Báo cáo thực tập kiểm nghiệm vi sinh

Độ sâu này phủ hợp đề các loại tảo cộng sinh với rạn san hô có thể thu nhận ánh sáng mặt trời cần cho quang hợp.. - Sự ô nhiễm: Các chất thải từ hoạt động sinh hoạt và sản xuất của con n

BAO CAO THUC TAP KIEM NGHIEM VI SINH

Giảng viên hướng dẫn:

Nhóm 6:

1 Ngo Thi Kim Phuong19180061

MỤC LỤC

M AAU

PHAAN | TONG QUAN

1 Rạn san hô

1.1 Đặc điểm rạn san hô

1.2 Các môi đe dọa

1.3 Hệ thông rạn san hô trên thê giới

1.4 Hệ thông rạn san hô ở Việt Nam

N Những nghiên cứu trong và ngoài nước đã được công bô

2.1 Tình hình nghiên cứu hiện nay

2.2 Giới thiệu BMCs

3 Tổng quan về loài san hô Acropora aspera

3.1 Lý do lựa chọn loài

3.2 Đặc điểm của loài

3.3 Điều kiện nuôi nhân tạo

3.4 Xác định địa điểm phù hợp

+> Giới thiệu kỹ thuật

4.1 Kỹ thuật PCR

4.2 Kỹ thuật giải trình tự rRNA 16S

PHÂÂN II QUY TRÌNH

1 Nuôi cây san hô

2 Tách, sàng lọc, nuôi cây các chủng BMCs

3 Chuẩn bị hỗn hop BMC

4 Thử nghiệm san hô với vi khuẩn

5, Đánh giá kết quả thử nghiệm

6 Sản phẩm khoa học dự kiên

7 Kê hoạch thực hiện

PHÂÂN III ĐÁNH GIÁ DỰ ÁN

MỞ ĐẦU

Hệ sinh thái rạn san hô là một trone những hệ sinh thái có tính đa dạng sinh học cao nhất và cổ xưa nhất trên hanh tinh (Cesar H., 2002) Chung gop phan quan trong trong sự đa dạng sinh học biến và đem lại nhiều lợi ích kinh tế như du lịch, thương mại, Tuy nhiên, rạn san hô lại là đối tượng dễ bị tôn thương khi chịu tác động của biến đổi khí hậu, axit hóa đại dương và hoạt động con người Theo nghiên cứu của Mạng lưới Giám sát Rạn san hô Toàn cầu (GCRMN), tình trạng tây trắng san hô trên thé giới diễn ra ngảy cảng thường xuyên Từ năm 1998 đến 2009, thế giới đã mất 14% tong lượng san hô toàn cầu Trong đó, Việt Nam có đến 96% san hô bị đe dọa, bao gồm 75% bị đe dọa nghiêm trọng đến rất nghiêm trọng Hệ sinh thái này đang bị suy thoái nghiêm trọng cả về số lượng và chất lượng [I1] Điều này đặt ra vẫn để cấp bách trong công tác giữ gìn và phục hỏi rạn san hô

Trong khi đó, probiotics được xem là lớp hàng rào bảo vệ rạn san hô Chúng có vai trò cộng sinh giúp cân bằng hệ sinh thái rạn san hô và giảm tác động stress của môi trường Với đặc điểm này, nhóm 7 quyết định chọn giải pháp: “ỨNG DỰNG KHUẨN PROBIOTICS BẢO VE SAN HO ACROPORA ASPERA KHOI TAY TRANG TAI HANG RAI, NINH THUẬN” với hai mục tiêu:

1 Phân lập những vi khuân có lợi cho san hô

PHẦN I TỔNG QUAN

1 Ran san ho

1.1 Đặc điểm rạn san hô

Rạn san hô là cấu trúc araponit được tạo bởi các cơ thê sông Chúng tồn tại đưới dạng các thể polyp nhỏ, và thường sống thành các quần thê gồm nhiều cá thê giống nhau Khi một đầu san hô sinh trưởng nó sẽ tạo cấu trúc xương canxi cacbonat bao quanh mỗi polyp mới Do tác động của các lực bên ngoài làm bộ xương vỡ, hình thành nên cấu trúc rạn

