng độc lập, cho phép thực hiện đồng thời các phản ứng CRISPR khác nhau trên cùng một đĩa thí nghiệm.
Quy trình phát hiện mục tiêu dựa trên Cas12a kết hợp với khuếch đại đẳng nhiệt trong nền tảng RT – RPA – CRISPR – Cas12a bao gồm hai bước chính: khuếch đại DNA và nhận diện mục tiêu thông qua cơ chế cắt của Cas12a Tuy nhiên, đặc điểm chính xác cao của phản ứng khuếch đại RT – RPA có thể tạo ra khí dung, làm tăng nguy cơ nhiễm chéo và dẫn đến kết quả dương tính giả Hơn nữa, khi các thuốc thử RT – RPA và thành phần CRISPR – Cas12a được kết hợp trong hệ thống "one-pot", sự cạnh tranh giữa chúng có thể làm giảm độ nhạy của hệ thống.
Quá trình cắt Cas12a và khuếch đại RT – RPA sử dụng chung cơ chất DNA, gây ra sự cạnh tranh giữa chúng Để khắc phục vấn đề này, Cas12a – crRNA được phối hợp với thuốc thử RT – RPA trong cùng một ống phản ứng Khi xác định ToBRFV, phức hợp Cas12a – crRNA được lắc xuống đáy ống trong suốt quá trình khuếch đại RT – RPA, giúp tương tác trực tiếp với sản phẩm phản ứng Chiến lược một giai đoạn RT – RPA – Cas12a không chỉ loại bỏ nguy cơ nhiễm khí dung mà còn giảm thiểu ảnh hưởng từ sự cạnh tranh giữa các cơ chất DNA, đảm bảo độ nhạy cao trong quá trình phát hiện mục tiêu.
Phản ứng và quy trình chẩn đoán của CRISPR-Cas9
Phản ứng CRISPR được thực hiện với thể tích cuối cùng 20 µL, sử dụng đệm TAE 1× pH 8.5 kết hợp với 0.05% Tween 20 và 12.5 mM MgCl₂ Phức hợp ribonucleoprotein CRISPR – Cas9 được chuẩn bị ở nồng độ 100 nM bằng cách ủ trong 30 phút ở nhiệt độ phòng Mỗi phản ứng trong mẫu thử nghiệm chứa 40 nM DNA sợi kép (dsDNA) đã được khuếch đại, sử dụng mồi có gắn biotin trên một sợi và mồi ngược trên sợi đối diện.
Khi thực hiện phát hiện mục tiêu đơn lẻ hoặc nhiều mục tiêu, mỗi phản ứng sử dụng
2 àL sản phẩm khuếch đại từ cỏc mẫu nhiễm ToBRFV Đối với xỏc định giới hạn phỏt hiện,
Sản phẩm RPA tinh sạch được sử dụng trong các phản ứng, được ủ trong máy trộn nhiệt Eppendorf ở nhiệt độ 37°C trong 25 phút Sau đó, thêm 100 nM beacon phân tử để tiếp tục quy trình.
Quá trình cắt Cas12a và khuếch đại RT – RPA có thể được tối ưu hóa bằng cách thêm các beacon phân tử ngay từ bước đầu của phản ứng CRISPR, giúp đơn giản hóa quy trình mà vẫn đảm bảo hiệu quả tương tự.
Hình 2.3 Phản ứng CRISPR – Cas9.
Phát hiện dựa trên công nghệ CRISPR – Cas9 đã mang lại những tiến bộ quan trọng trong sinh học phân tử và chẩn đoán Một trong những cải tiến nổi bật là phương pháp xét nghiệm axit nucleic bằng dòng chảy ngang do Wang và cộng sự phát triển, kết hợp với hệ thống CRISPR – Cas9 Phương pháp này giảm thiểu sự phụ thuộc vào enzym nuclease, protein hỗ trợ và đầu dò huỳnh quang đắt tiền, đồng thời đạt hiệu suất cao trong việc xác định DNA sợi kép (dsDNA) mục tiêu.
Kỹ thuật xét nghiệm axit nucleic dòng chảy ngang qua trung gian CRISPR – Cas9 (CASLFA) đã mang lại những cải tiến quan trọng trong quy trình phát hiện DNA.
