BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINHKHOA KHOA HỌC SINH HỌC BÁO CÁO GIỮA KỲ PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN THẾ HỆ MỚI DỰA TRÊN CRISPR VÀ KHUẾCH ĐẠI ĐẲNG NHIỆT ĐỂ PH
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Vật liệu
Nội dung 1: Tái nhiễm virus từ mẫu đất lên giống củ cải đường.
Mẫu đất được thu thập từ các khu vực trồng củ cải đường tại Bắc Dakota và Minnesota, Hoa Kỳ Hạt giống củ cải đường sử dụng trong thử nghiệm là giống nhạy cảm với bệnh HD0484.
Môi trường nuôi cấy: Sunshine Mix trộn với cát để trồng cây.
Phân bón: Multicote để cung cấp dinh dưỡng cho cây.
Nội dung 2: Thực hiện phiên mã ngược – khuếch đại polymerase tái tổ hợp
Mô rễ củ cải đường
Mồi PCR được thiết kế đặc biệt để khuếch đại đoạn gen của virus BNYVV, trong khi RNA định vị CRISPR được sử dụng để nhắm mục tiêu vào đoạn gen cụ thể của virus này Để phát hiện sự cắt DNA bởi Cas12a, ssDNA reporter đóng vai trò quan trọng trong quá trình này.
Enzyme: Reverse transcriptase (M-MuLV) để chuyển RNA thành DNA, Cas12a để cắt DNA mục tiêu.
Bộ kit chiết tách RNA: RNeasy Plant Mini Kit để tách RNA từ mẫu mô.
Gel agarose: Sử dụng để điện di sản phẩm PCR.
Thuốc nhuộm: SyberSafe để nhuộm gel agarose.
Plasmid: Mang trình tự gen tổng hợp của BNYVV để làm chuẩn.
Nội dung 3: Xét nghiệm xác nhận CRISPR Guide RNA
DNA plasmid: Mang trình tự gen BNYVV RNA-1 tổng hợp (Genewiz, South Plainfield, NJ, United States)
DNA khuôn mẫu tuyến tính (linear dsDNA template): Tạo ra bằng PCR từ plasmid DNA chứa trình tự BNYVV (464 bp) sử dụng mồi VR-3 và VR-4.
DNA tổng hợp BNYVV: Dùng làm mẫu kiểm tra độ nhạy của xét nghiệm.
Enzyme Cas12a: Từ vi khuẩn Lachnospinaceae (New England Biolabs, NEB, Ipswich, MA, United States)
Guide RNA (21 nts): Thiết kế và tổng hợp bởi IDT (Coralville, IA, United States) Hóa chất:
Dung dịch đệm: Cung cấp kèm với enzyme Cas12a.
Nội dung 4: Xét nghiệm CRISPR-Cas12a Reporter
Cas12a (New England Biolabs, NEB, Ipswich, MA, United States)
Guide RNA (IDT, Coralville, IA, United States) ssDNA reporter (IDT, Coralville, IA, United States)
DNA khuôn mẫu tuyến tính (linear dsDNA PCR fragment) từ BNYVV tổng hợp.
Dung dịch đệm Cas12a cognate buffer
Phương pháp nghiên cứu
3.2.1 Tái nhiễm virus từ mẫu đất lên giống củ cải đường
Các mẫu đất được thu thập từ các khu vực trồng củ cải đường ở Bắc Dakota và Minnesota, do các nhà nông học thuộc Hợp tác xã củ cải đường Nam Minnesota thực hiện.
Giống hạt củ cải đường HD0484, dễ bị nhiễm bệnh, đã được sử dụng trong nghiên cứu này Hạt được trồng trong hỗn hợp Sunshine Mix và cát theo tỷ lệ 1:1, với phân bón giải phóng chậm Multicote bổ sung theo hướng dẫn Cây được nuôi trong nhà kính ở nhiệt độ 24℃/18℃ và được cung cấp 8 giờ ánh sáng mỗi ngày, cùng với nước bổ sung khi cần thiết Sau sáu tuần trồng trong đất nhiễm bệnh, mẫu rễ từ hai đến ba cây mỗi chậu được thu hoạch, rửa nhẹ nhàng, giữ lại sợi lông rễ, lau khô và bảo quản ở -80℃ cho việc chiết xuất RNA sau này.
3.2.2 Phiên mã ngược – khuếch đại polymerase tái tổ hợp
Phản ứng RPA được thực hiện bằng bộ dụng cụ lỏng TwistAmp từ TwistDx, Cambridge, Vương quốc Anh Các mồi được thiết kế và tổng hợp bởi Integrated DNA Technologies (IDT) tại Coralville, IA, Hoa Kỳ, nhằm mục đích khuếch đại một đoạn DNA cụ thể.
