khảo sát mối tương quan giữa tính chất biểu hiện của phân tử mirna 21 với một số gen đích trên bệnh nhân ung thư vòm họng tại việt nam

Hồ Chí Minh Tên đề tài: Khảo sát mối tương quan giữa tính chất biểu hiện của phân tử miRNA-21 với một số gen đích trên bệnh nhân ung thư vòm họng tại Việt Nam Ý kiến của giáo viên hướng

TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ VÒM HỌNG

Định nghĩa, triệu chứng của ung thư vòm họng

Ung thư vòm họng (UTVH) là khối u ác tính xuất phát từ biểu mô của vùng vòm họng Về vị trí sinh bệnh của khối u, đó là nơi tiếp giáp mũi, họng và chỗ đổ của ống vòi nhĩ (ống thông giữa tai và mũi họng) nên khi khối u vòm họng xâm lấn, di căn sẽ có triệu chứng liên quan đến các cơ quan này (Hình 1.1) Cụ thể, một số triệu chứng ở tai thường gặp như nghe kém, ù tai, viêm tai giữa tái phát, đặc biệt chỉ xảy ra một bên, triệu chứng ở mũi bao gồm chảy nước mũi có máu, ngạt mũi một bên, chảy mũi nhầy và triệu chứng họng được ghi nhận là ho dai dẳng, khàn tiếng, ho khạc ra đờm dính máu, đau họng Một số triệu chứng thần kinh như đau đầu, thường là đau nửa đầu hoặc đau sâu trong hốc mắt Ngoài ra,do vòm họng có cấu trúc mô bạch huyết phức tạp nên khi có sự xuất hiện của khối u ác tính thì chúng sẽ nhanh chóng lây lan khắp vùng cổ, dẫn đến các hạch cổ sưng lớn không đau (gặp ở 75% bệnh nhân, thường ở hai bên và về phía sau) Ngoài ra, có nhiều bệnh nhân nổi hạch góc hàm trước khi có các triệu chứng kể trên cũng được ghi nhận ở những bệnh nhân mắc UTVH [101]

Hình 1.1.Cấu tạo của vòm họng và vị trí của ung thư vòm họng [134]

Phân tích dịch tễ của ung thư vòm họng

Về sự phân bố dịch tễ của UTVH thì đây là loại ung thư xuất hiện nhiều ở các nước đang phát triển, đặc biệt là các quốc gia thuộc khu vực Châu Phi, Châu Á [66] Theo nghiên cứu của Salehiniya và cộng sự (2018), bệnh UTVH có sự phân hóa về địa lý rất rõ rệt với 81% phân bố ở khu vực châu Á, 9% tập trung ở châu Phi và 10% còn lại phân bố rải rác khắp nơi trên thế giới [135] Nhìn chung, đây là loại ung thư đặc hữu chỉ có ở một số quốc gia, đặc biệt là ở khu vực Đông Nam Á, bao gồm Việt Nam Theo thống kê về dịch tễ học của UTVH được ghi nhận bởi Lao và cộng sự [66], cho thấy:

(1) Trong năm 2018, có đến 129.079 trường hợp mắc UTVH đã được ghi nhận trên thế giới, theo đó có 93.416 trường hợp (chiếm 72,37%) được chẩn đoán ở nam và 35.663 trường hợp (chiếm 27,63%) được chẩn đoán ở nữ Dữ liệu này cho thấy tỷ lệ mắc của nam gấp 2,62 lần so với nữ Về tỷ lệ tử vong, tổng cộng có 72.987 trường hợp tử vong gây ra bởi UTVH đã xảy ra, có đến 54.280 trường hợp đã tử vong (chiếm 74,37%) được ghi nhận ở nam, và 18.707 ca tử vong (chiếm 25,63%) được quan sát ở nữ (tỷ lệ theo giới: nam/nữ = 2,90)

(2) Trong tổng số 129.079 ca mắc UTVH trên thế giới, tỷ lệ mắc UTVH cao nhất được ghi nhận ở lần lượt năm quốc gia thuộc khu vực Châu Á, cụ thể là 33.198 trường hợp mắc UTVH ghi nhận ở Trung Quốc (chiếm 59%), Indonesia (17.992 ca, chiếm 18%), Việt Nam (6.212 ca, chiếm 6%), Ấn Độ (5086 ca mắc, chiếm 5%) và Philipines (2913 ca, chiếm 3%) Như đã đề cập, UTVH là loại ung thư có sự khác biệt rõ ràng về dịch tễ học, cụ thể có sự phân bố bệnh theo vùng địa lý, chủng tộc nghiêng hẳn về khu vực Châu Á, khi số ca tử vong ở các nước Trung Quốc, Indonesia, Việt Nam, Ấn Độ, Philipines lần lượt lên tới 31.413 ca (chiếm 43,04%), 11.204 ca (chiếm 15,35%), 4232 ca (chiếm 5,80%), 3.715 ca (chiếm 5,09%) và 1.899 trường hợp (chiếm 2,60%) trên tổng số 72.987 trường hợp tử vong do UTVH được ghi nhận

(3) Một trong những lý do cho sự khác biệt về tỷ lệ mắc và tử vong do UTVH ở các quần thể khác nhau có thể đến từ sự khác biệt bởi chính các yếu tố ảnh hưởng như độ tuổi, giới tính, chủng tộc, tập quán sinh hoạt và một số yếu tố nguy cơ như hút thuốc, chịu tác động ô nhiễm, tác động của hóa chất, hay thói quen thường xuyên tiêu thụ cá muối ở các nước Đông Nam Á [52, 100, 171]

Hình 1.2 Biểu đồ mô tả sự phân bố về tỷ lệ mắc (A) và tử vong (B) do UTVH ở các

Châu lục trên thế giới ghi nhận vào năm 2018 [66]

Riêng tại khu vực Đông Nam Á, theo cơ sở trích xuất dữ liệu thống kê từ chương trình nghiên cứu ung thư trên thế giới (Global Cancer Observatory, Globocan) về mối tương quan giữa tỷ lệ mắc bệnh cũng như tỷ lệ tử vong UTVH theo độ tuổi (Incidence– ASR, Mortality-ASR, Age-Word-Standardized) với chỉ số phát triển con người (HDI: Human Development Incidence) cho thấy:

- Việt Nam là một trong năm quốc gia thuộc khu vực Đông Nam Á có tỷ lệ mắc UTVH theo phân bố chuẩn của độ tuổi đứng thứ năm (ASR = 5,9/100.000), chỉ sau Malaysia, Indonesia, Singapore và Brunei Tuy nhiên, tỷ lệ tử vong của UTVH ở Việt Nam theo chỉ số ASR lại đứng thứ tư trong năm quốc gia có tỷ lệ tử vong do UTVH cao nhất khu vực (ASR = 3,9/100.000)

- Trong số 34.681 ca mắc UTVH và 22.231 ca tử vong thuộc khu vực Đông Nam Á thì ba quốc gia có số ca mắc UTVH cao nhất lần lượt là (1), Indonesia: 17.992 ca; (2), Việt Nam: 6.212 ca và (3), Philipines: 2.913 ca Về số trường hợp tử vong thì

Việt Nam cũng đứng thứ hai trong ba quốc gia có số ca tử vong cao do UTVH gây ra, lên đến 4.232 trường hợp (Bảng 1.1) Số liệu trên còn cho thấy số ca mắc UTVH ở các nước đang phát triển (chỉ số phát triển con người trung bình) cao hơn rất nhiều so với các nước phát triển và rất phát triển như Singapore và Thái Lan Nguyên nhân có thể là do ở các nước đang phát triển thì tác động của các yếu tố nguy cơ liên quan đến UTVH xảy ra nhiều hơn, việc phân bổ ngân sách ít hơn cho ngành y tế và y tế công cộng, không được tiếp cận với các phương pháp điều trị tiên tiến và kịp thời, thu nhập của người dân chưa cao, giáo dục sức khỏe và dịch vụ y tế kém làm cho hầu hết các trường hợp chẩn đoán UTVH đều ở giai đoạn muộn, đặc biệt là ở giai đoạn tiến triển của bệnh (xâm lấn – di căn), vì vậy, tỷ lệ tử vong cao cũng được ghi nhận nhiều hơn ở các quốc gia này [101, 111, 134]

Bảng 1.1 Tỷ lệ mắc và tử vong do UTVH ở các nước Đông Nam Á được ghi nhận vào năm 2018

Quốc gia Tỷ lệ mắc bệnh Tỷ lệ tử vong

Số ca Hạng % Số ca Hạng %

- Đồng thời, tại Việt Nam, cũng theo ghi nhận tại chương trình nghiên cứu ung thư trên thế giới thì UTVH xếp thứ sáu trong các loại ung thư phổ biến nhất tại Việt Nam và đứng đầu trong các loại ung thư vùng đầu và cổ (Hình 1.3)

Hình 1.3 Tỷ lệ các loại ung thư mắc phải phổ biến tại Việt Nam

Bệnh nguyên của UTVH

Hiện nay, việc chẩn đoán UTVH ở giai đoạn sớm thường chậm và gặp nhiều khó khăn bởi các triệu chứng ở giai đoạn đầu của bệnh khá mơ hồ, không đặc hiệu, rất dễ nhầm lẫn với các bệnh lý viêm nhiễm vùng tai mũi họng khác Trong đó, việc phát hiện bệnh ở giai đoạn sớm thì cơ hội chữa khỏi bệnh càng cao Cụ thể, ở giai đoạn I, tỷ lệ sống sau 5 năm ở những bệnh nhân mắc UTVH nếu điều trị kịp thời lên đến 72%, trong khi, UTVH nếu được phát hiện ở giai đoạn trễ, sẽ làm ảnh hưởng đến khả năng điều trị lẫn sống sót của bệnh nhân [200] Trong hai thập kỷ qua, việc điều trị UTVH đã được cải thiện đáng kể với sự kết hợp đồng thời của hóa trị và xạ trị Tuy nhiên, tỷ lệ mắc mới của bệnh nhân UTVH ở giai đoạn di căn vẫn còn khoảng từ 25-34% và tương quan với tỷ lệ sống sót thấp Do đó, việc tìm kiếm một hoặc nhiều dấu chứng sinh học, các chỉ thị phân tử (biomarker) ứng dụng trong chẩn đoán sớm, tiên lượng, thậm chí cả điều trị theo hướng y học cá thể hóa (personalized medicine) bao gồm trị liệu nhắm đích - nhắm tới một gen chuyên biệt, đặc hiệu cần cho sự phát triển và tồn tại của tế bào

UTVH hay nghiên cứu dược di truyền học (pharmacogenomics) – căn cứ vào đặc điểm di truyền của từng người ở cấp độ phân tử để đánh giá tác động đến việc cơ thể xử lý và đáp ứng với các loại thuốc điều trị đối với ung thư nói chung và UTVH nói riêng là vô cùng cấp thiết Cho đến nay, có ba nhóm nguyên nhân chính đã được xác định gây nên UTVH, bao gồm (1): Sự xâm nhiễm của Epstein–Barr virus (EBV infection); (2): Yếu tố di truyền (Genetic, Epigenetic susceptibility); (3): Yếu tố môi trường (Environmental carcinogens) [67] Đáng nhấn mạnh, UTVH là một bệnh lý đặc hữu với sự tương tác của nhiều nguyên nhân khác nhau (Bảng 1.2)

Bảng 1.2 Sự phân bố các yếu tố nguy cơ của UTVH trong các khu vực

Khu vực đại diện Quần thể đại diện

Khu vực Châu Á Đông Nam Á/ Ả Rập + + +

Trung Quốc + + + Đông Bắc Ấn Độ + + +

Khu vực Châu Âu Tây Ban Nha - + -

Khu vực Bắc Mỹ Đan Mạch - - +

1.1.3.1 Sự xâm nhiễm của Epstein-Barr virus

Epstein-Barr virus (EBV), hay còn gọi là human herpesvirus 4, được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1964 bởi Epstein và cộng sự [30] Về phân loại thì EBV thuộc họ

Herpesviridae, phân họ Gammaherpesvirinae, chi Lymphocryptovirus, loài Human Herpes virus 4 (HHV4) [69] Bộ gen của EBV có cấu trúc là DNA sợi đôi dài khoảng

184 kps mã hóa cho hơn 85 gen Có ba họ gen đóng vai trò rất quan trọng, bao gồm:

EBNAs (EBV nuclear antigens), LMPs (Latent membrane proteins) và EBERs

(Noncoding nuclear RNAs) [198, 199] Chức năng chính của các gen trong 3 họ gen được đề cập như sau: (1), EBNA-1 có chức năng sao chép bộ genome của EBV, phân chia episome của virus trong nguyên phân, góp phần tạo nên sự bất tử của tế bào,

EBNA-2 đóng vai trò là yếu tố kích hoạt đồng phiên mã giúp biểu hiện vượt mức các gen của virus và tế bào, tạo nên sự bất tử của tế bào; (2), LMP-1 làm giả tín hiệu của

CD40 ligand, tăng mức độ biểu hiện của Bcl-2 và a20, góp phần tạo nên sự bất của tử tế bào, LMP-2 đưa EBV vào trạng thái tiềm tan, đóng vai trò là một gen sinh ung

(oncogene) trong hội chứng Hodgkin và UTVH; (3), EBERs bao gồm EBER-1 và EBER-2, một trong những loại RNA không mã hóa xuất hiện trong giai đoạn tiềm tan của EBV [198, 199] Một nghiên cứu của Old và cộng sự (1996) đã phát hiện trên những mẫu huyết thanh của người bệnh UTVH có sự hiện diện của EBV, từ đó đưa ra giả thuyết đầu tiên về mối liên hệ giữa EBV với bệnh UTVH Về sau, các nghiên cứu lần lượt của Stevens (2005) và Frappier (2013) đều cho thấy sự hiện diện của EBV là một trong những chỉ điểm sinh học tiềm năng để hỗ trợ trong tiên lượng và chẩn đoán sớm bệnh UTVH [23, 158]

Riêng tại cộng đồng Việt Nam, đã có một nghiên cứu tiêu biểu của Lao và cộng sự (2017) ghi nhận được tỷ lệ dương tính các gen EBNA-1, EBNA-2, LMP-1, LMP-2 trong các mẫu UTVH cao hơn nhiều so với mẫu lành khi thực hiện trên tổng số 95 mẫu dịch phết bệnh và dịch phết lành bằng phương pháp PCR [69] Bên cạnh đó, tỷ lệ odds (OR) của các gen EBNA-1, EBNA-2, LMP-1 và LMP-2 làm tăng tỷ lệ mắc UTVH lên đến 81,10, 187,06, 158,26 và 84,60 lần so với trường hợp không có các gen EBNA-1, EBNA-2, LMP-1, LMP-2 Một điểm đáng chú ý, bốn gen này khi kết hợp trong sàng lọc và chẩn đoán cho độ đặc hiệu là 57,89%, độ nhạy lên đến 97,89%, hướng đến việc xây dựng một tổ hợp chỉ thị phân tử hữu ích, giúp cung cấp các thông tin, dữ liệu khoa học cần thiết cho các bác sĩ trong tiên lượng, chẩn đoán sớm và đánh giá về nguy cơ phát triển của bệnh trong trường hợp không xác định được các tiêu chuẩn chuẩn đoán lâm sàng ở bệnh UTVH, có thể được sử dụng như dấu chứng sinh học tiềm năng để phát hiện sự hiện diện và dự đoán cho sự phát triển của UTVH trên cộng đồng người Việt Nam Bên cạnh sự hiện diện của EBV, thì trong năm 2018, nhóm của ông cũng ghi nhận được sự hiện diện các biến thể trên gen EBNA-1 tại codon 487, bao gồm biến thể V-val, P-ala, P-thr và V-leu [63] Theo đó, biến thể V-val ở mẫu sinh thiết UTVH người Việt Nam là một biến thể đặc trưng ở khu vực châu Á và tương đồng với Trung Quốc [63] Bên cạnh nhóm gen EBNAs, thì một số biến thể khác như RPMS1-C/RPMS1-C * [62], hay sự biểu hiện ở các gen BALF5, LMPs cũng lần lượt được ghi nhận có mối tương quan mạnh với sự hình thành UTVH khi thực hiện trên chính mẫu sinh thiết vòm họng thu nhận từ bệnh nhân UTVH người Việt Nam [71, 73, 117]

