Xây dựng hệ thống mã vạch dna dna barcode Để nhận diện phân tử một số loài Đăng lan dendrobium spp khu vực tp hồ chí minh

Do vậy, rắt cằn một hệ thống nhận diện nhanh và chính xác các mẫu lan thu thập, Hơn nữa, việc sử dụng trình tự mã vạch DNA để xây dựng cây phát sinh chủng loài sẽ giúp chỉ ra mối quan

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP.HCM

ĐÈ TÀI KHOA HỌC CÔNG NGHỆ CÁP CƠ SỞ

XÂY DỰNG HỆ THÓNG MÃ VẠCH DNA (DNA BARCODE) ĐẺ NHẬN DIỆN PHÂN TỬ MOT SO LOAI ĐĂNG LAN (Dendrobium spp.) KHU VUC TP HO CHI MINH

Mã số: CS.2015.19.38

Chủ nhiệm: ThS Nguyễn Như Hoa

-Tp.HCM, 2017 -

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP.HCM

BAO CAO TONG KET

DE TAI KHOA HQC CONG NGHE CAP CO SO

XAY DUNG HE THONG MA VACH DNA (DNA BARCODE) DE NHAN DIEN PHAN TU’ MOT SO LOAI DANG LAN (Dendrobium spp.) KHU VỰC TP HÒ CHÍ MINH

Mã số: CS.2015,19.38

Trưởng Khoa Sinh học

1 Chủ nhiệm: ThS Nguyễn Như Hoa, giảng viên Khoa Sinh học Trường DH Sư phạm Tp.HCM

2 Cơ quan chủ trì: Khoa Sinh học, Trường ĐH Sư phạm Tp.HCM

3 Đơn vị phối hợp chính: Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp HCM

MỤC LỤC

Chuong 1 TONG QUAN

1.1 Gidi thigu vé lan Dendrobium

1.1.1 Vị trí phân loại

1.1.2 Sự phân bổ

1.1.4 Đặc điểm hình thái lan Dendrobium

1.2 Các loài Đăng lan trong nghiên cứu

1.2.1 Hoàng phi hac (Dendrobium signatum Rebb, f 1884) 1.2.2 Đại ¥ Thao (Dendrobium aphyllum (Roxb.) Fisher)

1.2.4, Long tu (Dendrobium primulinum Lindl.)

1.2.5 Gia hac xuân di linh tim (Dendrobium anosmum var alba)

1.2.8, Kim điệp vàng (Dendrobirem capillipes Rehb [-) 1.2.9 Hoàng thio Ngoc Thach (Dendrobium crystallinum Rehb f.) 1.2.10 Hoàng tháo voi (Dendrobium cretaceum Lindl.(D polyanthum Lindl.)).14

1.3.1 Các gen được sử dụng để xây dựng mã vạch DNA 15

3.2.2 Phương pháp giải phẫu hình thái

2.2.3 Tách chiết DNA tông số

Chương 3 KẾT QUÁ VÀ BÀN LUẬN

tin cậy của trình tự

Kết quả giải phẫu và mô tả hình thái

Kết quả tách chiết DNA tổng số

Kết quả so sánh trình tự của mẫu với cơ sở dữ liệu Genbank nhằm kiểm tra “ Xây dựng cây phát sinh chủng loài đối với trình tự marK và IT:

24

thước trình tự được

Bang 3.1 Kết quả ghí nhận đặc điểm hình thái cia 10 loài Dendrobium nghiên cứu.35

Bảng 3.3 Nhiệt độ bắt cặp của mỗi và kích thước trình tự khuếch ai của các cặp mỗi

Bảng 3.4 Tám tắt kết quả giải trình tự vùng matK (390F- 1326R) và ITS (1F ~ 4R) sau

Bang 3.5 Kết quả BLAST trình tự vùng matK của 27/30 mẫu Dendrobium trong

Bang 3.6 Kết quả BLAST trình tự vùng ITS ctia 27/30 mau Dendrobium trong nell n cửu với car sé dit liu Genbank

Hình 1.1 Hình minh họa các dạng chính của Dendrobium

Hình 1.2 Các nhóm /2endrobiiem

Hình 2.1 Hình minh họa quá trình hiệu chỉnh trình tự giải bang mỗi xuôi trên

Hình 2.2 Hình minh họa quá trình hiệu chỉnh trình tự giải bằng mỗi ngược trên

Hình 2.3 Hình minh họa quá trình thống nhất 2 trình tự trén SeaView Hình 2.4 Giao diện trang chủ NCBI

Hình 2.5 Giao diện BLAST

Hình 2.6 Hinh minh hoa két qua BLAST

Hình 3.1, Hinh chyp 10 loai Dendrobium trong nghiên cứu

Hinh 3.2 Kết quả điện di DNA tổng số của 10 mẫu Øendrabium Hình 3.3 Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại vùng marK của mẫu 2TT ở các ngường nhiệt độ từ 49°C tới 58°C

Hình 3.4 Kết quá điện di sản ales khuếch đại ng TS của mẫu 2TT ở các = nhiệt độ tir 49°C ti 58°C

Hình 3.6 Kết quả điện di sin phim PCR ving ITS cita 30 miu lan Dendrobium _ 44 Hình 3.7 Vùng chọn lựa để phân tích cây phát sinh chủng loài của bộ dữ liệu gồm » trình tự nghiên cứu đối với vùng maiK của Dendrobium

Hình 3.8 Mô hình cây phát sinh loài vùng marK của nhóm Dendrobiưm nghiên cứu 52 trinh ty nghién ciru déi vi ving ITS cla Dendrobium

Hình 3.11 Mô hình cây phi sinh loài từ trình tự nr vang m maiK va ITS cia nhém

Cơ quan chủ trì đề tài: Khoa Sinh học Trường Đại học Si phạm Tp.HCM

Cơ quan và cá nhân phối hợp thực hiện :

Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp HCM

“Thời gian thực hiện: 11/2015 ~ 11/2016,

2 Nội dung chính

~ Thu thập, hệ thống 10 loài Đăng lan khu vực tp HCM

~ Tách DNA tổng số cho 30 mẫu Đăng lan khu vực tp HCM

~ Khuếch đại vùng marker mục tiêu bằng phản ứng PCR

~ Giải và hiệu chỉnh trình tự 2 chiều cho mai marker

- Phân tích, xây dựng mã vạch DNA cho từng loài

3 Kết quả chính đạt được-

~ Hệ thống mã vạch DNA cho các loài lan đã thu thập dựa trên trình ty DNA của 2 marker

~ Các bài báo cáo tại hội nghị và đăng kí yếu:

+ Nguyễn Như Hoa Trần Hoảng Dũng, Dương Hoa Xô, Huỳnh Hữu Đức (2016), Phân tích mi quan hệ phát sinh chủng loài của một số giống lan phía Nam — lần thử IV ~ năm 2016,

Project Title: Construction DNA barcode to identify molecular some Dendrobium species (Dendrobium spp.) in Ho Chi Minh city

Code number: CS.2015,19.38

Coordinator: MS Nguyén Nhu Hoa

Implementing Institution: Department of Biology, HCM City University of Pedagogy

Cooperating Institution(s): Biotechnology Center HCM City Duration: from September -2015 to September -2016