Phần lớn san hô phát triển tốt nhất trong môi trường nước ấm, nông, trong sạch

và có nắng Chúng được tìm thấy ở cả các vùng biển nhiệt đới cũng như ôn đới, nhưng

chỉ hình thành ở khu vực nằm trong đường xích đạo trải từ vĩ độ 30° Bắc đến 30°

Nam Các loài san hô tạo rạn không sông tại các độ sâu quá 50m và nhiệt độ dưới 20°C Độ sâu này phủ hợp đề các loại tảo cộng sinh với rạn san hô có thể thu nhận ánh sáng mặt trời cần cho quang hợp

Đa dạng sinh học rạn san hô là vô cùng lớn Đây là nơi trú ngụ của hơn 4000 loài

cá như cá bướm, cá thia, má mó và một số sinh vật biển khác như san hô, giun nhiéu

tơ (polychaeia) Ngoài ra, san hô còn sông cộng sinh với các loại tảo đơn bảo, tảo san

hô nhiều loại rong biên giúp luân chuyên dinh dưỡng trong hệ sinh thái biển Vì vậy

mà hiệu suất sơ cấp của một rạn san hô cực kỳ cao [21]

1.2 Các mối đe dọa

Các nhà khoa học và nhà nghiên cứu từ Viện Tài nguyên Thế giới đã ước tính hai phan ba ran san hô trên thế đang đối mặt với các mối đe dọa nghiêm trọng Các mỗi đe đọa chính bao gồm:

- Biến đổi khí hậu: Các rạn san hô đang đối mặt với biến đổi khí hậu toàn cầu do chính con người gây ra Sự nóng lên của Trái đất kéo theo tăng nhiệt độ nước biến đã

là phá vỡ mỗi quan hệ cộng sinh giữa vi tảo đơn bào Điều này dẫn đến hiện tượng rạn san hô bị tay trang trên diện rộng

Hình 1 Hiện tượng tây trắng ở san hô (Nguồn: buttchi 3 Sha Life/Shutterstock )

- Biến bị acid hóa: Các hoạt động thải khí từ công nghiệp đã làm gia tăng lượng khí carbon dioxide Quá trình hòa tan khí CO; vào nước bién sé tao ra carbonic acid Kết quả là làm giảm pH môi trường nước và ức chế quá trình san hô trong việc hình thành bộ xương Những bộ xương yếu khiến cho san hô dễ bị tôn thương hơn đối với mam bệnh và dần dần gây phá hủy quần thê nảy

- Sự ô nhiễm: Các chất thải từ hoạt động sinh hoạt và sản xuất của con người thải trực tiếp xuống ao hồ theo dòng chạy đồ ra biến Điều này dẫn đến sự thay đổi cảnh quan và đe dọa lên sức khỏe của các rạn san hô

- Tảo và vi khuân: Phân bón giàu nitơ, chất thải động vật, chất thải con người và công nghiệp chưa qua xử lý gây ra hiện tượng phú dưỡng Tảo phát triên sinh sôi gây thiếu oxy và tạo điều kiện cho các vi khuân gây bệnh cho san hô hoạt động mạnh [2]

1.3 Hệ thống rạn san hô trên thế giới

Diện tích rạn san hô được ước tính là 284.300 km', chỉ chiếm dưới 0,1% diện

tích bề mặt của đại dương Các rạn san hô phân bố chủ yếu ở vùng biên Ân Độ -Thái Bình Dương (chiếm 91,9%), Đông Nam Á chiếm 32,3%, Đại Tây Dương và biến Caribbe thì chỉ bao phủ 7,6% diện tích

Vào năm 1998, rạn san hô lớn nhất thế giới Great Barrier đã đối mặt với đợt nắng nóng ký lục Từ năm 1980 đến 2015, sự biến động về độ bao phủ toàn cầu giảm nghiêm trọng Từ năm 2016, 98% rạn san hô Great Barrier đã bị tây trắng nghiêm trọng và 80% rạn san hô riêng lẻ bị tây trắng nhiều lần Một báo cáo gần đây của Mạng lưới Giám sát Rạn san hô Toàn cầu đã thu nhập số liệu từ 35.000 cuộc khảo sát trên 73 quốc gia trong vòng 40 năm qua để phản ánh sự biến động của rạn san hô Điều này cho thấy khả năng phục hồi của rạn san hô suy giảm

projected to experience severe heat stress annually will increase to 75% by the 2040s and 90% by the 2050s Data from Coral Reef Watch and WRI

