DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Một số mô hình nghiên cứu phổ biến sử dụng các chất gây Bảng 1.2 Các tác nhân và thông số đánh giá được sử dụng phổ biến trong các mô hình gây độc tế bào ga
TỔNG QUAN
Tổng quan về tổn thương gan
1.1.1 Cấu tạo và chức năng gan
Gan là cơ quan nội tạng lớn nhất trong cơ thể, gồm hai thùy phải và trái, được bao bọc bởi bao Glison Đơn vị chức năng của gan là tiểu thùy, có kích thước từ 0,5 – 1 mm, với tĩnh mạch trung tâm và các dãy tế bào gan lan tỏa như hình nan hoa Giữa các tiểu thùy có khoảng cửa chứa nhánh động mạch gan, tĩnh mạch cửa và ống mật.
Gan nhận máu từ hai nguồn chính: tĩnh mạch cửa (75%) và động mạch gan (25%) Ở người trưởng thành, gan chiếm khoảng 2% trọng lượng cơ thể và thực hiện nhiều chức năng quan trọng như hỗ trợ trao đổi chất, miễn dịch, tiêu hóa, giải độc và dự trữ vitamin Là một cơ quan thiết yếu, gan đóng vai trò trung tâm trong quá trình hấp thu và chuyển hóa chất dinh dưỡng, đồng thời thải trừ các chất độc hại trước khi đưa vào hệ tuần hoàn.
Gan thực hiện nhiều chức năng quan trọng, bao gồm bài tiết mật, chuyển hóa bilirubin, và điều chỉnh các chức năng liên quan đến máu và mạch máu Ngoài ra, gan còn tham gia vào việc chuyển hóa chất dinh dưỡng, giải độc các chất độc hại, hormon và thuốc, đồng thời dự trữ khoáng chất và vitamin như sắt, đồng và các loại vitamin khác.
A, D, E, K, B12), (7) Chức năng nội tiết (hoạt hóa vitamin D, chuyển hóa hormon tuyến giáp, bài tiết angiotensinogen, chuyển hóa hormon), (8) Chức năng miễn dịch (thành phần của hệ thống lưới nội mô, bất hoạt chất độc và thuốc) [54]
1.1.2 Các bệnh lý về gan
Bệnh lý gan có thể được phân loại theo thời gian tổn thương thành hai loại chính: tổn thương cấp tính và mạn tính, dựa trên các bất thường trong chức năng gan và kết quả xét nghiệm sinh hóa Ngoài ra, bệnh lý gan còn được phân loại theo nguyên nhân, bao gồm virus, vi khuẩn, ký sinh trùng, bệnh chuyển hóa do gen, bệnh gan do thuốc hoặc chất độc, nguyên nhân tự miễn, vấn đề mạch máu và ung thư.
Phân loại bệnh lý gan cũng có thể được trình bày theo tình trạng bệnh phổ biến thường gặp [9]:
Viêm gan là một bệnh lý có nhiều nguyên nhân, phổ biến nhất là do virus hoặc nghiện rượu Trong số các loại viêm gan virus, viêm gan B, A và C là thường gặp nhất Đặc biệt, viêm gan B và C có khả năng tiến triển thành viêm gan mạn tính, dẫn đến xơ gan.
Xơ gan là tình trạng tổn thương gan mạn tính không thể hồi phục, gây suy giảm hoạt động tế bào gan do sự hình thành quá nhiều mô sẹo Sự tắc nghẽn lưu thông máu dẫn đến tăng áp lực tĩnh mạch cửa, gây ra các biến chứng nghiêm trọng như phát triển tuần hoàn bàng hệ, giãn tĩnh mạch, cổ trướng, rối loạn đông máu, loãng xương và ung thư gan.
Ung thư gan là tình trạng phát sinh các khối u ác tính trong gan, gây hại cho tế bào gan và ảnh hưởng đến chức năng bình thường của gan Có hai loại khối u gan: khối u nguyên phát và khối u di căn, trong đó ung thư biểu mô tế bào gan là dạng phổ biến nhất của ung thư gan nguyên phát Đáng lưu ý, bệnh nhân ung thư gan do di căn thường có tỷ lệ tử vong cao, với hầu hết trường hợp không sống quá một năm sau khi được chẩn đoán.
Tổn thương gan do thuốc
Tổn thương gan do thuốc (DILI) xảy ra khi các loại thuốc, bao gồm thuốc kê đơn, thuốc không kê đơn, chế phẩm bổ sung, sản phẩm thảo dược và các chất ngoại lai, gây ra bất thường trong các xét nghiệm gan hoặc rối loạn chức năng gan mà không thể giải thích bằng các nguyên nhân khác.
Có 2 loại DILI: nội tại và đặc ứng DILI nội tại là độc tính trên gan do thuốc có thể dự đoán trước và liên quan đến liều (ví dụ: paracetamol), DILI đặc ứng ít xảy ra hơn, ít liên quan đến liều và có các biểu hiện đa dạng hơn
1.1.3 Dịch tễ các bệnh về gan
Theo Báo cáo Viêm gan Toàn cầu năm 2024 của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), số ca tử vong do viêm gan virus đang gia tăng, từ 1,1 triệu người vào năm 2019 lên 1,3 triệu người vào năm 2022 Mỗi ngày, khoảng 3.500 người chết vì viêm gan B và C, với 254 triệu người mắc viêm gan B và 50 triệu người mắc viêm gan C trên toàn cầu vào năm 2022, trong đó có 2,2 triệu ca nhiễm mới Việt Nam nằm trong nhóm 28 quốc gia có tỷ lệ lưu hành virus viêm gan B cao nhất thế giới vào năm 2020.
Theo báo cáo của Bộ Y tế và Tổ chức Y tế Thế giới năm 2017, Việt Nam có khoảng 7,8 triệu người mắc vi rút viêm gan B mãn tính và gần 1 triệu người nhiễm vi rút viêm gan C mãn tính.
Theo báo cáo GLOBOCAN 2020, trên toàn cầu có khoảng 905.700 người được chẩn đoán mắc ung thư gan và 830.200 ca tử vong do bệnh này Ung thư gan là một trong ba nguyên nhân hàng đầu gây tử vong do ung thư ở 46 quốc gia và nằm trong top năm nguyên nhân tử vong do ung thư ở 90 quốc gia Tại Việt Nam, ung thư gan là loại ung thư phổ biến nhất và là nguyên nhân tử vong hàng đầu trong các bệnh ung thư, với dự đoán số ca mới sẽ tăng 55,0% từ năm 2020 đến năm 2040, lên tới 1,4 triệu người nếu tỷ lệ mắc mới không thay đổi Bên cạnh đó, tổn thương gan do thuốc cũng đang gia tăng, với hơn 50% trong số 2000 ca suy gan cấp hàng năm ở Mỹ liên quan đến thuốc, trong đó 37% là do paracetamol.
Tổng quan về các mô hình đánh giá tác dụng bảo vệ gan
Các mô hình gây tổn thương gan in vivo thường gặp có thể được phân loại thành ba nhóm phương pháp chính: (1) Mô hình sử dụng độc tố, (2) Mô hình phẫu thuật, và (3) Mô hình lây nhiễm.
Mô hình phẫu thuật gan bao gồm các kỹ thuật như cắt bỏ một phần hoặc toàn bộ gan, thắt động mạch gan kết hợp với tạo rãnh cửa chủ, và phương pháp gây thiếu máu cục bộ tạm thời Ngoài ra, mô hình gây độc gan thông qua lây nhiễm có thể bao gồm các hình thức viêm gan virus hoặc viêm do kích hoạt con đường chết tế bào theo chương trình.
Mô hình sử dụng độc tố là phương pháp phổ biến để nghiên cứu tổn thương gan, thường áp dụng các hóa chất như paracetamol, carbon tetraclorid, D-galactosamin và thioacetamid Trong mô hình này, động vật thí nghiệm được cho sử dụng các chất độc với liều lượng khác nhau để gây tổn thương gan Các chất thử nghiệm tác dụng bảo vệ gan được sử dụng cùng, trước hoặc sau khi cho chất gây độc Đánh giá tổn thương và phục hồi gan được thực hiện qua việc định lượng các enzym chỉ điểm, bilirubin, và các thay đổi mô bệnh học cũng như thông số sinh hóa ở gan Sự gia tăng của các enzym như GPT, GOT và phosphatase kiềm trong huyết thanh chỉ ra sự tổn thương tế bào gan Hiệu quả điều trị của thuốc đối với từng loại chất gây độc có sự khác biệt, do đó cần kiểm tra hiệu quả của từng loại thuốc bằng nhiều phương pháp khác nhau Bảng 1.1 trình bày một số mô hình nghiên cứu phổ biến sử dụng các chất gây độc gan cùng với ưu nhược điểm của từng mô hình.
Mô hình in vivo là phương pháp nghiên cứu phổ biến, mang lại độ tương quan cao nhất với diễn biến thực tế trong cơ thể con người Phương pháp này cho phép đánh giá đầy đủ các thông số sinh hóa và mô bệnh học, góp phần quan trọng trong việc hiểu biết về các quá trình sinh lý và bệnh lý.
Mô hình in vivo cung cấp cái nhìn sâu sắc về tác động của hệ thống miễn dịch và hệ thần kinh trung ương đối với các bệnh lý gan.
Phương pháp nghiên cứu này gặp phải nhược điểm về kinh phí và đạo đức, do yêu cầu số lượng lớn mẫu thử và động vật nghiên cứu, cùng với thời gian nghiên cứu kéo dài Mặc dù đã phát triển các mô hình in vivo để mô phỏng bệnh lý gan, vẫn tồn tại sự khác biệt về sinh lý bệnh phân tử giữa động vật thí nghiệm và con người, cũng như sự khác nhau giữa các cá thể trong mô hình nghiên cứu.
