Khảo sát hoạt tính sinh học và Định lượng các chất chuyển hóa quan trọng của hạt cà phê xanh (coffea canephora) trước và sau lên men bằng chủng saccharomyces cerevisiae

Bởi lẽ, quá trình lên men đã được nhiều công trình nghiên cứu chứng minh là có khả năng nâng cao hoạt tính của hợp chất, làm cho đối tượng trở nên tương thíchsinh học hơn với cơ thể con

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA - ĐHQG-HCM

Khoa Kỹ thuật Hóa học

Bộ môn Kỹ thuật Hóa Hữu cơ

-

Luận văn Tốt nghiệp

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC VÀ ĐỊNH LƯỢNG CÁC CHẤT CHUYỂN HÓA QUAN TRỌNG CỦA

HẠT CÀ PHÊ XANH (Coffea canephora) TRƯỚC VÀ SAU LÊN MEN BẰNG CHỦNG Saccharomyces cerevisiae

BIOACTIVITY STUDY AND QUANTIFICATION OF IMPORTANT METABOLITES OF GREEN COFFEE BEANS

(Coffea canephora) BEFORE AND AFTER FERMENTATION

WITH Saccharomyces cerevisiae STRAIN

SVTH: Trần Huyền Trân – 2370039 GVHD: TS Lê Xuân Tiến

Thành phố Hồ Chí Minh, 0x/2024

i

LỜI CẢM ƠN

Để thực hiện được đề tài nghiên cứu này, em xin được gửi lời cảm ơn chân thành nhấtđến trường Đại học Bách Khoa ĐHQG – TP.HCM đã hỗ trợ về thời gian và phươngtiện vật chất cho nghiên cứu này, cảm ơn các thầy cô trong khoa Kỹ thuật Hóa học đặcbiệt là các thầy cô Bộ môn Kỹ thuật Hóa hữu cơ đã giảng dạy cho em nhiều bài học bổích giúp em lĩnh hội được những kiến thức quý báu để có thể áp dụng trong đề tàinghiên cứu của mình

Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến TS Lê Xuân Tiến và TS TốngThanh Danh là 2 người thầy đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kinh nghiệm, giải đápnhững thắc mắc và đóng góp nhiều ý kiến bổ ích cho đề tài nghiên cứu của em Bêncạnh những kiến thức về khoa học, em còn được học nhiều kiến thức về môi trườnglàm việc thực tế và một số kỹ năng quan trọng khác từ thầy Tiến, xin chân thành cảm

ơn thầy

Ngoài ra, xin cảm ơn các bạn làm luận văn tại phòng thí nghiệm 401B2 đã luôn sẵnsàng giúp đỡ và hỗ trợ em nhiệt tình trong quá trình thực hiện nghiên cứu Cảm ơn cácbạn vì đã là thanh xuân tươi đẹp và làm cuộc sống đại học của em bớt khô khan đi rấtnhiều Xin cảm ơn Nhật Anh, đã luôn bên em những ngày khó khăn nhất và là chỗ dựatinh thần vững chãi của em

Lời cảm ơn cuối cùng em xin được dành cho ba mẹ, người đã sinh ra và nuôi dưỡng

em, là chỗ dựa cả về vật chất và tinh thần giúp em có thể hoàn thiện ước mơ, cũng làđộng lực để em cố gắng hoàn thiện bản thân từng ngày

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 06 năm 2023

Trần Huyền Trân

TÓM TẮT

iii

ABSTRACT

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT iii

ABSTRACT iv

DANH MỤC HÌNH ẢNH vii

DANH MỤC BẢNG ix

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT x

LỜI MỞ ĐẦU x

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1

1.1 Tìm hiểu về da và sự lão hóa da 1

1.1.1 Cấu trúc da 1

1.1.2 Sự lão hóa da 3

1.2 Các nhân tố tác động tiêu cực đến làn da 4

1.2.1 Bức xạ cực tím (tia UV) từ ánh sáng mặt trời 4

1.2.2 Sự phá hủy da có liên quan đến elastase, collagenase và tyrosinase 4

1.3 Chiết xuất thực vật và các hợp chất tự nhiên trong điều trị các vấn đề về da 6

1.3.1 Nhóm các hợp chất phenolic 7

1.3.2 Nhóm các hợp chất isoprenoid 12

1.4 Khảo sát một số loài hoa mang hoạt tính sinh học 15

1.4.1 Hoa huệ trắng 15

1.4.2 Hoa kim ngân 17

1.4.3 Hoa lài ta 18

1.4.4 Hoa cúc vàng 20

1.4.5 Hoa nguyệt quế 21

1.4.6 Hoa cà phê 23

1.4.7 Hoa bưởi 24

1.5 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu 25

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 26

2.1 Hóa chất và thiết bị 26

2.1.1 Hóa chất 26

2.1.2 Thiết bị 26

2.2 Phương pháp thực nghiệm 27

2.2.1 Xử lý nguyên liệu 27

v

2.2.2 Phương pháp đo độ ẩm 27

2.2.3 Quy trình chiết xuất 28

2.2.4 Định lượng polyphenol tổng 29

2.2.5 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học 31

2.2.5.1 Hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase 31

2.2.5.2 Hoạt tính kháng oxy hóa 34

2.2.5.3 Khả năng gây độc tế bào của cao chiết: Phương pháp MTT 36

2.2.5.4 Đánh giá khả năng tác động của cao chiết lên sự tiết NO 38

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 41

3.1 Quá trình chiết xuất nguyên liệu 41

3.1.1 Xử lý và chuẩn bị nguyên liệu 41

3.1.2 Quy trình chiết 44

3.2 Hiệu suất thu cao tổng 46

3.3 Định lượng polyphenol tổng 47

3.4 Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa 50

3.5 Khảo sát hoạt tính ức chế tyrosinase 52

3.6 Khảo sát khả năng gây độc tế bào 55

3.7 Khảo sát hoạt tính kháng viêm 56

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 60

4.1 Kết luận 60

4.2 Kiến nghị 60

TÀI LIỆU THAM KHẢO 62

PHỤ LỤC 69

LỜI MỞ ĐẦU

Trong xã hội phát triển hiện nay, nhu cầu làm đẹp và chăm sóc sức khỏe rất được quantâm Con người không chỉ cần một sản phẩm hiệu quả mà còn phải an toàn và thânthiện với môi trường Đó cũng là lý do các sản phẩm có nguồn gốc thiên nhiên đượcđẩy mạnh nghiên cứu và phát triển Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng các loài thực vậtmang nhiều hoạt tính sinh học đặc biệt có lợi cho sức khỏe con người Trong đó, càphê là một loại cây trồng phổ biến tại các tỉnh Tây Nguyên của Việt Nam, được xemnhư một loại thực phẩm chức năng tự nhiên, giúp cải thiện sức khỏe hiệu quả

Cà phê thường được biết đến như loại đồ uống quen thuộc, nhưng hạt cà phê xanhchưa rang xay mới là đối tượng nghiên cứu phổ biến Nhiều kết quả nghiên cứu khẳngđịnh hạt cà phê xanh có đặc tính kháng oxy hóa, giảm mỡ nội tạng và trọng lượng cơthể, cải thiện tình trạng kháng insulin Do đó, cà phê xanh được ứng dụng đáng kểtrong lĩnh vực dược phẩm, nổi bật là các thực phẩm chức năng hỗ trợ giảm cân và điềutrị bệnh đái tháo đường Những hoạt tính trên được cho là có liên quan chặt chẽ đếncác chất chuyển hóa như caffeic acid, chlorogenic acid và dẫn xuất

Mặc dù được đánh giá là có nhiều lợi ích nhưng đa số các polyphenol trong hạt cà phêxanh liên hợp với đường dưới dạng các glycoside làm hạn chế sinh khả dụng của cácchất này Để tăng cường khả năng sinh học và giải phóng các hợp chất phenolic tự do,quá trình xử lý sinh học như lên men được xem là an toàn và tương thích sinh lý Mặtkhác, qua quá trình tìm hiểu về đối tượng, nghiên cứu nhận thấy các hoạt tính liênquan đến da ít được quan tâm khảo sát và ứng dụng trong dược mỹ phẩm vẫn còn hạnchế

Vì những lý do trên, đề tài được thực hiện với mục đích khảo sát một số hoạt tính sinhhọc như kháng oxy hóa, kháng viêm, ức chế quá trình peroxide hóa lipid trong giaiđoạn trước và sau lên men Việc định lượng một số chất chuyển hóa chính cũng đượcthực hiện để cung cấp cái nhìn tổng quát về cơ chế của quá trình lên men hạt cà phêxanh

x

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

Da là cơ quan lớn nhất, được xem là “bề mặt tráng lệ của cơ thể” [1] Da bao bọc toàn

bộ cơ thể nên đóng vai trò đặc biệt quan trọng giúp bảo vệ con người khỏi các tác nhânđộc hại khi tiếp xúc với môi trường Tuy nhiên, theo thời gian do ảnh hưởng của cácyếu tố bên ngoài như ô nhiễm môi trường, tia UV,… mà da dần mất đi cấu trúc vốn có,suy giảm chức năng, hình thành nếp nhăn Không những thế, các yếu tố trên còn lànguyên nhân gây nên các rối loạn sắc tố, viêm da hay thậm chí gây ung thư da