1 Objectives:

~ Some orchids codified to preserve and provide materials for future research -Two markers sequenced to create barcode system helps identify molecular DNA samples spread in any department and any stage of development without flowers,

2 Main contents:

~ Systems 10 Dendrobiwn species in HCM city

~ Separation DNA total for 30 Dendrobium samples in HCM city

~ Amplifying the target marker by PCR

- Sequencing and correction sequence for each marker

~ Analysis and construction of DNA barcodes for each species

“Application of biotechnology”

1, TINH CAP THIET CUA DE TAI

Lan Việt Nam với các loài có hoa đẹp, hương thơm quỷ phái là đổi tượng thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học, Hẳng năm, Việt Nam thường xuyên phát hiện các

họ phong phủ vả đặc sắc của hệ thực vật ở nước ta, có giá trị tài nguyên về nhiều mặt đối với nền kinh tế, đời sống con người

Nhiều loài lan rừng Việt Nam, đặc biệt là các loài thude chi Dendrobium cho hoa đẹp, kết hợp nhiều màu sắc phong phú hài hòa; hoa có hương thơm, lâu tàn, nở kéo đài từ 1 — 2 tháng Tình trạng thu hái, buôn bán lan rừng trái phép phổ nay có thể dẫn đến nguy cơ làm mắt nguồn gen lan rừng Bên cạnh đó, việc du nhập và

iến như hiện lai tạo ngày càng nhiều giống lan mới cũng lảm rất nhiều giống dần dẫn bị lãng quên 'Từ thực tế đỏ, rit nhiều công trình nghiên cửu được tiến hành nhằm bảo tồn đa dạng các loài lan, trong dé ¢6 lan Dendrobium

Cho đến nay, việc nghiên cứu về lan chủ yếu về hệ thống phân loại nuôi cấy mô một số loài Việc nghiên cứu, sưu tập, lai tạo các giống lan đã được thực hiện khá nhiễu ở các trường, viện nghiên cứu, các nghệ nhân Tuy nhiên, quá trình nhận điện tạo vẫn mang tính ngẫu nhiên không dựa trên nền tảng di truyền Do vậy, rất cẳn một

hệ thống nhận diện nhanh và chính xác các mẫu lan thu thập Trong các công cụ sinh học phân tử, mã vạch DNA (DNA barcode) được biết là công cụ hữu hiệu nhất hiện nay giúp định danh mẫu vật và phân tích tiến hóa sinh học nhanh chóng các thông tin như tên, thuộc tính sinh học nhằm đánh giá mỗi quan hệ nguồn gen mình đang cỏ [ 16,18,19]

Hơn nữa, việc sử dụng trình tự mã vạch DNA để xây dựng cây phát sinh chủng loài

sẽ giúp chỉ ra mỗi quan hệ di truyền giữa các loài thu thập được Từ đó chỉ ra các loài

sử khoa học quan trọng đẻ xây dựng các tổ hợp lai giữa các mẫu lan (lai cùng chỉ, giữa

thời gian công sức nhưng vẫn cho ra các dòng con lai đạt giá trị khoa học và kinh tế phục vụ nhu cầu nội địa và xuất khẩu, đây là một nhiệm vụ có tằm chiến lược lâu dài Hiện nay những nghiên cứu trong việc xây dựng mã vạch DNA nói chung và cụ thể

mỗi đặc hiệu ở Việt Nam mới có một với đối tượng phong lan bằng cách sử dụng cái

số nhóm nghiên cứu bắt đầu thực hiện Có rất nhiều marker tham gia trong phân tích mức đưới loài Mỗi đoạn mã vạch DNA có những đặc trưng riêng và có khả năng phân khả năng phân biệt sinh vật ở mức họ và chỉ; các đoạn DNA, như: 26, zbcLL, ndnE,

3 spacer có khả năng phân biệt ở mức loài và dưới loài (subspecies, variety, strain) dụng làm mã vạch chung cho tắt cả các loài sinh vật Vì vậy việc lựa chọn những đoạn DNA (gen) đặc trưng để làm mã vạch và việc phối hợp giữa các đoạn mã vạch DNA 1a rat can thiết và đem lại hiệu quả cao [36, 27 30

Trên đối tugng lan Dendrobium, cho đến thời điểm hiện tại, những nghiên cửu trong việc xây dựng mã vạch DNA cho bảng cách sử dụng mỗi đặc hiệu vẫn chưa hoàn

sử dụng nguồn gen Øendrobiwm một cách có hiệu quả, chúng tôi để xuất *Xây dựng

hệ thống mã vạch DNA (NA barcode) để nhận diện phân tử mộ (Dendrobiram spp.) ở khu vực Tp Hỗ Chí Minh”

2 MỤC TIÊU DE TAL

số loài Đăng lan

Hệ thống hóa các loài lan nhằm mục địch bảo tổn và để làm nguyên liệu bạn đầu cho các nghiên cứu về sau

Xác định trình tự DNA của các marker để tạo nên hệ thống mã vạch DNA giúp nhận điện phân tử các mẫu lan ở bộ phận bắt kỷ và giai đoạn phát triển bắt kỳ mà không cẩn có hoa

3 CÁCH TIẾP CẬN, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU, PHẠM Vĩ NGHIÊN CỨU, NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

3.1 Cách tiếp cận

nguồn tài liệu ở những quốc gia có nền khoa học kỹ thuật và đã có những thành tựu nhằm định hướng nhanh nhất cho các phương pháp và nội dung nghiên cứu trong đề tài

Điều tra, đảnh giá một số đặc điểm hinh thai lan Dendrobium khu vực tp HCM; từ đỏ xây dựng báo cáo mô tả một số đặc điểm hình thái của lan Øewdrobim khu vực tp HCM

Kế thừa các kết quả nghiên cứu về lan Øendrobiưm ở Việt Nam hoặc một số tài liệu bài viết có tính tham khảo, chuyên khảo

Lan Đendrobium thu thập được định danh phân tử bằng cách xây dựng hệ thống DNA hành xác định nguồn gốc loài và bảo vệ các loài đang có nguy cơ tuyệt chủng 3.2 Phương pháp nghiền cửu:

~ Phương pháp thu mẫu - Giải phẫu hoa

~ Phương pháp tách DNA tổng số khuếch đại các marker bằng kỹ thuật PCR

~ Phương pháp hiệu chính trình tự

3.3 Pham vi nghiên cứu

- 30 mau lan Dendrobium (10 loài) thu thập tại tp HCM Mỗi mẫu sẽ được giải trinh ty 2 marker 12 ITS va matK để xây dung DNA barcode 3⁄4 Nội dung nghiên cửu

~ Thu thập, hệ thống các mẫu Đăng lan khu vực tp, HCM

~ Xây dựng hệ thống mã vạch DNA cho mẫu vật nghiên cứu + Khuếch đại vùng marker mục tiêu bằng phản ửng PCR + Giải trình tự 2 chigu cho mdi marker

+ Hiệu chỉnh trình tự đã giải bằng phần mém FinchTV, Seaview + Kiểm tra tương đồng trên ngân hàng gen GenBank

1.1 Giới thiệu về lan Dendrobium

LLL Vị trí phân loại

Ho Phong lan (Orchidaceae) có 750 chỉ và hơn 25.000 loài (Takhtajan, 1987) Orchidaceae là họ lớn thử hai sau họ Cúc (Asteraccae), thuộc ngành Thực vật hạt kín {Angiospermae) và cũng la họ lớn nhất trong lớp Một lá mầm Dendrobium với số lượng loài lớn, đa dạng về hình đáng, màu sắc, kich thước

là chỉ lớn thứ hai trong họ Phong lan chỉ sau chi lan Long (Bulbophyllum) [11]