Bảng 1.1 Một số mô hình nghiên cứu phổ biến sử dụng các chất gây độc gan [28]
Mô hình Động vật Cơ chế Ưu điểm Hạn chế TLTK
Lợn, chó, thỏ, chuột nhắt, chuột cống
Chuyển hóa qua CYP450 tạo thành NAPQI có khả năng gây độc cho gan
Liên quan trực tiếp đến lâm sàng, độc tính phụ thuộc liều
Không hiệu quả trên chuột cống và yêu cầu gây cảm ứng CYP450 hoặc gây cạn kiệt GSH trước khi tiến hành gây độc
Lợn, chó, thỏ, chuột nhắt, chuột cống
Gây ra cạn kiệt uridin nội bào gây ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp ARN
Hiệu quả gây độc tốt
Không liên quan đến lâm sàng và đặc điểm tổn thương trên mô bệnh học khác biệt với hầu hết các tác nhân khác
Chó, thỏ, chuột nhắt, chuột cống
Chuyển hóa qua CYP450 tạo ra các gốc triclomethyl và triclomethyl peroxid
Gây ra tổn thương gan lan rộng
Không liên quan đến lâm sàng, có sự khác biệt đáng kể giữa các loài động vật và khó gây bệnh não gan
Thỏ, chuột cống, chuột nhắt
Chuyển hóa tạo thành thioacetamid sulfoxid (TASO) và TASO(2), gắn với protein và gây bất hoạt chúng
Phù hợp để nghiên cứu bệnh não - gan
Có sự khác biệt đáng kể giữa các loài động vật và nguy cơ phơi nhiễm cao với người thực hiện
1.2.2.1 Các mô hình đánh giá tác dụng bảo vệ gan in vitro
Tế bào gan nguyên phát của con người được xem là tiêu chuẩn vàng trong mô hình nuôi cấy tế bào gan in vitro do chức năng tương tự như gan người, mang lại kết quả dự đoán cao trong nghiên cứu dược lý và độc tính Tuy nhiên, những hạn chế như tính sẵn có thấp, sự thay đổi kiểu hình nhanh chóng và đời sống ngắn của tế bào khi nuôi cấy lâu dài dẫn đến việc mất dần đặc điểm tế bào gan, gây khó khăn trong việc lặp lại thí nghiệm và ảnh hưởng đến chất lượng nghiên cứu.
Các dòng tế bào từ khối ung thư gan người được ưa chuộng trong nghiên cứu in vitro nhờ vào tính sẵn có, khả năng tăng sinh cao và sự trao đổi chất ổn định Tuy nhiên, tiềm năng tăng sinh này thường đi kèm với việc mất các chức năng biệt hóa, dẫn đến thiếu sót trong biểu hiện chức năng Do đó, việc ứng dụng các dòng tế bào gan trong nghiên cứu in vitro cần xem xét các đặc tính chức năng cụ thể của từng dòng tế bào.
Các dòng tế bào gan bất tử phổ biến như HepG2, Hep3B, PLC/PRF/5, Huh7, HBG, Fa2N-4 và HepaRG thường được sử dụng trong nghiên cứu Trong đó, tế bào ung thư biểu mô gan HepG2 được ưa chuộng cho các nghiên cứu in vitro về tính gây độc tế bào nhờ vào tỷ lệ tăng sinh cao, hình thái giống tế bào gan và khả năng thực hiện nhiều chức năng gan biệt hóa.
❖ Về thông số đánh giá
Các thông số đánh giá tình trạng tổn thương tế bào
- Tỉ lệ tế bào sống được định nghĩa là số lượng tế bào khỏe mạnh trong một mẫu
Việc đo lường tỷ lệ tế bào sống là rất quan trọng trong tất cả các phương pháp nuôi cấy tế bào Xét nghiệm khả năng sống của tế bào giúp đánh giá tác động của các yếu tố đến sự phát triển của tế bào.
Lactat dehydrogenase (LDH) là một enzym quan trọng có mặt trong tất cả các tế bào và thường được giải phóng vào dịch nuôi cấy khi màng tế bào bị tổn thương Sự giải phóng LDH nhanh chóng này là dấu hiệu đặc trưng của các tế bào trải qua quá trình chết theo chương trình, hoại tử, và các dạng tổn thương tế bào khác.
Do đó, LDH được coi là một chỉ số đánh giá tình trạng hoại tử tế bào
Transaminase (AST, ALT) là các enzym quan trọng trong bào tương của tế bào gan Khi tế bào gan bị tổn thương, tính thấm của màng tế bào sẽ thay đổi, dẫn đến sự gia tăng nồng độ các enzym này.
Akalin phosphatase (ALP) chủ yếu được sản xuất tại gan và xương Khi nồng độ ALP tăng mà không có dấu hiệu bệnh lý ở xương, cần chú ý đến các bệnh lý gan mật, đặc biệt trong trường hợp tắc nghẽn gan mật.
AST, ALT và ALP là các chỉ số phổ biến trong việc đánh giá chức năng gan, trong khi LDH thường được sử dụng để đo lường độc tính tế bào trong các mô hình in vitro.
Các thông số đánh giá khả năng chống oxy hóa
Glutathion (GSH) là một tripeptid quan trọng, đóng vai trò trong việc chống lại stress oxy hóa và peroxy hóa lipid Hàm lượng GSH có thể bị cạn kiệt do stress oxy hóa, và mức độ hoạt động của enzym này được sử dụng để định lượng stress oxy hóa trong tế bào.
Tổng quan về cây Xấu hổ
Xấu hổ có tên khoa học là Mimosa pudica L.(Laajvanti), thuộc họ Đậu
(Fabaceae) Ở Việt Nam, Xấu hổ còn có tên gọi khác là: cây trinh nữ, cây thẹn, hàm tu thảo, cây mắc cỡ [3]
Hình 1.2 Hình ảnh về cây Xấu hổ
Cây nhỏ mọc hoang ven đường, có thân gai hình móc Lá cây là dạng 2 lần kép lông chim, với cuống phụ xếp như chân vịt và có khả năng cụp xuống khi chạm vào Cuống chung dài 4 cm, gầy và nhiều lông, trong khi cuống phụ có 2 đôi lông trắng cứng Lá chét nhỏ, từ 15-20 đôi, gần như không có cuống.
Hoa có màu tím đỏ, hình đầu trái xoan, với quả dài 2cm và rộng 3mm, tạo thành hình ngôi sao Hạt quả hẹp lại ở giữa và có lông cứng ở mép Hạt gần như hình trái xoan, kích thước dài 2mm và rộng 1,5mm Cụm hoa mọc ở kẽ lá, gồm nhiều hoa nhỏ xếp thành đầu tròn màu tím hồng, với đài nhỏ hình đấu và tràng có 4 cánh dính nhau ở nửa dưới Hoa có 4 nhị rất mảnh và bầu 4 noãn Thời gian ra hoa và quả thường vào khoảng tháng 6 đến tháng 8 hàng năm.
1.3.3 Phân bố và bộ phận dùng Ở Việt Nam, Xấu hổ phân bố rải rác khắp nơi, từ đồng bằng đến miền núi có độ cao dưới 1000m [67]
Vào mùa hè, khi cây phát triển xanh tốt, phần trên mặt đất của cây được thu hái Sau khi cắt lấy, bộ phận này sẽ được rửa sạch và phơi khô để bảo quản.
Rễ có thể đào quanh năm, rửa sạch, thái mỏng, phơi hay sấy khô [66], [67]
Dịch chiết từ lá cây chứa hàm lượng flavonoid và phenolic cao nhất, vượt trội hơn so với các bộ phận khác của cây Sự khác biệt rõ rệt giữa flavonoid và phenolic toàn phần được ghi nhận, với flavonoid chiếm ưu thế hơn trong các dịch chiết Ngoài ra, dịch chiết toàn cây còn phát hiện các hợp chất như 2'-hydroxy flavanon, 6-hydroxy flavon, ethyl gallat, catechin và acid gallic.
The extract of the leaves contains several active components, including mimosin, terpenoids, flavonoids, glycosides, alkaloids, quinine, phenols, tannins, saponins, and coumarin The roots of the plant are rich in flavonoids, phytosterols, alkaloids, amino acids, tannins, glycosides, and fatty acids Additionally, the seed extract includes phenols, flavonoids, d-xylose, and d-glucuronic acid Notably, the Mimosa pudica plant also contains a significant amount of selenium.
1.3.5 Một số tác dụng dược lý
Cây Xấu hổ, theo y học cổ truyền, được biết đến với nhiều công dụng chữa bệnh như điều trị bệnh phong, giảm viêm, và hỗ trợ trong các trường hợp hen suyễn, bệnh bạch cầu, cùng các bệnh về máu và phụ khoa Nước sắc từ rễ cây này còn được sử dụng để súc miệng, giúp giảm đau răng hiệu quả Hơn nữa, cây Xấu hổ cũng đóng vai trò quan trọng trong việc điều trị tiêu chảy, lỵ amip và nhiễm trùng đường tiết niệu.
Sau đây là một số tác dụng dược lý của cây Xấu hổ đã được nghiên cứu:
❖ Tác dụng bảo vệ gan của cây Xấu hổ
Cây Xấu hổ đã được nghiên cứu và chứng minh có khả năng bảo vệ gan trong các mô hình động vật thí nghiệm, đặc biệt khi tiếp xúc với các tác nhân độc hại như carbon tetraclorid, paracetamol và ethanol.
Nghiên cứu của Ayan Purkayastha và cộng sự cho thấy chiết xuất ethanol từ lá Mimosa pudica với liều 400mg/kg có khả năng ngăn ngừa đáng kể sự gia tăng nồng độ GOT, GPT, ALP và bilirubin trong huyết thanh, đồng thời cải thiện cấu trúc gan theo kiểm tra mô bệnh học Hiệu quả này tương đương với Silymarin liều 100mg/kg mà không ghi nhận tác dụng phụ Một nghiên cứu khác của Kumaresan và cộng sự cũng xác nhận tác dụng bảo vệ gan của dịch chiết Mimosa pudica với liều 1000mg/kg, cho kết quả khả quan Đối với tác nhân paracetamol, Kowsalya và cộng sự đã chứng minh rằng dịch chiết Mimosa pudica giúp cải thiện tổn thương mô bệnh học gần mức bình thường và giảm nồng độ bilirubin trong huyết thanh ở chuột bị ngộ độc paracetamol với liều 100mg/kg trong 7 ngày.
