phân tích tổng hợp và khảo sát một số đột biến nổi trội trên gene angptl3 đối với bệnh cao lipid trong máu

--- ∞0∞--- HỒ BẢO AN PHÂN TÍCH TỔNG HỢP VÀ KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐỘT BIẾN NỔI TRỘI TRÊN GENE ANGPTL3 ĐỐI VỚI BỆNH CAO LIPID TRONG MÁU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC TP... TRƯỜNG

TỔNG QUAN

Tổng quan về cholesterol

Cholesterol hiện diện trong các tế bào nhân thực (Eukaryote) và một số nhóm loài thuộc nhân sơ (Prokaryote), cholesterol là một hợp chất chứa 27 carbon với ba vùng cấu tạo chính bao gồm một đầu ưa nước, một đầu kỵ nước (giúp cho cholesterol không bị trộn lẫn vào nước) và vùng trung tâm chứa bốn vòng hydrocarbon giúp cho cholesterol có độ cứng (Schade et al., 2020; Craig et al., 2018) Vùng trung tâm của cholesterol là vùng mang chức năng chính của tất cả các steroid hormone, nhờ những cấu tạo đó mà cholesterol được đóng gói chung với apoprotein để được mang đi khắp cơ thể thông qua các mạch máu, bên cạnh đó, cơ thể con người có thể tổng hợp cholesterol tự do và cũng có thể thu nạp cholesterol từ hấp thụ chất dinh dưỡng (Hình I.1) (Craig et al., 2018)

Hình I.1 Cấu trúc của cholesterol (Peng et al., 2008) 1.2 Vai trò của cholesterol

Trong tế bào động vật có vú và con người, cholesterol được tổng hợp chủ yếu thông qua con đường tiền chất acetate hoặc hấp thu các nguồn thực phẩm hoặc ở gan (Russell et al., 1992) Cholesterol là một phân tử sinh học đem lại nhiều chức năng cần thiết cho con người, từ sinh sản đến vận chuyển chất dinh dưỡng đến những quá trình hoạt động của tế bào, cholesterol có ở khắp mọi nơi trong cơ thể giới động vật (Craig et al., 2018) Cholesterol là một hợp chất có vai trò quan trọng trong màng tế bào, là thành phần chính trong việc đảm bảo tính vẹn toàn và tính lỏng của màng tế bào và là tiền chất để tổng hợp các hormone steroid được sản xuất bởi tuyến thượng thận, các acid mật và vitamin D (Craig et al., 2018; Cerqueira et al., 2016; Russell et al., 1992) Sự điều hòa cân bằng nội mô cholesterol trong cơ thể được thực hiện thông qua 3 con đường chính: (1) điều hòa hoạt động sản xuất thụ thể lipoprotein tỷ trọng thấp, (2) hoạt hóa và điều hòa enzyme khử HMG – CoA và những enzyme khác trong con đường sinh tổng hợp cholesterol, (3) điều hòa sự tổng hợp 7α - hydroxylase trong acid mật (Russell et al., 1992) Sự bất thường về lượng cholesterol trong cơ thể là yếu tố tác động xấu đến sức khỏe con người, đặc biệt có liên quan đến các bệnh lý tim mạch (Cerqueira et al., 2016)

Do cấu trúc kỵ nước của cholesterol do đó nó không thể tan tốt trong mạch máu, vì vậy cholesterol được đóng gói trong lipoprotein có chứa phospholipid và apolipoprotein (Apo) (Wang et al., 2018) ) Lipoprotein là một đại phức hợp giữa lipid và protein (Genest et al, 2003) Cấu trúc chung của lipoprotein là hình cầu, chúng chứa nhiều thành phần khác nhau với lõi trung tâm được cấu tạo bởi lõi lipid, nơi chứa các cholesterol ester và trygliceride, lipoprotein có lớp ưa nước bên ngoài bao gồm apolipoprotein, phospholipid và các cholesterol tự do (Hình I.2-A) (Huff et al., 2022) Nhờ những cấu trúc đặc trưng này mà lipoprotetin có thể dễ dàng di chuyển khắp cơ thể thông qua máu và đến các tế bào (Huff et al., 2022; Craig et al., 2018)

