thực hành công nghệ di truyền 2

Ngoài ra hiện nay, một số loại đậu nành được biến đổi gen, có thểchứa ít chất dinh dưỡng hơn và tích tụ một lượng thuốc diệt cỏ nhiều hơn so với đậunành hữu cơ hoặc đậu nành thông thường

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN II

Ngành học Sinh viên thực hiện

Mã số sinh viên Niên khóa

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC : NGUYỄN LAN ANH : 21126009

: 2021 – 2025

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN II

TP Thủ Đức, 06/2024

MỤC LỤC

Trang

MỤC LỤC i

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT iii

DANH SÁCH ĐƠN VỊ ĐO LƯỜNG iv

DANH SÁCH CÁC BẢNG v

DANH SÁCH CÁC HÌNH vi

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu thực hành 1

1.3 Nội dung thực hành 1

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

2.1 Lương thực thực phẩm 2

2.2 Tổng quan về GMO 2

2.2.1 Khái niệm về sinh vật biến đổi gen – GMO 2

2.2.2 Tại sao phải kiểm tra GMO 2

2.2.3 Kiểm tra GMO trên đậu nành 2

2.2.4 Phương pháp xác định GMO trên đậu nành 3

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 4

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 4

3.2 Vật liệu nghiên cứu 4

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu 4

3.3.1 Ly trích DNA 4

3.3.2 Điện di định tính DNA ly trích và đo OD 7

3.3.3 PCR 8

3.3.4 Điện di phát hiện mẫu GMO 9

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 10

4.1 Kết quả và thảo luận 10

4.1.1 Kết quả điện di định tính DNA 10

4.1.2 Kết qủa đo OD kiểm tra lượng DNA ly trích 10

4.1.3 Kết quả điện di phát hiện GMO 10

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH SÁCH ĐƠN VỊ ĐO LƯỜNG

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Hình 3.1 Thành phần hỗn hợp các chất trong PCR 9 Hình 3.2 Thông số chu trình nhiệt 9

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 1.1 Quy trình xác định đậu nành GMO bằng kỹ thuật PCR 3

Hình 3.1 Mẫu đậu nành GMO 5

Hình 3.2 Mẫu sau khi thêm 600 μL SDSL SDS 5

Hình 3.3 Mẫu sau khi điện di và hút dịch nổi sang tube mới 6

Hình 3.4 Mẫu sau khi điện di và hút dịch nổi sang tube mới 6

Hình 3.5 Mẫu sau khi điện di và thêm ethanol 7

Hình 3.6 Mẫu DNA đựợc cho vào giếng và máy đo OD 8

Hình 4.1 Kết quả điện di định tính DNA 10

Hình 4.2 Kết quả đo OD kiểm tra lượng DNA ly trích 10

Hình 4.3 Kết quả điện di phát hiện GMO 11

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Ăn đậu nành thường xuyên được xem là một trong những chủ đề dinh dưỡng gây

ra nhiều tranh cãi nhất hiện nay Thực tế, đậu nành rất giàu chất dinh dưỡng và có thểđem đến nhiều lợi ích sức khỏe đáng chú ý như giảm đường huyết, cải thiện sức khỏetim mạch, giảm triệu chứng mãn kinh và các nguy cơ gây ung thư Tuy nhiên, cũng cómột số người lo ngại về sự ảnh hưởng của chế độ ăn giàu đậu nành đối với sức khoẻ,chẳng hạn như làm giảm chức năng tuyến giáp, tăng nguy cơ ung thư vú hoặc tác dụng

nữ hoá ở nam giới Ngoài ra hiện nay, một số loại đậu nành được biến đổi gen, có thểchứa ít chất dinh dưỡng hơn và tích tụ một lượng thuốc diệt cỏ nhiều hơn so với đậunành hữu cơ hoặc đậu nành thông thường gây ảnh hưởng lớn đến sức khỏe con người