Nghiên cứu về tác dụng bảo vệ gan của Xấu hổ hiện còn hạn chế cả ở Việt Nam và trên thế giới, đặc biệt là trong các mô hình in vitro Hơn nữa, các cơ chế bảo vệ tế bào gan của Xấu hổ vẫn chưa được làm rõ Do đó, cần thiết phải triển khai mô hình đánh giá tác dụng bảo vệ gan in vitro để bổ sung cho các kết quả từ các nghiên cứu in vivo.
Nghiên cứu của Nair và cộng sự đã chỉ ra tác dụng chống viêm của Mimosa pudica trên chuột thí nghiệm thông qua mô hình gây phù nề bàn chân do Carrageenan Kết quả cho thấy, việc sử dụng dịch chiết Xấu hổ với các liều lượng 200 mg/kg, 400 mg/kg và 800 mg/kg đã làm giảm đáng kể tình trạng viêm so với nhóm đối chứng.
Nghiên cứu của Goli và cộng sự cho thấy rằng việc sử dụng các liều lượng dịch chiết Xấu hổ 50 mg/kg, 100 mg/kg và 200 mg/kg mang lại kết quả tương tự.
❖ Tác dụng chống lo âu, trầm cảm
Nghiên cứu của Molina và cộng sự chỉ ra rằng việc sử dụng dịch chiết từ cây Mimosa pudica với liều 6,0 mg/kg và 8,0 mg/kg trong 30 ngày đã làm giảm tình trạng bất động trong bài kiểm tra bơi cưỡng bức trên mô hình chuột thí nghiệm Kết quả này tương tự như tác dụng của các chất chống trầm cảm ba vòng như clomipramin và desipramin, cho thấy Mimosa pudica có khả năng chống trầm cảm hiệu quả.
Tamilarasi và Ananthi đã nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết ethanol từ lá cây Xấu hổ, cho thấy Mimosa pudica có khả năng chống lại bốn loại vi khuẩn: Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, Klebsiella pneumonia, và nấm Aspergillus flavus cùng Trichophyton rubrum Phân tích hóa thực vật cho thấy hoạt tính kháng khuẩn này có liên quan đến các thành phần alkaloid và tannin có trong dịch chiết.
❖ Tác dụng hạ đường huyết
Nghiên cứu của Yupparach và cộng sự đã chỉ ra rằng Mimosa pudica có tác dụng chống đái tháo đường khi được sử dụng với liều 500 mg/kg trên mô hình chuột tiểu đường gây ra bởi streptozotocin 65 mg/kg trong 8 tuần Kết quả cho thấy Mimosa pudica giúp giảm đáng kể mức đường huyết lúc đói ở chuột thí nghiệm.
❖ Tác dụng hạ lipid máu
Nghiên cứu của Sowmya và cộng sự cho thấy dịch chiết ethanol từ cây Xấu hổ có khả năng hạ lipid máu hiệu quả, giảm đáng kể nồng độ triglycerid, LDL, VLDL và cholesterol, đồng thời làm tăng mức HDL trong huyết thanh, tương tự như tác dụng của thuốc lovastatin.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Dòng tế bào ung thư biểu mô gan HepG2, được cung cấp bởi ATCC (American Type Culture Collection), hiện đang được bảo quản trong nitơ lỏng tại Bộ môn Dược lý, Trường Đại học Dược Hà Nội.
Vào tháng 11 năm 2021, các bộ phận trên mặt đất của cây Xấu hổ (Mimosa pudica) đã được thu gom tại Hà Nội, Việt Nam Nguyên liệu này được giám định bởi Giáo sư Trần Thế Bách từ Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, và hiện đang được lưu trữ tại phòng lưu mẫu của viện.
Bộ phận trên mặt đất của cây Xấu hổ được rửa sạch và sấy khô trước khi nghiền thành bột Mỗi 50,04g bột sẽ được chiết bằng 200ml etanol 90% qua phương pháp đun hồi lưu, thực hiện hai lần với thời gian mỗi lần là 1 giờ Sau khi gộp các dịch chiết, chúng sẽ được cô đặc dưới áp suất giảm, thu được cao mềm với 4,66g bột nhão bán rắn màu nâu, có hàm ẩm 11,8% và hiệu suất chiết đạt 10,55%.
Để chuẩn bị cho các thử nghiệm, cao mềm Xấu hổ được hòa tan trong dung môi DMSO với nồng độ gốc 50mg/ml và bảo quản ở -20℃ Khi cần xử lý tế bào, tiến hành rã đông và pha loãng dung dịch gốc bằng môi trường nuôi cấy để đạt được các nồng độ xử lý chỉ định.
Nguyên vật liệu nghiên cứu
- Hóa chất trong nuôi cấy tế bào (PAN, Gibco, Mỹ): Môi trường nuôi cấy RPMI
1640, DMEM, huyết thanh thai bò FBS 10%, kháng sinh/kháng nấm Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B, dung dịch Trypsin 0,25%/0,53 mM EDTA
- Albumin huyết thanh bò (Bovine serum albumin, BSA) (Gibco, Mỹ)
- Amoni molybdat, acid thiobarbituric, 5,5’-dithiobus(2-nitrobenzoic acid), 3- (4,5-dimethylthiazol- 2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid (MTT)
- Hydrogen peroxid (Fisher Scientific, Anh)
- Acid acetic (Xilong Scientific, Trung Quốc)
- Bộ kit định lượng AST, ALT (Erba Mannheim, Đức)
- Bộ kit định lượng LDH (Promega, Mỹ)
- Bộ kit định lượng Protein BCA (Thermo Scientific, Mỹ)
- Paracetamol (Dược Trung Ương Mediplantex, Việt Nam)
2.2.2 Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu
- Đĩa nuôi cấy tế bào 6 giếng, 96 giếng (SPL, Hàn Quốc), đĩa nuôi cấy 10mm (Corning, Mỹ)
- Buồng đếm tế bào (Marienfeld, Đức)
- Các loại pipet: pipet đa kênh, pipet đơn (Eppendorf, Đức)
- Ống Falcon có thể tích 15mL, 50mL (SPL, Hàn Quốc)
- Tủ hút vô trùng (Telstar, Tây Ban Nha)
- Tủ ấm nuôi cấy tế bào (Incusafe, Nhật Bản)
- Bể cách thủy (Shel Lab, Mỹ)
- Máy ly tâm (Beckman Coulter, Mỹ)
- Nồi hấp tiệt trùng (Sturdy, Mỹ)
- Máy cất nước hai lần (Aquatron, Thụy Điển)
- Kính hiển vi (Zeiss, Đức)
- Tủ -20℃, tủ -80℃ (Sanyo, Nhật Bản)
- Máy siêu âm (Wisestir HS-30E, Mỹ)
- Máy ly tâm lạnh (Eppendorf, Đức)
- Máy đọc đĩa (Thermal Fisher, Mỹ)
- Cân phân tích 5 số (AND GR-200, Nhật Bản)
Nội dung nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện với hai nội dung chính:
Nội dung 1: Triển khai mô hình gây độc tế bào gan in vitro bằng paracetamol sử dụng dòng tế bào HepG2, bao gồm các bước:
- Thăm dò ảnh hưởng của nồng độ đến khả năng gây độc tế bào gan của paracetamol
- Thăm dò ảnh hưởng của thời gian đến khả năng gây độc tế bào gan bằng paracetamol
- Thẩm định mô hình đã triển khai bằng thuốc chứng dương N-Acetylcystein
Nội dung 2: Áp dụng mô hình đã triển khai để đánh giá sơ bộ tác dụng của Cao chiết
Sơ đồ thiết kế nghiên cứu:
Hình 2.2 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu
Phương pháp nghiên cứu
2.4.1 Phương pháp triển khai mô hình gây độc tế bào gan in vitro bằng paracetamol sử dụng dòng tế bào HepG2
2.4.1.1 Nuôi cấy tế bào và chuẩn bị tế bào cho các thí nghiệm
Tế bào HepG2 được nuôi cấy trong đĩa petri 10 mm với môi trường DMEM đầy đủ (bao gồm 10% huyết thanh nhau thai bò, 1% kháng sinh penicillin/streptomycin và kháng nấm amphotericin B) ở nhiệt độ 37°C, 5% CO2 và 95% độ ẩm Khi tế bào đạt 70% bề mặt đĩa, chúng được cấy chuyển sang đĩa mới hoặc sử dụng cho thí nghiệm Để chuẩn bị, hút môi trường cũ, rửa tế bào bằng dung dịch PBS, tách tế bào bằng trypsin 1X và ủ trong 3 phút Sau đó, trung hòa trypsin bằng môi trường DMEM đầy đủ, đếm tế bào bằng buồng đếm Neubauer và pha loãng trước khi cấy vào đĩa 96 giếng (1×10^4 tế bào/giếng) hoặc đĩa 6 giếng (5×10^5 tế bào/giếng) tùy theo thí nghiệm Cuối cùng, ủ đĩa trong 24 giờ trước khi tiến hành phân tích tiếp theo.
2.4.1.2 Thăm dò ảnh hưởng của nồng độ đến khả năng gây độc tế bào gan của paracetamol
Tế bào được trải trên đĩa 96 giếng và ủ trong tủ ấm trong 24 giờ Sau đó, môi trường cũ được thay thế và tế bào được xử lý bằng paracetamol với nồng độ từ 0,1 mM đến 30 mM trong môi trường DMEM chứa 0,5% FBS Sau 48 giờ ủ, dịch nổi phía trên từng giếng được thu thập để đo hoạt độ LDH trong dịch ngoại bào, trong khi phần tế bào còn lại được sử dụng để đánh giá khả năng sống sót của tế bào thông qua định lượng MTT.