Từ xưa con người đã biết tạo ra những công thức làm đẹp và trị liệu cho da từ cây cỏ.Khi khoa học phát triển, nhiều kết quả nghiên cứu đã củng cố cơ sở lý luận cho cáccông thức này Nhiều loài cây có khả năng điều trị một số rối loạn trên da như cúc La

Mã làm giảm các triệu chứng viêm, áp xe, kích ứng,…[2] Bên cạnh tác dụng chữa trị,thực vật còn là sản phẩm chăm sóc da hiệu quả như nhân sâm Hàn Quốc rất nổi tiếngvới tác dụng chống oxy hóa và ức chế hình thành melanin [3] Mặc dù các loại cây kểtrên có rất nhiều lợi ích nhưng đôi khi việc ứng dụng vẫn còn hạn chế do giá thànhcao, khó bảo quản Do đó, việc tìm ra nguyên liệu có đầy đủ những lợi ích sinh họcnhưng khắc phục được các vấn đề về giá cả và bảo quản sẽ mang lại triển vọng cho sựphát triển của ngành dược mỹ phẩm Cà phê xanh là đối tượng được chọn để đánh giátính khả thi trong đề tài này

Trong những năm gần đây, các sản phẩm lên men có nguồn gốc thực vật được ngườitiêu dùng đặc biệt quan tâm như kombucha, mỹ phẩm chứa dịch lên men của các loàithảo dược Bởi lẽ, quá trình lên men đã được nhiều công trình nghiên cứu chứng minh

là có khả năng nâng cao hoạt tính của hợp chất, làm cho đối tượng trở nên tương thíchsinh học hơn với cơ thể con người [4] Do đó, đề tài chọn vấn đề này để tìm hiểu vớimong muốn tìm ra các đặc tính nổi trội của hạt cà phê xanh sau khi lên men

Các kiến thức bao quát về cấu tạo da người, quá trình oxy hóa, viêm da và nguyênnhân hình thành sẽ được tìm hiểu trong chương này Bên cạnh đó, tổng quan về hạt càphê xanh và quá trình lên men cùng các loại chủng men cơ bản cũng được trình bày cụthể

1.1 Tìm hiểu về da, quá trình oxy hóa và phản ứng viêm trên da

Về mặt chức năng, da là một cơ quan đặc biệt nhất trên cơ thể người với cấu trúc phứctạp và đóng vai trò quan trọng [1] Ngoài việc làm rào chắn bảo vệ cơ thể khỏi sự xâmnhập của vi khuẩn và các chất độc hại từ môi trường thì da còn giúp điều hòa sự thoáthơi nước, nhiệt độ cơ thể và mang lại cảm giác [5] Vì sự phức tạp trong cấu trúc, da

có thể mềm mại hay thô ráp và nhăn nheo tùy vào vị trí trên cơ thể [1]

tế bào Merkel Lớp biểu bì lại được cấu tạo từ 4 lớp nhỏ hơn, từ dưới lên trên lần lượt

là lớp đáy (stratum basale), lớp gai (stratum spinosum), lớp hạt (stratum granulosum)

và lớp sừng (stratum corneum), riêng lòng bàn tay, bàn chân có thêm lớp sáng (stratum

lucidum) (Hình 1.2) [6, 7] Chức năng chính của lớp biểu bì là sinh sản tế bào điều

khiển quá trình thay da (keratin hóa), tế bào mới hình thành ở lớp đáy di chuyển lênphía trên thay cho các tế bào chết Lớp tế bào chết trên lớp sừng bị bong ra ở dạng vảynhỏ [6] Lớp sừng giữ vai trò đặc biệt quan trọng giúp ngăn chặn tác hại của môitrường lên da, bảo vệ da khỏi ngoại lực và hạn chế thoát hơi nước, chất điện ly khỏi cơthể [1, 5, 6]

2

Hình 1.2 Cấu tạo lớp biểu bì [6]

Lớp trung bì (dermis): chiếm gần 90% độ dày, có chức năng nâng đỡ Trung bì là lớpsợi đàn hồi gồm collagen, elastin, chất nền (glucosaminoglycan), nguyên bào sợi, tếbào dendrocyte, tế bào mast, tế bào mô, mạch máu, dây thần kinh và bạch huyết Lớptrung bì bao gồm lớp nhú bì (papillary dermis) và lớp lưới (reticular dermis), không córanh giới rõ ràng giữa 2 lớp Collagen nâng đỡ cơ học cho da, được sắp xếp ngangtrong lớp lưới Elastin giúp tăng độ đàn hồi, được xếp lỏng lẻo theo mọi hướng Chấtnền hỗ trợ collagen và mô đàn hồi, có khả năng giữ nước và vận chuyển chất dinhdưỡng, hormone, phân tử lưu chất [6, 8]

Lớp mỡ (subcutaneous fat): là lớp cuối cùng gắn các cơ quan xương, cơ, bắp thịt đến

da, lớp này chứa các dây thần kinh và các tế bào thịt Mô mỡ thực hiện chức nănggiảm chấn động và là nơi dự trữ năng lượng [5]

1.1.2 Quá trình oxy hóa trên da

Vẻ ngoài của da là yếu tố then chốt trong trải nghiệm xã hội và bề ngoài của conngười, có ảnh hưởng đáng kể về mặt cảm xúc và tâm lý đối với chất lượng cuộc sống.Cũng như các cơ quan khác, da sẽ phải trải qua quá trình lão hóa theo thời gian [9].Lão hóa da là quá trình thoái hóa đa hệ liên quan đến da và hệ thống nâng đỡ bao gồmxương, sụn và các khoang dưới da Các biểu hiện lâm sàng thường thấy bao gồm nhăn

da, da khô và thô ráp, mất độ đàn hồi, chảy xệ [10] Hơn nữa, những thay đổi liên quanđến tuổi tác của các mô liên kết dưới da còn tạo ra một môi trường vi mô cho các rốiloạn trên da như suy giảm hỗ trợ tuần hoàn máu và kém lành vết thương [11] Có 2

dạng lão hóa gồm lão hóa bên trong (nội tại) và lão hóa bên ngoài Lão hóa bên trong

là quá trình tự nhiên, diễn ra liên tục và chậm rãi mà ai cũng phải trải qua Đối tượngđáng lo ngại ở đây chính là lão hóa từ các tác nhân bên ngoài như ánh nắng mặt trời, ônhiễm,… Trong đó, bức xạ UV từ ánh nắng mặt trời được cho là nguyên nhân chínhgây nên lão hóa quang học cho làn da [10]

Cơ chế chính mà tia UV bắt đầu các phản ứng phân tử trên da là tạo ra gốc oxy hoạtđộng (ROS) gồm anion superoxide, peroxide và oxy nguyên tử [12] Bức xạ UV kíchthích sự tăng sinh quá mức ROS làm stress oxy hóa trong lớp biểu bì [13] Stress oxyhóa quá mức gây hại cho da và khiến da lão hóa, đây còn được gọi là lý thuyết gốc tự

do của sự lão hóa [9, 14] Lý thuyết này nói rằng ROS oxy hóa các thành phần tế bàonhư lipid, protein và acid nucleic để tạo ra kiểu hình lão hóa [9] Con người sở hữumột hệ thống phòng vệ chống oxy hóa bẩm sinh, bao gồm các enzyme chống oxy hóanhư SOD, catalase và glutathione peroxidase, cũng như các chất chống oxy hóa khôngchứa enzyme như glutathione, ascorbic acid và tocopherol, giúp trung hòa các gốc tự

do Tuy nhiên, hệ thống bẩm sinh này có thể bị quá tải và dẫn đến tình trạng stress oxyhóa [15]

Hình 1.3 Stress oxy hóa gây nên bởi các yếu tố nội sinh và ngoại sinh [15]

Hơn nữa, ROS do tia UV gây ra có thể làm thay đổi vật liệu di truyền như DNA, RNA

và các thành phần khác của tế bào như màng lipid, protein cấu trúc Tùy thuộc vàomức độ thay đổi phân tử, ROS có thể làm suy giảm đường dẫn truyền tín hiệu liên