Hinh 3 Dy bao tan suat tay trang cua ran san hé trong tuong lai

(Nguén: Burke, L., & Wood, K (2021)

1.4 Hệ thống rạn san hô ở Việt Nam

Vùng biển Việt Nam là một trong những vùng biển có thành phần loài san hô cứng đa dạng và phong phú nhất Chỉ xét riêng 8 đảo: Cô Tô, Bạch Long Vỹ, Côn Cỏ, Cù Lao Chàm, Nam Yết, vịnh Nha Trang, Côn Đảo và Phú Quốc, có 428 loài san hô cứng tạo rạn

đã được phân loại và mô tả.

Việt Nam có điều kiện tự nhiên thuận lợi cho sự phát triển của san hô tạo rạn Tuy nhiên, các rạn san hô lại đang chịu nguy cơ bị tàn phá bởi các hoạt động đánh cá quá mức, ô nhiễm và trầm tích, đặc biệt là sông Mê Kông Năm 1985, san hô có mặt ở hầu khắp các vùng ven đảo ở vịnh Hạ Long Đến năm 1998, diện tích san hô chỉ còn 2/3 so với năm 1985 Một khảo sát vào tháng 6 năm 2006 cho thấy hầu như không còn san hô tại các vịnh Hạ Long và Bái Tử Long Nhiều rạn san hô xung quanh Côn Đảo có hiện tượng tẩy trắng do sự xâm lấn của nước ngọt từ sông Sài Gòn vào năm 2005

Đi cùng với sự suy thoái của san hô trong vùng là sự vắng bóng của các loài hải sản quý và sự suy giảm sản lượng đánh bắt thủy sản nói chung Gần đây, sự phục hồi chậm của rạn san hô cứng đã được ghi nhận ở nhiều nơi Quan sát của nhóm nghiên cứu Viện Nghiên cứu Hải sản từ 2005 đến 2007 cho thấy biểu hiện phục hồi của san hô cứng ở Côn Đảo, nhiều polyp non mọc trở lại trên các tập đoàn san

hô bị tẩy trắng [4]

Trong 20 năm từ năm 2001 đến 2020, Việt Nam đã mất 12%

số rạn san hô, 48% số rạn san hô khác đang bị suy thoái nghiêm trọng Nhiều nơi diện tích che phủ san hô giảm trên 30%, tập trung

ở các vùng có dân cư sinh sống như các tỉnh ven biển miền Trung, Vịnh Hạ Long, một số đảo thuộc quần đảo Trường Sa [18] Hiện tượng tẩy trắng ở san hô còn được ghi nhận ở Ghềnh Ráng (Bình Định), đầm Cù Mông (Phú Yên), Vũng Rô (Khánh Hòa), Kỳ Lợi (Hà Tĩnh) [19] Đến năm 2020, đã có 6 loài san hô được đưa vào Sách đỏ Việt Nam và Danh mục đỏ TUCN Theo một nghiên cứu được công bố năm 2021, các rạn san hô ở Cù Lao Chàm và bán đảo Sơn Trà xuất hiện tẩy trắng ở mức độ thấp, trung bình tỉ lệ tẩy trắng ở Cù Lao Chàm là 9,09% và ở Sơn Trà là 8,86%, thấp hơn đáng kể so với mức

độ tẩy trắng ở những khu vực khác được khảo sát trong cùng nghiên cứu như Nha Trang, Ninh Thuận và Côn Đảo, trong đó vùng Đá Bàn

ở bắc Sơn Trà và Hòn Sụp ở Nam Sơn Trà không ghi nhận hiện tượng tẩy trắng [20]

2 Những nghiên cứu trong và ngoài nước đã được công bố 2.1 Tình hình nghiên cứu hiện nay

Hiện nay ở Việt Nam vẫn chưa có bất kỳ công trình nghiên cứu nào về việc ứng dụng vi khuẩn nhằm bảo vệ san hô trước biến đổi khí hậu Nhìn chung chỉ có những nghiên cứu xoay quanh vai trò và

