DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Kí hiệu nghiệm thức khử trùng mẫu cấy Bảng 2: Môi trường khảo sát sự tạo chồi dinh dưỡng từ chồi ngủ phát hoa Bảng 3: Môi trường khảo sát sự hình thành PLB từ
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Địa điểm và thời gian thực hiện đề tài
Địa điểm: Phòng thí nghiệm Nuôi cấy mô – Bộ môn Công Nghệ Sinh Học – Trường Đại Học Mở Bán Công Thành Phố Hồ Chí Minh
Thời gian: Từ ngày 08/03/2004 đến ngày 31/11/2005.
Vật liệu
Lan Hoà ẹieọp Phalaenopsis sp
Giống: Các giống lan Hồ điệp Phalaenopsis được mua tại công ty Lâm
Thăng đường Trường Sơn, quận Bình Thạnh
Mẫu khử trùng: Các đoạn phát hoa mang chồi ngủ của cây hoa lan Hồ Điệp trưởng thành
Mẫu cấy chồi và lá: chồi và lá của cây Hồ Điệp in-vitro có nguồn gốc từ các phát hoa
Hình 2.2 Maãu caáy a) Cây hoa lan Hồ điệp trưởng thành b) Caõy lan Hoà ẹieọp in-vitro
Môi trường nuôi cấy Knudson (KD) gồm:
- Muối khoáng đa lượng của KD: 100ml/l
- FeSO4 & EDTA cuûa Murashige & Skoog (MS): 4ml/l
- Muối khoáng vi lượng của Heller: 5ml/l
- Các chất điều hoà sinh trưởng thực vật BA, NAA, Adenin,IBA được thay ủoõổ tuyứ theo muùc ủớch thớ nghieọm
2.2.4 ẹieàu kieọn nuoõi caỏy Điều kiện phòng nuôi:
- Nhiệt độ phòng thí nghiệm: 27 o ± 2 o C
- Cường độ chiếu sáng: 2000 – 3000 Lux
- Thời gian chiếu sáng: 16 giờ/ngày
Nguyeón Thũ Thuùc Chi 23 Điều kiện kỹ thuật:
- Dụng cụ và trang thiết bị được hấp khử trùng
- Môi trường nuôi cấy được hấp khử trùng ở 121 o C, 1 atm trong 30 phút baèng noài haáp Autoclave
Tất cả các thí nghiệm đều được lập lại 3 lần
2.2.5 Dụng cụ,ù trang thiết bị và hoỏ chất
Dụng cụ và trang thiết bị được khử trùng, gồm có:
- Máy điều hòa nhiệt độ
- Dụng cụ cấy: Dao cấy, kẹp, kéo, đèn cồn, đĩa petri, giấy cấy, bông thaám, boâng khoâng thaám
- OÁng ủong 250ml, 500ml, 1000ml
- Hoá chất khử trùng: Hypochlorite calcium.