Một số yếu tố môi trường đã được chứng minh làm tăng nguy cơ mắc bệnh UTVH có thể kể đến như tập quán tiêu thụ cá muối (nitrosamines), thói quen hút thuốc (nicotine), sử dụng rượu (acetaldehyde), phơi nhiễm nơi làm việc (formaldehyde) đã được ghi nhận [23,24]

Một phân tích tổng hợp (meta-analysis) gồm 32 nghiên cứu cho thấy nguy cơ mắc UTVH ở người hút thuốc cao hơn 60% so với người không hút thuốc [190] Theo công bố này, ở những người sử dụng thuốc lá với số lượng 30 gói trong một năm có nguy cơ mắc UTVH cao gấp hai lần so với người hút dưới 30 gói trong một năm Một điều đáng nhấn mạnh, nguy cơ mắc UTVH đã được chứng minh sẽ tăng dần theo thời gian và tần suất hút thuốc (tăng 1–2% với mỗi gói/năm) Khói thuốc lá với thành phần chính là nicotine, có thể chuyển hóa thành các hợp chất độc hại như nitrosamine (NNK

& NNN) thông qua quá trình nitro hóa (25) Trong khi đó, hai độc tố NNK (4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone) và NNN (N’-nitrosonornicotine) chuyển hóa từ nitrosamine trong khói thuốc lá là các chất gây ung thư phổ biến thông qua việc hoạt hóa nhóm enzyme CYP2E1 (enzyme chịu chức năng xúc tác các phản ứng oxy hóa, cũng chịu trách nhiệm cho sự chuyển đổi sinh học của nitrosamines) để tạo ra các dạng tổn thương DNA, gọi là DNA "adduct" (sản phẩm “cộng”, sản phẩm phụ) giúp khối u vòm họng hình thành và phát triển [115]

Hình 1.4 Con đường tín hiệu trong UTVH cảm ứng bởi Nitrosamines và Nicotine

Phân tích về con đường tín hiệu của hợp chất NNK và NNN, cho thấy NNN thường phản ứng với một thụ thể mang tên α7nAChR (thụ thể chịu trách nhiệm cho việc kích thích và tăng trưởng của các tế bào biểu mô ung thư), trong khi NNK lại ức chế với thụ thể α4β2nAChR (thụ thể ngăn chặn sự hình thành và tiến triển của ung thư), làm thúc đẩy hoạt động của các tế bào khối u bằng cách hoạt hóa dòng Ca 2+ đi vào bên trong các tế bào, dẫn đến sự khử cực của màng tế bào [115, 152, 181] Dòng Ca 2+ này sau khi đi vào bên trong tế bào, làm kích hoạt hàng loạt protein sinh ung như protein kinase C, serotonin, RAF1 (RAF proto-oncogene serine/threonine-protein kinase), ERK 1/2 (extracellular signal-regulated kinases 1&2), Bcl-2, gây ra sự tăng sinh tế bào ung thư Bên cạnh đó, con đường tín hiệu PI3K/Akt cũng được kích hoạt để đáp ứng với sự hiện diện của hợp chất NNK, làm tăng sinh tế bào khối u và ức chế quá trình apoptosis [115,

Thói quen ăn uống, đặc biệt là việc tiêu thụ cá muối hoặc các thực phẩm bảo quản có chứa nitrosamine hoặc tiền chất nitrosamine và một số hợp chất khác đã được báo cáo là một trong những yếu tố nguy cơ chính ở bệnh UTVH [57] Đầu những năm

1970, Ho và cộng sự phát hiện việc tiêu thụ cá muối có thể là một yếu tố nguy cơ ở bệnh UTVH trong một nghiên cứu gồm 2041 mẫu UTVH từ Hồng Kông và 205 trường hợp mắc UTVH từ Los Angeles [51] Tiếp theo, có ít nhất 11 nghiên cứu theo sau đã được thực hiện trên các cộng đồng khác nhau để chứng minh mối tương quan thuận giữa thói quen ăn cá muối với UTVH Trái ngược với các công trình trên, chỉ có một công trình nghiên cứu tại Thái Lan chỉ ra rằng không có mối liên quan đáng kể nào giữa việc ăn cá muối với nguy cơ mắc UTVH [28] Lý do chính cho việc không có sự tương quan này có thể đến từ cỡ mẫu nghiên cứu chưa đủ lớn để quan sát

Chất nitrosamine trong mắm cá muối kiểu Quảng Đông được biết là chất gây ung thư phổ biến cho con người và được đánh giá là chất gây ung thư nhóm 1 do Cơ quan Nghiên cứu Ung thư Quốc tế (The International Agency for Research on Cancer, IARC) công nhận [169] Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng cá được bảo quản bằng muối có chứa N-nitrosamine, là một nguồn hóa chất gây ung thư có thể tác động lên vòm họng ở những người dễ mắc bệnh Theo cơ chế hoạt động, nitrosamine ở cá muối có thể chuyển hóa thành các phân tử gây ung thư bởi sự hoạt hóa của enzyme CYP450 2E1 Ngoài ra, một số hợp chất nitrite và các tác nhân nitro hóa khác còn có thể được tổng hợp bởi chính vi khuẩn hiện diện trên cá muối (Staphylococci, các vi khuẩn nitrat hóa), làm chuyển hóa nitrat và nitrit của muối thành các hợp chất độc hại như N- nitrosodimethylamine (NDMA), N-nitrosodiethylamine (NDEA), N-nitrosopyrrolidine (NYPR) và N-nitrosopiperidine cũng đã được quan sát [3, 129, 131, 169] Một nghiên cứu đáng chú ý được thực hiện bởi Jia và cộng sự, cho thấy thói quen ăn cá muối mặn ngay từ nhỏ sẽ làm tăng nguy cơ mắc UTVH về sau lên đến 2,45 lần (30) Ngoài ra, các thực phẩm được bảo quản bằng muối khác cũng có tác động tương tự đối với nguy cơ mắc UTVH Chẳng hạn như một phân tích tổng hợp được thực hiện bởi Gallicchio và cộng sự (2006) chứng minh các loại thực phẩm ướp muối, hay ngâm muối cũng chứa hàm lượng nitrosamine cao [39] Theo công bố này, những người tiêu thụ các thực phẩm trên ít nhất một lần mỗi tháng có nguy cơ mắc bệnh UTVH cao gấp hai lần so với người lành Việc tiêu thụ thực phẩm lên men với tần suất ít nhất một lần trong một tuần cũng được tìm thấy làm tăng nguy cơ đáng kể trong sự hình thành của khối u vòm họng

MỘT SỐ CHỈ THỊ PHÂN TỬ TIỀM NĂNG TRONG CHẨN ĐOÁN SỚM, TIÊN LƯỢNG VÀ ĐIỀU TRỊ UNG THƯ VÒM HỌNG

Chỉ điểm sinh học (dấu chứng sinh học, chỉ thị sinh học) là thuật ngữ mô tả các phân tử có đặc điểm đo lường và đánh giá được một cách khách quan quá trình sinh lý của bệnh, ứng dụng trong các nghiên cứu về cơ chế phát sinh, phát triển và kết thúc của bệnh ở cấp độ phân tử hoặc có thể hiểu là chất phát hiện sự bất thường sinh học giúp chẩn đoán sớm ung thư [48] Điều đáng lưu ý, bất kỳ một sự thay đổi bất thường ở cấp độ tế bào, DNA, RNA qua quá trình chuyển hoá hoặc tổn thương ở mức độ protein đều có thể tạo ra các chỉ thị (phân tử) này [22] Trong bệnh học phân tử của ung thư thì vai trò của các dấu chứng sinh học thường được sử dụng để phản ánh mô hình bệnh sinh của UT tương quan với các đánh giá lâm sàng, đánh giá tác dụng của một thuốc điều trị

UT hay được nghiên cứu trong các thử nghiệm lâm sàng (liệu pháp miễn dịch, nhắm trúng đích) [143] Cho đến nay, đã có một số công trình nghiên cứu tiêu biểu trên thế giới tìm kiếm về các chất chỉ điểm sinh học (CCĐSH) đặc hiệu cho UTVH (tính chất methyl hóa một số gen, sự biểu hiện, hiện diện, tính đa hình đơn của EBV) [62, 63, 67,

70, 71, 73, 166] Đáng tiếc, số lượng các nghiên cứu về hồ sơ các gen biểu hiện bất thường (expression profilling) trên UTVH vẫn còn khá ít, chỉ chú ý đến một hay hai gen tiềm năng, mặc dù một số ít công bố cho thấy các bất ổn di truyển ở một số gen trên NST, cụ thể là tính chất biểu hiện bất thường của một số gen mục tiêu có thể là nhân tố chính, thúc đẩy sự xâm nhiễm của EBV, hoặc mở đầu cho tiến trình sinh ung trong bệnh sinh của UTVH [10, 78] Bên cạnh đó, sự phối hợp của nhiều dấu chứng sinh học còn giúp cho chẩn đoán sớm UTVH với độ nhạy và độ đặc hiệu rất cao [69] Một điều đáng lưu ý khác, việc phối hợp nhiều CCĐSH dựa trên tính chất biểu hiện của các gen còn có thể là một tổ hợp chỉ thị (phân tử) hữu ích, có tiềm năng ứng dụng, cung cấp các dữ liệu khoa học cho ngành khoa học Genomics,ứng dụng lâm sàng của dữ liệu Genome trong chẩn đoán sớm và nghiên cứu bệnh lý UTVH, biết được hệ thống gen của từng cá nhân và qua đó dùng thuốc tác động đặc hiệu vào các gen gây bệnh của người bệnh [58, 84,

170, 204, 217] Ngoài ra, sự hiểu biết chuyên sâu về các đường dẫn tín hiệu (phân tử) trong UTVH còn có thể giúp xác định thêm các dấu chứng sinh học mới trong chẩn đoán sớm và tiên lượng cũng như có thể ứng dụng phương pháp “nhắm trúng đích” trong việc điều trị cá thể ở những bệnh nhân mắc UTVH trong tương lai gần Do đó, trong nghiên cứu này, nguyên nhân di truyền được xét ở khía cạnh: tính chất biểu hiện bất thường của một số gen mục tiêu vừa là các phân tử đích trực tiếp của các miRNAs vừa là các chỉ thị phân tử độc lập đóng vai trò quan trọng như thế nào trong việc hình thành, phát triển khối u vòm họng sẽ được đề cập rõ (Bảng 1.4)

Bảng 1.4 Chức năng cụ thể và con đường tín hiệu của ba gen mục tiêu

Tên gen Chức năng trong UTVH Con đường tín hiệu tham gia

• Ức chế quá trình apoptosis

• Thúc đẩy sự di cư

• Kháng lại hóa trị liệu (ciplastin)

Con đường tín hiệu: p53, PI3K-Akt, Apoptosis

• Ức chế sự tăng trưởng, sống sót, tăng sinh, di cư, xâm lấn, cảm ứng sự sinh mạch

• Nhạy với liệu pháp xạ trị

Con đường tín hiệu: Akt/mTOR, PI3K-Akt, HIF-1, Apoptosis, EMT

PDCD4 • Ức chế sự tăng sinh, sống sót, di cư, xâm lấn và di căn

Con đường tín hiệu: Apoptosis, FoxO, EMT, JNK, PI3K/Akt/mTor

• Nhạy với hóa trị liệu (cilastin)

• Thúc đẩy quá trình apoptosis, duy trì pha tiềm tan của EBV

1.2.1 Bcl-2 (B cell lymphoma 2) – nhân tố ức chế cơ chế tự thực bào và con đường tín hiệu apoptosis

Bcl-2 (hay còn được gọi là B cell lymphoma 2), nằm trên nhiễm sắc thể số 18, vị trí 18q21.33, là một thành viên thuộc họ Bcl-2, mã hóa protein với trọng lượng phân tử nặng 26 kD gồm 239 amino acids với một domain kỵ nước ở đầu C (C-terminus) cho phép nó định vị chủ yếu tại màng ngoài của ty thể, màng nhân và mạng lưới nội chất [179, 196] Bcl-2 là một protein được cấu thành bởi bốn domain khác nhau, bao gồm BH1 (nằm từ amino acid 136 đến 155), BH2 (amino acid 187 đến 202), BH3 (amino acid 93 đến 107), BH4 (amino acid 10 đến 30) và một lớp màng bán thấm nằm từ amino acid 230 đến 239 (Hình 1.6) Một số nghiên cứu cho thấy vùng Bcl-2 gồm bảy chuỗi xoắn alpha, bao gồm hai xoắn kỵ nước trung tâm (α1 và α2) được bao quanh bởi năm xoắn ốc lưỡng tính (α3, α4, α5, α6 và α7), các domain BH1, BH2 và BH3 nằm rất gần nhau và tạo thành khe hở kỵ nước để tương tác các thành viên khác trong họ Bcl-2 [24] Chức năng chủ yếu của gen này là duy trì sự sống sót của tế bào, bằng cách ức chế con đường tín hiệu apoptosis [133]

Hình 1.6 Cấu trúc protein của Bcl-2 [1]