Trong quá trình thực hiện xét nghiệm CASLFA, DNA mục tiêu được khuếch đại thông qua phản ứng PCR hoặc kỹ thuật RPA với mồi gắn biotin Mẫu DNA khuếch đại sau đó được xử lý với phức hợp ribonucleoprotein CRISPR-Cas9 Các amplicon mang biotin liên kết với CRISPR-Cas9 di chuyển đến dải thử nghiệm chứa streptavidin, nơi chúng bị giữ lại và phát sinh tín hiệu màu tại dòng kiểm tra Đồng thời, các đầu dò biotinyl hóa liên kết với streptavidin tại dòng kiểm soát, tạo ra một vạch màu để đảm bảo độ tin cậy của thử nghiệm.
Phương pháp CASLFA có nhiều ưu điểm nổi bật như tính đơn giản, chi phí thấp và khả năng phát hiện DNA mục tiêu với độ nhạy và đặc hiệu cao, chỉ cần vài bản sao gene để đạt ngưỡng phát hiện Thời gian thực hiện thử nghiệm dòng chảy ngang chỉ từ 3 đến 5 phút khi kết hợp với bước khuếch đại ban đầu bằng PCR hoặc RPA Tác giả cũng đề xuất một số cải tiến công nghệ cho CASLFA, bao gồm việc sử dụng đầu dò fluorophore FAM thay cho mồi gắn biotin truyền thống và khả năng tích hợp với nền tảng chẩn đoán tiên tiến COLUMBO.
Beacon phân tử là oligonucleotide DNA có cấu trúc vòng thân (stem-loop) giúp tăng tính ổn định và khả năng lai hóa đặc hiệu với DNA mục tiêu Vùng vòng chứa vị trí seed với hàm lượng GC cao và nhiệt độ nóng chảy (Tm) trên 50°C, đảm bảo hiệu suất tối ưu trong phản ứng CRISPR Các beacon nhắm vào vùng xa PAM (PAM – distal) được gắn fluorophore (FAM) ở đầu 3′, trong khi beacon nhắm vào vùng gần PAM (PAM – proximal) có fluorophore ở đầu 5′ Trước khi sử dụng, các beacon được làm nóng ở 95°C để phá vỡ cấu trúc thứ cấp không mong muốn, sau đó làm lạnh từ từ đến 25°C Việc chuẩn bị và đánh giá các beacon được thực hiện bằng công cụ dự đoán cấu trúc NUPACK để bảo vệ tính đặc hiệu trong quá trình lai hóa.
2.5.2.2 Thử nghiệm dòng chảy ngang
Thử nghiệm dòng chảy ngang sử dụng CRISPR – Cas12a đã được áp dụng trong nhiều nghiên cứu tiên tiến Quy trình này bao gồm việc ủ hỗn hợp ribonucleoprotein CRISPR – Cas12a (200 nM) và đầu dò DNA đơn sợi TTATT gắn nhãn fluorophore-biotin trong hai giờ ở nhiệt độ 37°C Sau đó, dải dòng chảy ngang được ngâm trong dung dịch phản ứng với đệm GenLine Dipstick và 5% PEG 6000 Sau khoảng năm phút, tín hiệu từ vạch kiểm tra và kiểm soát được ghi nhận bằng thiết bị hình ảnh dòng chảy ngang.
2.5.2.3 Thử nghiệm huỳnh quang Đối với phân tích tín hiệu huỳnh quang, các mẫu DNA sợi kép ở các nồng độ khác nhau (từ 0 đến 10 nM) được trộn với phức hợp ribonucleoprotein CRISPR – Cas12a đã chuẩn bị sẵn và đầu dò ssDNA TTATT gắn nhãn fluorophore – FAM Hỗn hợp được đo tín hiệu huỳnh quang bằng thiết bị đọc đa giếng (Clariostar Plus) Kết quả giúp định lượng chính xác DNA mục tiêu thông qua sự phụ thuộc tuyến tính của tín hiệu.
KẾT QUẢ
Kết quả
3.1.1 Chuẩn bị mẫu Để thiết lập hệ thống phát hiện dựa trên CRISPR – Cas12a, cây cà chua khỏe mạnh đã trải qua quá trình tiêm chủng cơ học với chủng virus Tomato brown rugose fruit virus (ToBRFV) được phát hiện và phân lập ở Iran Quá trình này được thực hiện nhằm tạo cây cà chua bị nhiễm ToBRFV để phục vụ cho các phân tích tiếp theo.