Theo Phong lan Việt Nam của Trần Hợp (1998), ở Việt Nam, Øendrobiuum có đến 100 loài, xếp trong 14 tông, được phân biệt bằng thân (giá hành), lá và hoa [H] 1.1.2 Sự phân bố

Chỉ Đendrobiiam có khoảng 1.600 loài và hiện đã được lai tạo thêm nhiều loại mới Tên Dendrobium có nguồn gốc từ chữ Hy Lạp, trong đó “Dendro”- có nghĩa lả

gỗ “bio"- có nghĩa là sống Dendrobium hầu hết là thực vật biểu sinh, sống bám trên

vo cây Ở Việt Nam, người ta còn gọi là Hoàng lan hay Đăng lan Đendrobium chỉ được tìm thấy ở Đông bán cầu trai dai từ Australia, xuyên suốt

Cattleya tuyệt đẹp, các nước Đông Nam Ả cũng hãnh diện vì có chi Dendrobium vo thude chi Dendrobium [11]

‘u kiện sinh thái của Øendrobium cũng rất đa đạng, có nhiều loài chỉ mọc và

ra hoa ở vùng lạnh, có loài ở vùng nóng, có loài trung gian, cũng có loài thích nghỉ với bắt cứ điều kiện khí hậu nào

Ở Việt Nam năm 1932, các nhà thực vật người Pháp (Gagnepsin và Guillaumin) đã công bố 53 loài Hoàng thảo ở Việt Nam, và sau đó đã công bố bỏ sung loại và định danh 97 loài Đendrobiưm ở Việt Nam, trong đó có 48 loài có giá trị làm trong cuốn Phong lan Việt Nam [1 1] Ở miễn Nam Việt Nam, tác giả Phạm Hoàng Hộ cũng đã mỏ tả 56 loài Hoàng thảo trong Cây cỏ miền Nam Việt Nam 2 [7]

“Theo công bồ *Trích yếu được cập nhật hóa về các loài lan ở Việt Nam, ở Việt Nam hiện đã biết được 897 loài lan thuộc 152 chỉ, chúng chiếm khoảng 75-80% trong loài cao nhất (107 loài), tiếp đến là Bulbophyllum, Eria, Liparis Công bỗ này cung tình trạng bị đe dọa tiêu diệt của từng loài [1]

1.1.3 Sự đa dạng và phong phú của lan Dendrobium

Dendrobium 1a chỉ lan (genus) đông đảo với hơn 1.000 loài (species) nguyên thủy được chia thành 40 nhóm (sections) thuộc đòng Đendrobiinae như Phalaenanthe, Eleutheroglossum, Callista, Ceratobium, Stachyobium

Do qué da dang nén Dendrobium tap trung thành hai dang chinh [5]:

- Dang ditng (Dendrobium loại phalaenopsis): thường mọc ở xử nóng, chịu ẩm,

có nhiều hoa Thành phổ Hỗ Chí Minh trồng rất nhiều loại này như: Nhất điêm hồng Nhất điểm hoàng, Báo bi Ý thảo, Thủy tiên, Soni

vàng,

Hình 1.1 Hình minh họa các đạng chính của Đe»drobium

A Dendrobium anosmum - Dang thong [38]

B Dendrobium carin[erum - Dạng đứng [37]

s Nhóm thứ nhất có đặc điểm là lá xanh quanh năm và hoa thì thường mọc ở gần ngọn như Dendrobium antennatum, Dendrobium phalaenopsis

- Nhóm thứ hai, lá thường rụng vào mùa đông và hoa thường mọc ở gẵn đốt trên thân cây như Øendrobiiem anosmuan, Dendrobium wardianuum Nhóm thứ ba hay còn gọi là nhóm Callista, khi ra hoa thì hoa rủ xuống phía dưới nhự Dendrobium chrysotoxum, Dendrobium farmeri

Nhóm thứ tư là nhóm Latoura với chùm hoa mọc thắng đứng như Đendrobium atroviolaceum, Dendrobium spectabile

màu đen và hoa thường là màu trắng như Dendrobium draconis, Dendrobium formosum

(Thủy Tiên), D farmari Paxt (Thủy tiên tring vang), D, lindleyi Steudel (Vay rong),

D thrysiflorum Reichb (Thay tiên vàng)

- Nhóm Dendrobium gồm có: D anosmum Lindl (Gid hac), D fimbriatum Hook.f' (Long nhãn), Ð hererocarpumi Lindl (Nhất điểm hoàng), Ð primulinum

Chính vì sự đa dạng vẻ chủng loại mà nhóm lan này có điều kiện sinh thái rắt đa dang, có loài hoa chỉ mọc ở vùng lạnh, có loài lại chỉ sống ở vùng có không khí nóng, điều kiện khí hậu nảo cũng sống được

Dendrobium có thê nhân nhanh giông bằng phương pháp chiết nhánh thông thường Vì nó là loại lan đa thân với nhiều giá hành, các giả hành thường mang một

sẽ đâm chỗi và cho ra một cây con mới Hoa của Dendrobium có thể mọc tử thân thành từng chùm hay chỉ mọc một hoa duy nhất Có một số loài 2endrobiưm trước khi

ra hoa sẽ rụng hết lá Đặc biệt hơn các giống lan khác, các chổi hoa của lan mọc hoa, vì thế một cây Dendrobium có thể cho ra nhiều cành hoa Mặt khác, hoa suốt quanh năm như Dendrobium caesar Alba, Dendrobium caesar latin Tuy nhiên,

có loài cũng sớm nở tối tản nhu Thach he (Dendrobium crulllenatum), Dendrobium cũng là giỗng rất đa đạng về màu sắc và kiểu đáng Chính vì thế, người Việt Nam dùng những hình tượng khác nhau để tượng trưng cho một số loài Gia hac), hay một đàn bướm vàng bay trong gió (lan Kim điệp) .[L1] 1.1.4 Đặc điểm hình thái lan Dendrobium

Dendrobium không có một hình dạng chung nhất về hoa và đạng cây đo số lượng quá lởn và phân bố rộng rãi Các loài thuộc chỉ Dendrobium déu có bộ phận sinh đường như rễ, thân, giả hành, lá và cơ quan sinh sản như hoa, quả [5]

~ Cây có hệ rễ khí sinh, rễ thuộc loại rễ bán gió Nhóm nảy thường có rễ nhỏ nhưng rắt nhiều rễ, chủ yếu bám vào giá thể, vảo thân cây đề hút chất dinh dưỡng

day bao quanh gồm những tế bào chết chứa đầy không khí

~ Rễ có lớp húi

nên rễ ánh lên màu xanh bạc

~ Một số loài có thân lá kém phát triển thậm chí tiêu giảm hoàn toàn, có hệ rễ chứa diệp lục tố giúp cây hắp thụ ánh sáng cần thiết cho sự ra hoa và quang hợp [5|