4

quan đến sự biệt hóa, tăng trưởng và lão hóa da Những khiếm khuyết vật liệu ditruyền có thể dẫn đến rối loạn chức năng tế bào bao gồm tổng hợp bất thường protein,tăng cường thoái hóa mô liên kết và thậm chí ung thư da [16] Hầu hết ROS được tạo

ra trong tế bào bởi chuỗi hô hấp của ty thể, nhưng trong điều kiện thiếu oxy sẽ tạo racác oxide nitric (NO) và các gốc nitrogen hoạt động (RNS) Các RNS tiếp tục tạo racác chất hoạt động khác như malondialdehyde (MDA) bằng cách gây ra quá trìnhperoxide hóa lipid quá mức [17] Cả những tổn thương protein và DNA hay stress oxyhóa do gốc tự do gây ra đều có thể khởi tạo các tín hiệu tiền viêm Do đó, có thể nóitình trạng viêm và stress oxy hóa có mối liên hệ chặt chẽ với nhau [18]

1.1.3 Phản ứng viêm trên da

Viêm là một cơ chế “bảo vệ vật chủ” được phát triển ở các sinh vật bậc cao để chốnglại những thương tổn như nhiễm khuẩn và tổn thương mô Đây là một phản ứng miễndịch thiết yếu của vật chủ cho phép loại bỏ các kích thích có hại cũng như chữa lànhcác mô bị chấn thương Do đó, phản ứng viêm được coi là một phần của khả năngmiễn dịch bẩm sinh và cũng là tuyến phòng thủ đầu tiên chống lại “những kẻ xâmlược” từ bên ngoài [19] Con người đã biết đến 5 dấu hiệu điển hình của tình trạngviêm hàng trăm năm nay bao gồm nóng, đỏ, sưng, đau và mất chức năng [20, 21].Viêm có thể chia làm 3 loại dựa trên thời gian phản ứng với các tác nhân gây viêm:Viêm cấp tính xảy ra ngay sau chấn thương và kéo dài khoảng vài ngày; Viêm mãntính có thể kéo dài hàng tháng hoặc thậm chí nhiều năm nếu tình trạng viêm cấp tínhkhông thuyên giảm; Viêm bán cấp tính là giai đoạn chuyển tiếp từ cấp tính sang mãntính kéo dài từ 2 đến 6 tuần [21]

Trong giai đoạn cấp tính, bạch cầu, chủ yếu là bạch cầu hạt, di chuyển dọc theogradient nồng độ đến vị trí tổn thương, được trung gian bởi các cytokine và protein cấptính Mục tiêu ở giai đoạn này là loại bỏ các kích thích viêm (tác nhân truyền nhiễm,vật chất lạ,…) hoặc các tế bào bị tổn thương và bắt đầu quá trình làm lành vết thương.Tình trạng viêm dai dẳng do tiếp xúc kéo dài với các kích thích viêm hoặc phản ứngkhông phù hợp với các phân tử tự thân có thể dẫn đến giai đoạn mãn tính Trong đó,quần thể tế bào miễn dịch hoạt động chuyển sang kiểu hình đơn nhân, tổn thương mô

và xơ hóa có thể xảy ra Viêm mãn tính được cho là góp phần gây ra nhiều bệnh baogồm viêm khớp, hen suyễn, xơ vữa động mạch, tiểu đường, ung thư và các tình trạng

lão hóa Quá trình viêm liên quan đến nhiều hệ thống sinh lý, trong đó hệ thống miễndịch đóng vai trò trung tâm [22-24] Tùy thuộc vào yếu tố kích hoạt, phản ứng viêm có

mục đích sinh lý và hậu quả bệnh lý khác nhau, được thể hiện cụ thể ở Hình 1.4 [20].

Hình 1.4 cũng cho thấy sự trục trặc về mặt chức năng của mô dường như là nguyên

nhân chính của tình trạng viêm mãn tính vì liên quan sâu sắc đến yếu tố cân bằng nộimôi trong cơ thể Phần lớn các phản ứng viêm có kiểm soát được cho là có lợi (ví dụ:bảo vệ cơ thể chống lại nhiễm trùng), tuy nhiên viêm có thể trở nên bất lợi nếu khôngđược điều hòa đúng cách (ví dụ: gây sốc nhiễm trùng) Các bệnh lý về viêm đều có cáctriệu chứng sinh lý thường thấy (sưng, nóng, đỏ, đau), ngoài ra, một số trường hợp cóthêm triệu chứng bổ sung khác thường mà ít tài liệu đề cập đến nguyên nhân Do đó,quan điểm tiêu chuẩn về tình trạng viêm như một phản ứng với nhiễm trùng hoặc chấnthương có thể cần được mở rộng để giải thích quá trình viêm gây ra bởi các loại tìnhtrạng bất lợi khác [20]

Một số nghiên cứu cho rằng gốc tự do là yếu tố đặc biệt quan trọng trong việc kíchhoạt các tín hiệu viêm Sự xâm nhập của tế bào miễn dịch (bạch cầu đơn nhân, đạithực bào, tế bào lympho và tế bào plasma) vào thành mạch và sự thoát mạch của các tếbào này vào mô cùng với giải phóng ROS gây nên các tổn thương mô ROS được tạo

ra bởi các tế bào viêm ngoài việc gây ra stress oxy hóa trực tiếp để loại bỏ tác nhânxâm lấn mô còn kích thích các con đường dẫn đến khuếch đại tình trạng viêm Sự kích

Xơ hóa, dị sản hoặc phát triển khối u

Tổn thương mô viêm &

nhiễm trùng huyết

Thích ứng với stress và phục hồi cân bằng nội môi Phản ứng sửa chữa mô

Tạo hàng rào chống nhiễm

hoạt các kinase (hoặc các enzyme tạo điều kiện cho quá trình phosphoryl hóa) do ROSdẫn đến sự kích hoạt các yếu tố phiên mã, từ đó tạo ra các cytokine và chemokine gâyviêm Sau khi được kích hoạt, các cytokine và chemokine này liên kết với các thụ thểtương ứng để tạo ra ROS [25, 26] Do đó, ROS vừa là thượng nguồn vừa là hạ nguồncủa chu kỳ viêm Sự hình thành ROS quá mức trong phản ứng viêm có thể gây ra tổnthương nặng hơn và làm trầm trọng thêm chu trình viêm – stress oxy hóa Nhìn chung,tình trạng viêm càng kéo dài thì nguy cơ mắc các bệnh lý như xơ vữa động mạch, ungthư và các bệnh thoái hóa thần kinh càng cao Mối liên hệ giữa trạng thái stress oxy

hóa và tình trạng viêm được biểu hiện cụ thể trên Hình 1.5.

Mối liên hệ giữa một số trạng thái bệnh lý và sự sản sinh ROS giúp các chất oxy hóa

và tác nhân gây viêm đang dần được hiểu rõ Đồng thời, vai trò của liệu pháp chốngoxy hóa (và chống viêm) như một biện pháp phòng vệ chống lại một số bệnh lý đang

được khám phá Mối tương quan giữa stress oxy và viêm ở Hình 1.5 cho thấy rằng

một trong những cách hữu hiệu để ngăn ngừa và làm giảm trạng thái viêm là hạn chếxuất hiện stress oxy hóa, tức là ngăn chặn việc tăng sinh quá mức ROS trong cơ thể Bên cạnh gốc tự do ROS, các gốc nitrogen hoạt động RNS cũng có liên quan mật thiếtđến quá trình viêm trong cơ thể Trong điều kiện bình thường, nitric oxide (NO) tham

Chất gây ung thư Chuyển đổi tế bào Đột biến

Lipid Protein DNA

Tăng trưởng tế bào &

tái tạo mô

Xâm nhập tế bào/ Tạo

mạch

Tế bào sống Chết tế bào

Viêm

Chất trung gian tiền viêm

Sản sinh ROS mức độ cao

Stress oxy hóa

Tăng sinh tế bào

Đường dẫn truyền tín hiệu

gia vào các quá trình sinh lý, chẳng hạn như giãn mạch và dẫn truyền thần kinh, tuynhiên, sự biểu hiện quá mức của phân tử này có thể dẫn đến các bệnh như hen suyễn,viêm, xơ vữa động mạch và đào thải nội tạng Trong các tế bào viêm, enzyme tổnghợp NO cảm ứng khi được kích hoạt sẽ hoạt hóa iNOS trong các đại thực bào, gây ra

sự sản sinh NO dai dẳng (Hình 1.6), NO được tạo ra theo cách này gây độc cho tế bào

và gây tổn hại cho các mô xung quanh [27]

Hình 1.6 Sự tạo thành RNS/ROS trong quá trình viêm [27]

