Tách chiết hoạt chất sinh học và phân tích bộ gen của chủng xạ khuẩn streptomyces sptt84

LỜI CAM ĐOAN Tôi là Ngô Hoàng Nhật Linh đã thực hiện nghiên cứu luận văn thạc sĩ ” Tách chiết hoạt chất sinh học và phân tích bộ gen của chủng xạ khuẩn Streptomyces sp.. Các nghiên cứu

TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU

Xạ khuẩn

1.1.1 Giới thiệu chung về xạ khuẩn

Xạ khuẩn (Actinomycetes) phân bố rộng rãi trong tự nhiên và là một nhóm vi khuẩn thật (Bacteria) Chúng vô cùng đa dạng, với ít nhất 350 chi được biết đến cho đến nay Hầu hết (đặc biệt là Streptomyces ) là sinh vật hoạt sinh, sống trong đất, nhưng chúng cũng được tìm thấy trong nước ngọt, nước mặn và không khí Chúng thường có mặt trong đất với mật độ 10 6 đến 10 9 tế bào trên mỗi gam đất, với Streptomyces chiếm trên 95% tổng số chủng xạ khuẩn được phân lập từ đất [6] Đa số xạ khuẩn là dạng sợi có thể phân nhánh, hiếu khí, hoạt sinh Hệ sợi của xạ khuẩn và hệ sợi của nấm sợi đều phân nhánh và không có vách ngăn, tuy nhiên sợi của xạ khuẩn mảnh hơn sợi nấm mốc Xạ khuẩn phát triển theo mọc chồi phân nhánh (Khoảng 30àm phõn 1 nhỏnh), trong giai đoạn phỏt triển độ dài sợi xạ khuẩn cú độ dài khoảng 11àm/h và chất nhõn của tế bào xạ khuẩn được sắp xếp đều đặn theo chiều dài của sợi Trên môi trường đặc, khuẩn lạc của xạ khuẩn có kích thước thay đổi tuỳ thuộc từng loài và và điều kiện ngoại cảnh Hình thái khuẩn lạc thường cứng, xù xì và có dạng nhung tơ hay mảnh dẻo

Xạ khuẩn đặc biệt là các loài thuộc chi Streptomyces, đã được chứng minh là nguồn hoạt chất có giá trị cao Chúng đã tạo nhiều hoạt chất chống vi trùng cần thiết về mặt lâm sàng, bao gồm streptomycin, actinomycin và streptothricin [6] Khoảng hai phần ba của tất cả các loại kháng sinh đã biết được sản xuất bởi xạ khuẩn, chủ yếu là bởi Streptomyces [6] Người ta tin rằng xạ khuẩn là nguồn gốc của khoảng 61% tất cả các hoạt chất sinh học có nguồn gốc từ vi sinh vật được phát hiện cho đến nay [7]

1.1.2 Xạ khuẩn Streptomyces sp TT8.4

Chủng xạ khuẩn Streptomyces sp TT8.4 được phân lập từ Quốc Oai phát triển tốt trên các môi trường ISP1 đến ISP6, R2YE và NDYE Ở môi trường ISP1 xạ khuẩn cho khuẩn ty khí sinh màu trắng, còn trên môi trường ISP2 đến ISP5 và R2YE, NDYE có màu xám nâu, và cho màu nâu đen trên môi trường ISP6 Chủng Streptomyces sp

TT8.4 có khuẩn ty cơ chất màu vàng hoặc vàng nâu trên môi trường ISP1 đến ISP5, R2YE, NDYE, trên ISP6 cho màu nâu đen Chủng xạ khuẩn không hình thành sắc tố melanin và sắc tố tan trên tất cả môi trường nuôi cấy

Hình 1 1 KTKS của xạ khuẩn Streptomyces sp TT8.4 trên môi trường BFM1

Chủng xạ khuẩn Streptomyces sp TT8.4 nuôi cấy trên môi trường ISP4 lỏng trong 14 ngày được quan sát dưới kính hiển vi với độ phóng đại 1000X, thấy bắt màu tím theo phương pháp nhuộm Gram, khuẩn ty dài, không đứt đoạn, phân nhiều sợi nhánh, có bào tử.