~ Rễ lan Dendrobium khong chịu được lạnh nếu bị lạnh trong thời gian dài, rễ

ng bám trên cao Đa số củ giả hành có màu xanh bóng, nên cùng với lá nó

~ Một số loài ở xứ lạnh, giả hành chỉ có nhiệm vụ dự trữ chất dinh đưỡng nên không cỏ màu xanh nhưng phía trên có mang lá [2]

1.143 Lá

~ Đendrobium là cây tự dưỡng, nó phát triển đầy đủ hệ thống lá

~ Lá mọc xen kề nhau và ôm lấy thân do lá có tận cùng là 1 cuống hay thuôn dài xuống thành bẹ ôm thân, hình dạng và cấu trúc lá rất đa dạng [5|

~ Lá có hình kim, trụ có rãnh hay phiển móng Dạng lá mềm mại mong nude nạc, đại có màu xanh bóng, đậm hay nhạt tùy thuộc vào vị trí sống của cây Phiến lá

10

như hình chữ V Những lá sắt dưới gốc đôi khi giảm đi chỉ còn những bẹ không phát giảm hẳn thành vảy Có những loài trút lá vào mùa khô hạn, sau đó cây ra hoa hay sống ẩn để khi gặp mưa thì cho chỗi mới [2]

D pendulum D simendii Gagnep D hercoglossum

[32, 33, 34 39]

1144 Hoa

~ Đendrobium thuộc nhóm phụ ra hoa ở nách lá,

- Chdi hoa mọc từ các mắt ngủ giữa các đọt lá trên thân gin ngọn và cả trên ngọn

ra hoa Thời gian ra hoa lä đầu mùa mưa hay đầu tết

- Khi đủ đình đường, Đendrobiưm cho hoa thành chùm, phát hoa đài và thời gian ra hoa trung bình 1 2 tháng [5]

114.5 Qua va hat

~ Quả lan thuộc quả nang, nở ra theo 3 - 6 đường nứt dọc Quả có dạng dài đến hình trụ ngắn phình ở giữa Khi chín, quả nở ra và mảnh vỏ còn dính lại với nhau ở khi quả đã mục nát [2]

~ Hạt rắt nhiều, li tí, không chứa chứa chất dịnh dưỡng Hạt chỉ cấu tạo bởi một lớp chưa phân hoá, trên một mạng lưởi nhỏ, xốp, chứa đầy không khí Hạt trưởng thiết [2]

1.2 Các loài Đăng lan trong nghiên cứu

1.2.1 Hoang phi hge (Dendrobium signatum Rehb, £ 1884) Phong lan thân cao 50-60 cm, rụng lá vào mùa thu Hoa to 6-7 cm, mọc 2-3 chiếc ở các đốt, thơm và lâu tản Nở vào mùa xuân-hạ

Phân bổ: Son La, Lai Châu, Thừa Thiên-Huế, Tây Nguyễn, Lâm Đồng, Nam Cát Tiên,

1.2.2 Đại Ý Thảo (Dendrobium aphylluen (Roxb,) Eisher) Phong lan có thân thòng, mảnh, suông dải đến 90cm Lá xếp 2 dãy có phiến thon đến 3.5cm môi xoan, dài 3cm, giữa có 3 gân màu vàng rất lợt Phân bổ: Sa Pa, Phi Khanh, Da Lat, Án Độ, Trung Quốc, Lào, Malaysia Phong lan có thân hình trụ đải đến 1-2m; có sọc dọc đỏ Lá có phiến dài 10-15cm hẹp

hưởng hay vàng vàng, môi có dạng bằu dục có 2 bớt đỏ, xoan, rìa lông, đầu lõm, cột cao 6mm,

Phân bố: Quáng Trị, Nepal, Ân Độ, Mianma, Thái Lan, Trung Quốc, Malaysia, Lao

Phong lan có thân mảnh, đứng hay thòng, hình trụ, đải đến 45cm Lá có phiến thon, rộng 6cm; môi xoan rộng, có 3 thùy, bìa có răng mịn và ria long gần như trắng, có đốm vàng và tím ở đáy; cột có nắp tía Thân không lá lúc phát hoa

1.3.5 Giả hạc xuân di linh tim (Dendrobium anosmum var alba) Than thong dai đến 1.2m lá có phiển mỏng, xếp 2 dãy, đài 10-18em, rộng 2-3em; bẹ mau rách Hoa to, ửng hưởng, với môi có tâm có sọc tía, cánh hoa nhọn, cao 3-4 cm, môi có long nằm, xoan rộng, đầu tà, cột co 8mm

Phân bố: Vinh, Đaklak, Lâm Đồng, Srilanca, Ấn Độ, Mianma, Lào, Thái Lan, Indonesia, Tân Ghi Nê

1.2.6 Xwong cé (Dendrobium aloifolium (B1.) Rehb, f.)

Phong lan có thân cao đến 40em có lá ở phần giữa Lá trong mặt phẳng dẹp hình dao gảm, dài 25cm Phẩn trên của thân hình chữ chỉ, có lá teo Mang hoa trắng, nhỏ, cao 4-5mm, một ô mỗi mắt; cánh hoa và lá đài dảnh, môi hẹp dài 3,Š5mm, đầu có 2 thùy tròn

Lan sống phụ, mọc bụi nhỏ cao 40em hình trụ ở gốc Lá ở giữa, dạng tam giác xếp trắng ở mỗi đốt Cánh môi ở định có 2 thùy tròn

Phân bố: Đà Lạt, Định Quán, Nam Cát Tiên, Tây Ninh, Thái Lan, Mianma, Malaysia, Indonesia

1.2.7 Thép nhét hoa (Dendrobium aduncum Wall, Ex Lindl.) Phong lan có thân thong dai 60cm, hinh trụ suông, hơi chữ chỉ Lá có phiến thon hẹp lot, rộng 3.5cm: phiến hoa dài 2 cm môi cao 1.2em, 3 thùy, thùy chót nhọn, có một lỗi hình liễm và một sóng giữa

Lan sống phụ thân buông xuống, hình trụ gãy khúc, dài 60em Lá hình giải nhọn dài nhạt, rộng 3,5em, cánh môi 3 thùy, thùy giữa nhọn

“Thái Lan Trung Quốc

1.2.8 Kim điệp vàng (Dendrobium capillipes Rehb.f,)

Căn hành bỏ, thân cao 5-15cm, lóng rộng 10-15mm, có rãnh rọc Lá 1-2; phiến thon 1.5-3em, lá đài giữa 9x5.5mm; cánh hoa cạnh 12x7mm, môi bầu dục tròn, to vào 17mm, vàng có bớt vàng đậm, móng (cựa) ngắn

Phân bố: Buôn Mê Thuột, Lâm Đồng, Thuận Hải, Án Độ, Mianma, Lào Thái Lan

“Trung Quốc

1.2.9 Hoang thio Ngge Thgch (Dendrobium crystallinum Rebb f.) Phong lan thành bụi, thin mau vang tuoi lúc khỏ, dải 30-50em Lá hình giải thuôn có phiến cứng, dài 7-12cm, rng 1-1,5em Hoa từng cặp trên một u, màu trắng, chót tía hay hơi hồng: cánh hoa đài 3cm, rộng lem; mdi tròn, bìa nguyên, có bớt to vàng ở giữa: cột có nắp hình chùy

Phân bổ: Quảng Trị, Gia Lai Công Tum, Bảo Lộc, Đả Lạt, Lào, Mianma, Thái Lan, Trung Quốc