Hình 2.3 Sơ đồ thiết kế thí nghiệm thăm dò ảnh hưởng của nồng độ đến khả năng gây độc tế bào gan của paracetamol
- Thông số đánh giá : Tỉ lệ tế bào sống, hoạt độ LDH
- Tiêu chí lựa chọn nồng độ: Lựa chọn nồng độ paracetamol gây chết khoảng 30-40% tế bào sau 48 giờ
2.4.1.3 Thăm dò ảnh hưởng của thời gian ủ đến khả năng gây độc tế bào gan bằng paracetamol
Tế bào được cấy trải ra đĩa 96 giếng và đĩa 6 giếng tùy thuộc loại thí nghiệm sử dụng.
Trên đĩa 96 giếng, sau 24 giờ ủ tế bào trong tủ ấm, môi trường cũ được thay thế bằng môi trường DMEM chứa 0,5% FBS Tế bào được xử lý bằng paracetamol với nồng độ đã chọn tại các thời điểm 48, 24 và 12 giờ trước khi thu mẫu Sau 48 giờ, dịch trong từng giếng được thu thập để định lượng các thông số AST, ALT, LDH và đo tỷ lệ tế bào sống.
Sau khi ủ tế bào trong 24 giờ trên đĩa 6 giếng, thay môi trường cũ bằng DMEM chứa 0,5% FBS và xử lý tế bào bằng paracetamol với nồng độ đã chọn tại các thời điểm 48, 24, và 12 giờ trước khi thu mẫu Sau 48 giờ, dùng trypsin 1X để tách tế bào, ủ trong tủ ấm 3 phút, sau đó trung hòa trypsin bằng môi trường Tiến hành ly tâm ở 2500 vòng/phút trong 3 phút, loại bỏ dịch nổi để thu khối tế bào và rửa 2 lần với dung dịch PBS Thêm 75 μL PBS chứa 1% Triton X lạnh vào khối tế bào, phá vỡ màng tế bào bằng máy siêu âm Cuối cùng, ly tâm lạnh trong 10 phút với tốc độ 14000 vòng/phút để thu dịch nổi, dùng dịch ly giải tế bào để định lượng hàm lượng MDA, GSH và hoạt độ CAT.
Hình 2.4 Sơ đồ thiết kế thí nghiệm thăm dò ảnh hưởng của thời gian ủ đến khả năng gây độc tế bào gan của paracetamol
Tỉ lệ tế bào sống và hoạt độ các enzyme AST, ALT được xác định thông qua phương pháp định lượng trên đĩa 96 giếng Đồng thời, hàm lượng MDA, GSH và hoạt độ enzyme CAT trong dịch ly giải tế bào được đo lường bằng phương pháp định lượng trên đĩa 6 giếng.
- Tiêu chí lựa chọn thời gian: Lựa chọn thời gian gây độc bằng paracetamol dẫn đến thay đổi rõ rệt đối với các thông số trên
2.4.1.4 Thẩm định mô hình gây độc tế bào gan in vitro bằng chứng dương N-
Tế bào được cấy trải ra đĩa 96 giếng và đĩa 6 giếng tùy thuộc loại thí nghiệm sử dụng
Trên đĩa 96 giếng, sau 24 giờ ủ tế bào trong tủ ấm, môi trường cũ được thay thế bằng môi trường DMEM chứa 0,5% FBS Tế bào được xử lý với các nồng độ 1, 3, 10 mM của chứng dương Sau 2 giờ, paracetamol được thêm vào với nồng độ đã chọn để gây độc Cuối cùng, sau thời gian ủ đã định, dịch từ từng giếng được thu thập để định lượng hoạt độ AST, ALT và đo tỷ lệ tế bào sống.
Sau 24 giờ ủ tế bào trên đĩa 6 giếng trong tủ ấm, tiến hành thay môi trường cũ bằng môi trường DMEM có chứa 0,5% FBS để xử lý tế bào bằng chứng dương Sau 2 giờ, tiến hành gây độc cho tế bào bằng paracetamol với nồng độ đã được chọn.
Sau khi ủ trong thời gian đã xác định, tiến hành thu dịch ly giải tế bào theo hướng dẫn đã nêu Dịch ly giải này sẽ được sử dụng để định lượng các thông số quan trọng như hàm lượng MDA, GSH và hoạt độ CAT.
Hình 2.5 trình bày sơ đồ thiết kế thí nghiệm nhằm thẩm định mô hình gây độc tế bào gan in vitro với sự hiện diện của N-Acetylcystein Thời gian thí nghiệm (n) có thể được điều chỉnh từ 12, 24 đến 48 giờ, tùy thuộc vào kết quả thu được từ các thông số định lượng cụ thể.
+ Tỉ lệ tế bào sống, hoạt độ AST, ALT, hoạt độ LDH (sử dụng định lượng trên đĩa
+ Hàm lượng MDA, GSH, hoạt độ CAT trong dịch ly giải tế bào (sử dụng định lượng trên đĩa 6 giếng)
2.4.2 Áp dụng mô hình đã triển khai để đánh giá sơ bộ tác dụng bảo vệ tế bào gan của cao chiết Xấu hổ
Tế bào được nuôi trên đĩa 96 giếng và sau 24 giờ ủ trong tủ ấm, môi trường cũ được thay thế Tế bào được xử lý bằng cao chiết Xấu hổ với nồng độ từ 1 đến 30 μg/ml trong môi trường DMEM có 0,5% FBS Sau 2 giờ, paracetamol được thêm vào với nồng độ đã chọn để gây độc Cuối cùng, dịch trong từng giếng được thu thập để định lượng các thông số và đo tỉ lệ tế bào sống.
Hình 2.6 trình bày sơ đồ thiết kế thí nghiệm đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan của cao chiết Xấu hổ Thời gian thí nghiệm (n) có thể được điều chỉnh thành 12, 24 hoặc 48 giờ, tùy thuộc vào kết quả thu được từ mô hình cho từng thông số định lượng.
- Thông số đánh giá : Tỉ lệ tế bào sống, hoạt độ AST, ALT
2.4.3 Phương pháp xác định các thông số nghiên cứu
2.4.3.1 Định lượng tế bào sống (MTT) Định lượng tế bào sống (MTT) được thực hiện theo phương pháp của Mossmann kèm theo một số thay đổi phù hợp với điều kiện thực nghiệm tại phòng thí nghiệm
Nguyên tắc Định lượng tế bào sống (MTT) là phương pháp xác định số lượng tế bào sống dựa trên khả năng của MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid) đi qua màng tế bào và bị khử bởi các enzym trong tế bào sống Quá trình này tạo ra formazan dạng kết tinh màu tím, được hòa tan trong DMSO và định lượng bằng cách đo độ hấp thụ tại bước sóng 570 nm Số lượng tế bào sống tỷ lệ thuận với nồng độ formazan, thể hiện qua giá trị mật độ quang của dung dịch.
Cấy tế bào vào đĩa 96 giếng với mật độ 1 × 10^4 tế bào/giếng trong môi trường DMEM đầy đủ ở điều kiện 37℃, 5% CO2 và 95% độ ẩm Sau 24 giờ, loại bỏ môi trường cũ và xử lý tế bào bằng paracetamol, chứng dương hoặc cao chiết dược liệu trong môi trường DMEM chứa 0,5% FBS, với mỗi nồng độ mẫu thử được thực hiện trên 3 giếng và lặp lại 3 lần Sau 48 giờ ủ, thêm 10 μL thuốc thử MTT 5 mg/mL vào mỗi giếng và ủ tiếp trong 2 giờ Sau đó, loại bỏ môi trường và thêm 150 μL dung dịch DMSO để hòa tan tinh thể formazan Cuối cùng, đo mật độ quang (OD) ở bước sóng 570 nm bằng máy đọc đĩa Varioskan Lux.
Tỉ lệ phần trăm tế bào sống sót được tính theo công thức:
2.4.3.2 Phương pháp xác định hoạt độ AST, ALT
AST xúc tác phản ứng giữa L-aspartat và 𝛼-cetoglutarat, tạo ra oxaloacetat và L-glutamat Sau đó, oxaloacetat phản ứng với NADH dưới sự xúc tác của MDH, chuyển đổi thành malat và NAD+.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Kết quả triển khai mô hình gây độc tế bào gan in vitro bằng paracetamol sử dụng dòng tế bào HepG2
3.1.1 Kết quả thăm dò ảnh hưởng của nồng độ đến khả năng gây độc tế bào gan của paracetamol
3.1.1.1 Ảnh hưởng của nồng độ paracetamol đến tỉ lệ tế bào sống Ảnh hưởng của paracetamol đến tỉ lệ tế bào sống được đánh giá bằng phương pháp định lượng tế bào sống MTT Kết quả được biểu diễn trong Hình 3.1
Hình 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ paracetamol đến tỉ lệ tế bào sống
Ghi chú: Dữ liệu được biểu diễn dưới dạng trung bình ± SE; *: Khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng (p < 0,05), n=3
Nghiên cứu cho thấy paracetamol làm giảm tỷ lệ sống của tế bào gan HepG2, với tỷ lệ tế bào sống giảm dần khi nồng độ paracetamol tăng Điều này chứng tỏ rằng tỷ lệ sống của tế bào phụ thuộc vào nồng độ paracetamol gây độc Tại các mức nồng độ 0.3 và 1, tác động của paracetamol càng rõ rệt.
3, 5, 10, 30 mM, tỉ lệ tế bào sống lần lượt là 97,2%, 92,0%, 75,6%, 67,5%, 55,0%, 34,4%
Tỉ l ệ tế b ào s ốn g (% ) (s o vớ i nh óm c h ứ n g)
T ỉ l ệ tế b à o s ốn g ( %) (so với nhóm chứng)
3.1.1.2 Ảnh hưởng của nồng độ paracetamol đến hoạt độ LDH
LDH là chỉ số sinh học quan trọng cho việc xác định tổn thương màng tế bào và sự chết tế bào Hình 3.2 minh họa ảnh hưởng của paracetamol đối với hoạt độ LDH trong môi trường nuôi cấy tế bào gan.