1.2 Mục tiêu thực hành

Xác định được đậu nành GMO, phân biệt được đậu nành GMO và đậu nành hữu

cơ bằng phương pháp PCR

1.3 Nội dung thực hành

Thu mẫu: tiến hành thu hạt của đậu nành GMO

Ly trích DNA: tiến hành ly trích DNA từ đậu nành GMO làm nguồn nguyên liệucho điện di và PCR

Điện di lần 1: Tiến hành điện di nhầm kiểm tra mẫu ly trích có chứa DNA haykhông

Đo quang phổ: đo lường nồng độ mẫu DNA

PCR: nhầm khuếch đại vật liệu DNA, các đoạn gene mong muốn bằng các cặpmồi chuyên biệt

Điện di lần 2: tiến hành điện di mẫu PCR nhầm phát hiện GMO

Đọc kết quả: đọc kết quả dựa vào đối chứng dương của cây GMO

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Lương thực thực phẩm

Lương thực thực phẩm là các loại cây trồng mà sản phẩm dùng làm lương thựccho người và thức ăn cho động vật Ngành lương thực thực phẩm là một ngành đóngvai trò quan trọng trong sự phát triển kinh tế - xã hội của thế giới, là nguồn nuôi sốngcho hơn 7 tỉ người trên thế giới Vấn đề đặt ra ở đây là để đảm bảo cho sự tồn tại của

xã hội loài người trong giai đoạn hiện nay và tương lai thì con người phải được cungcấp đầy đủ hương thực thực phẩm và nhiều nhu cầu khác Ở một số quốc gia, để tăngsản lượng lương thực người ta đã trồng những cây lương thực thay thế cho cây côngnghiệp Ví dụ ở Hoa Kỳ: nhờ thành tựu trong lĩnh vực công nghệ người ta đã sản xuấtđược các loại sợi hóa học thay thế cho sợi bông Vậy nên những vùng trồng bông khixưa đã được thay thế bằng trồng cây lương thực Còn ở Nhật thì chấm dứt trồng dâu đểtrồng lương thực Từ đó ta thấy vai trò cực kỳ quan trọng của ngành lương thực thựcphẩm đối với sự tồn tại và phát triển của xã hội loài người

2.2 Tổng quan về GMO

2.2.1 Khái niệm về sinh vật biến đổi gen – GMO

Sinh vật biến đổi gene - GMO (Genetically modified organisms) là sinh vật có bộgene được chèn một hoặc nhiều đoạn DNA làm bộ gene của sinh vật biến đổi, nhằmtăng các đặc tính ưu việt có chọn lọc

2.2.2 Tại sao phải kiểm tra GMO

Công nghệ sinh học phát triển: ngày càng nhiều thực phẩm có nguồn gốc là câytrồng GMO

Quan điểm xã hội: chưa quen, không thích nghi kịp, tâm lý lo sợ

Lợi ích và tác hại chưa xác định rõ ràng: mất cân bằng tự nhiên, nguy cơ gây gâyhại cho sức khỏe và đa dạng sinh học

2.2.3 Kiểm tra GMO trên đậu nành

Đậu nành biến đổi gen là những loại đậu đã được được tạo ra bằng cách thay đổigen – DNA dưới tác động của các kỹ thuật sinh học hiện đại (phương pháp chuyểngen, gây đột biến gen hoặc chỉnh sửa gen)

Đậu nành GMO giống đậu nành được cấy thêm những tính trạng của giống sinhvật khác, làm cho giống đậu nành này được dễ trồng trọt, dễ sản xuất ngay cả trongnhững môi trường khắc nghiệt Ngoài ra, GMO còn tạo ra giống đậu nành có tuổi đờilâu hơn, màu sắc bắt mắt, đều hạt hơn và giá thành rẻ hơn Hạt đậu nành biến đổi gen

để chống lại thuốc diệt cỏ và sản xuất dầu tốt cho sức khoẻ hơn

Năm 2015, 94% diện tích đậu nành ở Mỹ là cây biến đổi gien để chịu đượcglyphosate - chứa hàm lượng dinh dưỡng cao hơn

2.2.4 Phương pháp xác định GMO trên đậu nành

Kỹ thuật PCR, đây là một kỹ thuật nhằm tạo ra một lượng lớn bản sao DNA mụctiêu trong ống nghiệm dựa vào các chu kỳ nhiệt Sau đó tiến hành điện di và đọc kếtquả

Hình 1.1 Quy trình xác định đậu nành GMO bằng kỹ thuật PCR.