Nghiên cứu đã xác định 465 cặp bazơ của BNYVV RNA-1 và thiết lập phản ứng RPA với các thành phần như DNA plasmid chứa trình tự gen BNYVV RNA-1, mồi xuôi (VR-1) và mồi ngược (VR-2), cùng với các thuốc thử khác Phản ứng được ủ ở 40℃ trong 30 phút và amplicon RPA được phân tích bằng điện di gel agarose Đối với quá trình khuếch đại BNYVV từ mô rễ củ cải đường, RNA tổng được chiết xuất từ rễ khỏe mạnh và rễ bị nhiễm rhizomania Phản ứng RT-RPA được thiết lập với nồng độ RNA đồng nhất từ hai loại rễ, sử dụng các thành phần như mồi, đệm phản ứng, dNTP, và M-MuLV Reverse Transcriptase Các sản phẩm RT-RPA được hình dung bằng gel agarose có chứa thuốc nhuộm SyberSafe và sau đó giải phóng để tiến hành giải trình tự Sanger.
Bảng 3 1 Trình tự các đoạn mồi, ssDNA reporter, RNA định vị CRISPR và mục tiêu được sử dụng trong nghiên cứu này.
AUUGGCGGUUGC-3’(3180–3200) BNYVV synthetic template DNA
MT227164 gcgttctgattatcagaatcaacgagttggtgatgagcttctttcttggga ctttcacacgcctcacaaagcattggatgttactggtaagcaaattatttt tgttgatgagtttacagcctatgattggcggttgctagctgtgttggcttata gaaatcatgcccatactatttacttagttggtgatgagcagcagactggt attcaagagggtcgtggagaaggaatatcgatacttaacaaaattgat ctgtctaaggtttctacacatgttccaatcatgaactttagaaatcctgtcc gtgatgttaaggtattaaattatctgttcgggtctcgtatggttcctatgtct tccgttgaaaagggatttagtttcggggatattaaagaattttcgtctttgtc aaatatcccagacactaaaatcattcattattccgatgagactggtgaa catat (3064–3528)
Tọa độ liên quan đến mục tiêu BNYVV RNA-1 được chỉ ra trong dấu ngoặc đơn.
Trình tự gạch chân đề cập đến RNA hướng dẫn của BNYVV RNA-1
3.2.3 Xét nghiệm xác nhận CRISPR Guide RNA Đoạn DNA đại diện cho vùng gen RNA-1 của BNYVV (mã số truy cập GenBank MT227164) bao gồm 465 bp được chọn làm mục tiêu cho xét nghiệm CRISPR đã được tổng hợp (Bảng 3.1) và thu được trong một vectơ nhân bản chuẩn (Genewiz, South Plainfield, NJ, Hoa Kỳ) Trong đoạn tổng hợp, một trình tự PAM cho Cas12a đã được xác định và một guide RNA gồm 21 nts nhắm vào đoạn BNYVV đã chọn đã được thiết kế và tổng hợp (IDT, Coralville, IA, Hoa Kỳ) Cas12a từ Vi khuẩn Lachnospinaceae được sử dụng trong xác nhận RNA hướng dẫn được mua từ New England Biolabs (NEB,Ipswich, MA, Hoa Kỳ) Để thử nghiệm sự phân cắt cụ thể của DNA mục tiêu trong ống nghiệm xét nghiệm sinh hóa, một khuôn dsDNA tuyến tính (464 bp) được tạo ra thông qua PCR sử dụng các đoạn mồi VR-3 và VR-4 và DNA plasmid được nhân bản tổng hợp chứa trình tự BNYVV đã chọn (Bảng 3.1) Đầu tiên, phức hợp ribonucleoprotein được lắp ráp trước bằng cách sử dụng 30 nM Cas12a và 40 nM guide RNA trong đệm được cung cấp cùng với Cas12a và ủ ở 25℃ trong 10 phút Trong điều kiện in vitro phản ứng phõn cắt được thiết lập bằng cỏch thờm 10 àL của Cas12a được lắp rỏp trước (30 nM) và phức hợp RNA hướng dẫn (40 nM) đến khuôn mẫu (20 nM) cùng với 1X nồng độ của dung dịch đệm tương ứng trong thể tớch 30 àL trong đú thể tớch cuối cựng được tạo thành bằng nước không có nuclease và ủ ở 37℃ trong nhiều thời điểm khác nhau từ 5, 10, 20 và 30 phút để xác định động học cắt theo thời gian Các phản ứng cắt được phân tích trên gel agarose và chụp ảnh bằng ChemiDoc (Bio-Rad, Hercules, CA, Hoa Kỳ).