Dựa vào kích thước của các apolipoprotein, kích thước phân tử và mật độ lipid nên chúng đóng một vai trò quan trọng trọng việc phân loại lipoprotein thành năm loại chính: chylomicron, lipoprotein mật độ rất thấp (Very Low-density Lipoprotein, VLDL), lipoprotein mật độ trung bình (Intermediate-density Lipoprotein, IDL), lipoprotein mật độ thấp (Low-density Lipoprotein, LDL), và lipoprotein mật độ cao (High-density Lipoprotein, HDL) (Hình I.2.B, Bảng I.1, Bảng I.2) (Lent-Schochet et al., 2022; Tulenko et al., 2002; Ginsberg et al., 1998) Trong đó, HDL còn được xem như là một “cholesterol tốt” có thể đảo ngược quá trình vận chuyển cholesterol, LDL được xem như “cholesterol xấu” có thể thúc đẩy gây ra các bệnh tim mạch (Lent- Schochet et al., 2022; Tulenko et al., 2002) Cấu trúc cảu các lipoprtoein được mô tả chi tiết như sau:

Hình I.2 Cấu trúc của lipoprotein (A) và phân loại các lipoprotein (B)

− Chylomicron được tổng hợp từ ruột non, có kích thước lớn (đường kính 100 –

1000 nm, tỷ trọng > 0,95 g/ml), và giàu triglyceride, nhưng chỉ chứa lượng nhỏ protein trong phân tử, có chức năng vận chuyển các triglyceride từ ruột đến các mô trong cơ thể (Durrington et al., 2007)

− VLDL (đường kính 40 – 50 nm, tỷ trọng > 1,006 g/ml) là các phân tử lipoprotein được tổng hợp từ gan, nhỏ hơn chylomicron VLDL cũng trải qua các trình tự chuyển hóa tương tự chylomicron, chúng loại bỏ trygliceride khỏi lõi trung tâm và sản phẩm cuối cùng của chúng là LDL (Charlton‐Menys et al., 2008; Durrington et al., 2007; Genest et al, 2003)

− IDL (đường kính 25 – 30 nm, tỷ trọng 1,006 – 1,019 g/ml) là những lipoprotein VLDL còn sót lại sau khi chúng cạn kiệt triglyceride, vì vậy phải thu nạp thêm cholesterol và hình thành nên IDL, các IDL bị khử lipid bởi các hepatic lipase (HL) để hình thành các LDL (Genest et al., 2003)

− LDL (đường kính 20 – 25 nm, tỷ trọng 1019 – 1063 g/ml) rất giàu cholesterol và có kích thước vừa đủ để có thể thâm nhập vào trong nội mô mạch máu, và có thể xâm nhập vào trong các mô do đó chúng có thể tương tác với mọi tế bào trong cơ thể, chức năng chính của LDL là vận chuyển cholesterol để đưa cholesterol vào trong tế bào (Genest et al, 2003)

− Tương tự như LDL, HDL có khả năng khả năng xâm nhập vào trong nội mô mạch máu nhưng có kích thước nhỏ hơn (đường kính 6 – 10 nm, tỷ trọng 1063 – 1210 g/ml) HDL được xem xét về khả năng thu thập những cholesterol thặng dư từ quá trình vận chuyển từ các mô ngoại vi xuyên qua các dịch ngoài bào để đưa cholesterol trở về lại gan và để phá hủy cholesterol bởi túi mật, chuyển đổi thành muối mật hoặc chuyển đổi để “tái sản xuất” trở lại cho các lipoprotein (Durrington et al., 2007)

Bảng I.1 Các đặc điểm phân biệt lipoprotein

Lipoprotein Mật độ (g/ml) Kích thước

Chú thích: VLDL: lipoprotein tỷ trọng rất thấp; LDL: lipoprotein tỷ trọng thấp; IDL: lopprotein tỷ trọng trung bình; HDL: lipoprotein tỷ trọng cao; TG: triglyceride, PL: phospholipid, CH: cholesterol Tài liệu tham khảo: Lent-Schochet et al , 2022; Tulenko et al , 2002; Ginsberg et al , 1998

Bảng I.2 Đặc điểm và chức năng của các apolipoprotein

Khối lượng phân tử Lipoprotein Chức năng

Hình thành cấu trúc HDL, hoạt hóa LCAT

Hình thành cấu trúc HDL, Chuyển hóa triglyceride và các acid béo tự do

Chuyển hóa các hạt giàu triglyceride

Cân thiết tập hợp và bài tiết VLDL từ gan, thành phần cấu trúc của VLDL, IDL, LDL, phối tử của thụ thể LDL

Khối lượng phân tử Lipoprotein Chức năng B-48 264000 Chylomicron

Hình thành cấu trúc của chylomicron và tham gia quá trình bài tiết chylomicron từ gan