Hình 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ paracetamol đến hoạt độ LDH
Ghi chú: Dữ liệu được biểu diễn dưới dạng trung bình ± SE; *: Khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng (p < 0,05), n=3
Nghiên cứu cho thấy nồng độ paracetamol tăng dần dẫn đến hoạt độ LDH ngoại bào cũng tăng theo Cụ thể, tại nồng độ 5 mM, paracetamol làm tăng hoạt độ LDH gấp 1,32 lần so với nhóm chứng (p=0,019) Tương tự, ở nồng độ 10 mM và 30 mM, hoạt độ LDH lần lượt tăng gấp 1,80 lần (p=0,018) và 2,15 lần (p=0,002) so với nhóm chứng Ngược lại, không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về hàm lượng LDH được giải phóng giữa các nồng độ paracetamol 0,3 mM, 1 mM và 3 mM so với nhóm chứng.
Nghiên cứu kết hợp kết quả từ hai thí nghiệm cho thấy nồng độ paracetamol 5 mM là mức thích hợp để gây độc tế bào gan HepG2 trong mô hình đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan in vitro.
M ứ c độ g iả i ph ón g LDH (T ỉ l ệ tươ ng đố i s o vớ i nh óm c hứ ng )
Ho ạt đ ộ L DH (Tỉ lệ tương đối so với nhóm chứng)
3.1.2 Kết quả thăm dò ảnh hưởng của thời gian ủ đến khả năng gây độc tế bào của paracetamol ở nồng độ đã chọn
Nghiên cứu thăm dò cho thấy nồng độ paracetamol 5mM có ảnh hưởng đến độc tính tế bào Tiếp theo, nghiên cứu khảo sát tác động của thời gian ủ đối với các chỉ số sống sót và tình trạng stress oxy hóa tế bào, bao gồm tỉ lệ tế bào sống, hoạt động của các enzyme nội bào AST, ALT, LDH, cùng với hàm lượng MDA, GSH và hoạt độ CAT Kết quả được trình bày trong các hình 3.3, 3.4, 3.5, 3.6 và 3.7.
3.1.2.1 Ảnh hưởng của thời gian ủ paracetamol đến tỉ lệ tế bào sống
Hình 3.3 Ảnh hưởng của thời gian ủ paracetamol đến tỉ lệ tế bào sống
Dữ liệu được trình bày dưới dạng trung bình ± SE, với các khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng (p < 0,05), n=3 Nhóm chứng được đánh dấu là 0, trong khi các nhóm xử lý với paracetamol được theo dõi sau 12, 24 và 48 giờ.
Nồng độ paracetamol 5 mM được sử dụng để gây độc tế bào trong các khoảng thời gian 12, 24 và 48 giờ, cho thấy xu hướng giảm tỉ lệ tế bào sống Cụ thể, tỉ lệ tế bào sống tại các thời điểm 12, 24 và 48 giờ lần lượt là 95,9%, 78,0% và 67,9%, với sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng.
Ủ tế bào trong 48 giờ với paracetamol nồng độ 5 mM dẫn đến việc khoảng 30-40% tế bào chết, cho thấy đây là thời gian thích hợp để định lượng số lượng tế bào sống.
Tỉ l ệ tế b ào s ốn g (% ) (s o vớ i nh óm c hứ ng ) Nhóm chứng Nhóm paracetamol
T ỉ l ệ tế b à o s ốn g ( %) (so với nhóm chứng)
3.1.2.2 Ảnh hưởng của thời gian ủ paracetamol đến hoạt độ AST, ALT, LDH
AST, ALT và LDH là các enzym nội bào được giải phóng khi màng tế bào hoặc màng ty thể bị tổn thương, cho phép ước lượng mức độ tổn thương tế bào gan thông qua việc định lượng hoạt độ của chúng trong môi trường nuôi cấy tế bào Kết quả định lượng hoạt độ AST, ALT và LDH
Hình 3.4 thể hiện ảnh hưởng của thời gian ủ paracetamol đến hoạt độ của các enzyme AST, ALT và LDH Dữ liệu được trình bày dưới dạng trung bình ± SE, với dấu * chỉ ra sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng (p < 0,05) Nhóm chứng (0 giờ) và các nhóm xử lý với paracetamol trong 12, 24 và 48 giờ được nghiên cứu với n=3.
Nghiên cứu cho thấy việc ủ tế bào HepG2 với paracetamol nồng độ 5 mM trong các khoảng thời gian 12, 24, và 48 giờ đã dẫn đến sự gia tăng đáng kể hoạt độ AST và ALT so với nhóm chứng Cụ thể, hoạt độ AST tăng gấp 1,79 lần, 2,09 lần và 1,32 lần tại các thời điểm 12, 24 và 48 giờ, trong khi hoạt độ ALT tăng gấp 2,76 lần, 2,77 lần và 2,35 lần tương ứng Đặc biệt, hoạt độ AST và ALT đạt đỉnh sau 24 giờ ủ với paracetamol.
Như vậy, thời gian 24 giờ ủ tế bào với paracetamol nồng độ 5mM phù hợp để định lượng hai thông số AST, ALT
Hoạ t độ AS T, ALT , g iả i p hó ng LDH (T ỉ l ệ tươn g đố i s o vớ i n hó m chứng )
Thời gian ủ Ho ạt đ ộ AST , AL T , L DH (Tỉ lệ tương đối so với nhóm chứng)
Sử dụng paracetamol nồng độ 5 mM đã gây độc tế bào HepG2, với hoạt độ LDH tăng dần tại các thời điểm 12, 24 và 48 giờ so với nhóm chứng Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê chỉ được ghi nhận ở thời điểm 48 giờ.
Kết quả nghiên cứu cho thấy động học hoạt độ AST và ALT có sự khác biệt so với LDH, gây khó khăn trong thiết kế nghiên cứu khi định lượng đồng thời các thông số này AST và ALT được xem là enzym chỉ điểm tổn thương tương đối đặc hiệu cho tế bào gan và nhạy cảm hơn với độc tính của paracetamol, thể hiện qua sự tăng sớm và mạnh hơn trong thí nghiệm Vì vậy, trong các nghiên cứu tiếp theo, chỉ sử dụng AST và ALT để đánh giá mức độ tổn thương màng tế bào gan.
3.1.2.3 Ảnh hưởng của thời gian ủ paracetamol đến hàm lượng MDA
MDA là chỉ số sinh học quan trọng cho stress oxy hóa tế bào, và việc gây độc tế bào HepG2 bằng paracetamol ở các thời điểm khác nhau dẫn đến sự gia tăng hàm lượng MDA nội bào Kết quả định lượng MDA được thể hiện rõ ràng qua các thời điểm 12, 24 và 48 giờ trong Hình 3.5.
Hình 3.5 Ảnh hưởng của thời gian ủ paracetamol đến hàm lượng MDA
Ghi chú: Dữ liệu được biểu diễn dưới dạng trung bình ± SE; *: Khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng (p < 0,05), n=3;
0: Nhóm chứng, 12h, 24h, 48h: Nhóm xử lý với paracetamol trong 12, 24, 48 giờ
Kết quả áp dụng mô hình đã triển khai để đánh giá sơ bộ tác dụng bảo vệ tế bào
3.2.1 Ảnh hưởng của cao chiết Xấu hổ đến tỉ lệ tế bào sống trên mô hình gây độc tế bào gan in vitro bằng paracetamol
Hình 3.13 cho thấy ảnh hưởng của cao chiết Xấu hổ đến tỷ lệ tế bào sống trong mô hình độc tế bào gan in vitro sử dụng paracetamol Dữ liệu được trình bày dưới dạng trung bình ± SE; * cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng (p < 0,05), trong khi # chỉ ra sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nhóm paracetamol (p < 0,05), với n=3 Các nhóm được nghiên cứu bao gồm nhóm chứng (C) và nhóm paracetamol (Para).
5 mM) , NAc 3 mM + Para: Nhóm chứng dương (N-Acetylcystein 3 mM + paracetamol 5 mM), Mx + Para: Nhóm xử lý với cao chiết Xấu hổ (cao chiết x 𝜇g/ml + paracetamol 5 mM)
Xử lý tế bào bằng N-Acetylcystein với nồng độ 3mM đã cho thấy sự gia tăng đáng kể tỉ lệ tế bào sống, gấp 1,51 lần so với nhóm tế bào được xử lý bằng paracetamol (p=0,005).
Xử lý tế bào với cao chiết Xấu hổ ở các nồng độ 1, 3 và 10 𝜇g/ml cho thấy sự gia tăng đáng kể tỉ lệ tế bào sống, với mức tăng lần lượt là 1,26 lần (p=0,022), 1,34 lần (p=0,007) và 1,26 lần (p=0,007) so với nhóm chỉ sử dụng paracetamol Tuy nhiên, nồng độ 30 𝜇g/ml của cao chiết Xấu hổ không tạo ra sự khác biệt so với nhóm paracetamol.
Tỉ lệ t ế bào s ốn g( % ) (s o vớ i nh óm c hứ ng )
T ỉ l ệ tế b à o s ốn g ( %) (so với nhóm chứng)
3.2.2 Ảnh hưởng của cao chiết Xấu hổ đến hoạt độ AST, ALT trên mô hình gây độc tế bào gan in vitro bằng paracetamol
Cao chiết Xấu hổ có ảnh hưởng đến hoạt độ enzyme AST và ALT trong mô hình độc tế bào gan in vitro gây ra bởi paracetamol Dữ liệu được trình bày dưới dạng trung bình ± SE, với sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng (p < 0,05) và nhóm paracetamol (p < 0,05) Nghiên cứu này bao gồm 3 mẫu, trong đó C đại diện cho nhóm chứng và Para cho nhóm paracetamol.