Tùy vào số lượng sắp xếp của các domain mà chúng được phân làm hai loại chính yếu, là pro-apoptotic và anti–apoptotic, có chức năng kiểm soát sự chết tế bào theo chương trình thông qua việc điều hòa tính thấm màng ngoài của ty thể, dẫn đến con đường apoptosis [133] Nhìn chung, những domain BH này đóng vai trò quyết định chức năng của các protein tạo thành, chẳng hạn ở những protein kháng apoptosis thường có đầy đủ cả 4 domain BH (Bcl-2, Bcl-XL), trong khi ở nhóm pro-apoptotic, các BH domain lại chia thành hai nhóm: (1), nhóm chứa nhiều domain (multi domain) như Bax, Bak,…và (2), nhóm chỉ chứa duy nhất một vùng domain BH3 (BH3 only) như Bim, Bid, BAD,…(Hình 1.7) Tóm lại, về cấu trúc tổng quát của họ Bcl-2 có một số đặc điểm phân tử đáng chú ý như sau: (1): Tất cả những protein của họ Bcl-2 đều chứa hoặc chỉ chứa domain BH1, BH2 BH3 hoặc BH4; (2): Tất cả các protein kháng apoptosis đều chứa domain BH1 và BH2, một số có thêm BH4 ở đầu N như Bcl-2, Bcl-w và Bcl-XL; (3): Đối với các pro-apoptotic protein, cấu trúc chúng đều chứa vùng domain BH3, cần thiết cho việc dimer hóa với những protein khác của họ Bcl-2 và đảm báo cho hoạt tính tiêu diệt tế bào, một số protein khác lại chứa thêm cả domain BH1 và BH2 như Bax và Bak; (4): Vùng domain BH3 cũng hiện diện ở một số anti-apoptotic protein như Bcl-2, trong khi domain BH3 lại là một α-helix lưỡng tính (có cả phần ưa nước lẫn kỵ nước), do đó, nếu được gắn vào các rãnh kỵ nước của các phân tử kháng apoptosis, sẽ làm mất đi khả năng duy trì sống sót của tế bào ở những phân tử này Như vậy, trong con đường apoptosis, các nhóm protein đặc biệt chỉ có mỗi domain BH3 (BH3 only) thường xuyên đối kháng chọn lọc (ức chế) sự biểu hiện của Bcl-2 thông qua việc gắn vào các túi kỵ nước của các protein này Đây cũng chính là cơ sở khoa học đầu tiên cho việc thiết kế các phân tử “giả dạng BH3” (BH3 mimetic) để ra đời nhóm thuốc ức chế Bcl-2 trong các loại ung thư ác tính [1, 156]

Hình 1.7 Cấu trúc protein của các thành viên họ Bcl-2 [24]

Nhiều nghiên cứu cho thấy: Bcl-2 là một gen sinh ung mã hóa cho protein có chức năng kháng apoptosis của tế bào UTVH thông qua con đường ty thể, theo đó con đường này có thể được kích hoạt bởi các yếu tố kích thích như xạ trị, sự tổn thương DNA, và stress tế bào [42] Trong điều kiện có các yếu tố kích thích, Bcl-2 cư trú trên màng ty thể bên ngoài có thể mất ổn định thông qua sự giảm biểu hiện, theo đó, tỷ lệ giữa các chất proto-apoptotic và chất đối kháng apoptosis ngày càng lớn, gây ra sự lắp ráp các oligomers Bax, Bak ở màng ngoài ty thể [42, 120] Những oligomers này làm tổn thương tính thấm của màng, cho phép thành lập những kênh đầy protein ngoài màng [161] Kết quả là những nhân tố proto-apoptosis từ khoảng gian màng của ty thể được phóng thích vào bên trong tế bào chất Trong số này, các Cytochrome c (Cyt c) hoạt hoá trực tiếp Apaf1 với sự hiện diện của dATP hoặc ATP, tạo điều kiện hình thành một phức hợp “apoptosome” [194] Thể apoptosome sau khi được hình thành sẽ tuyển lựa và điều biến quá trình tự hoạt hoá caspase khởi đầu (caspase 9), rồi tiếp tục hoạt hoá các caspase “thực thi” 3, 6 và 7, dẫn đến sự chết của tế bào (apoptosis) Một số yếu tố kích thích khác như p53 hay Myc cũng có thể cảm ứng quá trình apoptosis thông qua việc phiên mã trực tiếp nhóm protein chỉ có BH3 (PUMA, NOXA, ), gây liên kết và ức chế Bcl-2 qua việc gắn vào domain BH3 của phân tử này, làm thúc đẩy cái chết của các phân tử dựa trên tính thấm hóa của màng ty thể [47] Trong con đường tín hiệu apoptosis cảm ứng bởi Bcl-2, Bcl-2 thường xuyên gắn với nhóm Bax, Bak thông qua vùng domain BH1 và BH2, hai vùng domain cần thiết cho chức năng ngăn chặn sự chết của Bcl-2, đóng vai trò trung tâm trong vai trò điều hòa âm tính quá trình apoptosis của hai phân tử này, làm ngăn cản sự phóng thích Cyt c ra khỏi ty thể, dẫn đến cơ chế kháng apoptosis [120, 126] Bên cạnh đó, các caspase 3 sau khi được hoạt hóa cũng có thể phân cắt tại các vị trí amino acid 34, 35 của Bcl-2, làm bất hoạt chức năng sinh ung của Bcl-2 Ngoài cơ chế chết tế bào theo chương trình, Bcl-2 còn chống lại sự tự thực bào (autophagy) bằng cách ức chế protein Beclin 1 (Atg6) cần thiết cho sự hình thành cơ chế tự thực bào [125], được mô tả ở hình 1.8

Hình 1.8 Con đường tín hiệu Apoptosis và sự tự thực bào cảm ứng bởi Bcl-2

Bcl-2 được phát hiện lần đầu tiên tại điểm gãy (breakpoint) do chuyển đoạn t(14,18) ở lympho nang (follicular lymphoma) cách đây 33 năm [83] Ngay từ trong tên gọi, đã cho thấy mối liên hệ mật thiết của gen mục tiêu này với cơ chế bệnh sinh của các nhóm bệnh lý dòng lympho Tuy nhiên, cũng có lẽ vì điều đó, hay ít nhất một phần, đã có sự “thiên vị” trong các nghiên cứu về vai trò của gen đích này trong các bệnh lý dòng tủy Thậm chí, hàng loạt những bất thường trong Bcl-2 ở nhiều loại lympho còn đưa đến việc ứng dụng các các chất ức chế Bcl-2 trong điều trị lympho [130] Riêng trong UTVH, Bcl-2 vẫn là một protein sinh ung (onco-protein) với vai trò ức chế quá trình apoptosis [133] Một nghiên cứu của Lu và cộng sự (1993) cho thấy Bcl-2 được phát hiện lên đến 80% ở carcinome tế bào gai không sừng hóa ở vòm họng (type 3, loại UTVH hay gặp nhất trong bệnh nhân UTVH của Việt Nam) và hiện diện tỷ lệ thấp (33,33%) ở carcinome tế bào gai sừng hóa (type 1) [94] Ngoài ra, mức biểu hiện thấp của Bcl-2 cũng được ghi nhận trên mẫu lành Nhằm tìm hiểu rõ nét hơn các đặc điểm phân tử của Bcl-2 dẫn đến sự hình thành và phát triển của UTVH, một nghiên cứu của Sheu và cộng sự (1997) phân tích sự biểu hiện của Bcl-2 trên bốn loại mẫu sinh thiết: mẫu sinh thiết lành, mẫu sinh thiết lành bị viêm ở biểu mô vòm họng (không có u), mẫu sinh thiết loạn sản tiền xâm lấn mức độ cao (hình thức tổn thương tiền ung thư sớm nhất có thể nhận ra trong sinh thiết) và mẫu sinh thiết UTVH [146] Theo đó, sự biểu hiện của Bcl-2 đạt 80% trên mẫu UTVH, hoàn toàn tương đồng với nghiên cứu của Lu và cộng sự (1993), chiếm tới 71% trên mẫu sinh thiết loạn sản trầm trọng, và cao hơn có ý nghĩa so với mẫu lành (p < 0,05) Điều này cho thấy sự tăng biểu hiện của Bcl-2 để tránh apoptosis dường như xảy ra từ giai đoạn sớm và có thể đóng một vai trò quan trọng trong quá trình sinh ung và tiến triển của UTVH khi được tìm thấy trên chính mẫu sinh thiết lành, cho đến mức độ nặng nhất của loạn sản mang tên ung thư biểu mô “tại chỗ” (carcinoma in situ, là sự phát triển không kiểm soát của tế bào vòm họng nằm tại vị trí ban đầu (trên màng đáy), chưa có biểu hiện xâm lấn đến nơi khác) và cuối cùng là mẫu UTVH Tương tự, một công trình tiêu biểu của Song và cộng sự (2006) thực hiện trên 164 mẫu lành (68 mẫu lành loạn sản, 45 mẫu sinh thiết lành tăng sản - mẫu có sự tăng kích thước của tổ chức và cơ quan nhưng chúng vẫn giữ trật tự sắp xếp bình thường trong mô (hyperplasia), 55 mẫu sinh thiết lành (được chẩn đoán không mắc UTVH) và 148 mẫu UTVH cho thấy sự tăng biểu hiện tăng của Bcl-2 chiếm 88,2% ở mẫu UTVH không bị biệt hóa (type 3 UTVH) cao hơn có ý nghĩa so với mẫu lành (p <

0,001), làm tăng nguy cơ và tỷ lệ mắc UTVH với sự khác biệt có ý nghĩa giữa mẫu mô sinh thiết bệnh và lành [33] Bên cạnh đó, sự tăng biểu hiện của Bcl-2 còn tương quan với giai đoạn bệnh, biểu hiện lên đến 92,5% ở giai đoạn III và IV Xét riêng về sự biểu hiện chuyên biệt của Bcl-2 trên từng loại sinh thiết, một sự khác biệt rất có ý nghĩa đã được quan sát thấy về mức độ biểu biện giảm của Bcl-2 trên chính mẫu lành và mẫu tăng sản so với mẫu UTVH Những kết quả này chỉ ra rằng quá trình tích lũy dần của sự bất hoạt của một số gen ức chế khối u, sự kích hoạt của Bcl-2 (gen sinh ung), cũng như tỷ lệ nhiễm EBV cao có liên quan chặt chẽ đến con đường hình thành và chuyển dạng UTVH từ các loại tổn thương biểu mô vòm họng cho đến UTVH [33] Quan sát trên mẫu lành, sự biểu hiện bất thường của Bcl-2 cao hơn một cách có ý nghĩa và thường xuyên quan sát thấy trên mẫu loạn sản hơn so với mẫu lành tăng sản, và phần trăm dương tính biểu hiện của Bcl-2 cũng nhiều hơn ở mẫu loạn sản so với mẫu lành (p <

0,01) Nghiên cứu này cũng khẳng định Bcl-2 chính là một yếu tố nguy cơ trong quá trình sinh ung Ngoài ra, ở một số công trình nghiên cứu tại các cộng đồng khác nhau trên thế giới cũng ghi nhận được tỷ lệ phát hiện của Bcl-2 đạt 89% trường hợp mắc UTVH người Nhật Bản [114], chiếm 75% mẫu mô mô đúc parrafin người Thái Lan [119], 76,49% ở ca mắc UTVH người Tây Ban Nha [174], 73% ở người mắc UTVH tại Bắc Phi [7], 75% trường hợp dương tính với sự biểu hiện của Bcl-2 ở UTVH trẻ em Argentina (pediatric carcinoma) [31] và 74,3% trường hợp mắc UTVH trên cộng đồng người Turkish [35], ngược lại, ở mẫu lành, tần số biểu hiện của gen này lại rất thấp Nhìn chung, sự tăng biểu hiện của Bcl-2 hoàn toàn tương quan dương với nguy cơ và tỷ lệ mắc bệnh UTVH, mối tương quan này có ý nghĩa về mặt thống kê

Ngoài sự biểu hiện độc lập của Bcl-2, thì một số hướng nghiên cứu kết hợp giữa yếu tố nhiễm EBV (sự hiện diện của EBV, tính chất biểu hiện của LMP-1, EBER-1,2) và yếu tố di truyền (sự tăng biểu hiện của Bcl-2) cũng đã được thực hiện [33, 119, 174] Theo đó, sự tăng biểu hiện của Bcl-2 trong các tế bào UTVH dương tính với EBV đã được chứng minh là cao hơn hẳn so với các mẫu âm tính EBV [193, 201] Do đó, mặc dù sự biểu hiện của Bcl-2 có thể không liên quan trực tiếp đến tính nhiễm EBV, tuy nhiên, Bcl-2 vẫn có thể hoạt động phối hợp với LMP-1 để thúc đẩy tăng trưởng tế bào khối u vòm họng nhanh hơn so với Bcl-2 hoạt động đơn lẻ [146] Thậm chí, một số tổ nhóm chỉ điểm sinh học (CCĐSH) có chứa Bcl-2 cũng được tiến hành nghiên cứu, có ứng dụng tiềm năng trong chẩn đoán sớm, đặc biệt là ứng dụng trong tiên lượng, hay các đáp ứng điều trị cũng được ghi nhận, chẳng hạn như tổ hợp có Bcl-2 và p53 - các chỉ thị phân tử của con đường apoptosis Gen ức chế khối u p53 (tumor supressor gene) là một gen quan trọng có vai trò điều hòa chu kỳ của tế bào (91) Công bố đầu tiên của Sheu và cộng sự (1997) cho thấy có đến 77% mẫu sinh thiết UTVH có sự đồng biểu hiện của p53 và Bcl-2, và sự tương quan này dường như xảy ra ở giai đoạn sớm trong tiến triển của bệnh, ngụ ý về sự tăng biểu hiện của Bcl-2 và thay đổi chức năng của p53 đóng một vai trò quan trọng trong bệnh sinh của UTVH [146] Tuy nhiên, một công bố thực hiện trên người mắc UTVH Nhật Bản lại cho thấy không có sự tương quan giữa Bcl-2 và p53 dù có 50% trường hợp mắc UTVH dương tính với sự biểu hiện cả hai gen này [114] Dữ liệu này ngụ ý, cơ chế tăng biểu hiện của Bcl-2 trong con đường tín hiệu apoptosis có thể phụ thuộc, hoặc không phụ thuộc vào p53 Một công bố tiêu biểu của Fan và cộng sự (2006) cho thấy sự biểu hiện bất thường của p53 có tương quan với sự biểu hiện của Bcl-2 và EBER-1, sự tương quan này được cho là có ý nghĩa thống kê (p

= 0,01) [33] Về tiến trình sinh ung, mức độ biểu hiện của p53 và EBER-1 được cho là cao hơn một cách có ý nghĩa ở mẫu UTVH so với mẫu loạn sản, tăng sản và mẫu lành (p < 0,001), đồng thời, ở mẫu lành, một sự khác biệt có ý nghĩa được quan sát trên mẫu loạn sản (tổn thương tiền ung thư) so với mẫu tăng sản (EBER-1), và mẫu tăng sản so với mẫu lành (đối với p53) [33] Như vậy vai trò của EBV trong sự tiến triển của UTVH ban đầu đã được xác định, sự biểu hiện của phơi nhiễm EBV được tìm thấy trên mẫu UTVH và loạn sản cao hơn so với mẫu tăng sản một cách chặt chẽ, cho thấy tính nhiễm EBV trong tiến trình sinh ung của UTVH có thể xuất hiện từ giai đoạn loạn sản, theo đó, EBV có thể đóng vai trò là một bước quan trọng trong tiến trình chuyển đổi của các tổn thương tiền UTVH sang UTVH Như đã đề cập, UTVH là một bệnh lý ác tính với sự tương tác lẫn nhau của nhiều yếu tố, cụ thể ở đây là yếu tố nhiễm và một số bất ổn di truyền trong cơ chế sinh ung của UTVH Hay nói cách khác, trong giai đoạn sớm nhất của tiến trình sinh ung, sự tăng biểu hiện quá mức của p53 có thể là sự thay đổi chính trong giai đoạn tế bào biểu mô vòm họng bình thường sang tế bào tế bào biểu mô tăng sản, trong khi từ giai đoạn tăng sản sang loạn sản lại chủ yếu phụ thuộc vào sự biểu hiện cao của EBV (sự tăng biểu hiện của EBER-1,2) và tăng biểu hiện vượt mức của Bcl-2, và ở giai đoạn cuối từ loạn sản sang UTVH lại đến từ sự tăng biểu hiện bất thường của p53 với tính nhiễm cao của EBV (Hình 1.9) Tóm lại, sự biểu hiện bất thường của các gen trên NST có thể xảy ra trước sự xâm nhiễm của EBV, đóng vai trò là nhân tố thúc đẩy tính nhiễm của EBV, có tiềm năng trong chẩn đoán sớm, sàng lọc và tiên lượng trong UTVH [33]