Hoạt hóa LCAT, ức chế LPL, ức chế CETP, ức chế ApoE đính vào LRP

Hoạt hóa LPL, suy giảm dẫn đến tang triglyceride trong máu toàn phần

VLDL, IDL, HDL Ức chế LPL, ngăn chặn hoặc thay thế ApoE đính vào LRP

Protein đa chức năng Điều chỉnh LPL, CETP, LCAT,

HP, phối tử thụ thể LDL, phối tử LRP

Chú thích: LCAT: enzym lecithin-cholesterol acyl transferase; LPL: enzyme lipoprotein lipase;

CETP: Protein trung chuyển Cholesteryl ester; LRP: thụ thể lipoprotein tỷ trọng thấp liên quan đến protein; HP: hepatic lipase Tài liệu tham khảo: Lent-Schochet et al , 2022; Tulenko et al , 2002; Ginsberg et al , 1998

Bệnh cao lipid trong máu

2.1 Định nghĩa về bệnh cao lipid trong máu

Bệnh cao lipid trong máu là bệnh được xác định bởi nồng độ lipid trong máu bất thường, chủ yếu là thay đổi các mức độ cholesterol tổng, LDL-C, triglyceride và mức độ lipoprotein tỷ trọng thấp (High Density Lipoprotein, HDL), vì vậy bệnh cao lipid trong máu là một trong những nguy cơ chính gây ra các bệnh tim mạch trên toàn thế giới (Bezerra et al., 2023; Pirillo et al., 2021) Theo Tổ chức Y tế thế giới WHO, có khoảng 1/3 số ca mắc bệnh nhồi máu cơ tim có sự đóng góp của cao cholesterol Việc cao lipid trong máu gây ra 2,6 triệu ca tử vong (chiếm 4,5% trong tổng số ca tử vong) và 29,7 triệu ca (DALYS) Theo thống kê của Global Burdern of Disease, ước lượng hơn 40 nghìn ca tử vong do có nồng độ cao cholesterol LDL ở Việt Nam (2019)

2.2 Nguyên nhân gây ra bệnh cao lipid trong máu

Lối sống sinh hoạt không lành mạnh cũng có thể ảnh hưởng đến mức độ lipid trong máu, tuy nhiên mức độ lipid trong máu cũng bị tăng cao do nguyên nhân di truyền, bị ảnh hưởng bởi sự khiếm khuyết của đơn hay đa gene trong cơ thể (Shattat et al., 2015; Stewart et al., 2020) Yếu tố di truyền dẫn đến một số dạng rối loạn: giảm lượng lipoprotein lipase (gây rối loạn cao chylomicron trong máu mang tính gia đình), suy giảm thụ thể LDL (gây rối loạn cao cholesterol trong máu mang tính gia đình), sự gia tăng sản xuất và bài tiết VLDL, gây rối loạn cao triglyceride trong máu mang tính gia đình) (Bảng I.3) (Shattat et al., 2015) Bệnh cao lipid trong máu không có triệu chứng cụ thể, nhưng nhìn chung bệnh được phát hiện khi thực hiện xét nghiệm lâm sàng hoặc được xác định ở những trường hợp cấp cứu do đột quỵ hoặc suy tim, những bệnh nhân có nồng độ cholesterol trong máu cao có thể xuất hiện những mảng u vàng dưới da và dưới hốc mắt (Stewart et al., 2020)

Bảng I.3 Một số gene liên quan đến bệnh cao lipid máu gây ra bởi yếu tố di truyền

TT Tên gene mục tiêu

Vị trí trên NST - tổng số exon

Chiều dài (bp) - Sự định vị trên trình tự

Tần số đột biến trên gene mục tiêu ở bệnh cao lipid trong máu (Nguồn trích dẫn)

Phối hợp với LDL để cải thiện quá trình vận chuyển cholesterol

90% trên bệnh cao cholesterol trong máu (Hartgers et al., 2015)

42645 bp NC_000002.12 (21001429 21044073, mạch bổ sung)

Mã hóa protein ApoB-100 và ApoB-48

5% trên bệnh cao cholesterol mang tính gia đình

TT Tên gene mục tiêu

Vị trí trên NST - tổng số exon

Chiều dài (bp) - Sự định vị trên trình tự

Tần số đột biến trên gene mục tiêu ở bệnh cao lipid trong máu (Nguồn trích dẫn)

Duy trì điều hoá lượng cholesterol

~ 2% trên bệnh cao cholesterol trong máu (Mikhailova et al., 2019)

8794 bp NC_000001.11 (62597520 62606313) Ức chế nội sinh, ức chế lipoprotein lipase (LPL) và lipase nội mô

0,3% trên các bệnh lý cao lipid máu (Bea et al., 2021; Stitziel et al., 2017) Chú thích: LDLR: Low Density Lipoprotein Receptor; APOB: Alipoprotein B,