5 mM) , NAc 3 mM + Para: Nhóm chứng dương (N-Acetylcystein 3 mM + paracetamol 5 mM), Mx + Para: Nhóm xử lý với cao chiết Xấu hổ (cao chiết x 𝜇g/ml + paracetamol 5 mM)
Sử dụng paracetamol đơn độc làm tăng rõ rệt hoạt độ AST, ALT giải phóng trong môi trường nuôi cấy (mức tăng gấp 2,1 lần (p=0,004) và 2,3 lần (p=0,003))
Xử lý tế bào với N-Acetylcystein nồng độ 3 mM làm giảm rõ rệt cả hoạt độ ALT và AST (lần lượt giảm 48,3% (p = 0,012) và 60,3% (p=0,0005) so với dùng paracetamol đơn độc)
Xử lý tế bào bằng cao chiết Xấu hổ ở các nồng độ khác nhau có tác dụng giảm sự giải phóng ALT và AST trong môi trường nuôi cấy Cụ thể, khi áp dụng các nồng độ 1 và 3, hiệu quả này càng được thể hiện rõ rệt.
Cao chiết Xấu hổ ở nồng độ 10 và 30 𝜇g/ml đã cho thấy hiệu quả rõ rệt trong việc giảm hoạt độ AST, với mức giảm lần lượt là 44,3%, 34,2%, 36,4% và 26,0% so với nhóm chỉ sử dụng paracetamol Ngoài ra, ở các nồng độ 1, 3, và 10 𝜇g/ml, cao chiết này cũng làm giảm đáng kể hoạt độ ALT, với mức giảm lần lượt là 32,7%, 38,3%, và 37,1% so với nhóm paracetamol.
Ho ạt độ AS T, ALT (T ỉ l ệ tươ ng đố i s o vớ i nh óm c hứ ng )
Hoạt động AST, ALT (tỉ lệ tương đối so với nhóm chứng) khi sử dụng cao chiết Xấu hổ với nồng độ 30 𝜇g/ml không cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với việc điều trị bằng paracetamol đơn độc.
BÀN LUẬN
Bàn luận kết quả triển khai mô hình gây độc tế bào gan in vitro bằng paracetamol sử dụng dòng tế bào HepG2
Nhóm nghiên cứu chúng tôi đã xây dựng phương pháp đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan in vitro bằng cách triển khai mô hình gây độc tế bào gan với paracetamol, sử dụng dòng tế bào HepG2 Mô hình nghiên cứu in vitro với các dòng tế bào là lựa chọn hiệu quả để sàng lọc và đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất tiềm năng, nhờ vào kết quả nhanh chóng, tính lặp lại cao và khả năng thiết lập cơ chế tác dụng ở mức độ tế bào và phân tử.
Dòng tế bào HepG2 là một mô hình phổ biến trong nghiên cứu độc tính in vitro, được sử dụng để thay thế tế bào gan người bình thường nhằm khảo sát chuyển hóa chất ngoại sinh và độc tính gan Các tế bào này giữ lại nhiều chức năng đặc trưng của tế bào gan, bao gồm hoạt động của nhiều enzym chống oxy hóa pha I và pha II Vì vậy, HepG2 là công cụ hữu ích cho việc nghiên cứu tác dụng bảo vệ tế bào, độc tính gen và chống độc tính của các hợp chất.
Paracetamol là một tác nhân phổ biến gây tổn thương gan, thường được nghiên cứu để đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan Thông thường, paracetamol được chuyển hóa chủ yếu thành các dẫn xuất glucuronat hoặc sunfat, trong khi một lượng nhỏ được chuyển hóa bởi cytochrom P450 CYP2E1 thành N-acetyl-p-benzoquinon imin (NAPQI) NAPQI là một chất độc hại với tế bào, được loại bỏ qua việc gắn vào glutathion và bài tiết ra ngoài Khi sử dụng paracetamol với nồng độ cao, glutathion bị cạn kiệt, dẫn đến NAPQI liên kết với protein tế bào, gây ra stress oxy hóa và rối loạn chức năng ty thể, cuối cùng dẫn đến hoại tử hoặc chết tế bào gan.
4.1.1 Bàn luận về kết quả đánh giá ảnh hưởng của nồng độ và thời gian ủ đến khả năng gây độc tế bào của paracetamol và việc lựa chọn các thông số nghiên cứu
Xét nghiệm độc tính tế bào là một phương pháp phổ biến trong nghiên cứu in vitro, với MTT và LDH là hai kỹ thuật chính để xác định độc tính và khả năng sống sót của tế bào sau khi tiếp xúc với chất độc Định lượng LDH dựa vào việc đo hoạt tính lactate dehydrogenase trong môi trường ngoại bào, mang lại độ tin cậy cao và thực hiện nhanh chóng Sự mất LDH nội bào cho thấy tế bào đã chết do tổn thương màng tế bào Trong khi đó, định lượng MTT sử dụng MTT để tạo ra formazan màu tím không tan, cho phép đo tỉ lệ tế bào sống thông qua phương pháp đo màu Độc tính của paracetamol thay đổi theo nồng độ, và nhiều nghiên cứu đã sử dụng các nồng độ khác nhau để khảo sát tác động của nó, như nghiên cứu của González với nồng độ 2, 4, 8 mM trên tế bào HepG2.
Kết quả nghiên cứu cho thấy IC50 của paracetamol đối với tế bào HepG2 là 10 mM sau 24 giờ ở nồng độ 80 mM Nghiên cứu của Rodrigues và cộng sự xác định IC10 của paracetamol là 2 mM với dãy nồng độ từ 1 mM đến 50 mM Do đó, cần khảo sát lại ảnh hưởng của nồng độ paracetamol đến khả năng gây độc trong các điều kiện thực nghiệm mới Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành khảo sát với dãy nồng độ paracetamol là 0.3, 1, 3, 5, 10, 30 mM.
Kết quả định lượng từ nghiệm pháp MTT cho thấy, nồng độ paracetamol tăng dần dẫn đến tỷ lệ sống của tế bào giảm dần, chứng minh rằng độc tính của paracetamol phụ thuộc vào nồng độ Sau 48 giờ, tỷ lệ tế bào sống ở nồng độ 10 mM là 55%, cho phép tính toán IC50 của paracetamol đối với dòng tế bào HepG2 Kết quả này nhất quán với các nghiên cứu trước đây trên thế giới Ở nồng độ 5 mM, tỷ lệ tế bào sống đạt 67,5% so với nhóm chứng, đây là nồng độ phù hợp để gây chết khoảng 30-40% tế bào, giúp phương pháp đủ nhạy để phát hiện sự khác biệt rõ rệt về tỷ lệ tế bào sống giữa các nhóm thí nghiệm, đồng thời cho phép tế bào hồi phục khi được xử lý bằng các tác nhân bảo vệ.
Kết quả đo hoạt độ LDH cho thấy độc tính của paracetamol tỉ lệ thuận với nồng độ, với nồng độ 5 mM làm tăng hoạt độ LDH lên 1,32 lần, gây độc tính có ý nghĩa trên tế bào HepG2 Dựa trên kết quả của hai thí nghiệm, nhóm nghiên cứu đã chọn nồng độ paracetamol 5 mM là nồng độ gây độc phù hợp cho các thí nghiệm tiếp theo.
Nghiên cứu cho thấy thời gian tiếp xúc với paracetamol có ảnh hưởng đáng kể đến độc tính tế bào gan, bên cạnh nồng độ của nó Các chất trung gian được tổng hợp và giải phóng trong tế bào gan thông qua nhiều cơ chế khác nhau Để đánh giá sự thay đổi của các chỉ số tổn thương tế bào gan, các nghiên cứu đã khảo sát tác động của thời gian ủ paracetamol nồng độ 5 mM trên tế bào trong các khoảng thời gian 12, 24 và 48 giờ Các thông số được định lượng bao gồm tỉ lệ tế bào sống, hoạt độ AST, ALT, LDH, hàm lượng MDA, GSH và hoạt độ CAT.
Kết quả định lượng MTT cho thấy, khi sử dụng nồng độ 5 mM paracetamol, tỷ lệ tế bào sống giảm dần theo thời gian ủ 12, 24 và 48 giờ, chứng tỏ độc tính của paracetamol phụ thuộc vào thời gian tiếp xúc Thời gian ủ 48 giờ với tỷ lệ tế bào sống 67,9% là thời điểm tối ưu để phát hiện sự khác biệt về tỷ lệ tế bào sống giữa các nhóm thí nghiệm, cũng như khả năng hồi phục của tế bào khi được xử lý bằng các tác nhân bảo vệ.
Hoạt độ LDH ngoại bào thường được sử dụng để định lượng tỷ lệ tế bào sống, nhưng tổn thương tế bào gan có thể được đánh giá chính xác hơn thông qua hoạt độ AST và ALT Nghiên cứu cho thấy hoạt độ AST và ALT là chỉ số nhạy để đánh giá độc tính của paracetamol theo thời gian Cụ thể, sau khi xử lý với paracetamol nồng độ 5mM, hoạt độ AST và ALT đã tăng đáng kể sau 12 giờ và duy trì sự khác biệt này đến 48 giờ Ngược lại, nồng độ LDH có sự dao động lớn trong các nhóm tế bào điều trị với paracetamol, mặc dù có xu hướng tăng nhưng không đạt mức ý nghĩa thống kê trong các thời điểm 12 và 24 giờ Vì vậy, hoạt độ AST và ALT được chọn làm chỉ điểm chính cho sự rò rỉ enzym nội bào, phản ánh tình trạng tổn thương tế bào gan.
Nghiên cứu cho thấy rằng hoạt độ AST và ALT tăng cao sau khi ủ tế bào với paracetamol, đạt đỉnh trong vòng 24 giờ Do đó, nhóm nghiên cứu đã quyết định chọn thời gian 24 giờ để tiến hành ủ tế bào với paracetamol ở nồng độ 5 mM trong các thử nghiệm tiếp theo.