3.2.4 Xét nghiệm CRISPR-Cas12a Reporter Đối với xét nghiệm CRISPR-based reporter, phức hợp ribonucleoprotein được lắp ráp trước bằng cách sử dụng Cas12a (30 nM), guide RNA (40 nM) và ssDNA reporter
The study utilized a 30 nM concentration of Cas12a cognate buffer at 25°C for 10 minutes, incorporating a single-stranded DNA (ssDNA) reporter labeled with a 5'6-carboxyfluorescein (FAM) and a 3' Black Hole Quencher-1 (BHQ-1), as detailed in Table 3.1 The ssDNA was synthesized by IDT in Coralville.
Để đánh giá độ nhạy của xét nghiệm CRISPR trong việc phát hiện BNYVV, một đoạn PCR dsDNA tuyến tính từ BNYVV tổng hợp đã được sử dụng Mẫu được pha loãng mười lần với các nồng độ 10, 1, 0,1 và 0,01 pM, và mỗi nồng độ 2 µL được sử dụng trong xét nghiệm CRISPR-reporter với thể tích 40 µL trong đĩa 96 giếng Các phản ứng được ủ ở 37℃ trong 60 phút, và tín hiệu huỳnh quang được đo ở bước sóng 485 nm và 535 nm Để phát hiện BNYVV từ mẫu rễ củ cải đường, RT-RPA được thực hiện với 100 ng RNA tổng chiết xuất từ mô rễ, sử dụng cặp mồi VR-1 và VR-2 trong thể tích 50 µL Các phản ứng RT-RPA được pha loãng đến 10−5, và 5 µL từ mỗi nồng độ được dùng cho xét nghiệm CRISPR Để giảm nhiễu nền, phản ứng không kiểm soát mẫu (NTC) được đưa vào xét nghiệm trước khi vẽ đồ thị.
CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Kết quả
4.1.1 Khuếch đại đẳng nhiệt và xác nhận trình tự của BNYVV từ rễ B vulgaris bằng RT-RPA
Củ cải đường được trồng trên đất ruộng nhiễm rhizomania nhằm so sánh các đặc điểm hình thái với cây khoẻ mạnh Nghiên cứu này đã xác nhận sự hiện diện của bệnh rhizomania trong đất thông qua xét nghiệm ELISA để phát hiện BNYVV.
Hình 4.1 Hình thái phần thân của các cây củ cải đường.
(1) Trồng với đất không nhiễm bệnh; (2) Trồng với đất nhiễm bệnh
Trong điều kiện nhà kính, cây củ cải đường trồng trong đất sạch phát triển tốt với lá màu xanh tươi Ngược lại, khi trồng trong chậu đất nhiễm, cây sẽ kém phát triển, với lá nhỏ và màu vàng.
Hình 4 2 Hình thái rễ cây của các cây củ cải đường.
(1) Trồng với đất không nhiễm; (2) Trồng với đất nhiễm
Quan sát hình thái rễ ở 2 cây, rễ cây ở chậu không có đất nhiễm rễ cái lớn, rễ con dày.
Rễ cây củ cải đường ở chậu đất chứa đất nhiễm có rễ cái nhỏ, rễ con mỏng, kém phát triển.
Hình 4.3 Kết quả điện di trên gel agarose (L) ladder; (A) Mẫu khoẻ, (B1) Mẫu bệnh nồng độ 5; (B2) Mẫu bệnh nồng độ 10, (C) NTC
Virus hoại tử gân vàng củ cải đường (BNYVV) gây ra bệnh rhizomani là virus RNA, do đó cần thực hiện RT-RPA với đoạn mồi khuếch đại 465 bp của BNYVV RNA-1 Kết quả cho thấy việc thêm EDTA nồng độ 20mM vào phản ứng RT-RPA giúp quan sát band sản phẩm dễ dàng hơn ở cả hai thể tích 5 và 10 EDTA Trên gel, có sự khuếch đại band mục tiêu ở mẫu cây trồng nhiễm bệnh, trong khi không có band khuếch đại ở mẫu đối chứng cây trồng không nhiễm và NTC, cho thấy tính đặc hiệu của thuốc thử trong phản ứng RPA Phân tích giải trình tự Sanger xác nhận đoạn khuếch đại có trình tự RNA-1 BNYVV mong đợi.