Trước đây ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu về việc bảo vệ san hô như nhân giống nhân tạo hoặc chỉnh sửa gen của san hô giúp gia tăng khả năng kháng nhiệt Tuy nhiên việc nhân giống nhân tạo rất khó khăn vì thường phải lặn xuống biển để cấy và trong quá trình trưởng thành, đặc biệt là ở giai đoạn ấu trùng, san hô vẫn rất nhạy cảm với stress nhiệt và dễ bị tẩy trắng, điều này khiến cho việc nhân giống nhân tạo không được hiệu quả và cũng tốn kém nhiều chi phí Còn về các nghiên cứu chỉnh sửa gene chỉ tập trung vào đối tượng là san hô mà bỏ qua các hệ vi sinh vật cộng sinh với nó, trong khi khả năng chống chịu với sự tẩy trắng phụ thuộc vào cả hệ holobiont

Vì vậy mà nghiên cứu về ứng dụng các vi khuẩn có lợi cho sức khoẻ san hô sẽ giúp cải thiện sức khỏe của cả holobiont, từ đó gia tăng hiệu quả chống chịu stress nhiệt cũng như kháng các mầm bệnh cho san hô một cách toàn diện hơn

2.2 Giới thiệu BMCs

BMCs (Beneficial Microorganism for Corals) là các vi sinh vật

“probiotic” có lợi cho san hô Thuật ngữ này trực tiếp đề cập đến

7

các vi sinh vật cộng sinh có vai trò duy trì và bảo vệ sự cân bằng hệ sinh thái rạn san hô BMCs góp phần tăng sức sống của san hô thông qua:

- Thúc đẩy dinh dưỡng và tăng trưởng: San hô cần những chất dinh dưỡng thiết yếu từ môi trường hoặc các hợp chất được chuyển hóa do tảo và vi sinh vật cộng sinh cung cấp Ở vùng nước nông, sản phẩm chuyển hóa của quá trình quang hợp cung cấp đến 90% nhu cầu năng lượng cho san hô

- Giảm stress và tác động của chất độc: San hô thường xuyên bị

đe dọa do tiếp xúc với các hợp chất độc hại Lượng lớn vi sinh vật có khả năng sử dụng chất độc hại này như chất nền và có tiềm năng giảm thiểu stress cho san hô trong các điều kiện môi trường khác nhau

- Ngăn cản mầm bệnh: Một số vi sinh vật được tìm thấy trong san hô có khả năng sản xuất các hợp chất chống khuẩn Vì vậy những vi sinh vật này góp phần giảm khả năng nhiễm mầm bệnh cho rạn san hô [9]

3 Tổng quan về loài san hô Acropora aspera

3.1 Lý do lựa chọn loài

- Thành phần khu hệ san hô ở khu vực Ninh Thuận gồm 13 giống khác nhau

trong đó giống Acropora thudc ho Acroporidae c6 độ phủ lớn nhất chiếm 20,5% va ty

lệ tây trắng rất cao 58,8% [13]

- Trong đó loài lcropora asperad hiện đang trong sách đỏ IUCN ở mức độ sẽ nguy cấp (VU) [15] đo đang chịu tác động của sự tây trắng và bệnh san hô, nhạy cảm với sự tăng nhiệt độ và axit hóa dai dương tác động của con người và hiện tượng tây

- Ảnh hưởng : Suy thoái, sau đó phục hồi chậm

- Định hướng: Tạo quần thể san hô có thể chống chịu tốt với stress nhiệt, mầm bệnh và tăng cường khả năng phục hồi sau tây trắng

3.2 Đặc điểm của loài

- Tập đoàn dạng cảnh cây, biến đổi rất lớn về hình thái tập đoàn và cầu trúc xương polyp, tuỳ điều kiện môi trường sống Cành chính mọc nhiều, xoè rộng ra; cành bên hướng lên trên, thon dân ra đỉnh Polyp trục lớn (đường kính tới 4,7mm), nhô cao

(<3mm), lỗ đỉnh có đường kính 1,0 — 1,8mm, xương thành dày Polyp bên có nhiều,

dạng môi đưới tròn, kích thước bằng nhau Mẫu sống có màu xanh xám, nhạt dần ở

đầu cảnh [16]

- Phân bố rộng cả ở vùng có sóng vả lặng sóng, tập trung ở vùng rạn nông [16]