1.2.10 Hoang théo vai (Dendrobium eretaceum Lindl, (D polyanthum Lindl.)) Phong lan có giả hành hỉnh thoi màu nâu tím, cỏ rãnh, trên đó là thân mánh ít nhánh đài 7-§em, rộng 1-2em Hoa to, trắng, có sọc đó: phiến hoa đài 2,5-3cm, môi có 3 sọc vàng, thùy 3, can

Phân bổ: Định Quán, Biên Hòa, Lào, Án Độ, Mianma, Thái Lan 1.3 Mã vạch DNA và ứng dụng trong nhận diện loài

Phương pháp phân loại hình thái có lịch sử phát triển lâu dai vả đã xây dựng được một hệ thống phân loại sinh vật nói chung và thực vật nói riêng tương đổi đầy đủ

và toàn diện Phương pháp phân loại này chủ yếu dựa vào sự khác biệt về đặc điểm hình thái sinh học giữa hai hay nhiều cá thẻ Tuy nhiên, phương pháp này cũng gặp rất nhiều khó khăn khi cần xác định những mẫu vật có đặc điểm giống nhau do cùng thích phân loại thấp như loài vả dưới loài

Ngày nay những trở ngại trong việc phân loại này tồn tại ngay trong nhiều nhà

chính xác bắt cứ mẫu động thực vật nào một cách nhanh chóng và tin cậy là mội

để thực tế được quan tâm Đó cũng là lý do chính để phát triển một phương pháp mới Được gọi là "xác định mã vạch DNA" - trình tự của chuỗi DNA được tiêu chuẩn hóa dàng tách ra và đặc trưng cho hầu hết các loài trên địa cầu Bằng cách khai thác những tiến bộ của đi truyền học phân tử công nghệ trình tự nucleotide và tin sinh học Mã

vấn

vạch DNA cho phép nhận diện một cách nhanh chóng và chính xác những giống loài phá hàng ngàn loài khác Mã vạch DNA là công cụ chính đối với các nhà phân loại trong sinh giới

Định nghĩa đơn giản nhất của mã vạch DNA là một hoặc nhiều trình tự gen được lấy từ mẫu gen đã được chuẩn hóa của bộ gen, dùng để xác định loải Nam 2003, Paul Herbert và các đồng nghiệp đã để xuất đầu tiên việc sử dụng những trình tự thu qua tất cả các đạng sống từ động vật cho đến thực vật và trên những mẫu mô nhỏ Việc phổ biển thông tin về mã vạch DNA được ứng dụng để nhận dạng các loài và được áp dụng đẫu tiên trên động vật Tuy nhiên, tiêu chuẩn thiết lập mã vạch DNA cho thực vật không được hội đồng các nhà thực vật học chấp nhận cho đến 6 nam sau khi tài liệu đầu tiên về mã vạch DNA trên động vật được công bỏ [16, 18, 27, 25] 1.3.1 Các gen được sử dụng đễ xây dựng mã vạch DNA

Ở thực vật, DNA nhân, lục lạp và ti thê đêu được sử dụng trong phân tích định danh phân từ Các gen tỉ thể có chỉ số đa dạng thấp giữa trình tự các loài: sự đa dạng đoạn trình tự dài khoảng 1.4 kb nén không thể sử dụng để làm DNA barcode cho thực vật

Nói chung, trong các tế bào, bộ gen tỉ thể tiến hóa với tốc độ chậm nhất, bộ gen của lục lạp với tốc độ nhanh hơn và hệ gen nhân với tốc độ nhanh nhất (Wolfe, Li và cộng sự 1987; Gaut 1998) Vì lý do này, các trình tự gen cpDNA (ví dụ zbeL, aípB,

15

trăT-trnL, traL-trnE, aipB-rbcL, psbA-trnH) được sử dụng thường xuyên hơn ở các

Cac gen cpDNA tham gia trong việc phân tích phân loại thực vật như: 16, rbcL., atpB, nÄliF, intron ta và marK tài rộng từ bộ cho đến mức dưới loài Vùng 16S phù hợp ở mức bộ, trong khi zbcL aipB và ndhl phù hợp từ mức bộ đến mức loài 'Vùng intron rrnL spacer :rnL-trnE và maiK có thể áp dụng trong một biên độ rộng tử loài

Để khắc phục những hạn chế của cpDNA, cũng như đề có được thông tin bô sung và độc lập trong phân tích phát sinh loài, rDNA đã được áp dụng rộng ri như cpDNA

“Trong tế bào gen rRNA được tỏ chức thành bai phần riêng biệt Cá hai phần của tDNA đều đã được sử dụng trong các nghiên cứu phát sinh loài, trong đó, vùng 18- 5.8S-26S được sử dụng thưởng xuyên hơn sơ với vùng 5S [36] Tóm lại, vùng ITS trong nhân có khá năng phân định loài rất cao nên nhiều nghiên cửu trước đây vẫn sử dụng vùng gen này làm marker cho DNA barcode Tuy nhiên vùng ITS là vùng phổ quát có ở hầu hết các sinh vật kể cả nắm, vi khuẩn nên hợp với các marker khác Đặc biệt các gen trong lục lạp lại được lựa chọn làm marker nhiều hơn cả vì tính chất đi truyền theo dòng mẹ nên không có hiện tượng tái tổ hợp, nhiều, DNA lục lạp là DNA sợi đôi, có chiều đài trong khoảng 35 - 217 kb tùy loài thực vật, trong đó phần đồng các loi có DNA dài khoảng 115 - 165 kb Trong mỗi tế bào thực vật có chứa 1000 - 10000 bản sao cpDNA Trong khi các gen mã hóa có khả cao hơn nên cho php phản định ở mức độ dưởi loài Hệ gen lục lạp được các nhà

có khả nắng nhận diện hằu hết các loài một cách hiệu quả tương tự như vùng COI cho động vật Hơn thể, thực vật thường thay đổi nhanh chóng cấu trúc bộ gen tỉ thẻ của chúng Vì thế các nghiên cứu tìm kiếm vẫn còn tiếp tục vả còn được để nghị là kết hợp nhiễu đoạn trình tự với nhau để làm các DNA barcodc ở thực vật Kết quả tổng kết trong 60 ấn phẩm xuất bản từ 2010 ~ 2013 về các vùng trình tự được để nghị để làm DNA barcode cho thực vật, có tổng cộng 17 trình tự (mK, rbcL, 1poB, rpoC, atpF-aipH, rps 16) Trong đó, vùng ITS xuất hiện (26 tài liệu tham khảo), tham khảo) Vùng gen tiếp tục sử dụng cho mã vạch là ITS2 (9 tài liệu tham khảo), khảo) [21]

“Trong nghiên cứu của Kress và cộng sự (2005), hai vùng gen được đề xuất là ứng viên tiểm năng cho ứng dụng mã vạch DNA ở thực vật cỏ hoa, đó li ving ITS Vùng ITS là vùng trình tự được sử dụng phỏ biến trong các nghiên cứu về phát sinh psbA mặc dù khá ngắn (khoảng 450 bp) nhưng lại là vùng plastid biển hóa nhất ở thực vật hạt kín và nó đễ đảng được khuếch đại ở hằu hết thực vật ở cạn Nghiên cứu được nghiệm trên 7 họ thực vật hạt kín có quan hệ gần với nhau và một nhỏm các loài được lấy mẫu từ thực vật địa phương gồm 50 họ thực vật gồm 99 loài thuộc 80 chi [19]