Nhìn chung, viêm là một trạng thái rất phức tạp của cơ thể mà bao gồm vô số chấttrung gian tham gia vào quá trình khởi phát Trong đó, các gốc tự do rất được quantâm vì đóng góp chính vào việc hình thành viêm mãn tính và ung thư Do đó, hướngtiếp cận mới hiện nay là nhắm vào việc ngăn ngừa stress oxy hóa thông qua ức chế NO

và các ROS ở cấp độ tế bào Các loại thuốc ức chế miễn dịch và chống viêm nổi tiếng

có bán trên thị trường chủ yếu là không chọn lọc trong cơ chế tác dụng và cũng cónhiều tác dụng phụ [27] Vì vậy, việc tìm ra các thành phần hoạt chất chiết xuất từthực vật có tính kháng oxy hóa, ức chế gốc tự do đặc hiệu và tương thích sinh học với

cơ thể người là thật sự cần thiết

1.2 Giới thiệu hạt cà phê xanh giống Coffea canephora

Cà phê là một trong những mặt hàng thực phẩm quan trọng đối với cả người tiêu dùng

và nhà sản xuất Một số quốc gia ở khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới xem cà phê làsản phẩm nông nghiệp xuất khẩu chính Hai loài cà phê chính được tiêu thụ trên toàn

thế giới là Coffea arabica (Arabica) và Coffea canephora (Robusta) [28] Ở phạm vi

8

nghiên cứu này, đối tượng được chọn là hạt cà phê giống Robusta vì có sản lượng lớn

ở Việt Nam và giá thành tương đối hợp lý so với giống Arabica

1.2.1 Nguồn gốc và phân bố

Trong suốt thế kỷ XVIII – XIX, chỉ có giống Arabica được trồng và tập trung chủ yếu

ở vùng nhiệt đới châu Mỹ, vùng Caribbean và châu Á Tuy nhiên, loài này rất nhạycảm với các mối đe dọa ký sinh, đây là lý do vào thế kỷ XIX một giống tự phát

(Coffea canephora) ở châu Phi được người địa phương nhanh chóng đưa vào trồng trọt

vì khả năng tự chống chịu tốt [29] Coffea canephora còn được gọi là cà phê Robusta,

có nguồn gốc từ các khu rừng nhiệt đới xung quanh Hồ Victoria ở Uganda, được dunhập vào Đông Nam Á vào năm 1900 sau khi bệnh gỉ sắt lá phá hủy tất cả các cây càphê Arabica (năm 1869) và hầu hết các đồn điền ở vùng trũng Java (năm 1876) Hiệntại, Robusta chiếm 36% sản lượng thế giới và được trồng ở các nước nhiệt đới từIndonesia và Việt Nam, qua châu Phi cận Sahara đến Brazil [30]

Tại Việt Nam, cà phê Robusta được trồng tập trung tại các vùng cao nguyên trên đấtFerralsols Rhodic phong hóa sâu trên đá bazan với 95% cà phê được trồng chủ yếu ởcác tỉnh Đăk Lăk, Gia Lai, Kon Tum, Lâm Đồng [31] Dưới ảnh hưởng của giá cà phêRobusta trên thị trường toàn cầu có lợi, diện tích canh tác đã tăng theo cấp số nhân kể

từ đầu những năm 1990 ở tỉnh Tây Nguyên Đăk Lăk; Việt Nam hiện nay là nước sảnxuất thứ hai trên toàn thế giới [32]

Hình 1.7 Lược đồ nông nghiệp Việt Nam

Lược đồ ở Hình 1.7 cho thấy vùng trồng cà phê tập trung tại Việt Nam nằm chủ yếu ở

cao nguyên khu vực Nam Trung Bộ

1.2.2 Đặc điểm thực vật

Cà phê Coffea canephora hay cà phê Robusta (ở Việt Nam còn gọi là cà phê vối) là

cây thường xanh, được phân loại khoa học theo Bảng 1.1 sau.

Bảng 1.1 Phân loại khoa học cây cà phê Robusta

Giới (regnum) Plantae

Bộ (ordo) Gentianales

Họ (familia) Rubiaceae

Tông (tribus) Coffeeae

Chi (genus) Coffea

Loài (species) C canephora Coffea canephora thuộc dạng cây bụi thường xanh với lá nhẵn và bóng, mọc cao tới 5

– 10 m, thích nghi với môi trường sống trong rừng dưới dạng thực vật dưới tán Tuynhiên, các giống Robusta hiện đại đã phát triển khả năng chịu nắng cao hơn sau nhiều

10

thế kỷ nhân giống chọn lọc ở các vùng tương đối khô và nhiều nắng hơn ở Châu Phi.Cây cà phê Robusta có lá ghép đôi hình elip, đầu nhọn, thân có phân nhánh lưỡng hình

từ trên xuống dưới nách lá Các chồi phía trên của nách lá phát triển thành các nhánhchính nằm ngang ở các cạnh đối diện của mỗi đốt Nhánh chính có sáu chồi ở mỗinách lá nơi có thể phát triển thành hoa hay cành phụ nằm ngang thứ cấp [33, 34]

(Hình 1.8).

Hình 1.8 Lá cà phê Robusta

Ở giai đoạn ra hoa, ba hoặc bốn nụ đầu tiên của cây cà phê phát triển thành cụm hoa,

thường có bốn hoa (Hình 1.9) Hoa cà phê gồm có tràng hoa 5 thùy màu trắng, đài

hoa, 5 nhị hoa và nhụy hoa Bầu nhụy nằm ở gốc tràng hoa và chứa 2 noãn, nếu được

thụ phấn hợp lý sẽ tạo ra 2 hạt cà phê (Hình 1.10) Hoa bắt đầu nở vào buổi sáng sớm

và duy trì nở suốt cả ngày [33]

Hình 1.9 Cà phê Robusta ra hoa

Hình 1.10 Cấu tạo hoa cà phê Robusta

Bầu nhụy sau khi thụ phấn bắt đầu phát triển thành quả hạch, thường gọi là quả mọng

hoặc quả anh đào có nhiều thịt quả (Hình 1.11) Trong 2 tháng đầu, bầu nhụy phát

triển rất chậm, từ tháng thứ 2 – 3, bầu nhụy tăng kích thước nhanh hơn và lớp vỏchiếm gần như toàn bộ không gian trong mỗi noãn, túi phôi phát triển và chứa đầy nộinhũ Từ tháng thứ 3 – 4, quả tăng đáng kể về khối lượng và kích thước, nội nhũ từ từthay thế lớp vỏ Trong khoảng giữa tháng thứ 6 – 9, quả đạt độ chín, hạt lắp đầy toàn

bộ nội nhũ Trong tháng cuối của giai đoạn trưởng thành, quả hoàn thành quá trìnhphát triển và có màu đỏ hoặc vàng, mỗi quả chứa 2 hạt được bọc trong lớp nhầy [33,

35] Quá trình hình thành và phát triển của quả được mô tả cụ thể ở Hình 1.12.

Hình 1.11 Quả cà phê Robusta

12

b) Mặt cắt ngang quả xanh a) Quả cà phê 3 tháng sau thụ phấn

Nhìn chung, một quả cà phê trưởng thành có cấu tạo gồm có 8 bộ phận theo thứ tự từtrong ra ngoài như sau: rãnh ở giữa nhân cà phê, phôi nảy mầm, nhân cà phê, lớp vỏ

lụa (silver skin), lớp vỏ trấu, lớp màng nhầy, thịt quả, vỏ quả ngoài cùng (Hình 1.13).

Hình 1.13 Cấu trúc bên trong của quả cà phê

Về đặc điểm sinh trưởng, Robusta phát triển ở nhiều vùng khí hậu và độ cao khácnhau, cho phép trồng trọt ở độ cao thấp bằng mực nước biển và cao tới 1.400 mét sovới mực nước biển, nhưng thường ở độ cao từ 500 đến 1.200 mét so với mực nướcbiển Đặc biệt, Robusta có khả năng chịu nhiệt độ cao hơn Arabica nhưng kém chịuđược nhiệt độ thấp Phạm vi nhiệt độ khí quyển tối ưu được giả định cho cà phê

Hình 1.12 Quá trình phát triển của quả cà phê [35]

Robusta là từ 22 – 30°C [33] Về mặt sinh sản, cây cà phê Robusta bắt đầu ra quả sau

3 năm tuổi Cây sẽ tăng dần sản lượng quả hàng năm và đạt độ chín hoàn toàn cũngnhư cho sản lượng quả tối đa vào khoảng năm thứ bảy Trong khoảng 20 năm tiếptheo, cây cà phê Robusta nhìn chung duy trì năng suất hạt tương đối ổn định nhưng cóthể bị ảnh hưởng bởi các cú sốc bên ngoài như các hiện tượng khí hậu, sâu bệnh hoặcdịch bệnh Cây cà phê Robusta có thời kỳ "sinh sản hoàn chỉnh" khoảng 27 năm, sau

đó năng suất bắt đầu giảm và có thể không còn khả năng duy trì lợi nhuận khả thi chongười nông dân Tuy nhiên, cây cà phê Robusta có thể sống được từ 30 – 50 nămnhưng có thể không tạo ra năng suất có lãi [33, 36]