4.1.2 Xác nhận RNA hướng dẫn (gRNA) được thiết kế để nhắm mục tiêu vào bộ gen BNYVV
Sơ đồ bộ gen RNA1 của BNYVV cho thấy vị trí của gRNA và thông tin trình tự tương ứng, với gRNA được thiết kế nhắm vào RNA-1, phần rất quan trọng trong việc mã hóa các enzyme cần thiết cho quá trình sao chép vi-rút Phần gạch chân thể hiện CRISPR-RNA, trong khi phần tô vàng đại diện cho PAM Để đánh giá hiệu quả cắt cis do Cas12a trung gian, thí nghiệm đã được thực hiện trong ống nghiệm bằng cách ủ các sản phẩm PCR từ RNA-1 tổng hợp của BNYVV cùng với enzyme Cas12a tại các thời điểm khác nhau.
5, 10, 20 và 30 phút ở 37°C và phân tích trên điện di gel agarose.
Kết quả từ gel agarose cho thấy hoạt động cắt DNA của RNA hướng dẫn BNY-gR1 diễn ra hiệu quả trong vòng 5 phút ủ, chứng minh tính năng cắt cao của nó Thử nghiệm trong ống nghiệm xác nhận khả năng hình thành phức hợp RNA-protein với Cas12a và nhận dạng trình tự PAM trên DNA khuôn mẫu, từ đó xúc tác quá trình cắt đặc hiệu và giải phóng các sản phẩm mong đợi.
4.1.3 Đánh giá độ nhạy của việc phát hiện BNYVV dựa trên CRISPR-Cas12a bằng cách sử dụng các mục tiêu tổng hợp
Kết quả phân tích là sự so sánh các tín hiệu huỳnh quang rõ ràng trong các phản ứng có
DNA khuôn mẫu BNYVV cho thấy tín hiệu rõ ràng khi được kiểm tra với các đối chứng âm tính không có khuôn mẫu Đánh giá cho thấy rằng lượng DNA khuôn mẫu tối thiểu cần thiết là 0,1 PM và tối đa là 10 PM để đạt được tín hiệu huỳnh quang bão hòa Kết quả này xác nhận rằng phức hợp RNA-Cas12a đã được lắp ráp trước đó có khả năng cắt đặc hiệu dsDNA mục tiêu, đồng thời Cas12a cũng thể hiện chức năng phụ trong việc cắt ssDNA không đặc hiệu.
Hình 4.5 trình bày kết quả điện di trên gel agarose, cho thấy sản phẩm DNA đã cắt với kích thước 331 và 133 bp Các mẫu được phân tích theo thời gian 5, 10, 20 và 30 phút, được đánh dấu từ 1 đến 4 ở đầu ảnh gel Trong đó, UC là DNA khuôn mẫu chưa cắt và M là ladder Quá trình này cắt trans của ssDNA và phát ra tín hiệu huỳnh quang có thể đo được.
Hình 4 6 Sơ đồ độ nhạy của phát hiện BNYVV dựa trên CRISPR-Cas12a sử dụng các mục tiêu DNA tổng hợp.
Trục y biểu diễn các giá trị trừ nền của các đơn vị huỳnh quang, trong khi trục x thể hiện các pha loãng của DNA mục tiêu được chỉ định theo picomolar (pM).
Tín hiệu đầu ra trong các phản ứng xét nghiệm được định lượng bằng máy đọc đĩa, với các phản ứng không có khuôn mẫu đóng vai trò đối chứng âm tính và giúp trừ nền Kết quả cho thấy phản ứng dựa trên khả năng phụ cắt ssDNA của Cas12a có độ nhạy phát hiện cao.
4.1.4 Phát hiện BNYVV dựa trên CRISPR-Cas12a trong rễ cây B Vulgaris nhiễm bệnh Rhizomania từ đất đồng ruộng
Hình 4 7 Đồ thị so sánh kết quả tín hiệu huỳnh quang của mẫu nhiễm bệnh và mẫu khoẻ.
Trục y biểu thị huỳnh quang từ nền và trục x biểu thị nồng độ pha loãng của DNA khuôn mẫu do RT-RPA tạo ra
Rễ cây bị nhiễm bệnh rhizomania được lấy từ đất ruộng dương tính với bệnh này qua phương pháp ELISA, trong khi rễ đối chứng là rễ khỏe mạnh trồng trên đất không nhiễm bệnh Phương pháp RT-RPA được thực hiện ở điều kiện đẳng nhiệt, sử dụng RNA tổng hợp từ cả rễ bị nhiễm và rễ khỏe mạnh Để kiểm tra độ nhạy của xét nghiệm CRISPR-Cas12a, các phản ứng RT-RPA được pha loãng theo chuỗi 10 lần, trong đó 5 μl dung dịch pha loãng được sử dụng cho phản ứng CRISPR-Cas12a với ssDNA gắn huỳnh quang Kết quả cho thấy tín hiệu huỳnh quang mạnh từ các mẫu rễ bị nhiễm so với mẫu rễ khỏe mạnh, với tín hiệu nền từ NTC được trừ đi để giảm nhiễu Đánh giá tương quan giữa độ giảm tín hiệu huỳnh quang và nồng độ pha loãng cho thấy giới hạn tối thiểu để nhận được tín hiệu huỳnh quang là 0,1 ng.