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian thực hiện nghiên cứu từ ngày 01/06/2024 đến ngày 03/06/2024

Địa điểm được thực hiện tại phòng Phòng 105 Tòa A2 Viện nghiên cứu Côngnghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu nghiên cứu

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu đậu nành GMO

3.2.2 Thiết bị và dụng cụ

Máy điện di, máy PCR, máy ly tâm và máy đo quang phổ

3.2.3 Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

Hóa chất gồm: PCI buffer; CI; Isopropanol; Ethanol 70oc; TE buffer, Master mix;Gelred; SDS; loading dye; gel agarose; dung dịch đệm điện di (TAE hoặc TBE)

3.2 Phương pháp nghiên cứu

Dùng kỹ thuật điện di để kiểm tra DNA tổng số Xuất hiện band sáng là do cóDNA trong mẫu, DNA sẽ được glycerol nặng hơn kéo lắng xuống đáy giếng, giúpDNA tránh khuếch tán ra bên ngoài, đồng thời làm băng điện di đẹp và gọn hơn Cuốicùng, để quan sát được DNA cần phải nhuộm phân tử này bằng các chất nhuộm nhưgelred, Và ngược lại nếu không có DNA trong mẫu những phản ứng trên sẽ khôngxảy ra và đồng thời band sáng cũng không xuất hiện

Điện di sản phẩm PCR kiểm tra DNA ly trích có dương tính hay âm tính với genchuyển vào hay không Thông qua điện di sản phẩm PCR có ladder, có band sáng xuấthiện nếu mẫu ly trích DNA dương tính Và ngược lại nếu mẫu âm tính, band sángkhông xuất hiện

3.3 Các bước tiến hành

3.3.1 Ly trích DNA

Bước 1: chuẩn bị mẫu đậu nành GMO, cho một số hạt đậu nành vào túi zip nhỏ

và dùng chày để nghiền chúng nhuyễn ra Sau đó chuẩn bị tube sạch và cho vào tubemột lượng nhỏ vừa đủ (quá nhiều hay quá ít cũng sẽ khiến cho quá trình ly trích và

b) a)

Hình 3.1 Mẫu đậu nành GMO (a) Hạt đậu nành nguyên; (b)

Hạt đậu nành sau khi được nghiền nhuyễn.

tử không xác định tồn tại ở pha nào như protein biến tính, ) Ngoài ra còn có isoamylalcohol giúp làm giảm bọt khí và làm quá trình tách lớp diễn ra tốt hơn.

Bước 4: đem tube trên đi ly tâm ở 10000 rpm trong 5 phút Sau ly tâm hút 500

μL SDSL dịch nổi qua tube mới

Hình 3.4 Mẫu sau khi điện di và hút dịch nổi sang tube mới (a)

thêm 500 μLL CI và điện di 5p; (b) hút 300 μLL dịch nổi qua tube mới.

b) a)

b) a)

Hình 3.3 Mẫu sau khi điện di và hút dịch nổi sang tube mới (a)

thêm 600 μLL PCI và điện di 5p; (b) hút 500 μLL dịch nổi qua tube mới.

Bước 5: thêm 500 μL SDSL CI vào tiếp tục đem đi ly tâm ở 10000 rpm trong 5 phút,sau đó hút 300 μL SDSL dịch nổi qua tube mới

Bước 6: bổ sung Isopropanol (Vmẫu*0,6 = VIsopropanol), như vậy sẽ thêm 180 µL

b) a)

Hình 3.5 Mẫu sau khi điện di và thêm ethanol (a) thêm 180 µL

Isopropanol và điện di 10p; (b) rồi thêm 500 µL Ethanol 70 o C.