- Đóng vai trò quan trọng trong việc tạo rạn ở vùng nông Có thể làm hàng mỹ nghệ, trang trí bê cá cảnh, làm vôi và xI măng

Neuon: Marinesavers

3.3 Điều kiện nuôi nhân tạo [17]

- D6 man/Trong lueng néng: 1.025 (Salinity/Specific Gravity: 1.025)

- Chuyên động của nước: mạnh

- Nhiệt độ: 23-26°C

- Cường độ ánh sang: 300-500 PAR

- Kích thước bề tối thiêu cho san hô trưởng thành: 380 L

4 Giới thiệu ky thuật

4.1 Kỹ thuật PCR

Khái niệm: PCR dựa trên việc sử dụng khả năng của DNA polymerase để tổng hợp chuỗi DNA mới bổ sung cho chuỗi khuôn mẫu được cung cấp Bởi vì DNA polymerase chỉ có thể thêm nucleotide vào nhóm 3'-OH đã có từ trước, nên nó cần một đoạn mồi

mà nó có thể thêm nucleotide đầu tiên

Nguyên tắc: Đây là một kỹ thuật để lấy một lượng lớn chuỗi DNA cụ thể từ một mẫu DNA Sự khuếch đại này dựa trên sự sao chép của một khuôn mẫu DNA sợi kép Nó được chia thành ba giai đoạn: giai đoạn biến tính, giai đoạn lai với mồi và giai đoạn kéo dài Các sản phẩm của mỗi bước tổng hợp đóng vai trò là khuôn mẫu cho các bước sau, do đó đạt được sự khuếch đại theo hàm mũ Phản ứng chuỗi polymerase được thực hiện trong một hỗn hợp phản ứng bao

10

gồm chiết xuất DNA (DNA khuôn mẫu), Taq polymerase, các đoạn mồi và bốn deoxyribonucleotide triphosphat (dNTPs) dư trong dung dịch đệm Các ống chứa phản ứng hỗn hợp phải chịu các chu kỳ nhiệt độ lặp đi lặp lại vài chục lần trong khối gia nhiệt của bộ tuần hoàn nhiệt (thiết bị có vỏ bọc nơi các ống mẫu được lắng đọng và trong đó nhiệt độ có thể thay đổi, rất nhanh và chính xác, từ 0 đến

100 ° C bằng hiệu ứng Peltier)

4.2 Kỹ thuật giải trình tự rRNA 16S

Khái niệm: Giải trình tự gen 16S rRNA là kỹ thuật dựa trên trình tự bảo tồn của gene 16S rRNA để xác định, phân loại và định lượng vi sinh vật trong các hỗn hợp sinh học phức tạp như mẫu môi trường từ nước biển hay từ đường ruột

- Gene 16S rRNA bao gồm cả vùng bảo tồn và vùng biến đổi Trong khi vùng được bảo tồn có thể làm cơ sở tạo các đoạn mồi PCR khuếch đại phổ quát, các vùng biến đổi cho phép phân biệt các vi sinh vật khác nhau [22]

PHẢN II QUY TRÌNH

1 Nuôi cấy san hồ

Ran san h6 Acropora aspera duoc thu thập ở Hang Rai, Ninh Thuan va cho vào

bể nước 3000L có hệ thống lọc nước biên (FWS) có kích thước lỗ 0.4 um San hé sé được nuôi trong điều kiện nguồn nước, nhiệt độ, ánh sáng và chu kỳ Mặt Trăng thích hợp Vào thời điểm trăng tròn tháng 12, khi các yếu tổ được chuẩn bị kỹ và đáp ứng mọi nhu cầu của loài này, chúng đồng loạt phóng trứng và tỉnh trùng (giao tử) vào nước Các trứng và tính trùng này sẽ được thu lấy và lọc qua một tắm vải Mesh có kích thước lỗ 60 um sau đó trộn với nhau dé thu tinh dé tao nên phôi Các phôi sẽ

được rửa lại với FWS và chuyền vào bê nuôi âu trùng [11]

Sau 9 ngày thu được các ấu trùng san hô Nuôi các ấu trùng trên các giá thê nhân tạo thành các san hô trưởng thành Các giá thể nhân tạo được làm từ pozzolana, xI

12