PCSK9: Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9

2.3 Phân loại bệnh cao lipid trong máu

Bệnh lipid trong máu được phân thành năm loại khác nhau, dựa trên 5 kiểu hình của Federickson và các cộng sự (1975) chi tiết như sau (Tulenko et al., 2002; Pappan et al., 2022; Majanović et al., 2021; Nouh et al., 2019):

Kiểu hình I là một rối loạn lipid không phổ biến gây ra bởi việc khiếm khuyết hoạt động của LPL dẫn đến việc khử triglyceride bị trì trệ và khiến cho thời gian phân hủy chylomicron bị chậm lại, gây ra bệnh cao triglyceride trong máu và dẫn đến các rối loạn ở tuyến tụy

Kiểu hình II là kiểu hình phổ biến nhất bao gồm hai loại là IIa và IIb Kiểu hình IIa bao gồm dạng đơn gene hiếm gây ra bởi sự khiếm khuyết thụ thể LDL, ngoài ra còn có thể gây ra bởi đa gene, dạng này phức tạp hơn và cần đến yếu tố môi trường từ đó gây ảnh hưởng xấu đến con đường chuyển hóa LDL, dẫn đến mắc bệnh cao cholesterol trong máu mang tính gia đình Kiểu hình IIb gây ra bệnh rối loạn cao lipid trong máu tổ hợp mang tính gia đình, kiểu hình này ít phổ biến và nó được xác định bởi sự cao cholesterol và triglyceride trong máu, nguyên nhân là bởi sự đột biến đơn gene hoặc đa gene gây nên sự tích tụ cholesterol LDL và triglyceride

Kiểu hình III là tình trạng rối loạn lipid hiếm gặp, bởi rối loạn này được xác định bởi sự tăng cao chylomicron và VLDL, gây ra bởi sự mất chức năng tổng hợp của ApoE, sự đột biến này của ApoE làm tăng cao chylomicron và các tàn dư VLDL trong máu Khi các hạt này tồn tại càng lâu, thì các LPL sẽ bị suy giảm khả năng phân hủy triglyceride, từ đó tạo ra các hạt cholesterol giàu triglyceride

Kiểu hình IV là một dạng rối loạn lipid phổ biến thông qua chỉ số triglyceride được tăng cao bởi vì mức độ VLDL tăng cao nhưng vẫn duy trì bình thường mức độ VLDL, và nó được di truyền trong tự nhiên, do đó rối loạn này được gọi là cao triglyceride trong máu mang tính gia đình

Kiểu hình V là dạng hiếm gặp nhưng lại có những đặc điểm tương đối tương đồng với loại IV, bởi vì cũng được xác định bằng mức độ triglyceride, ngoài việc tăng sự tổng hợp triglyceride, mà còn giảm khả năng khử các chylomicron và VLDL, các đặc điểm này tương đồng với sự suy giảm LPL

Bảng I.4 Các nguyên nhân nguyên phát phân loại theo phân loại Frederickson

Phân loại Kiểu rối loạn Lipoprotein bị tăng cao Tần số xuất hiện

I Familial hyperchylomicrons Chylomicron Cực kỳ hiếm gặp

IIa Familial hypercholesterolemia LDL Phổ biến

IIb Familial combined hyperlipidemia LDL và VLDL Ít phổ biến

III Familial dysbetalipoprotein IDL Hiếm gặp

IV Endogenous Hyperlipemia VLDL Phổ biến

V Familial hypertriglyceride Chylomicron và VLDL Phổ biến

Tổng quan về bệnh tim mạch

3.1 Tình hình bệnh tim mạch trên thế giới

Bệnh tim mạch (Cardiovascular Disease, CVD) là bệnh có đến hơn 18,5 triệu ca tử vong mỗi năm, là một trong những bệnh có số người mắc phải và tử vong cao nhất trên thế giới (WHO, 2019; Global Burdern of Disease (GBD), 2019) Theo dữ liệu của WHO (2019), bệnh tim mạch là một nhóm bệnh rối loạn tim mạch và mạch máu bao gồm bệnh tim mạch vành, bệnh xơ vữa động mạch, bệnh cao huyết áp, đột quỵ,… đây là những bệnh lý thuộc vào các bệnh về tim mạch (WHO, 2019) Theo WHO (2019), hơn 80% số ca mắc bệnh lý tim mạch tử vong là bởi vì bị suy tim và đột quỵ, 33,3% diễn ra chủ yếu ở người dưới 70 tuổi (Hình I.3)

Hình I.3 Các nguyên nhân tử vong hàng đầu trên thế giới (WHO)