Bước 7: ủ lạnh ở 20oC trong vòng 30 phút Đem đi ly tâm ở 10000 rpm trong

TE: cân bằng pH và bảo quản DNA

3.3.2 Điện di định tính DNA ly trích và đo OD

Đem mẫu đậu nành sau khi ly trích sẽ được đem đi điện di để xác định có DNAhay không

Nguyên tắc: các đoạn DNA mang điện tích âm nên di chuyển trong điện trườngtheo chiều từ cực âm sang cực dương Trên bảng gel agarose, các đoạn DNA có kíchthước khác nhau sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau trong điện trường

Sau khi tách chiết được DNA của đậu nành, ta tiến hành thực hiện điện di Tiếnhành:

Bước 1: chuẩn bị gel

tan hoàn toàn Làm nguội agarose xuống khoảng 60oC trước khi đổ gel vào khay cómang lược gel.

Bước 2: chuẩn bị bồn điện di

Khi gel nguội và đặc lại, khay gel được đặt vào bồn điện di, ngập trong dungdịch đệm điện di Lược gel được tháo ra tạo nên các “giếng” rỗng dành để cho mẫuđiện di vào

Bước 3: chuẩn bị mẫu

Hút 5μL SDSL mẫu DNA trộn cùng với 10 μL SDSL loading dye (bromophenol blue,glycerol)

Bước 4: hút 15 μL SDSL hỗn hợp trên vào giếng điện di, điện di trong vòng 30 phútvới hiệu điện thế 100V

Bước 4: điện di sau đó chụp gel và quan sát kết quả

Hình 3.6 Mẫu DNA đựợc cho vào giếng và máy đo OD.

Bước 5: tiến hành đo nồng độ bằng máy Biodrop, hút 2 - 3 μL SDSL mẫu bỏ vào máy

và đợi kết quả đo được

3.3.3 PCR

Nguyên lý hoạt động: việc tổng hợp DNA dựa trên mạch khuôn là một trình tựđích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệubản sao thông qua hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi đặc hiệu chođoạn DNA này

Bước 2: sau đó hút 1 μL SDSL DNA mẫu vào ống tube trên

Bước 3: thêm vào 4,75 μL SDSL nước khử ion

Bảng 3.2 Thông số chu trình nhiệt

40

3.3.4 Điện di phát hiện mẫu GMO

Sau khi PCR Điện di với 5 µL mẫu + Gelred 10 µL và điện di trong vòng 35phút ở 100V

Thực hiện điện di lần 2 để phát hiện xem độ khuếch đại của mẫu đậu nànhthường có trùng với độ khuếch đại của GMO hay không (dựa vào promoter 35S) Vìchúng ta không biết đậu nành thường có GMO hay không Việc mẫu có band sáng cócùng độ khuếch đại với promoter 35S là dương tính (mẫu đậu nành GMO) Ngoài ra,việc điện di lần 2, đối với mẫu từ đậu nành GMO, giúp ta quan sát được ngoàipromoter 35S còn có các promoter khác

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Kết quả và thảo luận

Hình 4.1 Kết quả điện di định tính DNA.

Hình 4.2 Kết qủa đo OD kiểm tra lượng DNA ly trích.

4.1.1 Kết quả điện di định tính DNA

Dựa vào hình ta thấy kết quả điện di ra band của mẫu đậu nành số 3 cho thấy

trong quá trình ly trích mẫu và đo mật độ quang có DNA

b)a)

4.1.2 Kết qủa đo OD kiểm tra lượng DNA ly trích

Ta có tỷ số OD260/OD280= 2,102 Quá trình tinh sạch DNA với nồng độ 612,2 ng/

µL, nồng độ DNA có đủ điều kiện để thực hiện phản ứng PCR

4.1.3 Kết quả điện di phát hiện GMO

Sau khi điện di với DNA mẫu đậu nành số 3 ta nhận được kết quả:

Hình 4.3 Kết quả điện di phát hiện GMO.

Mẫu đậu nành số 3 là mẫu có chứa gen GMO vì so sánh với 2 giếng kế bên phảicùng với ladder cũng có band giống nhau và cùng một mẫu ly trích