Hoạt chất tự nhiên

1.2.1 Giới thiệu chung về hoạt chất tự nhiên

Các hoạt chất tự nhiên đã được sử dụng trên toàn cầu trong hàng ngàn năm Một số hoạt chất tổng hợp tự nhiên có chức năng hoạt tính sinh học và đã được khám phá cho các ứng dụng khác nhau, đặc biệt là trong ngành công nghiệp thực phẩm và dược phẩm Những chất này là những cấu trúc hóa học thực hiện các chức năng chuyên biệt ở cấp độ sinh học [8]

Trong số nhiều nguồn hóa chất tự nhiên tiềm năng, vi khuẩn được công nhận là một nguồn đặc biệt dồi dào các hoạt chất này Mặc dù có đến 53 ngành vi khuẩn được biết đến, nhưng chỉ có 5 ngành được báo cáo là có khả năng sản xuất chất chống nhiễm trùng Và trong số năm ngành này, vi khuẩn thuộc bộ Actinomycetales của lớp Actinobacteria là nguồn chủ yếu, đóng góp đến khoảng 7000 hoạt chất đã được công bố.

Từ điển các hoạt chất tự nhiên

Từ các nguồn tự nhiên như thực vật, động vật và khoáng chất, hàng nghìn hoạt chất có hoạt tính sinh học đã được chiết tách Trong số các hoạt chất này, nhiều hợp chất đã được phát triển thành thuốc để điều trị một loạt các bệnh ở người và động vật Các hoạt chất này đóng vai trò quan trọng trong ngành y tế, đóng góp vào việc cải thiện sức khỏe và tuổi thọ của chúng ta.

7 nông nghiệp [9],[10] Do đó, xạ khuẩn được coi là nguồn mạnh nhất để sản xuất các chất chuyển hóa thứ cấp, kháng sinh và các hoạt chất có hoạt tính sinh học khác Người ta đã xác định rõ ràng rằng mỗi chủng xạ khuẩn có thể có tiềm năng di truyền để tạo ra 10-20 chất chuyển hóa thứ cấp [11],[12] Nhiều bằng chứng cho thấy xạ khuẩn là loài sản xuất kháng sinh đáng chú ý, tạo ra 75% tổng số sản phẩm đã biết và Streptomyces có vai trò đặc biệt trong sản xuất kháng sinh [13],[14]

Streptomyces mang lại nhiều hiệu quả điều trị bao gồm kháng khuẩn như tetracycline, kháng nấm như amphotericin và thuốc chống ung thư được minh họa bởi adriamycin và tacrolimus ức chế miễn dịch Streptomyces đã được báo cáo đóng góp gần 70% các chất chuyển hóa được mô tả trong xạ khuẩn [15] Streptomycetes và xạ khuẩn liên quan tiếp tục là nguồn hữu ích của các chất chuyển hóa thứ cấp mới với một loạt các hoạt động sinh học mà cuối cùng có thể tìm thấy các ứng dụng như chất chống nhiễm trùng, chất chống ung thư hoặc các hoạt chất hữu ích về mặt dược phẩm khác

1.2.2 Quá trình sinh tổng hợp hoạt chất thứ cấp ở vi sinh vật

Quá trình sinh tổng hợp hoạt chất thứ cấp ở vi sinh vật là quá trình sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học từ các nguyên liệu khác nhau Các hoạt chất thứ cấp ở vi sinh vật thường được chia các nhóm là: Polyketide I, Polyketide II, Polyketide II, Hybrid nonribosomal peptides – Polyketide, Nonribosomal Peptide Synthetase, Terpen, Đối với mỗi một nhóm hoạt chất thì con đường trao đổi chất cuẩ chúng sẽ có sự khác biệt Dưới đây là quá trình sinh tổng hợp của một số hoạt chất tự nhiên đã được nghiên cứu

Dihydrochalcomycin là một loại kháng sinh có vai trò quan trọng trong điều trị nhiễm trùng do vi khuẩn Gram (+), Gram (-) Chúng được tổng hợp từ chủng Streptomyces sp KCTC 0041BP thông qua nhóm gen PKS 1 gồm 32 đoạn ORF Quá trình này được minh họa trong Hình 1.2.