Phương pháp
2.3.1 Thí nghiệm 1: Khử trùng mẫu cấy
Nhằm tìm ra nồng độ dung dịch hypochlorite calcium và thời gian khử trùng thích hợp cho quá trình khử trùng mẫu cấy Đây là bước đầu tiên trong nuôi cấy, nhằm tạo ra mẫu sạch (không có nhiễm vi sinh vật và mẫu vẫn còn khả năng tái sinh) Đây sẽ là nguồn mẫu ban đầu cho việc nuôi cấy tiếp theo
Mẫu cấy là những đoạn phát hoa của cây lan Hồ Điệp (Phalaenopsis) mang choài nguû
Dùng bông gòn rửa và lau thật kỹ mẫu bằng dung dịch xà phòng đậm đặc, sau đó rửa mẫu dưới vòi nước chảy mạnh
Sau đó mẫu sẽ được lau sạch bằng cồn trước khi đưa vào tủ cấy vô trùng Tiến hành lắc mẫu với cồn 96 o trong 1 phút đối với mẫu già và trong 30 giây đối với mẫu non Sau đó lắc mẫu trong nước cất vô trùng trước khi khử truứng trong dung dũch hypochlorite calcium
Theo kinh nghiệm của cách nhà nghiên cứu về nuôi cấy mô thực vật, nồng độ dung dịch hypochlorite calcium được sử dụng để vô trùng là 9% - 10%, với thời gian xử lý là 5 – 30 phút (Street, 1974) và nồng độ dung dịch hypochlorite calcium 5% -15% với thời gian xử lý là 10 – 30 phút (Vũ Văn Vụ) [12] Trên cơ sở đó chúng tôi sử dụng nồng độ dung dịch hypochlorite calcium và định ra các mức nồng độ và thời gian xử lý sau:
- Thời gian khử trùng: 25 phút, 30 phút
Sau khi các mẫu được ngâm trong các dung dịch hypochlorite calcium ứng với các khoảng thời gian khác nhau chúng được rửa lại bằng nước cất vô trùng 3 laàn
Dùng dao mổ và kẹp đã được vô trùng tách nhẹ nhàng những vỏ bao ngoài của chồi ngủ trên phát hoa
Tieỏp theo laộc nheù baống dung dũch hypochlorite calcium 1% trong 3 phuựt và rửa lại bằng nước cất vô trùng lần nữa
Sau cùng dùng dao mổ và kẹp cắt bỏ những phần bị tổn thương bởi dung dịch hypochlorite calcium trong quá trình khử trùng, sau đó đem cấy vào môi trường Knudson (KD)
Bảng 1: Kí hiệu nghiệm thức khử trùng mẫu cấy
Kớ hieọu Dung dũch hypochlorite calcium
Tổ leọ maóu nhieóm, maóu cheỏt, maóu soỏng sau 1 tuaàn nuoõi caỏy
Số lượng mẫu chết do chất khử trùng k Số lượng mẫu chết do chất khử trùng Tổng số mẫu cấy hử trùng Số lượng mẫu sống và không bị nhiễm
2.3.2 Thí nghiệm 2: Tạo chồi từ chồi ngủ phát hoa
Tìm môi trường có nồng độ kích thích tố thích hợp cho sự hình thành chồi dinh dưỡng từ chồi ngủ phát hoa
Chồi ngủ phát hoa đã được khử trùng (không nhiễm vi sinh vật và còn khả năng tái sinh) được cấy vào môi trường KD cơ bản không bổ sung kích thích tố và môi trường KD có bổ sung các chất ĐHSTTV với nồng độ 1mg/l NAA cố định và nồng độ BA thay đổi được thể hiện dưới bảng 2
Bảng 2: Môi trường khảo sát sự tạo chồi dinh dưỡng từ chồi ngủ phát hoa
Chỉ tiêu theo dõi: trung bình số chồi dinh dưỡng hình thành sau 4 tuần nuoâi caáy
STT Kí hiệu môi trường NAA (mg/l) BA (mg/l)
2.3.3 Thí nghiệm 3: Tạo PLB (Protocom – Like Body) từ lá của chồi có nguồn gốc từ phát hoa
Tìm ra môi trường có nồng độ kích thích tố thích hợp cho sự tạo PLB từ lá của chồi in-vitro có nguồn gốc từ phát hoa