Hình 1.9 Sơ đồ mô tả bệnh sinh cơ bản của UTVH

Bên cạnh việc xác định Bcl-2 là một yếu tố nguy cơ trong chẩn đoán sớm UTVH, thì Bcl-2 còn được nhìn nhận là một yếu tố tiên lượng kém và độc lập ở những bệnh nhân mắc UTVH [35] Về mặt lý thuyết, gen Bcl-2 dẫn đến sự kháng xạ trị và tiên lượng xấu thông qua hai cơ chế: (1), ngăn chặn quá trình apoptosis tự phát, dẫn đến sự sống sót và tích lũy nhanh chóng các tế bào khối u vòm họng và (2), làm cản trở các điều trị liên quan đến apoptosis, bất kể loại trị liệu được sử dụng Theo đó, hai công trình nghiên cứu lần lượt của Sempere và Sarac cho thấy sự biểu hiện của Bcl-2 hoàn toàn tương quan với tỷ lệ sống sót kém ở những bệnh nhân mắc UTVH, sự tương quan này rất có ý nghĩa thống kê, ngoài ra sự đồng biểu hiện của cả hai phân tử Bcl-2 và LMP-1 còn tương quan mạnh với sự di căn của hạch bạch huyết so với mẫu không có di căn của hạch [137, 174] Công bố của Yu và cộng sự (2003) cho thấy ở nhóm bệnh nhân mắc UTVH có sự biểu hiện của Bcl-2 cho kết quả 65% bệnh nhân bị tái phát và 61% bệnh nhân chết sau 5 năm khi so sánh với nhóm không có sự biểu hiện gen này [201] Một điểm đáng chú ý khác, xác suất bị tái phát và tử vong ở những bệnh nhân UTVH có sự biểu hiện của Bcl-2 cao hơn so với nhóm chứng lên đến 3,38 và 4,75 lần Đồng thời, hai nghiên cứu lần lượt của Chen và cộng sự, đều đồng ủng hộ: (1): Sự biểu hiện của Bcl-2 là một yếu tố tiên lượng quan trọng trong giai đoạn tiến triển của bệnh (giai đoạn III và IV); (2): Bệnh nhân mắc UTVH giai đoạn cuối, âm tính với sự biểu hiện của Bcl-2 cho tỉ lệ sống còn không bệnh (disease-free survival rates) cao hơn so với những bệnh nhân mắc UTVH dương tính với biểu hiện của Bcl-2 ở giai đoạn III; (3): Tỷ lệ hoàn toàn khỏi bệnh sau 5 năm với sự biểu hiện của Bcl-2 tương đối thấp, chỉ có 29,9%; (4): Phân tử ức chế Bcl-2 trong điều kiện in vitro mang tên HA14-1 cho thấy khả năng ức chế sự di cư và biểu hiện của MMP-2 (matrix metalloproteinase-2)trên dòng tế bào UTVH, ngụ ý phân tử tổng hợp này có thể là một phương pháp điều trị mới với những bệnh nhân mắc UTVH dương tính với sự biểu hiện của Bcl-2 [17, 18] Ngoài ra, sự ức chế của Bcl-2 bằng phân tử có cấu trúc kẹp tóc nhỏ (small hairspin RNA, shRNA) tự tổng hợp tên YC137 làm thúc đẩy tính nhạy của dòng tế bào UTVH với ciplastin (hóa chất điều trị UTVH), tạo ra sự khử cực màng ty thể, làm hoạt hóa các caspase 9, caspase 3 và 7, bắt đầu tiến trình chết theo chương trình [93] Tóm lại, những nghiên cứu này đều chỉ ra rằng tính chất biểu hiện tăng của gen Bcl-2 là một dấu chứng sinh học đặc trưng cho sự hình thành UTVH, tiềm năng trong việc phát hiện sớm và tiên lượng, điều trị trong ung thư vòm họng

1.2.2 PDCD4 (Programmed Cell Death 4) - nhân tố điều hòa chu trình tế bào, con đường tín hiệu PI3K/Akt và sự chết tế bào theo chương trình

Gen PDCD4 (Programmed Cell Death 4), định vị tại vị trí 10q25.2 trên nhiễm sắc thể số 10 của bộ gen người, có kích thước 21 kb và chứa 11 exon Protein PDCD4 được mã hóa có chiều dài 469 amino acid với trọng lượng phân tử nặng gần 52 kD, gồm hai domain MA3 xoắn ốc alpha với mỗi domain dài khoảng 130 amino acid, chịu trách nhiệm cho việc gắn với nhân tố eIF4A (eukaryotic initiation factor-4A) để ức chế sự khởi đầu dịch mã bằng cách ngăn chặn eIF4G (Eukaryotic translation initiation factor 4 G) liên kết với eIF4A, trong khi đó eIF4A là một enzyme tháo xoắn RNA,xúc tác cho việc dãn xoắn cấu trúc thứ cấp ở vùng 5′ không dịch mã (5’UTR) của các mRNA đích, làm hạn chế sự tái tổ hợp ribosome, tổng hợp protein và ức chế khối u [211] Bên cạnh đó, protein PDCD4 còn chứa tín hiệu “xuất nhân” (nuclear export signals, NES) giúp protein này có thể có thể di chuyển qua lại giữa nhân và tế bào chất, làm ngăn chặn sự dịch mã xảy ra ở tế bào chất [5] Đáng chú ý, sự phosphoryl hóa tại hai vị trí amino acid Serine 67 và 457 của PDCD4 bởi hai nhân tố Akt và S6K1 (S6 kinase beta-1) làm thúc đẩy con đường thoái biến hay thủy phân protein PDCD4 phụ thuộc vào ubitiquin, giúp đánh dấu cấu trúc, protein của PDCD4 thông qua sự hoạt hóa của enzyme E3 (β- transducin repeat-containing protein, β-TRCP), làm phân giải protein này thông qua hệ thống ubiquitin-proteasome [26, 123] Ngoài ra, nó cũng được báo cáo liên kết với các RNA mục tiêu thông để thực hiện chức năng thông qua hai phân nhóm amino acid tích điện dương của nó tại vùng domain N-terminal (Hình 1.10)

Hình 1.10 Cấu trúc protein PDCD4 ở người [5]

Trong UTVH, PDCD4 đã được báo cáo tham gia vào việc kiểm soát một số con đường truyền tín hiệu tế bào quan trọng trong sự phát triển của khối u [213] Cụ thể, PDCD4 tương tác với eIF4A – nhân tố bắt đầu sự dịch mã của các gen sinh ung và protein AP-1, làm ngăn cản việc tạo ra các yếu tố phiên mã như c-Fos, cyclin D1 và c-

microRNA – MỘT CƠ CHẾ CỦA EPIGENETIC

microRNA (miRNA/miR) là một họ các phân tử RNA không mã hóa, có chiều dài khoảng 21 nucleotide (nt), đóng vai trò quan trọng trong điều hòa sau phiên mã sự biểu hiện gen ở người [36, 159, 203] Bên cạnh đó, chúng còn được chứng minh liên quan đến nhiều loại bệnh học, sinh học khác nhau như sự hình thành, phát triển, biệt hoá và thậm chí là cái chết của tế bào, bao gồm cả ung thư Thông thường, các miRNA có chức năng ức chế biểu hiện hoặc làm tăng biểu hiện của một hoặc nhiều gen đích bằng cách tương tác với vùng không dịch mã (3’-UTR) của các RNA thông tin (mRNA) tương ứng [61, 99, 167] Cùng với đó, kể từ khi được phát hiện lần đầu tiên vào năm

1993 bởi Vitor Ambros và cộng sự, có tên là miRNA lin-4 trên loài giun thì đến nay đã có hơn 20.000 phân tử miRNA được xác định trên 93 loài khác nhau, và hơn 2000 miRNA ở người có thể điều hoà đến hơn 60% toàn bộ hệ gen người

Bên cạnh sự biến đổi của các miRNA, sự rối loạn chức năng của quá trình sinh tổng hợp miRNA hoặc các biểu hiện bất thường của miRNA có thể gây ra nhiều loại ung thư thì một số tính chất đáng lưu ý giúp miRNA trở thành một lựa chọn tối ưu cho khuynh hướng sử dụng như một dấu chứng sinh học có thể kể đến, bao gồm tính đặc trưng trong các loại ung thư, tính lưu thông trong nhiều loại mẫu như huyết thanh, huyết tương, nước tiểu, nước bọt và các thành phần dịch khác trong cơ thể, tính bền giúp miRNA kháng lại các hoạt động của Rnase, điều kiện pH, nhiệt độ cực đoan Nói cách khác, các phân tử miRNA là khá bền [72]

1.3.1 Quá trình sinh tổng hợp miRNA

Quá trình sinh tổng hợp miRNA bao gồm các sự kiện phân cắt xảy ra trong nhân và sau đó là trong tế bào chất được thực hiện bởi hai phân tử mang tên Drosha và Dicer (thuộc nhóm RNase III) có bản chất endonuclease [25, 99], gồm 6 bước chính, (1): Ở giai đoạn trong nhân, các gen mã hóa cho miRNA hay các vùng intron mã hóa sẽ được phiên mã bởi RNA polymerase II tạo thành các phân tử miRNA sơ cấp (primary miRNA, pri-miRNA) Về cấu trúc, phân tử pri-miRNA chứa một đến hai cấu trúc kẹp tóc [59], có đầu 5’ được gắn mũ chụp và đầu 3’ có cấu trúc dạng poly(A) Sau đó, (2): các phân tử pri-miRNA sẽ được biến đổi thành phân tử pre-miRNA (precursor miRNA) với cấu trúc thứ cấp có chiều dài khoảng 70 nt với đầu 5’ phosphate và 3’ nhô ra hai nucleotide [25, 159] Trong khi đó, quá trình biến đổi này cần thiết phải có sự hỗ trợ của phân tử Drosha [25], trong khi phân tử Drosha chỉ thể hiện hoạt tính phân cắt khi hình thành phức hợp với một phân tử protein dsRBD có tên là Pasha (trong Drosophila) hay DGCR8 (trong động vật có vú) để phân cắt pri-miRNA thành pre-miRNA [25] (3): Phân tử pre-miRNA sau khi được tạo thành, đầu 3’ có 2 nucleotide nhô ra, sẽ được phân tử exportin-5 nhận diện và vận chuyển ra khỏi nhân, vào trong tế bào chất để bước vào giai đoạn biến đổi tiếp theo thông qua con đường RAN-GTP (RAs-related Nuclear – GTP pathway) [159] (4): Khi đi vào trong tế bào chất, pre-miRNA tiếp tục bị cắt bởi phân tử Dicer tạo thành thể miRNA nhị phân dạng mạch đôi có chiều dài khoảng 20 nt

[36] Tiếp theo, (5) và (6): phân tử miRNA mạch đôi sẽ được tháo xoắn, một trong hai mạch (mạch passenger) sẽ nhanh chóng bị phân hủy, mạch còn lại chính là miRNA trưởng thành (mature miRNA) gắn kết với protein Ago (là nhân tố khởi đầu dịch mã

2C2 – eIF2C2 ở eukaryote) và phức hợp RISC (RNA-induced silencing complex) để tham gia vào quá trình điều hòa sự biểu hiện gen thông qua hai cách: phân hủy mRNA hay ức chế sự dịch mã [59], được mô tả ở hình 1.14

Hình 1.14 Con đường sinh tổng hợp miRNAs [68]

1.3.2 Cơ chế phân tử hoạt động của miRNA

Sự bất thường biểu hiện của miRNA trong ung thư được chia thành hai nhóm chính: (1), sự tăng biểu hiện của miRNA (up-regulated miRNA) và (2), sự giảm biểu hiện của miRNA (down-regulated miRNA) [159, 203] Nếu một miRNA tăng biểu hiện và ức chế quá trình tổng hợp một hoặc nhiều gen ức chế khối u thì đó là các miRNA gây ung thư (onco-miRNA) Ngược lại, nếu một miRNA được giảm biểu hiện và ức chế sự tổng hợp một hay nhiều gen gây ung thư, đó là các miR ức chế khối u (tumor suppressor miRNA) (Hình 1.15)

Hình 1.15 Vai trò của miRNA [68]

Các phân tử miRNA tham gia vào quá trình điều hòa âm sự biểu hiện gen bằng cách gắn vào vùng 3’ không dịch mã (3’UTR) của mRNA mã hóa cho phân tử protein, làm cho mRNA bị phân hủy hoặc sự dịch mã xảy ra trên phân tử mRNA này bị khóa [36] Bên cạnh đó, một vài nghiên cứu gần đây còn cho thấy miRNA có khả năng gắn lên vùng 5’ không dịch mã (5’UTR), chẳng hạn như miR-10a tương tác với vùng 5’UTR của mRNA tăng cường dịch mã tạo protein ribosome [121] Tóm lại, miRNA hoạt động theo hai phương thức: (1) là ức chế quá trình dịch mã, (2) là phân hủy RNA thông tin (mRNA)

Giai đoạn đầu tiên khi hình thành phức hợp miRNA-RISC, là giai đoạn nhận diện mRNA của gen mục tiêu [99] Phức hợp miRNA-RISC này sẽ gắn lên vùng 3’UTR của mRNA thông qua sự bắt cặp bổ sung của các base giữa mRNA với trình tự trên mạch dẫn (guide strand) của phân tử miRNA theo nguyên tắc bổ sung của Watson-Crick [183] Sự nhận diện này phụ thuộc rất nhiều vào sự bắt cặp bổ sung của base giữa vùng

“trung tâm” trên phân tử miRNA với mRNA Trong đó, vùng “trung tâm” là vùng trình tự nằm ở đầu 5’ của phân tử miRNA có kích thước từ 2 - 7 nucleotide (Hình 1.16) Sự bắt cặp giữa các cặp base giữa vùng “trung tâm” với vùng trình tự trên mRNA có thể trùng khớp hoàn toàn hoặc không hoàn toàn và quyết định tính ổn định tương tác giữa miRNA với mRNA Hiện nay, có hai cơ chế để giải thích cho quá trình ức chế dịch mã, câm lặng gen: phụ thuộc hay không phụ thuộc vào phân tử cắt “slicer” [36]

Hình 1.16 Các kiểu bắt cặp giữa miRNA và mạch mRNA mục tiêu [68]