Hình 1 2 Con đường sinh tổng hợp Dihydrochalcomycin

Doxorubicin (DXR) là một polyketide loại anthracycline Nó được sản xuất bởi Streptomyces peucetius ATCC 27952 Giống như quá trình sinh tổng hợp các chất chuyển hóa thứ cấp khác ở các loài Streptomyces, quá trình sinh tổng hợp DXR được điều hòa chặt chẽ Mức độ sản xuất DXR rất thấp được duy trì trong tự nhiên.

Hình 1 3 Con đường sinh tổng hợp Doxorubicin

Cụm gen sinh tổng hợp DXR/DNR ∼40-kb chứa chứa 37 khung đọc mở Quá trình sinh tổng hợp DXR ở đây chủng được hoàn thành trong ba giai đoạn: (a) hình thành ε-rhodomycinone, (b) hình thành thymidine diphosphate (TDP)-L-daunosamine, và (c) glycosyl hóa sau đó là sau sửa đổi (methyl hóa, decarboxyl hóa và hydroxyl hóa)

Daptomycin là một loại kháng sinh được tổng hợp từ chủng xạ khuẩn

Streptomyces roseosporus, được sử dụng để điều trị nhiễm trùng da và cấu trúc da do vi khuẩn gram dương gây ra, cũng như điều trị nhiễm khuẩn huyết do các chủng của vi khuẩn S Aureus gây ra Quá trình tổng hợp daptomycin bắt đầu với các enzyme NRPS (Non-Ribosomal Peptide Synthetases) DptA, DptBC và DptD, mỗi enzyme này đều có các miền xúc tác riêng biệt Các cụm gen mã hoá cho daptomycin thì bào gôm tổng

10 cộng 43 miền xúc Quá trình sinh tổng hợp daptomycin được thể hiện ở hình 1.4 tác.

Hình 1 4 Con đường sinh tổng hợp daptomycin của S roseosporus

Himastatin là một kháng sinh peptide vòng lớn có cấu trúc đồng âm được phân lập từ Streptomyces hisastatinicus Khang sinh này ức chế vi khuẩn gram(+), bao gồm Staphylococcus vàng kháng methicillin nhưng không phải vi khuẩn gram(-) Nó cũng gây độc tế bào đối với tế bào khối u của động vật có vú Quá trình sinh tổng hợp được thể hiện ở hình 1.5

Hình 1 5 Con đường sinh tổng hợp Himastatin

Các phản ứng sinh tổng hợp Himastatın được xúc tác bởi các P450 HmtT, HmtN và HmtS Quá trình epoxid hóa đặc hiệu vùng và lập thể được xúc tác bởi HmtT liên kết đôi C2/C3 của vòng indole có nguồn gốc từ L-tryptophan, và quá trình tạo vòng tiếp theo để tạo thành nửa hexahydropyrroloindole, quá trình hydroxyl hóa y của axit piperazic (Pip) được xúc tác bởi HmtN và liên kết thơm biaryl giữa các depsipeptide để tạo ra các monome dimer hoạt động được xúc tác bởi dạng HmtS của Humastatin

Phenalinolactones là các glycosid terpene được sản xuất bởi Streptomyces sp

Sinh tổng hợp phenalinolactones diễn ra qua bốn giai đoạn chính: (1) Xây dựng và mở rộng khung xương terpene từ phosphoenolpyruvate; (2) Biến đổi chuỗi carbon từ phosphoenolpyruvate thành vòng ɤ-butyrolactone; (3) Tổng hợp L-amicetose và pyrrole-2-carboxylic acid; (4) Điều chỉnh và chuyển nhóm chức ở bước cuối cùng.

Hình 1 6 Con đường sinh tổng hợp Phenalinolactones

 Giới thiệu chung về kháng sinh

Theo Waksman (1942), có thể định nghĩa như sau: “Kháng sinh là những sản phẩm trao đổi chất tự nhiên được các vi sinh vật tạo ra có tác dụng ức chế phát triển hay tiêu diệt chọn lọc đối với các vi sinh vật khác”

Tuy nhiên định nghĩa này chưa đề cập đến các các hoạt chất hoá học, kháng sinh từ thực vật, kháng sinh bán tổng hợp có tác dụng tiêu diệt chọn lọc các vi sinh vật Ngày nay, chung ta có thể định nghĩa như sau: “Kháng sinh là tất cả các hoạt chất có nguồn gốc tự nhiên, tổng hợp có tác dụng ức chế hoặc tiêu diệt chọn lọc đối với các vi sinh vật gây bệnh mà không có hoặc hầu như không có tác dụng với con người, động vật và thực vật bằng con đường cung cấp chung” [21]