Sơ đồ cũng cho thấy độ nhạy của xét nghiệm đối với lượng ít mẫu.
Hình 4.8 Minh họa sơ đồ các quy trình từng bước liên quan đến việc phát triển chẩn đoán BNYVV dựa trên
CRISPR-Cas12a cho bệnh rễ giả ở rễ củ cải đường.
Sơ đồ minh họa các giai đoạn phát triển phương pháp dựa trên CRISPR-Cas12a để phát hiện BNYVV bao gồm enzyme Cas12a, RNA hướng dẫn CRISPR và ssDNA gắn tín hiệu huỳnh quang Quá trình này cho thấy cách thông tin từ RNA virus được chuyển đổi thành tín hiệu có thể phát hiện được.
Thảo luận
Bệnh rễ do BNYVV là một vấn đề toàn cầu nghiêm trọng, ảnh hưởng đến năng suất củ cải đường Để quản lý bệnh hiệu quả, cần có phương pháp chẩn đoán chính xác và nhạy cảm Nghiên cứu này giới thiệu phương pháp phát hiện BNYVV dựa trên CRISPR-Cas12a, trong đó khuếch đại đẳng nhiệt mẫu vi-rút là bước quan trọng Các phương pháp phân tử trước đây như RT-PCR thông thường, RT-PCR lồng nhau và IC-RT-LAMP tuy nhiên, đều yêu cầu phân tích bằng điện di gel, gây tốn thời gian Phương pháp LAMP cần từ bốn đến sáu đoạn mồi, dẫn đến khả năng tạo ra khuếch đại nền không mục tiêu Do đó, việc phát triển một phương pháp tối ưu hơn vẫn là một lĩnh vực nghiên cứu quan trọng.
Phương pháp RT-RPA một bước đẳng nhiệt kết hợp với CRISPR-Cas12, sử dụng endonuclease Cas12a, cho phép cắt DNA sợi đôi (ds) mục tiêu theo trình tự cụ thể nhờ vào gRNA Sau khi cắt, Cas12a có khả năng cắt ssDNA không phân biệt, tạo ra tín hiệu đầu ra tăng cường thông qua ssDNA gắn tín hiệu huỳnh quang, nâng cao độ nhạy cho xét nghiệm Phương pháp này đơn giản, chỉ cần hai đoạn mồi và có thể thực hiện ở nhiệt độ đẳng nhiệt mà không cần thiết bị phức tạp, vượt trội hơn so với các phương pháp phân tử hiện có trong việc phát hiện BNYVV gRNA được thiết kế dựa vào trình tự RNA-1 của BNYVV, đảm bảo tính ổn định và độ tin cậy cao trong việc phát hiện Sự phát triển của các phương pháp phát hiện virus chính xác và nhạy cảm là cần thiết để quản lý bệnh, trong khi các công cụ chẩn đoán dựa trên CRISPR-Cas đang trở thành xu hướng nổi bật trong lĩnh vực này.
Phương pháp RT-RPA đẳng nhiệt một bước cho phép phát hiện BNYVV từ rễ củ cải đường bị nhiễm rhizomania một cách đơn giản và hiệu quả, khác biệt so với các xét nghiệm RT-PCR truyền thống Kết hợp với công nghệ CRISPR-Cas12a, phương pháp này tạo ra nền tảng phát hiện nhạy, đặc hiệu và có khả năng xử lý cao, hỗ trợ đánh giá rhizomania Việc phát triển và xác nhận phương pháp chẩn đoán BNYVV dựa trên CRISPR mang lại lợi thế về độ nhạy và độ mạnh trong điều kiện đẳng nhiệt, đóng vai trò quan trọng trong ngành công nghiệp củ cải đường để quản lý virus Hơn nữa, công nghệ này có thể được áp dụng để phát hiện các loại virus lây nhiễm cây trồng khác, mở rộng khả năng chẩn đoán cho các tác nhân gây bệnh trong đất.