1.2.3 Thành phần hóa học

Thành phần hóa học của cà phê rất phức tạp với nhiều hợp chất có thể thay đổi trongquá trình quả chín Trong số đó, hơn 700 hợp chất góp phần tạo nên mùi thơm vàhương vị cho hạt cà phê Các chất chuyển hóa quan trọng nhất liên quan đến việc điềuchỉnh chất lượng và mùi vị của cà phê là caffeine, trigonelline, đường, lipid vàchlorogenic acid [37]

Trong các hợp chất chuyển hóa của hạt cà phê, caffeine (thuộc nhóm alkaloid) gần nhưđược biết đến nhiều nhất, được xem như một chất kích thích nhẹ hệ thần kinh trung

ương (Hình 1.14) Tuy nhiên, caffeine không chiếm tỉ lệ lớn trong thành phần hóa học

của hạt cà phê (khoảng 2,38% đối với Robusta), mà thành phần chủ yếu là cácpolyphenol (7 – 14% đối với Robusta), trong đó các phân tử chlorogenic acid là dồidào nhất [38, 39] Chlorogenic acid là một nhóm các hợp chất bao gồm cáchydroxycinnamate, chẳng hạn như caffeic acid, ferulic acid và p-coumaric acid, liênkết với quinic acid để tạo thành một loạt các cấu trúc liên hợp được gọi làcaffeoylquinic acid, feruloylquinic acid và p-coumaroylquinic acid tồn tại ở nhiềudạng đồng phân

14

N N

N

N O

O

Hình 1.14 Công thức cấu tạo của caffeine

Năm 2016, Babova và cộng sự đã tiến hành phân tích định tính và định lượng cao chiếthạt cà phê xanh của hai loại Arabica và Robusta từ nhiều vùng địa lý khác nhau, trong

đó có Việt Nam Kết quả phân tích cho thấy, trong hạt cà phê xanh Robusta nguồn gốc

từ Việt Nam có 16 loại hợp chất được tìm thấy bao gồm caffeine và 15 loạichlorogenic acid Cấu trúc của các loại chlorogenic acid trong nghiên cứu của Babova

được thể hiện cụ thể ở Hình 1.15 Cũng trong nghiên cứu này, kết quả định lượng thu

được cho thấy neochlorogenic acid là hợp chất chiếm hàm lượng cao nhất trong hồ sơhóa học của hạt cà phê xanh Robusta

O O

OH

NH O

HO

HO

O O

OH OH

O

OH

OH OH

OH

HO

O O O

OH OH

H

N O

HO OH

HO

O

O O OH OH

O

HO OH O

HO OH

HOO OH

O OH O

O HO

HO

O

OH

OH O

HO

HO OH

O

OO

HO O

O OH OH O

O

O O

HO OHO

OH O

OH OH O

HO

HO

HOO OH

O O

OH OH O

O O

15

Hình 1.15 Công thức cấu tạo của các chlorogenic acid (1) caffeic acid; (2)

p-coumaroylquinic acid; (3) p-coumaroyl-Ntryptophan; (4) chlorogenic acid

(3-O-16

caffeoylquinic acid); (5) neochlorogenic acid (5-O-caffeoylquinic acid); (6) cryptochlorogenic acid (4-O-caffeoylquinic acid); (7) caffeoyl-N-tryptophan; (8) 3-O- feruloylquinic acid; (9) 5-O-feruloylquinic acid; (10) 3,4-O-dicaffeoylquinic acid; (11) 3,5-O-dicaffeoylquinic acid; (12) 4,5-O-dicaffeoylquinic acid; (13) 3-O-feruloyl- 4-caffeoylquinic acid; (14) 3-O-feruloyl-5-caffeoylquinic acid; (15) 4-O-feruloyl-5- caffeoylquinic acid;

Dựa vào cấu trúc của các chlorogenic acid có thể thấy đây là tác nhân chính tạo nênđặc tính chống oxy hóa của hạt cà phê Hoạt động chống oxy hóa của các hợp chất nàyphần lớn được điều chỉnh bởi nhóm chức năng (nhóm -OH gắn trên vòng thơm) Cácchlorogenic acid cũng là các polyphenol, đặc trưng với sự sẵn có của hydro phenolic,được dùng để loại bỏ các gốc tự do Một polyphenol được xác định là chất chống oxyhóa sẽ đáp ứng hai tiêu chí cơ bản: thứ nhất, khi hiện diện ở nồng độ thấp so với chấtnền bị oxy hóa sẽ trì hoãn, làm chậm hoặc ngăn chặn hoàn toàn quá trình tự oxy hóahoặc oxy hóa qua trung gian gốc tự do; thứ hai, hợp chất được hình thành sau phảnứng bắt gốc tự do phải ổn định và không trải qua quá trình oxy hóa tiếp theo Sự ổnđịnh này có thể thông qua liên kết hydro hoặc bằng cách tạo thành phức chất với cácelectron p (các đám mây điện tử) [40] Tuy nhiên, các hợp chất chlorogenic acid lại rất

dễ bị phân hủy bởi nhiệt độ cao Quá trình rang hạt cà phê giữ vai trò chính trong việctạo ra mùi thơm và hương vị nhưng đây cũng là lý do làm giảm đáng kể hàm lượngchlorogenic acid Thành phần của cà phê rang là carbohydrate (38–42% chất khô),melanoidin (23%), lipid (11 – 17%), protein (10%), khoáng chất (4,5 – 4,7%),chlorogenic acid (2,7 – 3,1%), axit béo (2,4 – 2,5%), caffeine (1,3 – 2,4%) [40] Phântích thành phần trên cho thấy hàm lượng chlorogenic acid đã giảm đi đáng kể so vớilúc chưa rang (giảm từ 2,25 – 5 lần) Vì lý do trên, để tập trung tìm hiểu và khai tháchoạt tính sinh học tiềm năng của hạt cà phê Robusta, đề tài sẽ chọn nguyên liệu là hạt

cà phê xanh chưa rang xay để đảm bảo hàm lượng chlorogenic acid ở mức tối đa

1.2.4 Hoạt tính sinh học

Với thành phần hoạt chất đa dạng như đã phân tích, mối quan hệ của cà phê với sứckhỏe đã được đề cập trong hơn 8000 nghiên cứu y học chuyên nghiệp trong suốt 40năm qua Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng cà phê có thể giúp ngăn ngừa một số bệnhmãn tính như giảm nguy cơ phát triển tiểu đường tuýp 2, giảm nguy cơ tổn thương gan

và xơ gan Nguy cơ mắc bệnh Parkinson, Alzheimer cũng thấp hơn ở những ngườithường xuyên dùng cà phê [41-43] Nhìn chung, các lợi ích cho sức khỏe của hạt càphê chủ yếu đến từ hai hoạt tính sinh học quan trọng là kháng oxy hóa và kháng viêm.

a) Hoạt tính kháng oxy hóa

Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã chỉ ra rằng có vô số chất chống oxy hóa trong thựcphẩm, đặc biệt là thực phẩm có nguồn gốc từ thực vật Nhiều bằng chứng thuyết phụccho thấy việc bổ sung nhiều thực phẩm, thảo dược và đồ uống có nguồn gốc thực vật,giàu chất chống oxy hóa trong chế độ ăn uống giúp tăng cường sức khỏe và giảm nguy

cơ mắc bệnh [44] Cà phê là một loại đồ uống phổ biến, và như đã trình bày, cà phêchứa nhiều chlorogenic acid được xem là chất chống oxy hóa chủ yếu [45] Caffeicacid và các dẫn xuất thể hiện khả năng chống oxy hóa tiềm năng trong nhiều nghiêncứu, có thể trung hòa các gốc tự do như 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH),hydroxyl, các anion superoxide, peroxynitrite và oxy đơn nguyên tử [46]

Hạt cà phê xanh đã được Naidu và cộng sự chứng minh là có hoạt tính kháng oxy hóađáng kể Trong nghiên cứu, nhóm tác giả đã đánh giá khả năng bắt gốc tự do DPPHcủa các cao chiết cà phê xanh giống Arabica và Robusta Kết quả cho thấy cao chiết càphê Robusta tại nồng độ 200 ppm có thể ức chế đến 88% gốc tự do DPPH, khá tốt sovới chất chuẩn BHA (ức chế được khoảng 90% gốc tự do tại cùng nồng độ) Ngoài ra,nghiên cứu của nhóm Naidu còn đánh giá khả năng bắt gốc tự do hydroxyl của các caochiết, được biết hydroxyl là một gốc tự do cực kỳ dễ phản ứng được hình thành trongcác hệ thống sinh học và có khả năng gây tổn hại cao trong bệnh lý gốc tự do, có khảnăng phá hủy hầu hết mọi phân tử được tìm thấy trong tế bào sống Gốc hydroxyl cũng

có khả năng liên hợp với các nucleotide trong DNA gây đứt gãy sợi, có tác động sâurộng, cuối cùng có thể dẫn đến ung thư, đột biến và độc tế bào Ngoài ra, những gốcnày được coi là một trong những loài khởi đầu nhanh chóng quá trình peroxid hóalipid Kết quả phân tích của Naidu và cộng sự cho thấy cao chiết cà phê xanh cả thô vàtinh chế đều có khả năng trung hòa gốc tự do đáng kể (lần lượt là 80% và 92% tại 200ppm), trong khi chất chuẩn BHA ức chế được khoảng 90% tại 200 ppm Cũng theoNaidu và cộng sự, khả năng dập tắt các gốc hydroxyl của cà phê có liên quan trực tiếpđến việc ngăn chặn sự lan truyền của quá trình peroxid hóa lipid Các polyphenol trong