Hình 3.1 Cây S lycopersicum (cà chua) vào ngày thứ 10 sau khi nhiễm virus (10 dpi) với
Virus RNA thực vật ToBRFV không gây triệu chứng bệnh ở các cây được xử lý giả lập, trong khi hiện tượng hoại tử xuất hiện ở cây nhiễm virus Để khuếch đại một vùng cụ thể của bộ gen ToBRFV, các oligonucleotide đã được thiết kế, nhắm vào vùng mã hóa protein vỏ ở đầu 3' của bộ gen Mục tiêu này nhằm đảm bảo phát hiện nhiều loại RNA ToBRFV, bao gồm RNA tiểu gen và bộ gen đầy đủ Sự hiện diện của virus trong các cây nhiễm được xác nhận lần đầu bằng các đoạn mồi đặc hiệu thông qua phân tích RT-PCR.
Mồi RT – RPA được thiết kế đặc hiệu cho virus ToBRFV nhằm kiểm tra độ chính xác của sản phẩm khuếch đại từ phản ứng PCR Kỹ thuật điện di trên gel đã được áp dụng để quan sát trực quan các sản phẩm khuếch đại từ các DNA sợi đôi (dsDNA) có nguồn gốc từ virus khác nhau.
Hình 3.3.Kết quả điện di các mẫu RNA tổng số thu từ cây bị nhiễm virus.
3.1.2 Phát hiện ToBRFV bằng CRISPR – Cas12a
Hệ thống CRISPR RNA phụ thuộc Cas12a (crRNA) được thiết kế để nhận diện các amplicon có motif liền kề protospacer (PAM), giúp ngăn chặn tương tác chéo với bộ gen vật chủ Cas12a được sử dụng dưới dạng chế phẩm thương mại, trong khi crRNA được sản xuất thông qua phiên mã in vitro Ribonucleoprotein (RNP) được tổng hợp trước khi thực hiện quy trình phát hiện chẩn đoán virus trên thực vật.
Quá trình phản ứng CRISPR – Cas12a được sử dụng để phát hiện virus thực vật thông qua phân tử ssDNA gắn huỳnh quang Phương pháp RT-RPA tạo ra đoạn DNA amplicon từ virus, cho thấy hiệu quả cao trong phát hiện Virus cũng được kiểm tra bằng phương pháp điện di gel như một biện pháp đối chứng Tuy nhiên, các mồi trong thí nghiệm đôi khi khuếch đại vật liệu từ cây không nhiễm bệnh, dẫn đến tín hiệu không mong muốn Để xác định ngưỡng phát hiện, nhiều mẫu được pha loãng (khoảng hệ số 10^10) từ vật liệu ban đầu với nồng độ virus rất thấp đã được phân tích, và kết quả được trình bày trong Hình 3.4.
Hình 3.4.Phát hiện ToBRFV bằng dải biotin (A) Mẫu RNA tinh sạch; B) Mẫu RNA thô).
RNA tinh sạch từ cây cà chua Solanum lycopersicum (S lycopersicum) nhiễm ToBRFV đã được phát hiện nhờ hệ thống CRISPR – Cas12a Phương pháp RT – RPA cho phép khuếch đại gen virus chỉ trong 30 phút, nhanh hơn nhiều so với 2 giờ của RT – PCR, mặc dù có thể tạo ra tín hiệu nền cao hơn do hiện tượng khuếch đại giả Hình 3.4 minh họa kết quả cắt ssDNA bởi phức hợp crRNA – Cas12a – dsDNA, cho thấy cây nhiễm bệnh có thể phân biệt với cây đối chứng qua tín hiệu huỳnh quang chỉ sau 30 phút phản ứng ở các tải lượng virus khác nhau Việc sử dụng RT – RPA đã rút ngắn thời gian chẩn đoán từ RNA thô và tinh sạch xuống chỉ còn 30 phút.