Lá của chồi 8 tuần tuổi (cao 2 – 3 cm) ở thí nghiệm 2 được cắt thành những mảnh nhỏ 5 x 5 (mm), được cấy vào môi trường KD có bổ sung các chất ĐHSTTV: NAA, BA, Adenin ở các nồng độ phối hợp khác nhau Các mẫu cấy được đặt vào trong tối, sau 2 tuần được lấy ra đặt trên các kệ sáng
Bảng 3: Môi trường khảo sát sự hình thành PLB từ lá của chồi in-vitro
STT Kí hiệu môi trường NAA (mg/l) BA (mg/l) Adenin (mg/l)
Chỉ tiêu theo dõi: số PLB hình thành trên mảnh lá sau 10 tuần nuôi cấy
2.3.4 Thí nghiệm 4: Tạo PLB và cụm chồi từ chồi ngọn của chồi in-vitro có nguồn gốc từ phát hoa
Tìm ra môi trường có nồng độ kích thích tố thích hợp cho sự tạo PLB và cụm chồi từ chồi ngọn của chồi in-vitro có nguồn gốc từ phát hoa
Cây in-vitro 12 tuần tuổi được tách lấy chồi ngọn và cấy vào môi trường
KD có bổ sung chất ĐHSTTV với nồng độ khác nhau (bảng 4)
Cách lấy chồi ngọn: dùng dao mổ rạch nhẹ dọc xuống ở giữa cuống lá, sau đó dùng kẹp tách lá ra khỏi thân, tách từng lá một cho đến lá cuối cùng và dùng dao mổ tách lấy chồi ngọn
Bảng 4: Môi trường khảo sát sự hình thành PLB và cụm chồi từ chồi ngọn của chồi in-vitro có nguồn gốc từ phát hoa
STT Kí hiệu môi trường NAA (mg/l) BA (mg/l) Adenin (mg/l)
Chỉ tiêu theo dõi: số PLB và số chồi hình thành từ chồi ngọn sau 10 tuần nuoâi caáy
2.3.5 Thí nghiệm 5: Tạo chồi từ PLB
Tìm ra môi trường có nồng độ kích thích tố thích hợp cho sự hình thành chồi từ PLB
Dùng kẹp cấy chuyền PLB hình thành từ lá và chồi ở thí nghiệm 3 và 4 sang các môi trường có nồng độ kích thích tố thay đổi (theo bảng 5)
Bảng 5: Môi trường khảo sát sự hình thành chồi từ PLB
STT Kớ hieọu moõi trường
Chỉ tiêu theo dõi: số chồi trung bình trên một cụm và chiều cao chồi sau
2.3.6 Thí nghiệm 6: Khảo sát sự hình thành rễ của chồi lan
Tìm ra môi trường có nồng độ kích thích tố thích hợp cho sự hình thành rễ của choài lan in-vitro.
Các chồi in-vitro hình thành từ PLB ở thí nghiệm 4 được cấy chuyền sang môi trường KD (không có kích thích tố) trong 6 tuần cho các chồi phát triển thành những chồi hoàn chỉnh có 2 lá Các chồi hoàn chỉnh này được cấy tiếp sang môi trường KD có bổ sung 0,5mg/l NAA cố định kết hợp với BA và NAA có nồng độ thay đổi (theo bảng 7)
Bảng 6: Môi trường khảo sát sự hình thành rễ của chồi con
Chỉ tiêu theo dõi sau 10 tuần nuôi cấy:
- Số rễ trung bình trên một chồi và chiều dài rễ
2.3.7 Thí nghiệm 7: Khảo sát sự phát triển của cây lan con in-vitro ngoài vườn ươm
Khảo sát sự tăng trưởng của cây lan Hồ Điệp con thu được từ nuôi cấy in- vitro ngoài vườn ươm
Các cây lan con Hồ Điệp Phalaenopsis in-vitro hoàn chỉnh có 2 - 4 lá, cao trung bình từ 3 - 5 cm, có rễ to, khoẻ, dài 3 – 5 cm thu được ở thí nghiệm 6, sau khi lấy ra khỏi môi trường thì được rửa sạch agar, rồi đem trồng vào chậu nhựa hoặc gốm có giá thể là những mẫu than vụn nhỏ và dớn 5 - 6 giờ tưới nước 1 lần với chế độ phun sương
Chỉ tiêu theo dõi: tỉ lệ cây con sống sót ngoài vườn ươm sau 8 tuần nuôi troàng.
Xử lý số liệu
Số liệu thu được được xử lý bằng phần mềm MSTATC
Ngu yeón Thũ Thuùc Chi 33