18

cà phê (cụ thể là các chlorogenic acid) là những chất loại bỏ tốt các loại oxy hoạt động,

do đó làm giảm tốc độ phản ứng dây chuyền [47-49]

Trong một nghiên cứu khác về hoạt tính kháng oxy hóa của hạt cà phê, Kiattisin vàcộng sự đã tiến hành đánh giá khả năng ức chế gốc tự do DPPH, ABTS và ức chế quátrình peroxide hóa lipid của cả hạt cà phê xanh và hạt cà phê rang để so sánh hoạt tính.Kết quả nghiên cứu cho thấy trong cả 3 thí nghiệm đánh giá khả năng chống oxy hóa,cao chiết của hạt cà phê xanh đều thể hiện tiềm năng vượt trội hơn so với cao chiết càphê rang Cụ thể, trong thí nghiệm DPPH, giá trị IC50 của cao chiết ethanol hạt cà phêxanh thấp hơn so với cao cà phê rang (0,070 ± 0, 01 mg/ml so với 0,090 ± 0,01mg/ml); giá trị IC50 cũng có xu hương tương tự cho 2 thí nghiệm còn lại (0,014 ± 0,01mg/ml và 0,023 ± 0,01 mg/ml đối với thí nghiệm ABTS; 2,632 ± 1,71 mg/ml và 5,144

± 0,01 mg/ml đối với thí nghiệm peroxide hóa lipid) Kết quả này có thể được giảithích do hạt cà phê xanh có hàm lượng polyphenol tổng nhiều hơn so với hạt cà phêrang Những kết quả này cũng chỉ rõ rằng các hợp chất phenolic trong hạt cà phê là tácnhân chính tạo nên khả năng chống oxy hóa Hơn nữa, nghiên cứu này cũng thực hiện

so sánh khả năng kháng oxy hóa của hạt cà phê với các loại thực vật chống oxy hóanổi tiếng như nghệ và măng cụt Kết quả cho thấy hoạt tính chống peroxid hóa lipidcủa cà phê có thể cạnh tranh với chiết xuất từ nghệ và măng cụt, trong đó quá trìnhperoxid hóa lipid được biết như nguyên nhân chính gây lão hóa da [50, 51] Do đó, kếtquả nghiên cứu của Kiattisin và cộng sự còn cung cấp nền tảng để đánh giá mối quan

hệ chặt chẽ giữa quá trình oxy hóa và sự lão hóa da

b) Hoạt tính kháng viêm

Các chất trung gian gây viêm như nitric oxide (NO), yếu tố hoại tử khối u (TNF-α),interleukin-6 (IL-6), prostaglandin E2 (PGE2) và leukotriene B4 (LTB4) được tiết ratrong phản ứng viêm, tạo ra các yếu tố gây viêm như NO và PGE2 do đại thực bào gây

ra Việc sản sinh quá mức NO có thể gây giãn mạch, tổn thương mô, gây đột biến vàtổn thương mô thần kinh [52, 53] Do đó, việc tìm hiểu tiềm năng của các chất hóa họcthực vật có khả năng giảm thiểu việc sản sinh không kiểm soát các chất trung gian tiềnviêm sẽ góp phần làm giảm sự xuất hiện ban đầu hoặc sự tiến triển của bệnh [54].Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã đánh giá hoạt tính kháng viêm của thực vật từ xưa

đến nay, trong đó khả năng kháng viêm của hạt cà phê xanh được chú ý đáng kể nhữngnăm gần đây.

Trong một nghiên cứu của Lemos và cộng sự về hạt cà phê xanh (năm 2022), tác dụngchống viêm của chiết xuất ethanol cà phê được xác định bằng khả năng ức chế nitricoxide, anion superoxide và các cytokine gây viêm TNF-α và IL-6, được sản sinh bởicác đại thực bào kích thích bằng LPS Nghiên cứu được thực hiện trên 11 giống cà phêkhác nhau nhưng kết quả thu được cho thấy chỉ có một số giống là có tác dụng khángviêm đáng kể, trong đó có Robusta Cao chiết ethanol của cà phê xanh Robusta chohiệu quả kháng viêm đầy triển vọng trong hầu hết các thí nghiệm Chỉ riêng thí nghiệmxác định khả năng ức chế nitric oxide, giống Robusta cho kết quả khiêm tốn so với các

loài khác (Hình 1.16 a) Còn lại, kết quả của ba thí nghiệm bao gồm đánh giá khả

năng ức chế anion superoxide và ức chế các cytokine TNF-α, IL-6 đều rất tốt, có mẫu

còn cho kết quả tốt hơn cả chất chuẩn caffeine và chlorogenic acid (Hình 1.16 b, c, d)

[54]

a) Khả năng ức chế NO b) Khả năng ức chế anion superoxide

c) Khả năng ức chế cytokine TNF- α d) Khả năng ức chế cytokine IL-6

Hình 1.16 Kết quả đánh giá kháng viêm trong nghiên cứu Lemos và cộng sự [54]

20

Một nghiên cứu khác về hoạt tính kháng viêm theo phương pháp in vivo được thực

hiện bởi Pergolizzi và cộng sự (năm 2020) cũng cho thấy tiềm năng kháng viêm hiệuquả của hạt cà phê xanh giống Robusta Nghiên cứu này dùng mô hình chuột bị gâyphù chân bởi carrageenan, sau đó nhóm tác giả tiến hành điều trị bằng cách bôi mộtloại thuốc mỡ có chứa thành phần cao chiết methanol cà phê xanh Kết quả nghiên cứucho thấy việc bôi tại chỗ thuốc mỡ chứa 21% cao chiết ức chế đáng kể sự hình thànhphù chân do carrageenan gây ra bắt đầu từ giờ thứ 3 (43,91%); sau đó khả năng ức chếtăng rõ rệt ở giờ thứ 4 (49,25%) và vượt 50% ở giờ thứ 5 (52,89%) Việc xác định tỷ lệphần trăm ức chế cho thấy thuốc mỡ chứa chiết xuất cà phê xanh Robusta ở nồng độ21% tạo ra tác dụng tương đương với thuốc bôi thương mại EmatonilVR, từ đó chothấy hoạt tính kháng viêm đầy hứa hẹn của chiết xuất methanol được nghiên cứu [55]

1.3 Quá trình lên men thực vật

Lên men là một công nghệ cổ xưa được dùng để nâng cao thời hạn sử dụng cũng nhưchất lượng dinh dưỡng và cảm quan của thực phẩm Nhiều thay đổi sinh hóa xảy ratrong quá trình lên men, dẫn đến thay đổi tỷ lệ các thành phần dinh dưỡng và phảndinh dưỡng, do đó ảnh hưởng đến các đặc tính của sản phẩm như hoạt tính sinh học vàkhả năng tiêu hóa [56] Gần đây, quy trình sinh học này đã được áp dụng rộng rãi đểsản xuất và chiết xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học trong ngành công nghiệp thựcphẩm, hóa chất và dược phẩm [57]

1.3.1 Tổng quan về lên men

Thuật ngữ “lên men” bắt nguồn từ động từ “fervere” trong tiếng Latin, có nghĩa là làmnổi bọt, nhằm mô tả hiện tượng hoạt động của nấm men trong dịch chiết trái cây hoặcdịch chiết đại mạch Hiện tượng sôi bọt này là do CO2 sinh ra bởi sự phân giải hiếu khícác loại đường có trong dịch chiết Về phương diện sinh hóa, lên men có ý nghĩa liênquan đến sự sinh năng lượng bởi quá trình phân giải các hợp chất hữu cơ, trong khi đó,

về phương diện vi sinh vật học trong công nghiệp thì nghĩa của lên men rộng hơn [58].Hoạt động điều hòa của vi sinh vật trên cơ chất thực phẩm là gốc rễ của quá trình lênmen Quá trình lên men có thể được gây ra một cách tự nhiên bởi các vi sinh vậtthường thấy trong nguyên liệu thô Dưa cải truyền thống, bánh mì và kim chi là kếtquả của thực phẩm lên men được chế biến thông qua quá trình lên men tự phát Những

tiến bộ trong công nghệ sinh học đã biến quá trình lên men thành một quy trình cókiểm soát, sử dụng giống men ban đầu cho phép thu được sản phẩm được tiêu chuẩnhóa [59].