3.1.3 Phát hiện ToBRFV trong các mẫu thực địa bằng cách sử dụng khuếch đại RT – RPA kết hợp với CRISPR – Cas12a một bước
Các hệ thống phát hiện virus thực vật hiện nay cần thiết phải hoạt động nhanh chóng và di động mà không yêu cầu thiết bị cồng kềnh hay nhân viên có tay nghề cao Hệ thống CRISPR – Cas đáp ứng các tiêu chí này, cho phép sử dụng thí nghiệm sắc ký miễn dịch trên các dải dòng chảy ngang mà không cần máy quang phổ huỳnh quang Kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt như RT – RPA hoạt động ổn định ở nhiệt độ thấp, loại bỏ nhu cầu về máy tuần hoàn nhiệt và hóa chất đắt tiền Để tạo ra các chiết xuất phục vụ cho phân tích, dung dịch phân giải kiềm được sử dụng, giúp thu được toàn bộ axit nucleic, bao gồm cả DNA và RNA từ mô thực vật mà không cần thiết bị phức tạp.
Phương pháp mới sử dụng dung dịch ly giải chỉ mất 5 phút, thay vì 90 phút như phương pháp truyền thống, đồng thời không cần dụng cụ và hóa chất đặc biệt Trong quá trình CRISPR – Cas12a, một phân tử ssDNA gắn fluorescein và biotin được dùng làm đầu dò để xác định kết quả dương tính của nhiễm trùng cho từng mẫu.
Các xét nghiệm được thực hiện đồng thời với và không có quá trình tinh chế RNA Khi RNA không được tinh sạch, cường độ vạch thử nghiệm giảm, cho thấy có ít RNA virus trong mẫu Đặc biệt, khi sử dụng crRNA để phát hiện ToBRFV, cường độ dải biên chỉ được quan sát trong các mẫu từ RNA tinh chế Sự giảm cường độ này là do chiết xuất thô chứa ít vật liệu di truyền tự do hơn, dẫn đến ảnh hưởng tiêu cực đến kết quả.
3.1.4 Độ nhạy phát hiện ToBRFV trong các mẫu thực địa sử dụng khuếch đại RT- RPA kết hợp với CRISPR-Cas12a một bước Để phát hiện ToBRFV, cần một khoảng nồng độ từ 10 pM đến 10 nM của sản phẩm
Hệ thống CRISPR – Cas12a đã được thử nghiệm để xác định khả năng nhận diện chính xác ToBRFV trong điều kiện yêu cầu tối thiểu 10 pM sản phẩm RT – RPA Các thí nghiệm phát hiện đã chứng minh rằng nồng độ 10 pM của ToBRFV trong mẫu tinh khiết có thể được xác định thành công khi kết hợp với sản phẩm RT – RPA Kết quả cho thấy tín hiệu huỳnh quang từ mẫu tinh khiết cao hơn 120% so với tín hiệu tạo ra ở nồng độ ToBRFV 1 pM.
Dữ liệu huỳnh quang tương đối tại thời điểm cuối được thu thập từ các mẫu pha loãng nhiễm ToBRFV (+) và mẫu giả tiêm nhiễm (−) qua phương pháp RT-RPA Độ lệch chuẩn được biểu thị qua thanh sai số, với kích thước mẫu là 4, bao gồm hai lần khuếch đại và hai phản ứng CRISPR-Cas12a cho mỗi lần khuếch đại Các giá trị mức độ thay đổi (± sai số chuẩn) cho các nồng độ khác nhau của ToBRFV tinh sạch lần lượt là: 118337,34 ± 10631,72 cho mẫu giả tiêm nhiễm (Mock) và 120706,67 ± 9463,64 cho nồng độ 10 pM.
Kết quả nghiên cứu cho thấy mức độ huỳnh quang của ToBRFV ở các nồng độ khác nhau có sự khác biệt rõ rệt Cụ thể, ở nồng độ 100 pM, giá trị là 201741 ± 17772,45; ở 1 nM là 955734,34 ± 25202,89; và ở 10 nM là 2386504,34 ± 281430,83 Đối với mẫu giả tiêm nhiễm, mức độ huỳnh quang là 89438 ± 10229,29; 10 pM đạt 94350,67 ± 12244,73; 100 pM là 128093,67 ± 10018,47; 1 nM là 412358,67 ± 74738,96; và 10 nM là 2186124,67 ± 152508,45 Kết quả kiểm định Welch’s t-test cho thấy mức độ huỳnh quang ở các mẫu nhiễm bệnh có ý nghĩa thống kê cao hơn so với mẫu không nhiễm (*), với P < 0,05.