Quá trình im lặng gen phụ thuộc vào phân tử cắt (slicer), tức là khi có sự bắt cặp hoàn toàn giữa vùng “trung tâm” với trình tự trên mRNA và sự bắt cặp này mở rộng sang hai bên vùng “trung tâm” khoảng 10-11 nucleotide, được xúc tác bởi Ago2 Các sản phẩm của quá trình phân cắt được phân hủy bắt đầu bằng sự deadenyl hóa phân tử mRNA để loại bỏ đuôi polyA Tiếp theo, quá trình phân hủy mRNA được thực hiện bởi exosome – một phức hợp protein với hoạt tính 3’- 5’ exonuclease Ngoài ra, phân tử mRNA có thể bị tháo mũ chụp ở đầu 5’ bởi enzyme Dcp1 và Dcp2, mRNA bị phân hủy bởi Xrnp1 có hoạt tính 5’-3’ exoribonuclease [99]

Sự im lặng không phụ thuộc vào phân tử cắt (slicer) là sự bắt cặp không hoàn toàn giữa vùng “trung tâm” với phân tử mRNA đích dẫn đến sự ức chế hoạt tính phân cắt của Ago2 Nhiều bằng chứng thực nghiệm cho thấy, theo cách này, miRNA cũng thúc đẩy quá trình deadenyl hóa phân tử mRNA, tháo mũ chụp không phụ thuộc vào hoạt tính slicer, dẫn đến ức chế sự khởi đầu dịch mã hay ức chế sự phiên mã Cuối cùng phân tử mRNA phân hủy theo con đường exosome và Xrn1p [72]

1.3.3 Tính chất biểu hiện của các miRNAs trong ung thư vòm họng

Dữ liệu về các phân tử miRNA trong UTVH được công bố lần đầu tiên vào năm

2008 bởi Sengupta và cộng sự [145] Trong công bố của họ, bằng cách sử dụng phương pháp microarray trên 31 mẫu bệnh và 10 mẫu lành, kết quả đã phát hiện được tám miRNA có sự biểu hiện bất thường trên các mẫu UTVH Trong số đó, sáu phân tử miRNA, bao gồm miR-29c, miR-34b/c, miR-212, miR-216 và miR-217 đóng vai trò gen ức chế khối u và có sự giảm biểu hiện trong các mô UTVH và hai onco-miRNA, bao gồm miR-151, miR-192 có vai trò thúc đẩy khối u vòm họng và có sự biểu hiện cao trong các mẫu UTVH so với mẫu lành Đặc biệt, một số phân tử mục tiêu đã được báo cáo có liên quan trực tiếp đến sự biểu hiện thấp của miR-29c, bao gồm: FLJ12505, COL4A1, COL4A2, COL5A2, COL3A1, COL1A2, FBN1, SPARC, COL15A1, FUS1 IFNG, LAMC1, có sự biểu hiện cao trong các khối u UTVH so với mẫu biểu mô vòm họng bình thường, làm thúc đẩy sự xâm lấn và di căn của các tế bào khối u Kể từ công trình này, hàng loạt các công trình theo sau đã được tiến hành thực hiện nhằm tìm hiểu về vai trò của miRNA, đặc biệt là chức năng của miRNA đối với bệnh sinh UTVH thông qua việc tìm hiểu các mạng lưới điều hòa trực tiếp bởi miRNA trong tiến triển của UTVH Trong những năm qua, nhiều nghiên cứu đã cho thấy một tỷ lệ rất cao các phân tử miRNA đóng vai trò quan trọng trong sinh bệnh học của UTVH (Bảng 1.5) Theo đó, sự điều hòa của miRNA có thể hoạt động như các chất ức chế khối u hoặc gây ung thư, làm dẫn đến một loạt các con đường tín hiệu liên quan đến UTVH, như tăng sinh tế bào, apoptosis, sống sót cũng như di căn, đóng vai trò quan trọng trong UTVH [9, 157]

Bảng 1.5 Bộ cơ sở dữ liệu của các miRNAs biểu hiện bất thường trong UTVH

Tăng biểu hiện Giảm biểu hiện Tài liệu tham khảo miR-10b miR-144 miR-1 miR-138

[68] miR-18a miR-149 miRNA let-7 miR-184 miR-18b miR-155 miR-9 miR-200 miR-21 miR-205 miR-26a miR-204 miR-30a miR-214 miR-29c miR-216b miR-93 miR-378 miR-98 miR-375 miR-141 miR-421 miR-124 miR-451

Có thể tóm tắt các miRNA đóng vai trò sinh ung nổi trội như miR-21, miR-214, miR-155, miR-141 thường biểu hiện vượt mức Tại Việt Nam, tính chất biểu hiện tăng của miR-141 đã được ghi nhận trên bệnh nhân UTVH [61, 70] Trong năm 2019, nhóm nghiên cứu của Lao và cộng sự đã chỉ rõ sự tăng biểu hiện của miRNA-155 hoàn toàn tương quan dương với sự biểu hiện của hai gen mục tiêu trên EBV là LMP-1, LMP-2 trên 93 mẫu mô sinh thiết UTVH theo nghiên cứu ca chứng tại Việt Nam bằng phương pháp Realtime RT-PCR, làm thúc đẩy khả năng tăng trưởng của tế bào, di cư và xâm lấn trong UTVH [65] Ngược lại, một số miRNA có vai trò ức chế khối u như miR-9, miR-26, miR-29,… lại có sự giảm biểu hiện [9]

1.3.4 Dự đoán gen đích của miRNA

Theo cơ chế phân tử hoạt động của miRNA thì các phân tử miRNA tham gia vào quá trình điều hòa gen bằng các gắn vào vùng 3’UTR của các mRNA mục tiêu, làm cho các mRNA bị phân hủy hoặc làm dừng quá trình dịch mã Bên cạnh đó, một phân tử miRNA có thể tương tác với nhiều mRNA đích, cũng như một mRNA cũng có thể là mRNA đích của nhiều miR khác nhau trong các loại tế bào khác nhau, giúp các phân tử miRNA có thể đồng thời tham gia vào nhiều quá trình sinh học khác nhau, có những tác động khác nhau lên sự tồn tại, tăng trưởng và phát triển của nhiều loại tế bào [72] Do đó, nếu chỉ dựa vào tính chất biểu hiện của mỗi miRNA sẽ làm giới hạn đi tầm nhìn về mạng lưới phân tử phức tạp của tương tác miRNA–mRNA mang lại trong quá trình bệnh học ung thư ở người Hiện nay, các nhà nghiên cứu cần có một phương pháp để xác định chính xác các phân tử mục tiêu của miRNA trước khi áp dụng các phương pháp thực nghiệm, giúp phân tích các đặc điểm, chức năng của miRNA trong các quá trình sinh bệnh học, từ đó có thể dự đoán chức năng chính xác của chúng Do đó, việc xác định chính xác tương tác giữa miRNA với mRNA mục tiêu là một trong những phần rất quan trọng trong việc làm sáng tỏ các cơ chế mà miRNA hoạt động, cả trong các quá trình sinh lý bình thường lẫn trong bệnh học

VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

Y Đức – Thu nhận mẫu nghiên cứu

Địa điểm thu nhận mẫu: khoa Tai mũi họng Bệnh viện Chợ Rẫy, TP Hồ Chí Minh Việc lấy mẫu sinh thiết UTVH và mẫu lành đã được thông qua và cho phép của Hội Đồng Y Đức của bệnh viện Chợ Rẫy TP.HCM: 516/BVCR-HDDD (Phụ lục 1)

Mẫu nghiên cứu bao gồm mẫu sinh thiết mô UTVH, được thu nhận từ các bệnh nhân đến khám tại bệnh viện được bác sĩ khám chẩn đoán là mắc bệnh ung thư vòm họng Chỉ tiêu lựa chọn mẫu:

(1) Tất cả bệnh nhân được chẩn đoán là ung thư vòm họng thông qua các chỉ tiêu: làm giải phẫu bệnh xác định type mô học theo WHO (thuộc dạng carcinoma tế bào gai sừng hóa, carcinoma tế bào gai không sừng hóa, carcinoma tế bào gai không sừng hóa, không biệt hóa, carcinoma tế bào gai đáy), xác định giai đoạn bệnh

(2) Quá trình bệnh sử rõ ràng

(3) Bệnh nhân đồng ý tham gia nghiên cứu

(4) Tất cả thông tin bệnh nhân được yêu cầu giữ bí mật

Các mẫu lành là dịch phết tế bào vòm họng được thu nhận từ những người đến khám và được bác sĩ chẩn đoán không mắc bệnh ung thư vòm họng

Về cỡ mẫu nghiên cứu: việc ước lượng số lượng cỡ mẫu dựa trên một số công trình nghiên cứu đã được thực hiện trên thế giới Cụ thể, nghiên cứu này dựa trên kết quả nghiên cứu của Li và cộng sự (2014) cho thấy kết quả tăng biểu hiện miR-21 ở các mẫu mô UTVH chiếm tỷ lệ 69% [80] Do đó, áp dụng công thức tính cỡ mẫu d q

≥ Theo đó: Z(1-α)/2 là giá trị tới hạn mức (1-α)/2 theo phân phối chuẩn tắc

X~N (0;1), với α = 5% thì Z(1-α)/2 = 1,96; p = 0,69; q = 0,31 và d là sai số ước lượng 10% Phần mềm sử dụng: MedCalc (Statistics for Biomedical Research soflware, MedCalc ® ; 2019) Kết quả tính toán cỡ mẫu n ≥ 82 mẫu Do đó, trong nghiên cứu này, cỡ mẫu sử dụng là 93 mẫu sinh thiết mô UTVH và 100 mẫu dịch phết lành Cỡ mẫu này cũng được sử dụng trong việc phân tích sự biểu hiện của Bcl-2, PTEN và PDCD4.

Hóa chất, thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

Hóa chất sử dụng: DEPC (catalog: DD-053, TBR Technology Joint Stock company), bộ GeneJET RNA Purification Kit (Thermo Scientific, catalog: K0732), EDTA 50nM (TBR Technology Joint Stock company, catalog: DD-035), bộ SensiFAST TM cDNA Synthesis Kit (Bioline, catalog: BIO-65054), bộ SensiFAST TM SYBR ® No-ROX Kit (Bioline, catalog: BIO-98005), bộ mirVana™miRNA Isolation Kit (Invitrogen, catalog: AM1560), bộ TaqMan TM Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific, Catalog: A28007) Bộ kit TaqMan™ microRNA Assays (hsa-miR-21, Thermo Fisher Scientific), thang phân tử HyperLadder™ 100bp (Bioline, catalog BIO-33030), Agarose (Bioline, Catalog: BIO-41025)

Thiết bị sử dụng: Máy ly tâm lạnh (Hetttich, Model: MIKRO 200R), bộ điện di nằm ngang (Takara, Model: Mupid®-exu), bàn đèn đọc gel bằng UV (Cleaver Scientific, Model: CSLUVTS312), tủ hút khí độc (ESCO, Model: ADC-3B1), máy đọc quang phổ (Biorad, SmartSpec™ Plus Spetrophotometer), máy PCR định lượng nhanh đa màu (Bioer, Model: LineGene K Plus).

CÁC CÔNG CỤ TIN SINH SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU

Cơ sở dữ liệu sinh học NCBI (National Center for Biotechnology Information)

(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/): phần mềm dùng cho việc khai thác thông tin Dịch vụ

Pubmed (http://www.ncbi.nlm.nih.gov.pubmed/): khai thác tất các công trình nghiên cứu khoa học đã công bố về Y – Sinh trong MEDLINE Dịch vụ Genbank: tìm kiếm các thông tin như trình tự nucleotide và protein, taxonomy, genome, mapping, cấu trúc protein, thông tin vùng domain và bài báo đã công bố trên Pubmed

Chương trình BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) trên trang web

NCBI Các sản phẩm giải trình tự khi được đưa vào chương trình này sẽ được so sánh với hàng trăm triệu trình tự được lưu trữ trong cơ sở dữ liệu GenBank của NCBI

IDT analyzer (https://sg.idtdna.com/calc/analyzer/): giúp xác định các thông số quan trọng của mồi như: chiều dài mồi, %GC, nhiệt độ nóng chảy, khả năng hình thành các cấu trúc thứ cấp (Hairpin-dimer; Self-dimer; Hetero-dimer)

Chương trình phân tích trình tự Annhyb phiên bản 4.946, là phần mềm dùng để thao tác xử lí trên các trình tự nucleotide, bao gồm các tính năng như đọc trình tự, tìm kiếm, sắp xếp trình tự oligonucleotide,…

Chương trình thiết kế mồi Primer 3, là một phần mềm dùng để thiết kế mồi cho các phản ứng PCR, được sử dụng khá phổ biến miRBase (http://www.mirbase.org/): là một cơ sở dữ liệu sinh học lưu trữ các thông tin về các microRNA Mỗi một thành phần trong cơ sở dữ liệu miRBase đại diện cho một trình tự hairpin, kèm theo các thông tin về vị trí và thứ tự của chuỗi miRNA trưởng thành

Các cơ sở dữ liệu cục bộ dùng để dự đoán các vị trị gắn của miRNA với một chuỗi trình tự hoàn chỉnh: TargetScan 7.1 (http://www.targetscan.org/vert_71/);

RNAhybrid (http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/); miRanda

Công cụ trực tuyến dự đoán vị trí gắn của miRNA trong vùng 3’UTR: Diana Tools(http://diana.imis.athena-innovation.gr/DianaTools/index.php/); PicTar (http://pictar.mdcberlin.de/); miRNAMap (ftp://mirnamap.mbc.nctu.edu.tw/miRNAMap2/); miRmap (https://mirmap.ezlab.org/downloads/mirmap201301e/)

Các phần mềm trực tuyến, nhằm dự đoán các vị trị gắn của miRNA trên trình tự mRNA đích ở cả ba vùng CDS, vùng 3’ và 5’ UTR bao gồm: PITA

(http://genie.weizmann.ac.il/pubs/mir07/mir07_prediction.html/); RNA22 (https://cm.- jefferson.edu/rna22/); miRwalk (http://zmf.umm.uniheidelberg.de/apps/zmf/mirwalk2- /miRretsysself.html/)

Bioedit: là phần mềm dùng để so sánh nhiều trình tự nucleotide hay amino acid miRDB (http://www.mirdb.org/): là một cơ sở dữ liệu trực tuyến cho dự đoán mục tiêu miRNA và các chức năng

GeneMANIA (http://genemania.org/): Giúp dự đoán các tương tác của gen với nhóm gen quan tâm.