Sự lên men trong điều kiện không có sự tham gia của oxy phân tử gọi là lên men yếmkhí (ví dụ: lên men rượu, lên men lactic, aceton, butanol ) Trong quá trình này, chấtnhận H cuối cùng là các hợp chất hữu cơ Còn sự lên men trong điều kiện có oxy phân

tử gọi là lên men hiếu khí (ví dụ: lên men acetic, citric ) Trong điều kiện hiếu khí, sựoxy hóa các phân tử pyridine nucleotides diễn ra bằng sự chuyển điện tử thông qua hệthống cytochrome mà trong đó oxygen đóng vai trò là chất nhận điện tử cuối cùng [58,60] Việc phân loại các quá trình lên men dựa trên một số đặc điểm như sau [58]:

 Theo tính chất môi trường: lỏng, rắn, bán rắn

 Theo đặc tính sử dụng oxygen của chủng vi sinh vật: lên men hiếu khí, lên men

22

Về bản chất, lên men là quá trình oxy hoá khử sinh học được tiến hành do hoạt độngsống của vi sinh vật dưới sự xúc tác của enzyme nhằm cung cấp năng lượng và cáchợp chất trung gian cần thiết cho chúng [60] Sơ đồ tóm tắt chuyển hóa của các hợp

chất trong tế bào vi sinh vật được thể hiện trên Hình 1.17:

Hình 1.17 Mối tương quan của các đường hướng chuyển hóa cơ chất lên men [60]

Cũng như trong quá trình oxy hoá khử sinh học ở mọi cơ thể khác, các mạch phản ứngcủa sự đường phân, chu trình Krebs, chu trình Pentosophosphate là những phản ứnghoá sinh cơ bản nhất của các quá trình lên men ở tế bào vi sinh vật [60]

1.3.2 Nấm men

Nấm men khá phổ biến trong tự nhiên, nhất là ở các môi trường chứa đường với pHthấp (rau quả, mật, rỉ đường, mật ong ) Nấm men có nhiều hình dạng khác nhau nhưtròn, oval, hình quả chanh, hình chùy, hình trứng, hình thoi, hình lưỡi liềm, hình tamgiác, hình ống… Kích thước tế bào nấm men thay đổi tùy thuộc vào từng giống, từngloài và cả môi trường nuôi cấy với kích thước trung bình khoảng (3 – 5) × (5 – 10) µm.Nấm men sinh trưởng khá nhanh, thời gian thế hệ khoảng 30 – 40 phút Ngày nay,nấm men được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp lên men để sản xuất cồn, rượubia, rượu vang, men bánh mì và các loại đồ uống khác [61]

Hệ thống nấm men có thể được chia thành hai nhóm: hướng methyl (chỉ sử dụng chấtdẫn xuất methane như nguồn carbon và năng lượng chuyển hoá) và không hướng

methyl [62] (Hình 1.18)

Saccharomyces cerevisiae (men bia hoặc men làm bánh) là loại nấm men chắc chắn

được con người khai thác nhiều nhất Saccharomyces là sinh vật được lựa chọn hàng

đầu cho các ứng dụng công nghiệp, việc sử dụng chủng này để sản xuất bia đã có từ ítnhất thiên niên kỷ thứ 6 trước Công nguyên Men làm bánh là nền tảng của công nghệ

sinh học hiện đại, cho phép phát triển các quy trình sản xuất hiệu quả [63] Chủng S.

cerevisiae được dùng rộng rãi hơn vi khuẩn, các loại nấm men và nấm sợi khác vì vượt

trội hơn ở nhiều đặc điểm sinh lý bao gồm khả năng chịu được phạm vi pH rộng vàmôi trường acid (pH khoảng 4 – 4,5 hoặc thấp hơn), phát triển mạnh trong dịch đường,chịu được độ cồn tương đối cao cũng như khả năng chống lại áp suất thẩm thấu cao

Saccharomyces cerevisiae cũng có một số ưu điểm quan trọng xét từ quan điểm an

toàn và đặc tính này khuyến khích việc sử dụng trong các quy trình công nghiệp khác

24

Saccharomyces cerevisiae Kluyveromyces lactis Yarrowia lipolyticaa Arxula adeninivorans Zygosaccharomyces bailii Pichia stipites

Kluyveromyces marxianus Saccharomyces occidentalis Zygosaccharomyces rouxii

Pichia pastoris Hansenula polymorpha Pichia minuta

Candida boidinii

Không hướng methyl

Hướng methyl

Phân loại nấm men

Hình 1.18 Phân loại một số chủng men phổ biến [62]

nhau Chủng nấm men này thường được coi là an toàn vì không gây bệnh và trước đây

đã được sử dụng trong các ngành công nghiệp dinh dưỡng và sản xuất dược phẩm sinh

học [61, 62] Nhiệt độ thích hợp đối với sinh trưởng của S cerevisiae là 25 – 30℃,nhiệt độ tối thiểu khoảng 2 – 3℃ và tối đa 40℃ Nhiệt độ cao hơn nữa, mức sinhtrưởng và phát triển của nấm men bị chậm lại hoặc dần chết đi

Đối với cà phê xanh giống Robusta, nấm men Saccharomyces cerevisiae là lựa chọn

tối ưu cho quá trình lên men vì theo một số nghiên cứu đã thực hiện, dịch chiết từ hạt

cà phê xanh có pH tương đối thấp khoảng 4.3 – 5.0 [64] Giá trị pH này ức chế hoạtđộng của nhiều nhóm vi sinh vật khác nhưng lại nằm trong khoảng hoạt động tối ưucủa nấm men Ngoài ra, nấm men có hệ enzyme đa dạng, sử dụng được hầu hết cácloại đường làm dinh dưỡng Cùng lúc, trong hạt cà phê xanh, hầu hết các hợp chấtphenolic được liên hợp với đường dưới dạng glycoside, đây có thể được xem là nguồndinh dưỡng phù hợp cho nấm men sinh trưởng và phát triển [65] Việc sử dụng nấm

men Saccharomyces cerevisiae vừa giúp giải phóng các polyphenol tự do, vừa giúp

bảo quản dịch chiết tốt hơn, kéo dài thời gian sử dụng

1.3.3 Sự biến đổi của các hợp chất phenolic trong quá trình lên men

Phenolic acid là dẫn xuất của cinnamic acid hoặc benzoic acid Sự biến đổi sinh họccủa hydroxycinnamic acid, chẳng hạn như caffeic acid, ferulic hoặc p-coumaric, bởi vikhuẩn acid lactic và decarboxylase hoặc reductase của nấm men đã được ghi nhậntrong các nghiên cứu trước đây [66] Hydroxycinnamic acid tự do thường được liên

hợp với quinic acid trong nền thực phẩm, do đó tạo ra nhóm chlorogenic acid L.

gasseri và Bifidobacterium animalis subsp Lactis đã cho thấy khả năng giải phóng

caffeic acid khỏi chlorogenic acid liên hợp trong cơ chất hạt hướng dương Sự giảiphóng các chất chuyển hóa thứ cấp acetate/lactate bởi các vi sinh vật này ở bột hạthướng dương cao hơn so với protein hướng dương cô đặc Điều này ngụ ý rằng sự hiệndiện cao hơn của các hợp chất phenolic trong bột có thể mang lại tác dụng hiệp đồngđối với sự phát triển của men vi sinh và sau đó là các chất chuyển hóa của nó [67].Quá trình biến đổi sinh học của một số phenolic acid phổ biến được đề xuất cụ thể như

trên Hình 1.19 [66].