Paracetamol gây độc tế bào thông qua chất chuyển hóa NAPQI, dẫn đến stress oxy hóa nội bào và tổn thương tế bào gan Tình trạng này được phản ánh qua các chỉ điểm oxy hóa như malondialdehyd và mức dự trữ glutathion Khả năng chống oxy hóa của tế bào gan cũng có thể được đánh giá qua hoạt tính của các enzym như catalase, glutathion peroxidase và superoxide dismutase.
Malondialdehyd (MDA) là sản phẩm cuối cùng của quá trình peroxid hóa lipid, thường được sử dụng trong các mô hình nghiên cứu độc tính gan in vitro và in vivo sau khi tiếp xúc với paracetamol Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy MDA là một chỉ số đáng tin cậy để đánh giá độc tính trên tế bào gan do paracetamol gây ra Kết quả cho thấy hàm lượng MDA ở nhóm tế bào xử lý với paracetamol tăng cao so với nhóm chứng ở tất cả các thời điểm 12, 24 và 48 giờ, với mức tăng gấp 1,99 lần so với tế bào chứng tại 48 giờ, là mức cao nhất Sự gia tăng này cho thấy cơ chế độc tính của paracetamol liên quan chặt chẽ đến quá trình peroxid hóa lipid, dẫn đến tổn thương tế bào gan do stress oxy hóa.
Glutathion là chất giải độc quan trọng, giúp loại bỏ NAPQI, một sản phẩm chuyển hóa có tính oxy hóa cao Thời gian tiếp xúc với paracetamol kéo dài dẫn đến cạn kiệt GSH nội bào Nghiên cứu cho thấy hàm lượng GSH giảm dần theo thời gian ủ tế bào, đặc biệt giảm rõ rệt nhất sau 48 giờ Hoạt độ CAT trong nhóm paracetamol có xu hướng tăng so với nhóm chứng, có thể do sự giảm GSH ban đầu để phục vụ cho cơ chế giải độc của tế bào.
ROS tự do tăng lên, tế bào phải tăng cường sản xuất CAT để loại bỏ các gốc ROS như
H2O2 và superoxid Hoạt độ CAT ở nghiên cứu của chúng tôi có xu hướng tăng dần theo thời gian, tăng cao nhất ở 48 giờ, tăng gấp 1,43 lần so với nhóm chứng
Bàn luận về kết quả áp dụng mô hình đã triển khai để đánh giá sơ bộ tác dụng bảo vệ tế bào gan của cao chiết Xấu hổ
Trong nghiên cứu này, nhóm nghiên cứu đã thành công trong việc triển khai mô hình gây độc tế bào gan bằng paracetamol và xác nhận hiệu quả của mô hình bằng N-Acetylcystein thông qua các chỉ số như tỉ lệ tế bào sống, hoạt độ AST, ALT, và hàm lượng MDA, GSH, CAT Chúng tôi đã tiến hành đánh giá sơ bộ tác dụng bảo vệ gan của cao chiết Xấu hổ dựa trên các thông số đánh giá mức độ toàn vẹn của tế bào gan, bao gồm AST, ALT và tỉ lệ tế bào sống Để khảo sát các thông số này, nhóm nghiên cứu đã sử dụng dãy nồng độ 1, 3, 10, 30 𝜇g/ml của cao chiết Xấu hổ.
Nghiên cứu cho thấy cao chiết Xấu hổ tăng tỉ lệ tế bào sống đáng kể ở nồng độ 1,3 và 10 𝜇g/ml, đồng thời giảm mức độ rò rỉ AST, ALT ra ngoại bào, chứng minh khả năng cải thiện sống sót của tế bào và giảm tổn thương do paracetamol Tuy nhiên, nồng độ cao nhất 30 𝜇g/ml lại làm giảm nhẹ hoạt độ AST mà không có sự khác biệt về giải phóng ALT hay tỉ lệ tế bào sống, có thể do độc tính trung bình của Xấu hổ với một số dòng tế bào ung thư, dẫn đến tác động ngược lại với tế bào ung thư biểu mô gan HepG2.
Cao chiết Xấu hổ đã cho thấy khả năng cải thiện sự sống sót của tế bào và giảm thiểu tổn thương tế bào do paracetamol Nghiên cứu ban đầu cho thấy Xấu hổ có thể là một dược liệu tiềm năng trong việc bảo vệ tế bào gan, với các nồng độ hiệu quả được xác định là 1, 3 và 10 𝜇g/ml Cần thực hiện thêm các nghiên cứu để đánh giá sâu hơn về tác dụng bảo vệ tế bào gan của loại dược liệu này.
Trong nghiên cứu này, nhóm nghiên cứu đã thực hiện đánh giá sơ bộ các thông số cơ bản như tỉ lệ tế bào sống và hoạt độ AST, ALT Các nghiên cứu tiếp theo sẽ tập trung vào việc đánh giá sâu hơn tác dụng bảo vệ tế bào gan thông qua các chỉ số chống oxy hóa, bao gồm hàm lượng MDA, GSH và hoạt độ CAT.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Kết luận
- Đã triển khai được mô hình đánh giá tác dụng bảo vệ gan in vitro sử dùng dòng tế bào HepG2:
Nồng độ gây độc tính tối ưu trên tế bào gan đã được xác định là 5mM, với tỉ lệ tế bào sống đạt 67,9% Đồng thời, hoạt độ LDH tăng lên 1,32 lần so với tế bào chứng.
Để đạt được kết quả chính xác trong việc định lượng các thông số phản ánh độc tính trên tế bào gan, cần lựa chọn thời gian tối ưu cho từng chỉ số Cụ thể, định lượng tế bào sống bằng phương pháp MTT nên được thực hiện sau 48 giờ, trong khi đó, hoạt độ AST và ALT cần được đo sau 24 giờ Đối với các chỉ số MDA, GSH và hoạt độ CAT, thời gian tối ưu cũng là 48 giờ.
Nồng độ 3 mM của N-Acetylcystein đã được chọn làm chứng dương để đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan Việc xử lý tế bào bằng N-Acetylcystein đã cải thiện rõ rệt tỷ lệ tế bào sống và giảm đáng kể ảnh hưởng của paracetamol đến sự rò rỉ AST, ALT, hình thành MDA, hàm lượng GSH và hoạt độ CAT nội bào.
Mô hình gây độc tế bào gan in vitro đã được áp dụng để đánh giá tác dụng của cao chiết Xấu hổ Kết quả cho thấy các nồng độ 1, 3, và 10 𝜇g/ml của cao chiết giúp giảm tổn thương màng tế bào và tăng tỉ lệ tế bào sống.
Nghiên cứu tiếp tục đánh giá tác dụng và cơ chế bảo vệ tế bào gan của cao chiết Xấu hổ trên mô hình gây độc tế bào gan bằng paracetamol, sử dụng dòng tế bào HepG2 Kết quả cho thấy cao chiết Xấu hổ có khả năng bảo vệ tế bào gan khỏi tổn thương do paracetamol gây ra, mở ra triển vọng trong việc phát triển các liệu pháp hỗ trợ điều trị bệnh gan.
Áp dụng mô hình đã triển khai giúp sàng lọc, phát hiện và đánh giá các dược liệu có tiềm năng phát triển thành những tác nhân bảo vệ tế bào gan.
TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT
1 Bộ Y Tế (2013), Giải phẫu Bệnh học, Nhà Xuất bản Giáo dục Việt Nam, Hà
2 Bộ Y Tế (2021), Kế hoạch phòng chống bệnh viêm gan virus giai đoạn 2021-
2025, chủ biên, Bộ Y Tế, Hà Nội, tr tr.5-7
3 Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học,
4 Mai Nguyễn Ngọc Trác (2020), Nghiên cứu tác dụng dược lý theo hướng bảo vệ gan, thận của Bí kỳ nam (Hydnophytum formicarum Jack., Rubiaceae), tr.1-
5 Nguyễn Văn Rư, Phùng Thanh Hương (2020), Hóa sinh lâm sàng, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội, tr.79-116
6 Tổ chức Y tế thế giới (2020), Viêm gan vi rút: Những điều bạn cần biết, Manila,
7 Viện Dược liệu (2003), Cây thuốc và động vật làm thuốc, tập II, NXB Khoa học-Kỹ thuật Hà Nội, tr 1099-1101
8 Ahmad, Feroz và Tabassum, Nahida Journal of Acute Disease (2012),
"Experimental models used for the study of antihepatotoxic agents" 1(2), tr 85-
9 Allen, Human Anatomy và Physiology, Northeastern University (2002), "The liver: anatomy, physiology, disease and treatment"
10 Baby Joseph Jency George, Jeevitha Mohan (2013), "Pharmacology and
Traditional Uses of Mimosa pudica", International Journal of Pharmaceutical
Sciences and Drug Research 5(2), tr 41-44
11 Bao, X Q và Liu, G T (2010), "Bicyclol protects HepG2 cells against D- galactosamine-induced apoptosis through inducing heat shock protein 27 and mitochondria associated pathway", Acta Pharmacol Sin 31(2), tr 219-26
12 Bunchorntavakul, C và Reddy, K R (2013), "Acetaminophen-related hepatotoxicity", Clin Liver Dis 17(4), tr 587-607, viii
13 C.Delgado-Montemayor, P.Cordero-Pérezb (2015), "Models of hepatoprotective activity assessment", tr 1-16
14 Cristovao F Lima, Manuel Fernandes-Ferreira, Cristina Pereira-Wilson (2006),
"Phenolic compounds protect HepG2 cells from oxidative damage: relevance of glutathione levels", Life Sciences 79(21)
15 Chidiac, A S và các cộng sự (2023), "Paracetamol (acetaminophen) overdose and hepatotoxicity: mechanism, treatment, prevention measures, and estimates of burden of disease", Expert Opin Drug Metab Toxicol 19(5), tr 297-317
16 Decker, T và Lohmann-Matthes, M L (1988), "A quick and simple method for the quantitation of lactate dehydrogenase release in measurements of cellular cytotoxicity and tumor necrosis factor (TNF) activity", J Immunol Methods 115(1), tr 61-9
17 Delgado-Montemayor, Cecilia và các cộng sự (2015), "Models of hepatoprotective activity assessment" 17(69), tr 222-228
18 Donato, M T., Tolosa, L và Gomez-Lechon, M J (2015), "Culture and
Functional Characterization of Human Hepatoma HepG2 Cells", Methods Mol
20 Fotakis, George và Timbrell, John A %J Toxicology letters (2006), "In vitro cytotoxicity assays: comparison of LDH, neutral red, MTT and protein assay in hepatoma cell lines following exposure to cadmium chloride" 160(2), tr 171-
21 Frank, D và các cộng sự (2020), "Inducing Acute Liver Injury in Rats via
Carbon Tetrachloride (CCl4) Exposure Through an Orogastric Tube", J Vis
22 Gandhiraja N Sriram S, Meena V, Srilakshmi K, Sasikumar C, Rajeshwari R,
(2009), "Phytochemical Screening And Antimicrobial Activity of the Plant Extracts of Mimosa pudica L Against Selected Microbes", Ethnobotanical
23 Gerber, M A và Thung, S N (1987), "Histology of the liver", Am J Surg
24 Goli, Venkateshwarlu và các cộng sự (2011), "Effects of anti-Inflammatory activity of Mimosa pudica" 1(3), tr 69-71
25 Gonzalez, L T và các cộng sự (2017), "In vitro assessment of hepatoprotective agents against damage induced by acetaminophen and CCl(4)", BMC
26 Guguen-Guillouzo, C và Guillouzo, A (2010), "General review on in vitro hepatocyte models and their applications", Methods Mol Biol 640, tr 1-40
27 Hadwan, M H và Abed, H N (2016), "Data supporting the spectrophotometric method for the estimation of catalase activity", Data Brief
28 Hefler, J và các cộng sự (2021), "Preclinical models of acute liver failure: a comprehensive review", PeerJ 9, tr e12579
29 Hinson, J A., Roberts, D W và James, L P (2010), "Mechanisms of acetaminophen-induced liver necrosis", Handb Exp Pharmacol(196), tr 369-
30 Hwang, D., Goo, T W và Yun, E Y (2020), "In Vitro Protective Effect of Paste and Sauce Extract Made with Protaetia brevitarsis Larvae on HepG2 Cells Damaged by Ethanol", Insects 11(8)
31 Ijaz, S và các cộng sự (2019), "HPLC profiling of Mimosa pudica polyphenols and their non-invasive biophysical investigations for anti-dermatoheliotic and skin reinstating potential", Biomed Pharmacother 109, tr 865-875
32 Jang, M và các cộng sự (2015), "On-chip three-dimensional cell culture in phaseguides improves hepatocyte functions in vitro", Biomicrofluidics 9(3), tr
33 Jose, J và các cộng sự (2016), "Structural characterization of a novel derivative of myricetin from Mimosa pudica as an anti-proliferative agent for the treatment of cancer", Biomed Pharmacother 84, tr 1067-1077
34 Kamiloglu Senem, Sari Gulce (2020), "Guidelines for cell viability assays",
35 Koh, P H., Mokhtar, R A và Iqbal, M (2012), "Antioxidant potential of
Cymbopogon citratus extract: alleviation of carbon tetrachloride-induced hepatic oxidative stress and toxicity", Hum Exp Toxicol 31(1), tr 81-91
36 Kowsalya, R và Sangeetha, KA %J Plant Arch (2020), "Hepatoprotective activity of ethyl acetate of Mimosa pudica leaves against paracetamol induced in albino wister rats" 20(2), tr 2006-2011
37 Kumar, KS và Kumar, KLS %J Der Pharmacia Lettre (2010),
"Hepatoprotective effects of 50% ethanolic extract of Mimosa pudica against CCl4 induced hepatotoxicity in rats" 2(1), tr 261-264
38 Kumar, P., Nagarajan, A và Uchil, P D (2018), "Analysis of Cell Viability by the Lactate Dehydrogenase Assay", Cold Spring Harb Protoc 2018(6)
39 Liang, F và các cộng sự (2018), "Attenuation of tert-Butyl Hydroperoxide ( t-
BHP)-Induced Oxidative Damage in HepG2 Cells by Tangeretin: Relevance of the Nrf2-ARE and MAPK Signaling Pathways", J Agric Food Chem 66(25), tr 6317-6325
40 Lister I N E., Ginting C N (2019), "Hepatoprotective effect of Eugenol on
Acetaminophen-Induced Hepatotoxicity in HepG2 cells", Journal of Physics:
41 Lister, INE và các cộng sự (2019), Hepatoprotective effect of eugenol on acetaminophen-induced hepatotoxicity in HepG2 cells, Journal of Physics:
Conference Series, IOP Publishing, tr 012009
42 Liu, F P và các cộng sự (2016), "Hepatoprotective effects of Solanum nigrum against ethanol-induced injury in primary hepatocytes and mice with analysis of glutathione S-transferase A1", J Chin Med Assoc 79(2), tr 65-71
43 Lorincz, T và các cộng sự (2021), "The Performance of HepG2 and HepaRG
Systems through the Glass of Acetaminophen-Induced Toxicity", Life (Basel) 11(8)
44 Lubna Azmi Manish Kumar Singh and Ali Kamal Akhtar (2011),
"Pharmacological and biological overview on Mimosa pudica Linn", Int J of
45 Manov, I., Hirsh, M và Iancu, T C (2004), "N-acetylcysteine does not protect
HepG2 cells against acetaminophen-induced apoptosis", Basic Clin Pharmacol
46 McGill, M R và các cộng sự (2012), "Acetaminophen-induced liver injury in rats and mice: comparison of protein adducts, mitochondrial dysfunction, and oxidative stress in the mechanism of toxicity", Toxicol Appl Pharmacol 264(3), tr 387-94
47 Molina, M., Contreras, C M và Tellez-Alcantara, P (1999), "Mimosa pudica may possess antidepressant actions in the rat", Phytomedicine 6(5), tr 319-23
48 Mosmann, T (1983), "Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays", J Immunol
49 Moyer, RA, Sidell, FR và Salem, H (2014), Encyclopedia of toxicology, chủ biên, Elsevier Inc.: Amsterdam, The Netherlands
50 Nair, Parvathy Velayudhan, Nair, Bindu Latha R %J International Journal of
Basic và Pharmacology, Clinical (2017), "Anti-inflammatory activity of hydroalcoholic extract of Mimosa pudica whole plant in rats" 6(3), tr 518-523
51 Nandi, A và các cộng sự (2019), "Role of Catalase in Oxidative Stress- and
Age-Associated Degenerative Diseases", Oxid Med Cell Longev 2019, tr
52 Nazeema T.H., Brindha V (2009), "Antihepatotoxic and antioxidant defense potential of Mimosa pudica", International Journal of Drug Discovery 1(2), tr 01-04
53 Olsvik, P A và các cộng sự (2005), "mRNA expression of antioxidant enzymes (SOD, CAT and GSH-Px) and lipid peroxidative stress in liver of Atlantic salmon (Salmo salar) exposed to hyperoxic water during smoltification", Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol 141(3), tr 314-
54 Ozougwu, Jevas C %J International Journal of Research in Pharmacy và
Biosciences (2017), "Physiology of the liver" 4(8), tr 13-24
55 Palabiyik, S S và các cộng sự (2016), "The protective effects of carvacrol and thymol against paracetamol-induced toxicity on human hepatocellular carcinoma cell lines (HepG2)", Hum Exp Toxicol 35(12), tr 1252-1263
56 Pande, Milind, Anupam Pathak (2010), "Preliminary pharmacognostic evaluations and phytochemical Studies on roots of Mimosa pudica (Laajvanti)",
Int J Pharm Sci Rev Res, tr 50-52
57 Pareek, A và các cộng sự (2013), "Antioxidant and hepatoprotective activity of
Fagonia schweinfurthii (Hadidi) Hadidi extract in carbon tetrachloride induced hepatotoxicity in HepG2 cell line and rats", J Ethnopharmacol 150(3), tr 973-
58 Park, S và các cộng sự (2020), "A mixture of mulberry and silk amino acids protected against D-galactosamine induced acute liver damage by attenuating oxidative stress and inflammation in HepG2 cells and rats", Exp Ther Med 19(6), tr 3611-3619
59 Patel, N K và Bhutani, K K (2014), "Suppressive effects of Mimosa pudica
(L.) constituents on the production of LPS-induced pro-inflammatory mediators", EXCLI J 13, tr 1011-21
60 Purkayastha, Ayan và các cộng sự (2016), "Evaluation of hepatoprotective activity of the ethanolic extract of leaves of Mimosa pudica Linn in carbon tetrachloride induced hepatic injury in albino rats" 5, tr 496-501
61 R Kumaresan, Sneeha Veerakumar, V Elango (2015), "A Study on
Hepatoprotective Activity of Mimosa pudica in Albino Rats", International
Journal of Pharmacognosy and Phytochemical Research, tr 337-339
62 Rodrigues, R M và các cộng sự (2016), "Toxicogenomics-based prediction of acetaminophen-induced liver injury using human hepatic cell systems", Toxicol
63 Rotundo, L và Pyrsopoulos, N (2020), "Liver injury induced by paracetamol and challenges associated with intentional and unintentional use", World J
64 Rumgay, H và các cộng sự (2022), "Global burden of primary liver cancer in
2020 and predictions to 2040", J Hepatol 77(6), tr 1598-1606
65 She Xingxing, Wang Fei (2015), "In vitroantioxidant and protective effects of corn peptides on ethanol-induced damage in HepG2 cells", Food and