KHAI THÁC DỮ LIỆU VỀ TÍNH CHẤT BIỂU HIỆN CỦA miRNA-21 VÀ CÁC GEN ĐÍCH

Các thông tin liên quan đến miR-21, gen đích, bao gồm vị trí, cấu trúc, tính chất biểu hiện, v.v… được tiến hành tìm kiếm, thu thập dựa trên các bài báo công bố trên các cơ sở khoa học như là PUBMED; Web of Science; Embase Database được cập nhật đến tháng 07 năm 2020 bằng một số từ khóa như: Nasopharyngeal carcinoma, microRNA, miRNA-21,…

Các công bố khoa học được chọn vào phân tích theo một số tiêu chuẩn như sau: [1]: Nghiên cứu ca-chứng (case-control study) và nghiên cứu đoàn hệ (cohort study) trong khảo sát sự biểu hiện của miRNA-21 và các gen đích với các đặc điểm lâm sàng: giai đoạn bệnh, độ tuổi,…; [2]: Mối quan hệ giữa tính chất biểu hiện miRNA-21/gen đích ở bệnh UTVH; [3]: Các bài báo liên quan đến phương pháp phân tích, phát hiện sự biểu hiện của miRNA-21 với gen đích Dữ liệu trích xuất bao gồm: tác giả, năm xuất bản, phương pháp phân tích sự biểu hiện, tần số biểu hiện trên mẫu bệnh, đặc điểm mẫu chứng, các thông tin về bệnh nhân bao gồm chủng tộc, giai đoạn bệnh, độ tuổi,…

PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ BỘ MỒI

Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu (Bảng 2.1) sẽ được tiến hành khảo sát các thông số vật lý, vị trí bắt cặp trên trình tự đích, độ đặc hiệu của mồi bằng các công cụ tin sinh học khác nhau

Bảng 2.1 Trình tự mồi xuôi và mồi ngược dùng trong phản ứng Real-time PCR

Ký hiệu Trình tự mồi 5’-3’ TLTK

Chú thích: F: mồi xuôi; R: mồi ngược; TLTK: Tài liệu tham khảo; *: Tự thiết kế bằng công cụ Primer 3

Các thông số vật lý của mồi được khảo sát bằng phần mềm trực tuyến IDT OligoAnalyzer 3.1 (http://sg.idtdna.com/calc/analyzer) Các thông số của mồi phải đạt các tiêu chí sau: chiều dài mồi trong khoảng 17 - 28 bp, %GC nằm trong khoảng 40 - 60%, Tm nằm trong khoảng 50 - 65 o C, năng lượng hình thành các cấu trúc thứ cấp (ΔG) phải lớn hoặc bằng -9Kcal/mol -1

Phần mềm Annhyb v.4.946 được sử dụng để khảo sát vị trí bắt cặp của mồi trên trình tự đích, độ dài của sản phẩm PCR Mồi đạt yêu cầu khi trình tự mồi bắt cặp với trình tự đích trên 90% tổng số nucleotide của mồi

Phần mềm trực tuyến Primer-BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools-

/primerblast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome) trên trang web NCBI Các đoạn mồi khi đưa vào chương trình này sẽ được so sánh với hàng trăm triệu trình tự được lưu trữ trong cơ sở dữ liệu GenBank của NCBI Từ kết quả có thể khẳng định rằng cặp mồi PCR đang khảo sát đặc hiệu với gen mục tiêu hoặc đặc hiệu với các gen khác.

PHƯƠNG PHÁP DỰ ĐOÁN CÁC GEN ĐÍCH CỦA miRNA-21

Tổng cộng có mười hai công cụ tin sinh dùng có chức năng dự đoán mRNA mục tiêu của miRNA được sử dụng để dự đoán và sàng lọc kết quả Ngoài ra, việc sử dụng cả

12 công cụ dự đoán rất phổ biến này còn có thể thu hẹp lại lượng dữ liệu được tạo ra bằng các bộ lọc/tham số như chỉ dự đoán ở vùng 3’UTR, vùng “trung tâm” dài từ 7 nt trở lên và giá trị p < 0,05 Tiếp theo, các gen mục tiêu được chọn để khảo sát trong nghiên cứu này phải được dự đoán bởi ít nhất bảy công cụ dự đoán khác nhau

2.4.2 Khảo sát chức năng của các gen đích dự đoán

Các gen mục tiêu sau khi được lọc sẽ được lập danh sách, sau đó dựa vào các tài liệu, công bố uy tín được xuất bản trước đó để tìm kiếm các chức năng của các gen giả định này có liên quan đến UTVH hoặc đã được xác nhận bằng thực nghiệm trên UTVH bằng cách sử dụng các từ khóa: Tên gen và ung thư vòm họng; Tên gen biểu hiện ở bệnh nhân ung thư vòm họng Tiếp theo, các gen mục tiêu tiềm năng này sẽ được được chia thành các nhóm như sau dựa trên các công bố đã tìm kiếm: (1): các gen đã được xác nhận là bị biểu hiện quá mức (2): các gen bị ức chế trong các nghiên cứu khác nhau về UTVH; (3): các gen liên quan đến sự tiến triển của ung thư; (4): các gen thúc đẩy sự sinh khối u; (5): các gen thúc đẩy sự di cư của tế bào và (6): gen thúc đẩy sự tăng sinh tế bào UTVH

2.4.3 Xây dựng mạng lưới gen (Gene Networks)

Sự tương quan của các gen đích tiềm năng đã được sàng lọc sẽ được xây dựng bằng cách sử dụng công cụ gen MANIA Các tham số mà gen MANIA quan tâm bao gồm sự đồng biểu hiện (co-expression), đồng vị trí (co-localization), tương tác di truyền (genetic interactions), con đường tín hiệu (pathway), tương tác vật lý (physical interaction), dự đoán (predicted).

PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT VÀ PHÁT HIỆN miRNA-21

miRNA-21 tổng số của mẫu sinh thiết UTVH và mẫu dịch phết vòm họng từ người lành được tách chiết bằng mirVana™miRNA Isolation Kit (Invitrogen, catalog: AM1560) Việc chuyển đổi mRNA thành cDNA được tiến hành với TaqMan TM Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific, Catalog: A28007) Việc khảo sát tính chất biểu hiện của miR-21 được thực hiện với bộ kit TaqMan™ microRNA Assays (hsa-miR-21, Thermo Fisher Scientific) Quá trình thực hiện phản ứng định lượng miRNA-21 hoàn toàn tuân theo hướng dẫn của nhà sản xuất Chứng nội cho phản ứng Real-time khảo sát tính chất biểu hiện của miR-21 là U6snRNA Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt Real-time PCR trong định lượng miRNA mục tiêu được trình bày lần lượt ở bảng 2.2 và 2.3

Bảng 2.2 Thành phần phản ứng trong định lượng miRNA-21

20X TaqMan Pri-miRNA assays 1,0 àl 2X TaqMan Gene Expression Master Mix 10,0 àl cDNA (nồng độ 200 ng) 4,0 àl

Bảng 2.3 Chu trình nhiệt phản ứng Real-time PCR trong định lượng miRNA-21

Bước Nhiệt độ Thời gian

PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT RNA GEN Bcl-2, PDCD4, PTEN

Để đảm bảo thu được RNA tinh sạch, cần phải loại bỏ RNase bám trên dụng cụ thiết bị bằng cách ngâm dụng cụ trong dung dịch DEPC 1% trong 8 - 10 tiếng đồng hồ, sau đó hấp khử trùng với nhiệt độ áp suất cao Quá trình tách chiết RNA được thực hiện theo chỉ dẫn của bộ kit GeneJET RNA Purification Kit (Thermo Scientific, catalog: K0732) Mẫu RNA sau khi tách sẽ được lưu trữ trong dung dịch EDTA 50nM ở nhiệt độ -20 o C Độ tinh sạch của RNA sau khi tách chiết sẽ được xác định thông qua kết quả đo mật độ quang ở bước sóng λ = 260 nm và λ = 280 nm Độ tinh sạch RNA sau khi tách chiết được xác định thông qua tỷ số A260/A280 ~ 2,0.

PHƯƠNG PHÁP REAL-TIME PCR KHẢO SÁT TÍNH CHẤT BIỂU HIỆN CỦA CÁC GEN Bcl-2, PDCD4, PTEN

RNA sau khi được thu nhận sẽ được tiến hành đánh giá sự biểu hiện thông qua kỹ thuật Reverse Transcription PCR với các cặp mồi chuyên biệt để chuyển các mRNA thành cDNA dựa theo hướng dẫn của SensiFAST TM cDNA Synthesis Kit (Bioline, catalog: BIO-65054) và tiến hành khuếch đại các cDNA mục tiêu theo SensiFAST TM SYBR ® No-ROX Kit (Bioline, catalog: BIO-98005) Thành phần phản ứng Reverse Transcriptase PCR và Real-time PCR cho các gen mục tiêu được trình bày ở bảng 2.4 Theo đó, quy trình nhiệt cho phản ứng Reverse-Transcriptase PCR và Real-time PCR trong phát hiện các gen mục tiêu được trình bày ở bảng 2.5

Bảng 2.4 Thành phần phản ứng Reverse Transcriptase PCR, Real-time PCR các gen mục tiêu

Phản ứng Reverse Transcriptase PCR

Thành phần Thể tớch (àl)

Phản ứng Real-time PCR

2X SensiFAST ® SYBR No-ROX Mix 10

Bảng 2.5 Chu trình nhiệt phản ứng Reverse Transcriptase PCR, Real-time PCR các gen mục tiêu

Bước Nhiệt độ ( o C) Thời gian

THỐNG KÊ, PHÂN TÍCH SỐ LIỆU THỰC NGHIỆM

Số liệu sau khi thu nhận được phân tích đánh giá bằng phần mềm thống kê y học Medcalc ® ở khoảng tin cậy 95% Tính chất biểu hiện của các gen mục tiêu và tính chất biểu hiện của miRNA-21 được tiến hành phân tích thống kê giữa mẫu bệnh và mẫu lành bằng phép thống kê Chi bình phương hoặc Fisher’s exact test Đồng thời, tính chất biểu hiện của các gen mục tiêu và miRNA-21 được tính toán dựa trên phương pháp định lượng tương đối 2 -∆∆Ct của Livak với chứng nội là U6snRNA (đối với thử nghiệm đánh giá sự biểu hiện của miRNA-21) và GAPDH (đối với thử nghiệm đánh giá sự biểu hiện của các gen mục tiêu PDCD4, PTEN, Bcl-2) Theo đó, các gen có 2 -∆∆Ct >1 là tăng biểu hiện và nhỏ hơn 1 là giảm biểu hiện Sự khác biệt về sự biểu hiện của các gen (dựa trên chỉ số Ct) giữa hai nhóm bệnh, lành được phân tích bằng unpaired two-tailed student’s t test Mức độ khác biệt có ý nghĩa thống kê được biểu diễn */p < 0,05; **/p < 0,01;

****/p < 0,0001; ***/p < 0,001; ns (not significant): không có ý nghĩa; với khoảng tin cậy 95% (95% Confidence intervals, 95%CI) Ngoài ra, để ghi nhận mối tương quan giữa phân tử miRNA-21 với gen đích, số liệu sau khi thu nhận sẽ được tính toán bằng tương quan tuyến tính Pearson (Bảng 2.6) Theo đó, công thức tính của các giá trị được thể hiện, bao gồm:

Giá trị OR = (a/b)/(c/d), và 95% CI (cận trên/ cận dưới) = e ^ [ln(OR) ± 1,96 (1/a + 1/b + 1/c + 1/d)] với a, b ,c ,d thể hiện số trường hợp của các biến phân tích Độ nhạy (Se) = Số dương tính thật/(số dương tính thật + số âm tính giả) Độ đặc hiệu = Số trường hợp âm tính thật/ (số trường hợp âm tính thật + số trường hợp dương tính giả)

Bảng 2.6 Hệ thống điểm của giá trị kappa, OR và hệ số tương quan r sử dụng trong Y học (Medcalc ® 2019)

Giá trị kappa (Độ phù hợp) Hệ số tương quan r (Mức độ tương quan) Điểm Ý nghĩa Điểm Ý nghĩa

0,81 - 1,00 Hầu như hoàn toàn |r| > 0,8 Tương quan mạnh 0,61 - 0,80 Chặt chẽ |r| = 0,4 – 0,8 Tương quan vừa 0,41 - 0,60 Trung bình |r| < 0,4 Tương quan yếu

< 0,20 Rất ít -1 ≤ r ≤ 0 Tương quan nghịch

> 1 Khả năng mắc bệnh cao hơn khả năng không mắc bệnh

= 1 Khả năng mắc bệnh bằng khả năng không mắc bệnh

< 1 Khả năng mắc bệnh thấp hơn khả năng không mắc bệnh

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 KẾT QUẢ KHAI THÁC DỮ LIỆU – KHẢO SÁT IN SLICO

Kết quả khai thác dữ liệu tính chất biểu hiện miRNA-21 trên UTVH

Thông qua quá trình khai thác dữ liệu được thực hiện bằng các từ khóa như

“Nasopharyngeal carcinoma”, “microRNA”, “miRNA-21”,…trên các ngân hàng dữ liệu lớn và uy tín Tổng các công trình được tìm thấy nghiên cứu về tính chất biểu hiện của miR-21 trên ung thư vòm họng bao gồm 11 bài (cập nhật đến tháng 07 năm 2020) Thông tin liên quan đến sự biểu hiện của miR-21 được trình bày ở bảng 3.1

Bảng 3.1 Các công trình nghiên cứu liên quan đến sự biểu hiện của miRNA-21

Tác giả (năm) Quốc gia Phương pháp Loại mẫu Biểu hiện TLTK

Liu (2013) Trung Quốc qRT-PCR Huyết tương Tăng [88] Yang (2013) Trung Quốc qRT-PCR Dòng tế bào Tăng [192]

Ou (2014) Trung Quốc qRT-PCR Mô sinh thiết Tăng [122]

Li (2014) Trung Quốc qRT-PCR Mô sinh thiết Tăng [80]

Plieskatt (2014) Mỹ qRT-PCR Mô đúc Tăng [128]

Miao (2015) Trung Quốc qRT-PCR Mô sinh thiết Tăng [110] Yang (2016) Trung Quốc qRT-PCR Dòng tế bào Tăng [191] Zhu (2015) Trung Quốc qRT-PCR Dòng tế bào Tăng [219]

He (2017) Trung Quốc qRT-PCR Huyết thanh Tăng [46] Savitri (2017) Indonesia qRT-PCR Huyết tương Tăng [139] Herawati (2019) Indonesia qRT-PCR Huyết tương Tăng [49]

Chú thích: qRT-PCR: quantitive Real-Time Reverse Trancsription – Polymerase chain reaction; Mô đúc FFPE: Formaline Fixed Paraffin Embedded

Kết quả khai thác dữ liệu cho thấy:

(1) Số lượng các công trình nghiên cứu về sự biểu hiện của miR-21 trong ung thư vòm họng vẫn còn khá ít ỏi, cụ thể cho tới giữa năm 2020, chỉ có mười một công trình nghiên cứu liên quan đến miR-21 được thực hiện trên đối tượng UTVH Trong khi đó, hầu hết công trình đều được thực hiện trên cộng đồng người Trung Quốc, chỉ có ba công trình nghiên cứu được thực hiện tại Malaysia và Indonesia Nhìn chung, dữ liệu này có thể dễ dàng lý giải nếu dựa vào sự phân bố dịch tễ của UTVH theo ghi nhận của Globocan (2018), đó là Châu Á là khu vực có số ca mắc và tử vong do UTVH cao nhất thế giới, lên đến 109.221 trường hợp mắc và 62.033 ca tử vong Trong số đó, Trung Quốc và Indonesia cũng lần lượt là hai trong năm quốc gia ở Châu Á được ghi nhận với số ca mắc UTVH cao nhất khu vực, lên đến 60.588 và 17.992 trường hợp mắc Riêng tại Việt Nam, đã có hai công trình nghiên cứu của Lao và cộng sự trong năm 2018 và 2019 nghiên cứu về tính chất biểu hiện của miR-155, miR-141, tuy nhiên tới thời điểm này, công trình nghiên cứu về miR-21 được thực hiện trên ung thư nói chung và đối tượng UTVH nói riêng vẫn chưa được thực hiện Do đó, việc nghiên cứu về tính chất biểu hiện của miR-21 mang tính cấp thiết và sẽ góp phần bổ sung thêm vào cơ sở dữ liệu phân tử của các miRNA đã được thực hiện trên cộng đồng người bệnh UTVH Việt Nam, bao gồm cả miR-155 và miR-141