Hình 1.19 Sự biến đổi sinh học của các hợp chất phenolic trong quá trình lên men

1.3.4 Một số nghiên cứu về ứng dụng lên men

Quá trình lên men có tiềm năng cải thiện chức năng của thực phẩm, chủ yếu dựa vàoquá trình chế biến ướt cà phê để loại bỏ chất nhầy Tuy nhiên, quá trình này cũng cảithiện các thuộc tính chất lượng cảm quan của cà phê Quá trình lên men đã được ápdụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp thực phẩm, hóa chất và dược phẩm để hỗtrợ sản xuất, chiết xuất và biến đổi các hợp chất sinh học Lên men vi sinh vật là một

hệ thống xử lý công nghệ sinh học thú vị, có thể cải thiện tổng hàm lượng phenolictrong thực phẩm và thảo mộc bằng cách giải phóng các hợp chất phenolic liên kếtkhông hòa tan và do đó làm tăng giá trị dinh dưỡng của thực vật [68, 69]

Ảnh hưởng của quá trình lên men bởi Saccharomyces cerevisiae đến đặc tính sinh học của cây quế (Cinnamomum cassia) đã được Darwesh và cộng sự khảo sát (năm 2023) Nghiên cứu đã chứng minh rằng dịch chiết quế lên men S cerevisiae có hàm lượng

chất chống oxy hóa cao hơn so với quế không lên men Trong điều kiện tối ưu, hoạttính bắt gốc tự do ABTS, DPPH và H2O2 tăng lần lượt là 43,8%, 61,5% và 71,9%.Ngoài ra, tổng lượng polyphenol và flavonoid cũng tăng lần lượt là 81,3% và 415% sovới loại không lên men Đặc tính chống viêm cũng tăng từ 89% lên 92% sau khi lên

men Kết quả nghiên cứu cho thấy quá trình lên men dịch chiết quế bằng S cerevisiae

như một công cụ hữu ích để tăng hàm lượng chất chống oxy hóa và chống viêm [70]

26

Theo Palmieri và cộng sự, các hợp chất phenolic chiếm phần lớn trong cà phê xanh vàđược công nhận là chất chống oxy hóa tự nhiên Tuy nhiên, các hydroxycinnamic acidnhư chlorogenic acid được tìm thấy chủ yếu ở dạng este hóa làm giảm khả dụng sinhhọc của chúng Vì vậy, nhóm tác giả đã thực hiện quá trình biến đổi sinh học cà phê

nhân bằng cách sử dụng chủng nấm men Aspergillus oryzae Cà phê nhân được lên

men ở trạng thái rắn tại 25°C trong 24, 48 và 72 giờ Hoạt tính chống oxy hóa của dịchchiết được đánh giá bằng phương pháp DPPH, đồng thời việc xác định hàm lượngpolyphenol tổng cũng được thực hiện Các chất chuyển hóa như 5-O-caffeoylquinicacid (5 – CQA), caffeic acid và caffeine được định lượng bằng HPLC Kết quả thuđược cho thấy chiết xuất cà phê xanh lên men trong 24 giờ có hoạt tính chống oxy hóatăng 115,7% so với mẫu không lên men Ngoài ra, quá trình lên men cà phê đã thúcđẩy sự gia tăng 68,6% hàm lượng polyphenol tổng, chlorogenic acid và caffeic acid.Nghiên cứu cho thấy biến đổi sinh học là một chiến lược để thu được chiết xuất giàuhợp chất chống oxy hóa và là nguyên liệu đầy hứa hẹn cho ngành công nghiệp thựcphẩm và mỹ phẩm [65]

Qua tìm hiểu, đề tài nhận thấy rằng quá trình lên men không phải là điều quá mới lạđối với ngành sản xuất cà phê Nhưng hầu như các quá trình lên men đó đều chỉ là mộtphần trong công đoạn xử lý hạt để tạo hương thơm và mùi vị chứ không tập trung sâuvào sự biến đổi hoạt tính sinh học và sự chuyển hóa các chất trong hạt cà phê Do đó,các nghiên cứu cụ thể và chi tiết hơn về sự thay đổi hoạt tính sinh học, hàm lượng cácchất chuyển hóa trong hạt cà phê xanh sau quá trình lên men là thật sự cần thiết

1.4 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu

Là nước xuất khẩu cà phê lớn thứ 2 trên thế giới, Việt Nam sở hữu trữ lượng cà phê rấtlớn để phục vụ cho ngành công nghiệp cà phê cả trong và ngoài nước Đa số cà phêđều được sử dụng cho mục đích làm nước giải khát nhưng nhiều nghiên cứu trên thếgiới đã chỉ ra nhiều đặc tính dược lý đặc biệt quan trọng của loại thực phẩm này nhưkháng oxy hóa, kháng viêm, giảm béo phì, giảm cân,… Do đó, trữ lượng cà phê khổng

lồ của Việt Nam còn là một nguồn dồi dào cho mục đích nghiên cứu Nhiều nghiêncứu đã chỉ ra rằng các đặc tính dược lý quan trọng của cà phê chủ yếu đến từ các hợpchất phenolic, tồn tại nhiều nhất trong hạt cà phê xanh chưa qua rang xay Tuy nhiên,trong hạt cà phê xanh tự nhiên, các hợp chất phenolic này không nằm ở dạng tự do mà

liên hợp với các gốc đường để tạo glycoside hoặc liên kết với thành mạch làm giảmsinh khả dụng của cà phê xanh Do đó, một quá trình sinh học được đề xuất để cảithiện tình trạng này chính là lên men

Tóm lại, mục tiêu nghiên cứu của đề tài này là khảo sát, so sánh và đánh giá hoạt tínhsinh học (hoạt tính kháng oxy hóa, ức chế quá trình peroxide hóa lipid và kháng viêm)cùng với hàm lượng của các chất chuyển hóa quan trọng của hạt cà phê xanh giốngRobusta ở 5 độ chín khác nhau (bao gồm xanh non, xanh già, chín ương, chín đỏ và

chín đỏ đậm) trước và sau khi lên men bằng chủng nấm men Saccharomyces

cerevisiae Với mục tiêu đã đặt ra, nội dung nghiên cứu bao gồm các phần sau:

 Xử lý, đánh giá tính chất của nguyên liệu và chiết cao ethanol của các mẫunguyên liệu ban đầu

 Khảo sát khả năng kháng oxy hóa, hoạt tính ức chế quá trình peroxide hóa lipid

và hoạt tính kháng viêm của các mẫu cao ethanol trước lên men

 Định lượng hàm lượng các chất chuyển hóa 5-O-caffeoylquinic acid (5 –CQA); 3-O-caffeoylquinic acid (3 – CQA); 3,4-O-dicaffeoylquinic acid (3,4 –diCQA); 3,5-O-dicaffeoylquinic acid (3,5 – diCQA) và caffeic acid trong caochiết trước lên men

 Khảo sát điều kiện lên men (dạng rắn) với nấm men Saccharomyces cerevisiae

với hai yếu tố nồng độ men cấy và thời gian lên men

 Khảo sát, so sánh và nhận xét về khả năng kháng oxy hóa, hoạt tính ức chế quátrình peroxide hóa lipid và hoạt tính kháng viêm của các mẫu cao sau lên men

 Định lượng, so sánh và nhận xét về hàm lượng các hợp chất 5 – CQA; 3 –CQA; 3,4 – diCQA; 3,5 – diCQA và caffeic acid trong cao chiết sau lên men

28

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

2.1 Hóa chất và thiết bị

2.1.1 Hóa chất

Thông tin về các loại hóa chất dùng trong nghiên cứu này bao gồm nhà sản xuất và

nguồn gốc được liệt kê ở (Bảng 2.1).

Bảng 2.2 Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

3,4-Di-O-caffeoylquinic acid (≥98%) Sigma - Aldrich Mỹ

3,5-Di-O-caffeoylquinic acid (≥98%) Sigma - Aldrich Mỹ

2.1.2 Thiết bị

Các thiết bị và mục đích sử dụng thiết bị phục vụ cho nghiên cứu được liệt kê trong

cao chiết

4 Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

Agilent LC 1260 – đầu dò DAD

Định lượng hàm lượngchất cụ thể trong cao chiết

5 Cân 5 số Quintix 125D-1S – Sartorius Đo khối lượng

6 Hệ thống cô quay chân không (Marshall

Scientific, Hampton, NH, USA) Thu hồi dung môi chiết

2.2 Phương pháp thực nghiệm

2.2.1 Xử lý nguyên liệu

Các mẫu nguyên liệu gồm hạt cà phê xanh ở 5 độ chín khác nhau (xanh non, xanh già,

chín ương, chín đỏ và chín đỏ đậm) (Hình 2.1) được thu hái tại huyện Lâm Hà, tỉnh

Lâm Đồng Sau khi thu hoạch, hạt được phơi sấy nhà kính đến độ ẩm dưới 12%, sau

đó xay nhuyễn bằng máy nghiền (Hình 2.2).

30

Hình 2.20 Nguyên liệu ở 5 độ chín khác nhau

(chèn hình 5 loại xay nhuyễn)

2.2.2 Phương pháp đo độ ẩm

Độ ẩm được xác định bằng máy đo độ ẩm Satorius MA37 – 1

Cách tiến hành: Cân khoảng 0,5 gam nguyên liệu trải thành một lớp mỏng trên đĩanhôm, cho vào máy đo độ ẩm Nguyên liệu được sấy ở 105 đến khối lượng không℃đổi Khi màn hình máy hiện chữ END, quá trình đo kết thúc và ta đọc độ ẩm hiện trênmáy

Phép đo được thực hiện 3 lần và lấy kết quả trung bình Từ độ ẩm, khối lượngnguyên liệu khô (mnlk) được tính theo công thức:

m nlk =m cân × (1−W %)

Trong đó: mnlk: khối lượng nguyên liệu khô (g)

mcân: khối lượng nguyên liệu được cân (g)