Giải trình tự genome

1.3.1 Giới thiệu chung về giải trình tự genome

Streptomyces thường chứa một nhiễm sắc thể lớn và tuyến tính bao gồm hơn 20 cụm gen sinh tổng hợp chất chuyển hóa thứ cấp và ít hơn 10% cụm gen sinh tổng hợp chất chuyển hóa thứ cấp được biểu hiện [26, 27] Ngày nay, các phương pháp, kỹ thuật mới và mạnh mẽ đã được phát triển để khai thác bộ gen ở Streptomyces

 Giải trình tự thế hệ đầu tiên

Giải trình tự thế hệ thứ nhất ban đầu được phát triển bởi Sanger vào năm 1975 (phương pháp chấm dứt chuỗi) và song song bởi Maxam và Gilbert vào năm 1977 (phương pháp giải trình tự hóa học) [28, 29, 30] Từ các phương pháp thế hệ đầu tiên này, giải trình tự Sanger cuối cùng đã chiếm ưu thế do nó ít phức tạp hơn về mặt kỹ thuật và dễ mở rộng quy mô hơn

Hình 1 7 Giải trình tự gen bằng trình tự Sanger [31]

Bốn ống nghiệm chứa 4 loại ddNTP khác nhau được đánh dấu đồng vị phóng xạ đồng thời được thực hiện phản ứng tổng hợp Sau đó sản phẩm của 4 ống nghiệm được điện di hiện hình đồng vị phóng xạ trên cùng một bản gel để quan sát các band DNA Căn cứ vào vị trí các vạch quan sát được trên bản gel mà xác định trình tự các nucleotide theo chiều từ 5 -3 từ dưới lên trên

Phương pháp này dẫn đến độ dài đọc trung bình khoảng 800 cơ sở, nhưng có thể mở rộng đến trên 1000 cơ sở Dù việc triển khai hoàn toàn tự động là nền tảng chính cho giải trình tự ban đầu của bộ gen người, nhưng hạn chế của phương pháp này là thông lượng thấp và chi phí cao, khiến việc giải trình tự bộ gen người đầu tiên mất khoảng 10 năm và 3 tỷ đô la.

 Giải trình tự thế hệ thứ 2

Các công cụ thương mại của SGS xuất hiện vào năm 2005 do thông lượng thấp và chi phí cao của các phương pháp thế hệ đầu tiên Để giải quyết vấn đề này, các công cụ của SGS đạt được thông lượng cao hơn nhiều bằng cách sắp xếp song song một số lượng lớn các phân tử ADN Với hầu hết các công nghệ của SGS, hàng chục nghìn sợi giống hệt nhau được neo vào một vị trí nhất định để được đọc trong một quy trình bao gồm các hoạt động quét và rửa liên tiếp

Quy trình giải trình tự „wash-and-scan' liên quan đến việc cho thuốc thử vào liên tục, chẳng hạn như các nucleotide được đánh dấu, kết hợp các nucleotide vào chuỗi ADN, dừng phản ứng kết hợp, rửa sạch thuốc thử dư thừa, quét để xác định các bazơ được kết hợp và cuối cùng là xử lý chuỗi mới Các cơ sở được kết hợp để chuẩn bị mẫu ADN cho chu kỳ ' wash-and-scan' tiếp theo [35] Chu kỳ này được lặp lại cho đến khi phản ứng không còn khả thi Các vị trí neo ADN có thể có mật độ các đoạn ADN rất cao, dẫn đến thông lượng tổng thể cực kỳ cao và kết quả là chi phí thấp cho mỗi cơ sở được xác định khi các thiết bị đó chạy ở công suất cao Ví dụ: công cụ HiSeq 2000 của Illumina có thể tạo ra tối đa 300 gigabase dữ liệu trình tự trong một lần chạy

Thời gian cho ra kết quả đối với các phương pháp SGS này thường lâu (thường mất nhiều ngày), do cần có số lượng lớn các chu trình quét và rửa Hơn nữa, vì sản lượng từng bước khi thêm từng bazơ là