(2) Xét về loại mẫu sử dụng trong các công trình nghiên cứu, mẫu mô (sinh thiết) được ưu tiên sử dụng trong các phân tích tính chất biểu hiện của miR-21 trên đối tượng UTVH so sánh với mẫu lành (mẫu không bị mắc UTVH) Bên cạnh đó, một số ít công trình còn lại sử dụng dòng tế bào UTVH hay huyết thanh, huyết tương từ bệnh nhân UTVH làm mẫu nghiên cứu Việc sử dụng mẫu mô (sinh thiết) có thể lý giải là do các công bố này đều là công trình đầu tiên nghiên cứu về tính chất biểu hiện của miRNA-21 trên UTVH nên để chọn được mẫu bệnh (UTVH) chắc chắn và chính xác nhất vẫn là mẫu mô sinh thiết được lấy từ chính vị trí khối u ác tính từ vòm họng người bệnh Theo đó, các mẫu mô sinh thiết vòm họng có thể được lấy bằng phương pháp sinh thiết nội soi, sinh thiết kim,…Các nghiên cứu khác sử dụng huyết thanh hay huyết thanh để phân tích sự biểu hiện của miR-21 cũng tương đối dễ hiểu bởi vì miRNA-21 có thể lưu thông trong các loại mẫu dịch thể khác nhau, do đó dữ liệu này nhấn mạnh về tính khả khi trong việc phát triển các hướng nghiên cứu, tìm hiểu về tính chất biểu hiện của miR-21 trên các loại mẫu không xâm lấn như dịch phết tế bào vòm họng, mẫu máu ngoại vi,… hướng đến triển vọng của xét nghiệm sinh thiết lỏng miRNA-21 tuần hoàn trong chẩn đoán sớm UTVH Hay ở một số công trình khác, việc thực hiện trên dòng tế bào UTVH để nghiên cứu cơ chế kháng thuốc ciplastin có liên quan đến các con đường tín hiệu được điều hòa trực tiếp bởi miRNA-21 cũng được ghi nhận Nhìn chung, đối với các loại mẫu được sử dụng để khảo sát sự biểu hiện của miR nói riêng bao gồm cả hai công bố của Lao và cộng sự về tính chất biểu hiện của miR-155 và miR-141 trên cộng đồng người Việt Nam cũng như các phương pháp chẩn đoán UTVH hiện nay thì mẫu mô sinh thiết đều được sử dụng hầu hết trong chẩn đoán và nghiên cứu Do đó, việc xây dựng quy trình phân tích sự biểu hiện của miR-21 trên chính mẫu mô sinh thiết thu nhận từ bệnh nhân UTVH người Việt Nam là vô cùng hợp lý

(3) Tất cả mười một công trình nghiên cứu trên thế giới về sự biểu hiện của miR-21 trên đối tượng UTVH đều sử dụng phương pháp qRT-PCR để khảo sát sự biểu hiện của miR-21 Dữ liệu này có thể lý giải là do phương pháp này là một phương pháp có độ nhạy, độ đặc hiệu cao, có thể định lượngtrực tiếp qua mỗi chu kỳ sau khuếch đại, có thể dễ dàng được áp dụng cho nghiên cứu đánh giá sự biểu hiện các miRNAs, dễ thực hiện và cho kết quả nhanh chóng hơn so với các phương pháp khác Do đó, trong nghiên cứu này, việc khảo sát sự biểu hiện của phân tử miR-21 ở bệnh nhân UTVH trên cộng đồng người Việt Nam sẽ được thực hiện và đánh giá bằng phương pháp qRT-PCR

(4) Như đã đề cập, hầu hết các công trình nghiên cứu đều chỉ ra sự tăng biểu hiện của miR-21 có liên quan mật thiết với quá trình hình thành bệnh ung thư, bao gồm cả UTVH Trong UTVH, phân tử miR-21 đóng vai trò như một oncogene với sự tăng biểu hiện đặc trưng trong các khối vòm họng Cụ thể, như trong nghiên cứu của Liu và cộng sự (2013), sự biểu hiện của miR-21 ở khối u vòm họng tăng gấp 6,65 lần so với sự biểu hiện miR-21 trong các mẫu đối chứng Đồng thời, nhóm He và cộng sự (2017) còn chứng minh thêm sự tăng biểu hiện của phân tử này có tương quan thuận với sự tiên lượng kém trong UTVH Hay nói cách khác, sự tăng biểu hiện của miR-21 tỷ lệ nghịch với khả năng sống sót và khỏi bệnh của bệnh nhân UTVH Bên cạnh đó, miR-

21 còn được chứng minh là có vai trò sinh ung, được tăng lên ở các khối u vòm họng và điều hòa nhiều con đường tín hiệu khác nhau như LMP1/PI3K/Akt/FOXO3a, miR/21/PI3K/Akt/PTEN, làm thúc đẩy sự đề kháng thuốc hóa trị liệu chống UTVH (cisplastin) ở các tế bào khối u bằng cách tăng biểu hiện của miR-21 Trong khi, sự giảm biểu hiện của miR-21 lại ức chế sự tăng sinh của dòng tế bào UTVH bằng cách làm gián đoạn pha G1 trong chu trình tế bào, dẫn đến giảm kháng xạ trị trong điều trị UTVH Bên cạnh đó, sự tương tác phức tạp, liên hoàn của các mRNA mục tiêu còn liên quan mật thiết đến sự tăng biểu hiện của miR-21, dẫn đến sự đa dạng chức năng của phân tử này trong UTVH Hai nghiên cứu lẩn lượt của Ou và Li (2014) cho thấy:

STAT3 có thể đóng vai trò là gen cảm ứng thúc đẩy sự tăng biểu hiện của miR-21 bằng cách gắn vào vùng promoter của phân tử này, làm thúc đẩy sự tăng sinh và ức chế sự chết theo chương trình ở UTVH bằng cách điều hòa âm tính PTEN thông qua con đường tín hiệu PI3K/Akt hay thông qua việc làm tăng biểu hiện của Bcl-2 mà thúc đẩy sự di cư và tăng sinh, ngăn chặn sự chết theo chương trình trong quá trình tiến triển khối u Sự bắt cặp của miR-21 trên vùng 3’UTR của gen PDCD4 còn làm tăng cường ức chế quá trình apoptosis, dẫn đến sự kháng ciplastin được quan sát thấy trên dòng tế bào UTVH Tóm lại, miR-21 đóng vai trò là một onco-miRNA thông qua các chức năng: điều hòa sự tăng sinh của tế bào, ức chế hoạt động tế bào T gây độc, né tránh sự chết theo chương trình và điều hòa nhiều con đường tín hiệu khác nhau trong cơ chế bệnh sinh của UTVH

Thông qua việc khai thác dữ liệu, các dữ liệu này sẽ là một cơ sở khoa học vững chắc cho việc xây dựng quy trình thực nghiệm trên chính mẫu mô sinh thiết thu nhận từ bệnh nhân UTVH người Việt Nam bằng phương pháp Realtime RT–PCR, giúp tìm hiểu sâu hơn về vai trò, tính tuần hoàn, các mạng lưới phân tử của miR-21 trong quá trình hình thành bệnh, giúp ứng dụng trong việc chẩn đoán sớm, tiên lượng và điều trị UTVH Điều này, hứa hẹn mở ra một ra một lĩnh vực nghiên cứu về các phân tử miRNAs trong bệnh UTVH tại Việt Nam

3.1.2 Kết quả khai thác dữ liệu tính chất biểu hiện các gen Bcl-2, PDCD4,

Bảng 3.2 Thông tin các công trình nghiên cứu liên quan đến sự biểu hiện của Bcl-2,

Gen Tác giả (năm) Quốc gia Phương pháp

Lu (1993) Trung Quốc IHC MĐ Tăng [94]

Sheu (1997) Trung Quốc IHC MĐ Tăng [146]

Masuda (1998) Nhật Bản IHC MĐ Tăng [105]

Niehom (2000) Thái Lan IHC MĐ Tăng [119]

Yu (2003) Trung Quốc IHC MĐ Tăng [201]

Fan (2006) Trung Quốc IHC MĐ Tăng [33]

Yip (2006) Trung Quốc IHC MĐ Tăng [197]

Chen (2008) Trung Quốc IHC MĐ Tăng [17]

Chen (2010) Trung Quốc IHC MĐ Tăng [18]

Fendri (2010) Tunisia qRT-PCR ST Tăng [35]

Bourouba (2011) Algeria IHC MĐ Tăng [7]

Li (2014) Trung Quốc qRT-PCR ST Tăng [80]

PDCD4 Bose (2009) Trung Quốc qRT-PCR ST Giảm [6]

Zhen (2013) Trung Quốc qRT-PCR ST Giảm [213] Yang (2013) Trung Quốc qRT-PCR ST Giảm [192] Liu (2017) Trung Quốc qRT-PCR ST Giảm [87]

Ma (2017) Trung Quốc IHC ST Giảm [97]

Zhen (2017) Trung Quốc qRT-PCR ST Giảm [214] Zheng (2019) Trung Quốc qRT-PCR ST Giảm [215]

Chen (2013) Trung Quốc qRT-PCR ST Giảm [19]

Ou (2014) Trung Quốc qRT-PCR ST Giảm [122] Cai (2015) Trung Quốc qRT-PCR ST Giảm [11] Liu (2016) Trung Quốc qRT-PCR ST Giảm [89]

Li (2016) Trung Quốc qRT-PCR ST Giảm [79] Zhou (2016) Trung Quốc qRT-PCR ST Giảm [218] Huang (2016) Trung Quốc qRT-PCR ST Giảm [55] Chen (2017) Trung Quốc qRT-PCR ST Giảm [20] Zhang (2017) Trung Quốc qRT-PCR ST Giảm [208]

Wu (2018) Trung Quốc qRT-PCR ST Giảm [185] Lyu (2018) Trung Quốc qRT-PCR ST Giảm [96] Wang (2018) Trung Quốc qRT-PCR ST Giảm [175]

Ma (2018) Trung Quốc qRT-PCR ST Giảm [98] Qin (2019) Trung Quốc qRT-PCR ST Giảm [132] Song (2019) Trung Quốc qRT-PCR ST Giảm [154] Zuo (2019) Trung Quốc qRT-PCR ST Giảm [221]

Chú thích: qRT-PCR: quantitive Real-Time Reverse Trancsription – Polymerase chain reaction; MĐ: Mô đúc parrafin; ST: Mô sinh thiết, IHC: Immunohistochemistry (Hóa mô miễn dịch)

Thông qua kết quả khai thác dữ liệu được trình bày ở bảng 3.2, tổng số công trình nghiên cứu liên quan đến tính chất biểu hiện của ở các gen Bcl-2, PDCD4, PTEN khi thực hiện trên đối tượng UTVH thu được lần lượt là 13 bài, 7 bài và 16 bài Tương tự với các nghiên cứu về tính chất biểu hiện của phân tử miRNA-21, hầu hết các công trình nghiên cứu này đều tập trung chủ yếu ở các nước thuộc khu vực Châu Á, cụ thể Trung Quốc, Thái Lan, Nhật Bản và một số ít công trình ở khu vực ngoài Châu Á như khu vực Bắc Phi (Algeria, Tunisia) – những quốc gia thuộc các Châu lục có tỷ lệ mắc và tử vong UTVH cao nhất so với thế giới Phương pháp được sử dụng chủ yếu trong các công trình là phương pháp qRT-PCR (24/36), một số lượng ít nghiên cứu sử dụng phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch (11/36) Dữ liệu này có thể giải thích là do phương pháp qRT-PCR có độ nhạy và đặc hiệu cao, đánh giá được sự biểu hiện của các phân tử ở cấp độ mRNA, có thể phân tích định lượng tương đối và tuyệt đối, có nhiều loại thuốc nhuộm thương mại (các chất huỳnh quang) và chi phí phân tích tương đối thấp so với các phương pháp khác như IHC (nhuộm hóa mô miễn dịch) Xét về nguồn mẫu, mẫu được sử dụng trong các nghiên cứu trên thế giới đều tập trung sử dụng mẫu mô (tissue), không có nghiên cứu nào trên mẫu máu hay huyết thanh được ghi nhận ở các gen này Việc sử dụng mô (sinh thiết) khối u vòm họng có thể lý giải là do các mẫu mô này được thu nhận trực tiếp từ mô ung thư hoặc bị nghi ngờ ung thư của người bệnh Theo đó, đối với các phương pháp chẩn đoán UTVH hiện nay, mẫu mô sinh thiết được ưu tiên sử dụng để chẩn đoán và nghiên cứu, do đó, mẫu mô được sử dụng trong hầu hết các nghiên cứu liên quan đến Bcl-2, PDCD4, PTEN trên UTVH là điều tương đối dễ hiểu Xét về tính chất biểu hiện của ba gen mục tiêu, theo nghiên cứu của Fendri và cộng sự (2010) cho thấy sự biểu hiện của Bcl-2 ở mẫu sinh thiết

UTVH tăng gấp 10 lần so với sự biểu hiện của Bcl-2 trong mẫu đối chứng (mẫu được xác định không mắc UTVH) Đồng thời, nhóm tác giả cũng khẳng định sự tăng cao của

Bcl-2 tỷ lệ nghịch với khả năng sống sót của bệnh nhân UTVH Ngược lại, theo ghi nhận của Wang và cộng sự (2018), tính chất biểu hiện của gen PTEN lại giảm biểu hiện 9,4 lần trên 20 mẫu sinh thiết UTVH so với người lành, trong khi, sự điều hòa biểu hiện giảm của PTEN lại dẫn đến sự rối loạn trong việc điều hòa nhiều chức năng quan trọng của tế bào và có liên quan chặt chẽ với sự tăng sinh, sống sót và di căn của UTVH thông qua con đường tín hiệu PI3K/Akt Hoạt động như một gen ức chế khối u,

PDCD4 cũng được quan sát thấy giảm biểu hiện ở mẫu UTVH so với người lành (2 -

∆∆Ct = 0,6 55 tuổi Từ những ghi nhận trên cho thấy đa số người mắc UTVH trong nghiên cứu này đều ở tuổi trung niên hoặc tuổi già và hiếm gặp ở người trẻ tuổi, dữ liệu này hoàn toàn tương đồng với ghi nhận trên thế giới và trong nước, cho thấy UTVH là một bệnh lý có thời gian ủ bệnh lâu năm với ngụ ý do sự tiếp xúc với các tác nhân gây ung thư, yếu tố nguy cơ trong giai đoạn sớm (20 – 30 tuổi) và mất vài thập kỷ để phát triển thành khối u vòm họng ở tuổi trung niên [135]