Tổ chức Kew, Royal Botanic Gadens, ở Anh một trong các viện khoa học tiên phong và dẫn đầu vẻ lĩnh vực khoa học thực vật và bảo tổn lớn nhất thế giới cũng đã vật Công trình đã tiến hành thiết kế các cặp mỗi phổ quát cho hơn 100 vị trí trên trung vào các vùng gen mã hóa, có 5 ứng cử viên được chọn làm DNA barcode cho

maIK + ti-psbA với nhau để DNA barcoding hiệu quả hơn [23]

Tế chức CBOL đánh giá bảy vùng gen lục lạp trên khắp bộ gen thực vật và đề xuất một sự kết hợp của mafK và rbcL như mã vạch cho thực vật (2009)

Tô chức China Plant BOL Group đề xuất việc bổ sung vùng ITS trong nhân (Internal Transcibed Spacer) kết hợp với marK + zbeL như mã vạch cho thực vật đề có (2011)

Hội thảo quốc tế lần thứ 4 về Barcode cho sự sống để nghị sử dụng 3 locus để làm mã vach cho thye vat marK + rbcL + psbA-tmnH (2011), [21]

Kẻ thừa các kết quả nghiên cửu trên, đề tài quyết định chọn 2 locus để xây dựng ĐNA barcode cho các loài Dendrobium trong nghiên cứu

IT$ (Internal transcribed spacer) là một đoạn RNA không có chức năng, nằm giữa các RNA cấu trúc của ribosome thường được dịch mã ITS là vùng không bảo quá trình sinh tống hợp protein điển ra bình thường, sai sót ở các gen nảy luôn được sửa chữa kịp thời Có thể nói rằng do các vũng xung quanh được bảo tồn nên vùng ITS với nhau Một lợi thế của vùng TTS là nó bao gồm 2 loeus riêng biệt (TTS1 và ITS2) được nồi với nhau qua locus 5.8S Vùng 5.8S khá bảo tổn trên thực tế có đủ tín hiệu phát sinh loài phân biệt ở mức bộ và ngảnh, Do đó các locus 5.8 cỏ thể phục vụ như

là một điểm neo liên kết quan trọng đề so sánh trình tự trong cả phát sinh loài và nhận diện Tiện ích của vùng bảo tổn như 5,85 tạo thuận lợi cho việc so sánh cơ sở dữ liệu, trình trưởng thành của rRNA, phẩn ITS bị cắt và nhanh chóng phân hủy [20] Ving ITS 1a ving c6 rit nhiều biến đổi Mặc dù, vùng ITS thường được

sử dụng trong nghiên cứu tiễn hóa của sinh vật: tuy nhiên, phẩn lớn các so sánh trên vùng này thường sử dụng để xác định các biệt hóa trong cùng một loài [23]

PFPRMF3 © tạ [TS

[ ra ) TẾ — Z9nMA nea

Hình 1.4 Cấu trúc vùng ITS cia Dendrobium Vùng gen mafK (gen mã hóa cho maturaseK) được phát hiện đầu tiên trên cây thuốc lá (Nicotiana tabacum) khi giải trình tự vùng gen trnK mã hóa cho tRNALys (UUU) của lục lạp Nó gồm 1 đoạn ORE chứa 509 codon nằm trong intron của gen trnK và đường như chưa rồ chức năng Các nghiên cứu sử dụng trình tự gen maiK để trong luc lap và do vậy gen zmafK trở thành gen marker quan trọng để giúp phân loại thực wat Gen matK (MaturaseK): cing vei ving đệm psbA - traH đã được để xuất làm DNA barcoding cho nhóm thực vật có hoa Két qua sir dung gen marK cho phan loại đã thu được sự tương đồng rất cao với phân loại hình thái và cho giá trị bootstrap

từ 92 ~ 100% [20]

1.3.2 Các công trình xây dựng mã vạch DNA cho họ Lan Ngay sau khi khái niệm mã vạch DNA ra đời nhiều công trình trên thể giới đã tập trung vào việc thiết lập bộ dữ liệu DNA cho sinh vật bản địa Hoa Lan đã nhanh mặt sinh học và giá trị về mặt kinh tế, y học của chúng Họ hoa lan là một họ thực vật được đánh giá là rất khó để nhận diện, định danh đặc biệt là thời kỷ chúng chưa ra hoa Nhiều loài chỉ khác với loài lân cận ở một điểm hình thái rất nhỏ và tình tế, do

do Orchidaceae rat dé lai tạo cả ngoài thiên nhiên lẫn trong nhà trồng nên có rắt nhiều đạng trung gian hoặc các biển dị; điều đó dẫn đến việc phân loại chúng ở mức chỉ và loài cực kỳ khó khăn Do vậy, khi kỹ thuật phân loại bằng trình tự DNA ra đời nó thể kể ra vài công trình tiêu biểu trên thể giới về hưởng nghiên cửu nảy như:

19

nhận diện nhờ trình tự vùng ITS Nghiên cứu tiến hành giải trình tự vùng ITS của 5

tự Vùng ITS sau khi xử lý có chiều dài 644bp gồm 235bp ITS1, 163bp 5,88 va 264bp được phân biệt với 4 loài còn lại ở L1 vị trí (7 trong ITSI, | trong 5.8S 3 trong ITS2) Theo nhóm tác giả, ITS có thể được dùng để nhận dạng phân tử các giống Dendrobium officinale [14]

Nhóm tác giả Đài Loan, Wen-Li và cộng sự 2009, sử dụng trình tự vùng marK

ở lục lạp để phân tích mối quan hệ di truyền của các loài Øendrobium Kết quả cho 99,7%), nhóm kết luận rằng trình tự gen mafK rất bảo thủ ở chỉ Dendrobium, [28] Trên đổi tượng Dendrobiưm, nhóm tác giả Nhật Bản (Asahina và cộng sự, 2010) lại sử dụng trình tự gen marK và rbcL dé phân định loài đồng thời nghiên cứu Jimbriatum, Ð moniliforme, D nobile, D pulchelluum, và D rosaense.|12] Theo kết quả nghiên cửu mỗi quan hệ phát sinh chủng loại của 20 loài Dendrobium của Chiang và cộng sy 2012, vùng ITSI và ITS2 có mức độ đa dạng cao nằm trong khoảng 636 đến 653 bp mức độ phân biệt 75,7% đến 99,1% Phân tích phát liệu và có chung hình thái ngoài [13]

Một công trình mang tính tổng kết về mã vạch DNA cho Øendrobium công bố đầu năm 2012 do nhóm tác giá Án Độ (Singh và cộng sự, 2012) Theo đó, các tác giả

1, tưnH-psbA và ITS nằm trong nhân của 36 loai Dendrobium /23} Sharma và cộng sự (2012) đã giải trình tự gen IT§ nằm trong nhân của 10 loài địa lan Cymbidium thu th§p từ vùng Đông Bắc của Ản Độ để phân tích định danh dưới loài và quan hệ phát sinh chủng loài của chúng [22]