3.1.5 Cas9 cho phép phát hiện trình tự ToBRFV cụ thể
Thảo luận
Để đánh giá độ nhạy của hệ thống, chúng tôi đã thực hiện một dãy pha loãng cho các sản phẩm RT – RPA của ToBRFV Kết quả cho thấy 10 pM sản phẩm RT – RPA là đủ để xác định sự hiện diện của ToBRFV.
Nghiên cứu cho thấy cần khoảng 10 pM đến 10 nM sản phẩm RT – RPA để phát hiện ToBRFV, với ngưỡng tối thiểu 10 pM yêu cầu Hệ thống CRISPR – Cas12a đã được kiểm tra khả năng nhận diện chính xác loại virus này Các thí nghiệm riêng biệt sử dụng sản phẩm RT – RPA từ ToBRFV cho thấy nồng độ 10 pM tạo ra tín hiệu huỳnh quang cao hơn 120% so với 1 pM Kết quả từ mẫu thô của bộ gen ToBRFV nhất quán với mẫu tinh sạch, mặc dù giới hạn phát hiện của mẫu thô cao hơn một chút ở nồng độ 100 pM Những phát hiện này chỉ ra rằng hệ thống CRISPR – Cas12a có tiềm năng xác định ToBRFV ngay cả ở nồng độ thấp.
3.1.5 Cas9 cho phép phát hiện trình tự ToBRFV cụ thể
COLUMBO tích hợp hệ thống CRISPR – Cas9 để mở rộng bộ công cụ phát hiện dựa trên CRISPR, tương tự như DETECTR và SHERLOCK, nhưng cần một bước tiền khuếch đại Khác với các phương pháp khác, COLUMBO dựa vào việc lai hóa hoặc thay thế sợi DNA, với DNA amplicon tạo ra là mục tiêu chính của quy trình.
Phương pháp CRISPR – Cas12a được sử dụng để xác định virus thực vật ở các tải lượng virus khác nhau, nhờ vào ribonucleoprotein sgRNA – Cas9, mang lại tính đặc hiệu cao trong quá trình phát hiện Tín hiệu huỳnh quang từ beacon phân tử tương tác với sợi DNA bị thay thế cho phép phát hiện các DNA amplicon khác nhau bằng cùng một enzyme (Cas9), đồng thời loại bỏ nhu cầu chuẩn bị phức tạp cho các phản ứng vi mô song song, nâng cao tính tiện dụng và tiêu chuẩn hóa trong quy trình (Ackerman và ctv, 2020; Tian và ctv).
Năm 2020, một thí nghiệm đã áp dụng thành công kỹ thuật độc đáo để nhận diện virus ToBRFV trong các mẫu cây bị nhiễm bệnh, chứng minh khả năng ứng dụng của nó trong chẩn đoán bệnh cây.
Chúng tôi đã chứng minh khả năng tương tác giữa COLUMBO và DETECTR, một yếu tố quan trọng trong việc nâng cao độ phức tạp của các chẩn đoán dựa trên CRISPR Kết quả cho thấy R-loop CRISPR-Cas9 có tác dụng trong việc kích hoạt beacon phân tử qua xét nghiệm dòng chảy ngang (lateral flow assay), với hai loại beacon được minh họa trong Hình 3.6.
Nghiên cứu thiết kế áp dụng Cas9 tự nhiên từ Streptococcus pyogenes, nhưng việc phát hiện các biến thể virus sẽ hiệu quả hơn khi sử dụng các phiên bản Cas9 cải tiến với độ đặc hiệu cao hơn (Slaymaker và cộng sự, 2016).
Nghiên cứu về phát hiện CRISPR-Cas9 R-loop với beacon phân tử (COLUMBO) sử dụng Beacon 1 và Beacon 2 có ý nghĩa quan trọng trong việc phát hiện các biến thể virus mới Để nâng cao tốc độ quy trình, cần kết hợp quá trình phát hiện và khuếch đại thành một quy trình duy nhất Kết quả nghiên cứu khuyến khích áp dụng các kỹ thuật chẩn đoán tiên tiến, giúp phát hiện ngay các ca nhiễm bệnh tại chỗ và thực hiện các hành động kịp thời.