Xét về phân loại UTVH, kết quả khảo sát ghi nhận được: carcinome tế bào gai không biệt hóa (type 3) chiếm tỷ lệ cao nhất (67,64%), carcinome tế bào gai không sừng hóa (type 2) chiếm 27,96%, carcinome tế bào gai sừng hóa (type 1) chiếm 4,30% và không ghi nhận được bất kỳ trường hợp carcinome tế bào gai dạng đáy trong 40 mẫu sinh thiết UTVH Trong báo cáo của Nguyễn và cộng sự (2011), kết quả giải phẫu bệnh trên 500 trường hợp ung thư vòm sống ở các tỉnh phía Nam, được phát hiện trong thời gian 3,5 năm (4/2007 – 10/2010) cho thấy loại ung thư biểu mô vòm họng không biệt hóa (type 3) là loại hay gặp nhất ở những bệnh nhân mắc UTVH của Việt nam nói chung và miền Nam nói riêng [118] Theo đó, đặc điểm của loại ung thư này là loại nhạy tia nhưng cũng là loại ung thư cho di căn sớm nhất, vì vậy tỷ lệ thành công của điều trị thường thấp và tỷ lệ % sống sau 5 năm là rất thấp Kết quả trên cũng được ghi nhận tương đồng với các công trình nghiên cứu khác trên thế giới, chẳng hạn như nghiên cứu của Fendri và cộng sự [35] và Savitri và cộng sự [139]

Qua kết quả thu nhận mẫu, cho thấy tỷ lệ bệnh nhân phát hiện bệnh UTVH ở giai đoạn IV chiếm tỷ lệ cao nhất (48,39%), tiếp đến là giai đoạn II (chiếm 35,48%) và giai đoạn III (chiếm 16,13%) và không có bất kỳ ca nào phát hiện bệnh ở giai đoạn I (0,00%) Dữ liệu này cho thấy hầu hết bệnh nhân đều ở giai đoạn trễ (giai đoạn II: đã xuất hiện hạch cổ (thường gặp), hạch góc hàm (trường hợp điển hình), hạch xuất hiện cùng bên với khối u) hoặc đã quá muộn (giai đoạn III: đã di căn đến các hạch bạch huyết hoặc các bộ phận khác của cổ họng, giai đoạn IV:lan đến các hạch bạch huyết và các phần khác nhau của đầu, cổ hoặc ngực, đã di căn đến các bộ phận xa của cơ thể như cột sống cổ phổi hoặc gan theo đường máu) Kết quả này cũng được ghi nhận trong công trình của Nguyễn và cộng sự (2011), cho thấy tỷ lệ bệnh nhân UTVH đến khám trễ rất cao, có xu hướng tái phát sau điều trị sớm, tỷ lệ chữa khỏi, hiệu quả điều trị không cao [118] Trên thế giới, một số công trình tiêu biểu của Chen và cộng sự (2010) và Savitri và cộng sự (2017) cũng ghi nhận tỷ lệ bệnh nhân phát hiện bệnh ở giai đoạn muộn chiếm đa số [18, 139] Nguyên nhân có thể là do ở các nước đang phát triển như Việt Nam thì tác động của các yếu tố nguy cơ liên quan đến UTVH xảy ra nhiều hơn (hút thuốc, uống rượu, phơi nhiễm hóa chất), thu nhập của người dân chưa cao, trang thiết bị ở các cơ sở y tế chưa đồng bộ, hiểu biết về dự phòng và phát hiện sớm UTVH của người dân còn hạn chế, cũng như do triệu chứng của UTVH không đặc hiệu ở giai đoạn đầu, thường không có biểu hiện triệu chứng rõ ràng hay các triệu chứng lâm sàng ở giai đoạn đầu thường “vay, mượn” từ các cơ quan kế cận làm cho hầu hết các trường hợp chẩn đoán UTVH đều ở giai đoạn rất muộn, đặc biệt là ở giai đoạn tiến triển của bệnh (xâm lấn – di căn), dẫn đến hiệu quả điều trị bệnh nhân thấp và tỷ lệ tử vong cao

3.3.2 Kết quả khảo sát tính chất biểu hiện của miRNA-21 trên bộ mẫu UTVH và mẫu dịch phết vòm họng người Việt Nam

Tổng số miRNA-21 của mẫu sinh thiết UTVH và mẫu dịch phết vòm họng người lành được sử dụng trong nghiên cứu này để đánh giá sự biểu hiện của phân tử miRNA-21 trên bệnh nhân UTVH người Việt Nam Theo đó, các mẫu mô sinh thiết và mẫu dịch phết lành được tiến hành thu nhận từ Bệnh viện Chợ Rẫy Sau khi tách chiết

RNA, kết quả tách chiết sẽ được kiểm tra nồng độ thông qua việc đo mật độ quang tại các bước sóng 260nm và 280nm Kết quả phân tích mật độ quang cho thấy các mẫu cDNA sau khi tách đều có độ tinh sạch cao (Dữ liệu không trình bày) Sau đó, nhằm kiểm tra sự biểu hiện của phân tử cần khảo sát, sản phẩm sau khi tách chiết được pha loãng với nồng độ cDNA đưa vào mỗi phản ứng là 200 ng cho phản ứng Real-time

PCR để khảo sát sự biểu hiện của miRNA-21 Chứng nội sử dụng trong phản ứng này là U6snRNA Kết quả kiểm tra chứng nội được thể hiện ở hình 3.6

Hình 3.6 (A) Kết quả khuếch đại chứng nội U6snRNA trên các mẫu đại diện (B) Kết quả chu kỳ ngưỡng của U6snRNA trên mẫu bệnh và lành

Chú thích: Sự khác biệt về sự biểu hiện của chứng nội U6snRNA giữa hai nhóm được phân tích bằng unpaired two-tailed student’s t test, ns (not significant): p > 0,05

Theo kết quả phân tích ghi nhận được, chu kỳ ngưỡng của chứng nội U6snRNA ở mẫu sinh thiết khối u vòm họng và mẫu lành lần lượt là 29,41 ± 1,56 và 30,11 ± 1,61 với p = 0,53, cho thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê ở giá trị trung bình chu kỳ ngưỡng của U6snRNA trên mẫu sinh thiết UTVH và mẫu lành Ngoài ra, kết quả Real-time PCR gen U6snRNA còn cho thấy tín hiệu khuếch đại vượt qua giá trị ngưỡng một cách rõ rệt, biểu hiện dương tính ở tất cả các mẫu Do đó, gen U6snRNA được sử dụng làm chứng nội để phân tích mức biểu hiện của miR-21 ở các mẫu sinh thiết UTVH và dịch phết lành trong nghiên cứu này

Hình 3.7 Kết quả khuếch đại phân tử miRNA-21 trên các mẫu đại diện

Tiến hành khuếch đại phân tử miR-21 trên 93 mẫu sinh phẩm UTVH và 100 mẫu lành bằng phương pháp Real-time PCR (Hình 3.7) Kết quả khảo sát tính chất biểu hiện của miR-21 ở UTVH và mẫu lành được tính toán ở bảng 3.12

Bảng 3.12 Kết quả phân tích sự biểu hiện của miRNA-21

Chú thích: Phương pháp Chi bình phương được áp dụng phân tích P (positive): dương tính; N (Negative): âm tính; OR (Odds Ratio): Tỷ lệ odds; Se (Sensitivity): độ nhạy; Sp (Specificity): độ đặc hiệu

Qua kết quả phân tích thống kê ở bảng 3.12 cho thấy: tần số biểu hiện của miR-

21 là 84,95% ở mẫu sinh thiết vòm họng và 42,00% ở mẫu lành, sự chênh lệch này rất có ý nghĩa về mặt thống kê (p < 0,0001) Hay có thể nói, tần số biểu hiện của phân tử miRNA-21 ở các mẫu sinh thiết UTVH cao hơn so với mẫu lành, tính tương quan giữa tần số biểu hiện của phân tử này với UTVH là rất chặt chẽ Theo đó, xét về mức độ phù hợp giữa lâm sàng và xét nghiệm, cụ thể ở đây là mức độ phù hợp giữa hai kỹ thuật chẩn đoán khác nhau (phương pháp Real-time PCR và phương pháp chẩn đoán dựa trên giải phẫu bệnh) cho thấy độ phù hợp trung bình giữa hai phương pháp (κ = 0,43)

Về các chỉ số đánh giá phương pháp xác định tính chất biểu hiện của miR mục tiêu trong nghiên cứu này như độ nhạy (dương tính thật, Se – Sensitivity) và độ đặc hiệu (âm tính thật, Sp - Specificity) cũng được tính toán lần lượt với Se = 84,95% và Sp 58,00% Qua kết quả phân tích này có thể thấy phương pháp Real-time PCR xác định tính chất biểu hiện của miR-21 trong các mẫu sinh phẩm UTVH bệnh và lành cho tỷ lệ dương tính thật và âm tính thật lên đến 84,95% và 58,00%, giúp chẩn đoán sớm bệnh nhân mắc UTVH và có thể ứng dụng cho một quần thể lớn Nói cách khác, phương pháp Real-time PCR dựa trên sự biểu hiện của miRNA-21 khá tốt trong việc tuyên bố một đối tượng là không mắc bệnh UTVH, vì tỉ lệ âm tính thật đạt 58,00% và rất chính xác trong việc chẩn đoán bệnh nhân mắc bệnh UTVH, tỉ lệ dương tính thật lên đến 84,95% Kết quả phân tích OR còn cho thấy OR > 1 với khoảng tin cậy 95% dao động trong khoảng 3,90 đến 5,59, nghĩa là khả năng mắc UTVH ở nhóm có sự biểu hiện của miR-21 có tỷ lệ mắc cao gấp 7,79 lần so với nhóm không có sự biểu hiện của miR này, và sự chênh lệch rất đáng tin cậy với p < 0,0001 Như vậy, dựa trên kết quả ghi nhận được tần số biểu hiện cao của miR-21 có liên hệ mật thiết với bệnh UTVH, là một trong các nguyên nhân dẫn đến UTVH

Bảng 3.13 Giá trị trung bình Ct của các mẫu thí nghiệm và giá trị 2 -∆∆Ct trong phân tích sự biểu hiện của miR-21

Mẫu bệnh (Ct) Mẫu lành (Ct) miR-21 25,95 29,59

Giá trị 2 -∆∆Ct của miR-21/(bệnh:lành): 7,67

Hình 3.8 (A) Giá trị trung bình chu kì ngưỡng của miRNA-21; (B) Mức biểu hiện của miRNA-21 trong mẫu bệnh và lành

Chú thích: Sự khác biệt về sự biểu hiện của miR-21 giữa các nhóm được phân tích bằng unpaired two-tailed student’s t test, ****: p < 0,0001

Tiếp theo, sự tăng biểu hiện của miR-21 ở mẫu sinh thiết vòm họng so với mẫu lành sẽ được tính toán thông qua giá trị 2 -∆∆Ct Kết quả phân tích cho thấy: miR-21 có sự biểu hiện tăng ở mẫu mô sinh thiết UTVH cao gấp 7,67 lần so với mẫu lành (Bảng

3.13) Đồng thời, sự khác biệt về sự biểu hiện cao của miR-21 giữa các nhóm còn được phân tích bằng thuật toán unpaired two-tailed student’s t test với giá trị tương quan cao (p < 0,0001) (Hình 3.8) Trong nghiên cứu này, các phân tử miRNA-21 đã hoạt động như một oncogene với tính chất tăng biểu hiện điển hình trên cộng đồng người bệnh UTVH Việt Nam thông qua thực nghiệm chứng minh Ngoài ra, tính chất tăng biểu hiện của miR-21 ở mẫu bệnh so với mẫu lành cũng hoàn toàn tương đồng với nhận định ở các công trình nghiên cứu trên các bộ mẫu khác nhau trên thế giới, cụ thể là công trình của Savitri và cộng sự (2017): Phân tử miR-21 có sự tăng biểu hiện gấp 4,47 lần so với mẫu lành thông qua giá trị 2 -∆∆Ct [139] Điều này khẳng định: Tính chất biểu hiện bất thường của miRNA-21 là một đặc trưng phân tử ở bệnh UTVH người Việt Nam nói riêng và khu vực Châu Á nói chung, góp phần trong sự hình thành khối u

Kết quả phân tích sự biểu hiện của miR-21 với các đặc điểm lâm sàng được thể hiện ở bảng 3.14

Bảng 3.14 Kết quả phân tích mối tương quan giữa sự biểu hiện của phân tử miRNA-21 và các đặc điểm lâm sàng miR-21

Chú thích: P (positive): dương tính; N (Negative): âm tính

Tiêu đề	Khảo sát mối tương quan giữa tính chất biểu hiện của phân tử miRNA-21 với một số gen đích trên bệnh nhân ung thư vòm họng tại Việt Nam
Tác giả	Quang Trọng Minh
Người hướng dẫn	PGS.TS. Lê Huyền Ái Thúy, ThS. Lao Đức Thuận
Trường học	Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh
Chuyên ngành	Công nghệ Sinh học
Thể loại	Khóa luận tốt nghiệp
Năm xuất bản	2020
Thành phố	Thành phố Hồ Chí Minh

Định dạng
Số trang	175
Dung lượng	3,53 MB

Tài liệu tham khảo	Loại	Chi tiết
28. Sheedy FJ, Palsson-McDermott E, Hennessy EJ, Martin C, O'leary JJ, Ruan Q, Johnson DS, Chen Y, O'neill LA. Negative regulation of TLR4 via targeting of the proinflammatory tumor suppressor PDCD4 by the microRNA miR- 21. Nature immunology. 2010 Feb;11(2):141-7	Khác
29. Lao TD, Nguyen DH. Le THA. Study of mir-141 and its Potential Targeted mRNA PTEN Expression in Nasopharyngeal Carcinoma: From in Silico to Initial Experiment Analysis. AJPRHC, 2018b.;10(3):66-74	Khác
30. Ali IU, Schriml LM, Dean M. Mutational spectra of PTEN/MMAC1 gene: a tumor suppressor with lipid phosphatase activity. Journal of the national cancer institute. 1999 Nov 17;91(22):1922-32	Khác
31. Lu XX, Cao LY, Chen X, Xiao J, Zou Y, Chen Q. PTEN inhibits cell proliferation, promotes cell apoptosis, and induces cell cycle arrest via downregulating the PI3K/AKT/hTERT pathway in lung adenocarcinoma A549 cells.BioMed research international. 2016 Jan 1;2016. DOI: 10.1155/2016/2476842	Khác
32. Peralta-Zaragoza O, Deas J, Meneses-Acosta A, De la O-Gómez F, Fernández-Tilapa G, Gómez-Cerón C, Benítez- Boijseauneau O, Burguete-García A, Torres-Poveda K, Bermúdez-Morales VH, Madrid-Marina V. Relevance of miR- 21 in regulation of tumor suppressor gene PTEN in human cervical cancer cells. BMC cancer. 2016 Dec 1;16(1):215	Khác
33. Meng F, Henson R, Wehbe – Janek H, Ghoshal K, Jacob ST, Patel T. MicroRNA-21 regulates expression of the PTEN tumor suppressor gene in human hepatocellular cancer. Gastroenterology. 2007 Aug 1;133(2):647-58	Khác