Thái Lan (Siripiyasing và cộng sự 2012) bằng các trình tự gen rpoB, rpoCL, matK, va dinh cc loai Cymbidium aloifotium, C atropurpureum, C bicolor, C chloranthum, C dayanum, C devonianum, C ensifolium, C finlaysonianum, C haematodes, C roseum, C sinense, C tigrinum va C tracyanum rit tt, [24]

Một nhóm tác giả Hàn Quốc (Kim và cộng sự 2014) đã nghiên cứu xây dựng

mã vạch cho phong lan tại Hàn Quốc Nhóm nảy đã phân tích 647 trình tự của các lan và 4 loài đối chứng đẻ phát triẻ

Hàn Quốc Mức độ phân giải loài cho từng mã vạch riêng lẻ đao động tử 60,5% (rbcL) hợp năm mã vạch này với nhau Trong số 26 khả năng kết hợp có thể có của 5 vùng 6

aipH + psbK-ps6l + trnH-psbA, với trình tự DNA ngắn nhất, là lựa chọn tốt nhất cho

mã vạch của các loài phong lan Hàn Quốc [17]

ìn một mã vạch DNA hiệu quả cho Orchidaccae tại

Nhóm tác giả Trung Quốc (Feng và cộng sự, 2015) sử dụng trình tự vùng ITS2

để làm barcode và phân tích phát sinh chủng loài của nhóm Dendrobium ding lam được liệu, có nguy cơ tuyệt chủng và có hình thái ngoài giống nhau đặc biệt ứ giải đoạn chưa ra hoa Kết quả phân tích 43 mẫu ITS2 của Øendrobium và sử dụng trình tự chỉ hiệu quả khi được dùng làm barcode để xác định các loài Ðendrobiun mà còn có tiềm năng dùng đề phân tích phát sinh loài của chi Dendrobium [15] Theo Xu và cộng sự 2015, Dendrobium là một trong những chỉ lớn nhất của thực vật có hoa, có nhiều vai trò quan trọng trong nghề làm vườn, y học cũng như bảo tồn đa dạng sinh học; tuy nhiên, đây cũng là một nhóm khả khó khăn để xác định loài Nhóm tac gid nay đã phân tích 1698 trình tự của 184 loài Dendrobium chủ yếu thu (ITS, ITS2, matK, rbcL, trnH-psbA) có thé dé dang khuếch đại và giải trình tự,

2I

pháp đánh giá Nghiên cứu nảy cũng đề nghị giới thiệu sự kết hợp ITS + møK như là

mã vạch cho nhóm thực vật có hoa [29]

“Trong nước

Việt Nam nằm trong vùng Đông Nam A thuộc khu vực nhiệt đởi gió mùa nóng

và ấm rất thuận lợi cho hệ thực vật phát triển Họ Lan ở Việt Nam là một đối tượng Phạm Hoàng Hộ cho rằng có khoảng 500 loài phân bổ rộng rãi, đặc biệt khu vực rừng gồm khoảng 126 chỉ và 36 loài, trong đó có nhiều loài mới trong hệ thực vật toàn cầu

và còn rất nhiều loài chưa được biết đến Dendrobium (Lan Hoang Thao, Ding Lan) Li giống và cũng đứng thứ hai trong các loài lan được nuôi trồng nhiễu nhất chỉ sau thơm

Họ hoa Lan là một họ thực vật được đánh giá là rất khó để nhận diện, định danh đặc biệt là thời kỳ chúng chưa ra hoa Nhiễu loài chi khác với loài lân cận ở một điểm thái thông thường, Hơn nita, do Orchidaceae rit dé lai tạo cả ngoài thiên nhiên lẫn trong nhà trồng, nên có rất nhiều dạng trung gian hoặc các biến dị điều đó dẫn đến việc phân loại chúng ở mức chỉ và loài cực kỷ khỏ khăn Do vậy, khi kỹ thuật mã vạch loài nhất là loài Lan Cùng với đỏ các nghiên cứu về đa dạng và nền tảng dĩ truyền đặc điểm hình thái và mức phân tử của các loài Lan bản địa

Ở Việt Nam cũng cỏ một số công trình về hướng nghiên cứu nảy như: Năm 2012, nhóm tác gia Tran Hoàng Dũng, Trẳn Lệ Trúc Hà, Vũ Thị Huyền Trang Trần Duy Qúy đã thành công khi sử dụng mã vạch DNA tử đoạn trình tự ITS

- một loài lan rit quý đo chúng có mùi hương trằm rất đặc trưng [ 10]

vạch DNA cho các loài lan Hài Paphiopedilun của họ Orchidacea ở Việt Nam

Để tài luận án tiến sỹ của tác giả Trần Duy Dương bảo vệ năm 2015 sử dụng chỉ thị ITS để nhận dạng một số nguồn gen Hoàng thảo bản địa quý của Việt Nam

a

sở nhận diện ở mức loài và dưới loài cho các mẫu vậy này (có 27 mẫu đã được định danh chính xác) Trinh tr ITS một lần nữa cho thấy chúng là một mã vạch DNA phố quát trong việc phân định loài và ở mức dưới loài cho nhóm thực vật có hoa.[9] rình tự và sử dụng vùng ITS của 32 mẫu lan Hoàng Thảo ở Việt Nam để làm cơ

2.1 Vật liệu nghiên cứu

Vật liệu nghiên cứu là 30 mẫu (10 loài) lan Ðendrobiưmn thu tại vườn lan thuộc Trung tâm Công nghệ Sinh học tp.HCM, Vườn lan Phú Nhuận, Vườn lan Bình Chánh Bang 2.1 Ký hiệu tên loài và tên khoa học của 10 loài Dendrobium trong nghiên cửu

+2PN: loài Hoàng phi hạc, thu mẫu tại Phú Nhuận

+2BC: loài Hoàng phi hạc thu mẫu tại Bình Chánh

2.2 Phương pháp

3.2.1 Phương pháp thu thập và bảo quán mẫu lan

Cách chọn mẫu dé nghiên cứu: chọn những cây khóe, bẹ lớn, nhiều thân, cành hoa to, gốc cành hoa thẳng, ngọn cành uốn cong mềm mại, phát hoa có trên 1/3 số nụ

cân đối không ngửa ra hay cụp vào, màu sắc hoa phải tươi

Mỗi mẫu thu nhận sẽ được tiến hành bảo quán lạnh sảu bằng cách chọn lá bánh

t, lau sạch bằng côn, đề nơi thoáng mắt, sau đó cắt tir 1-5g li tuoi cho vio dng falcon

10ml, đánh số ký hiệu (theo số hiệu quản lý mẫu của trung tâm) cắn thận trong ông lẫn

số theo đối, sau đó cho ống mẫu vật vảo tủ lạnh sâu (-20°C đến -§0°C) cho các nghiên cứu về sau

3.2.2 Phương pháp phân tích hình thái

3.2.2.1 Phương pháp phân tích hoa theo phẫu thức ngang

Dendrobium gấu hoa bảo quanh trụ nhụy tắt trên

Sắp xếp các cánh

giống hoa ban dau

Hoa đối xứng qua một mặt phẳng 2 Phương pháp phân tích hoa theo phẫu thức dọc

Hình ảnh giải phẫu nữa hoa nửa của vi

Các mẫu được mô tả thông nhất như nhau gồm các thông tin vẻ: rễ thân hình dang 14, chóp lá, hình dạng và màu sắc lá đài lưng, hình dạng và màu sắc lá đài bên, dạng phát hoa:

11/ Lá đài lưng (trên) - Nhãn hay thẳng: (1) Nhãn; (2) Thing

KI/ Lá đài lưng (trên) - Có lông: (1) Có lông; (2) Không

F2/ Hình dạng lá đải bên (2 lá): (1) Hình gido, thon dai; (2) Bau duc, trimg G2/ Màu sắc lá đải bên (2 lá): (1) Trắng, pha lê; (2) Hồng, trà: (3) Lục nhạt, lục sẫm: (4) Tim; (5) Vang, cam; (6) Bd; (7) Nâu vàng

H2/ Đặc điểm lá đải bên: (1) Dom tim, do; (2) Dom nâu đó: (3) Sọc tím: (4) Sọc nâu đỏ: (5) Sọc lục; (6) Không

12/ La dai bén - Nhan hay thing: (1) Nhan; (2) Thing

K2/ La dai bên - Có lông: (1) Có; (2) Không

E3/ Hình dạng cánh hoa: (1) Hình giáo thon dài; (2) Bau dục, trứng G3/ Màu sắc cánh hoa: (1) Trắng pha lê; (2) Hồng, trà; (3) Lục nhạt, lục sẫm: (4) Tím; (5) Vàng, cam; (6) Nau vang

(5) Sọc nâu đỏ; (6) Không

13/ Cánh hoa - Nhãn hay thắng: (1) Nhãn; (2) Thắng

Kâ/ Cánh hoa - Có lông: (1) Có; (2) Không

F4/ Hinh dạng môi hoa: (1) Ông; (2) Trụ; (3) Phiến răng reo; (4) Phiến chia thùy;(5) Phu, túi

G4/ Màu sắc môi hoa: (1) Trắng, pha lê; (2) Hồng, trà; (3) Lục nhạt, lục sẫm; (4) Tím; (5) Vàng, cam; (6) Đỏ: (7) Nâu vàng

H4/ Đặc điểm môi hoa: (1) Dém tim, đỏ; (2) Đốm nâu đỏ; (3) Đốm vàng nghệ: (4) Đốm trắng, vàng; (5) Sọc tím; (6) Không

14/ Môi hoa - Nhãn hay thẳng: (1) Nhãn; (2) Thing

K4/ Môi hoa - Có lông: (1) Có; (2) Không

N4/ Môi hoa - đặc điểm mép môi: (1) Răng reo (có ria, lông); (2) Tron M/ Kiểu mọc phát hoa: (1) Đinh chồi; (2) Gốc thân; (3) Nách lá L/ Dạng phát hoa: (1) Hoa đơn; (2) Hoa chim; (3) Nhánh hoa hoa mọc riêng lẻ, mọc cụm; (4) Cảnh đối xứng; (5) Cành kép (Phan Thúc Huân, 2005) Kết quả được ghi nhận theo bảng:

Miu lan Dendrobium thu thập được sẽ được tách DNA tổng số bằng phương pháp CTAB với một số cải tiền nhỏ [4.35]

Bước Ì: Cân 0.5g mẫu lá đã được rửa sạch cho vào eppendorf 2mL Bước 2: Thêm SOOuL CTAB 2% + 2% PVP + 0,2% j ~ Mercaptoethanol nghiễn trong

từ hút

Bước 3: Bổ sung 4uL RNase, Vortex

Bude 4: U dich nghién 60 phut, 65°C; & 30 phit dau, ctr 10 phiit Vortex lẳn Bude 5: Li tâm 14.000 vòng/phút trong 10 phút, thu dich nỗi Bước 6: Bổ sung 1V Chloroform : Isoamyl alcohol (24: 1) đảo đều 5 phút Bước 7: Li tâm 14.000 vòng/phút trong 10 phút thu dich nôi

Bước 8: Lap lai bước 6, 7

Bước 9: Thêm 0,8V ammonium acetate 7,5M (lạnh) + 1V ethanol Bước 10: Đảo đều, ủ đá 60 phút

Bước 11: Li tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút, thu tủa

Bude 12: Rita tia bing 500uL cthanol 70%,

Bước 13: Li tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút, thu tủa

Bước 14: Để kh6, bé sung 100uL TE buffer

98C, bắt cặp 40 giây ở 50°C và kéo dài 40 giây ở 72°C), sau cùng là kết thúc ở 72°C trong 10 phút

Bảng 2.2 Cặp mỗi được sử dụng trong phản ứng khuếch đại trình tự mục tiêu vả kích thước trình tự được khuếch đại:

2.2.5 Phương pháp điện di trên gel agarose

Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%, 120V, 65mA trong

20 phút, đệm TAE 0,5X Sản phẩm PCR của các mẫu sẽ được tải vào giếng cùng với tỉa UV và DNA ladder sẽ được dùng làm thang đo kích thước cho các sản phẩm PCR băng sảng liên tiếp cách nhau khoảng 100bp, băng nhỏ nhất (nằm dưới củng) có kích đúng kích thước như trên lý thuyết thi xem như phản ứng khuếch đại thành công và có thể sử dụng sản phẩm PCR đó để giải trình tự

Nếu quang phổ điện di cho kết quả một dải băng rộng hoặc cho nhiều vạch thì chứng tỏ DNA đã bị gãy đoạn nhiễu hoặc lẫn DNA với RNA Nếu quang phổ điện di hiện lên các băng DNA, trên bảng gel điện di có thể dùng ethidium bromid Thuốc thử này tạo liên kết nhuộm với các base nito, khi chiếu tia tử ngoại (tia UV) vảo bảng gel thì các băng sáng hiện lên [1]

Sản phẩm PCR sẽ được giải trình tự hai chiều (chiều xuôi vả chiều ngược) tại Macrogen, Hản Quốc

3.2.7.1 Hiệu chỉnh trình tự bằng phẫn mềm FinchTV

Kết quả giải trình tự 2 chiều được trả về dưới các dạng file: file ABI (abl) va file text, Sử dụng phẩn mềm FinchTV mở file AB1 đối với trình tự được giải với mỗi xuôi (forward) và mỗi ngược (Feverse)

“Trong các cửa số hiện ra có các sóng sắc phổ:

«_ Màu xanh lục: nucleotide loại A (Adenine)

« _ Màu xanh dương: nucleotide loai C (Cystein)

* Mau den: nucleotide loai G (Guanine)

Nếu kết quả giải tốt sẽ thấy các đỉnh (peak) rõ ràng, không mập mở (unambiguous) thé hign cho timg loai nucleotide logi A — T - G — C Sử dụng các thanh trượt X vả Y để tăng hoặc giảm lần lượt chiều rộng vả chiều cao của các đỉnh

có các đỉnh sóng mập mờ

2.2.7.2 Hiệu chỉnh trình tự bằng phẫn mêm SeaView

Bước |: trong cửa số chương trình FinchTV chọn menu ‘Edit’, chon ‘copy in EASTA Formai" (hoặc sử dụng tổ hợp phim nhanh Ctrl+C)

Bude 2: mo phiin mém SeaView 4.2.12, vao menu ‘Edit’ chgn “load sequence”, Khi cửa số hiện ra, nhẫn tổ hợp phím Ctl+V để dán trình tự đã copy dưới định dạng chuyén vio 6 ‘Sep name’ trong ctra sé, chon “Add to alignment”

30