Nghiên cứu này chứng minh rằng việc kết hợp RT – RPA với kỹ thuật CRISPR – Cas12a tạo ra một phương pháp hiệu quả và đơn giản để phát hiện ToBRFV trong mô thực vật nhiễm bệnh Phương pháp này đã được xác nhận bởi các nghiên cứu trước đó, củng cố tính đáng tin cậy của nó trong chẩn đoán Đặc biệt, phương pháp cho phép phát hiện nhanh chóng chỉ trong 30 phút từ lá thực vật được bảo quản ở nhiệt độ 37 – 40 °C, mà không cần tinh chế RNA Quy trình này cũng hỗ trợ việc giải thích kết quả ngay lập tức qua xét nghiệm huỳnh quang và các dải dòng chảy bên Nếu được kiểm tra trên nhiều loài thực vật khác nhau, việc sử dụng chiết xuất thô để phát hiện axit nucleic sẽ nổi bật như một phương pháp hứa hẹn, nhanh chóng và thực tiễn trong chẩn đoán thực vật.
Nghiên cứu hiện tại cho thấy phương pháp khuếch đại polymerase tái tổ hợp phiên mã ngược (RT – RPA) đã vượt trội về độ bền, độ nhạy và tốc độ so với các kỹ thuật trước đây như phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược (RT – PCR) và khuếch đại đẳng nhiệt qua trung gian vòng lặp (LAMP) Hệ thống CRISPR – Cas12a đã cải thiện đáng kể độ chính xác trong phát hiện mầm bệnh, trong khi các hệ thống CRISPR – Cas khác, như CRISPR – Cas12b, cũng mang lại độ đặc hiệu tương đương, mở rộng công cụ phân tích hệ gen chính xác.
RNA là vật liệu di truyền của nhiều virus thực vật, nhưng virus DNA cũng có tầm quan trọng kinh tế trong nông nghiệp Cas12f và Cas12a là các enzyme có khả năng nhắm mục tiêu DNA sợi đơn và sợi kép, hỗ trợ phát hiện đa dạng Ngoài virus, thực vật còn bị nhiễm vi khuẩn, nấm và oomycetes Hệ thống CRISPR-Cas12 đã chứng minh hiệu quả trong việc phát hiện gen của các mầm bệnh này, mở rộng ứng dụng chẩn đoán bệnh trên thực vật Khả năng nhận diện trình tự của hệ thống cho phép xác định đa dạng di truyền trong mầm bệnh, bao gồm cả các biến thể khác biệt Để quản lý bệnh hiệu quả, cần phát triển các phương pháp kiểm soát dựa trên nguyên tắc sinh thái và giám sát thực địa liên tục Nghiên cứu cũng đã phát triển phương pháp mới sử dụng CRISPR-Cas9 để phát hiện mẫu nhiễm ToBRFV, đồng thời chứng minh tính năng phối hợp của COLUMBO và DETECTR, tăng cường khả năng ứng dụng chẩn đoán dựa trên CRISPR.
Nghiên cứu này mở ra cơ hội áp dụng hệ thống CRISPR-Cas trong nông nghiệp hiện đại, với khả năng phát triển kỹ thuật phát hiện virus thực vật nhanh chóng, đơn giản và tiết kiệm chi phí ngay tại hiện trường Đặc biệt, nghiên cứu đã thành công trong việc phát hiện virus ở cây cà chua và dự kiến sẽ mở rộng sang các cây trồng khác như ớt, ngô và khoai tây trong tương lai Hệ thống CRISPR-Cas cũng được sử dụng như công cụ can thiệp RNA (RNAi) để chống lại bệnh tật và phát triển giống cây trồng bền bỉ hơn, năng suất cao hơn Các chương trình lai tạo, kỹ thuật di truyền và chẩn đoán tích hợp dựa trên CRISPR-Cas hứa hẹn sẽ cách mạng hóa nông nghiệp và góp phần giải quyết vấn đề cung cấp đủ lương thực.
Việc kết hợp khuếch đại RT – RPA với CRISPR – Cas12a và CRISPR – Cas9 R – loop để mở tín hiệu beacon phân tử sẽ tạo ra một phương pháp chính xác và nhạy bén trong việc phát hiện ToBRFV ngay tại thực địa.