3.2 Tình hình bệnh tim mạch ở Việt Nam Ở Việt Nam, ước lượng có đến 240.161 ca tử vong do mắc bệnh tim mạch (Hình I.4) với số ca tử vong do đột quỵ là cao nhất là 135.999, chiếm 56,6% số ca tử vong do bệnh tim mạch (GBD, 2019) Bên cạnh đó, tỷ lệ mắc bệnh và tỷ lệ tử vong của bệnh lý tim mạch được chẩn đoán ở bệnh viện tương ứng với 9,0% và 18,6% (Anh Hien et al 2020) Một trong những nguyên nhân chính gây nên bệnh lý tim mạch là do lối sống không lành mạnh chủ yếu là việc sử dụng thuốc, chế độ ăn uống không phù hợp, ít vận động thể dục thể thao, những lối sống này có thể thể hiện ở các bệnh nhân thông qua các chỉ số tăng huyết áp máu, tăng đường trong máu và béo phì (WHO)

Hình I.4 Các ca tử vong do bệnh tim mạch gây ra ở Việt Nam (GBD)

Tổng quan về gene ANGPTL3

4.1 Thông tin về gene ANGPTL3

Gene Angiopoietin-like 3 (ANGPTL3) mã hóa protein ANGPTL3, đây là yếu tố điều hòa chính của quá trình chuyển hóa lipoprotein Gene ANGPTL3 dài 8794 nucleotide, với 6 vùng intron và 7 vùng exon, gene nằm ở vị trí nhiễm sắc thể số 1p31.1 - p22.3 (Jiang et al., 2019; Mohamed et al., 2022; Tikka et al., 2016; Luo et al., 2023; NCBI) (Hình I.5)

Hình I.5 Vị trí của gene ANGPTL3 trên NST số 1

4.2 Thông tin về protein ANGPTL3

ANGPTL3 thuộc một trong họ protein ANGPTL gồm có từ ANGPTL1 - ANGPTL8, họ protein ANGPTL có những vùng cấu trúc tương tự nhau như vùng peptide tín hiệu N-terminal (SP), vùng xoắn N-terminal (Coil-coiled domain, CCD), vùng liên kết và vùng C-terminal giống fibrinogen (Fibrinogen-like domain, FLD); trong đó ANGPTL3 chứa 4 cyteines bảo tồn liên quan đến liên kết disulfide nội phân tử của FLD đóng một vai trò quan trọng trong chuyển hóa lipid ở người (Santulli et al., 2014; Liu et al., 2021)

Protein của ANGPTL3 có cấu trúc bao gồm 460 amino acid (a.a) và có khối lượng phân tử khoảng 70 kD, được biểu hiện và bài tiết tại tế bào gan, cấu trúc của ANGPTL3 có vùng tín hiệu peptide đặc biệt (0 – 17 a.a), một vùng xoắn kép đầu N (N-terminal coiled-coil domain, CCD), và một vùng tương đồng fibrinogen đầu C (C- terminal fibrinogen like domain, FBG) (Jiang et al., 2019; Mohamed et al., 2022;

Tikka et al., 2016; Luo et al., 2023) Vùng xoắn kép đầu N (17 – 210 a.a) đặc biệt là vùng amino acid 32 - 55, là vùng có khả năng ảnh hưởng đến mức độ triglyceride trong máu thông qua việc ức chế hoạt tính xúc tác của hai enzyme ngoại bào là LPL và các lipase nội bào (Edothelial lipase, EL) (Tikka et al., 2016; Luo et al., 2023)

Vùng tương đồng fibrinogen (237 – 455 a.a) liên kết với các thụ thể intergrin (các protein xuyên màng) αvβ3 và gây ảnh hưởng lên sự tạo mạch máu, tương tự chức năng với angiopioetin (Tikka et al., 2016) Đoạn liên kế ngắn (221 – 222 a.a và 224 – 225 a.a) đóng vai trò như là một vùng cắt furin, vùng này được cho rằng là khi ANGPTL3 được cắt nhỏ ở vùng này có thể nâng cao khả năng hoạt động ức chế LPL và EL ở vùng CCD (Hình I.6) (Ono et al., 2003; Tikka et al., 2016)

Hình I.6 Cấu trúc của protein ANGPTL3

*Cơ chế hoạt động của ANGPTL3 trong việc ức chế LPL

Quá trình phân hủy Triglycerid-rich lipoprotein bằng LPL đóng một vai trò quan trọng trong việc vận chuyển và chuyển hóa, cung cấp lipid cho việc sử dụng năng lượng hay dự trữ năng lượng (Su et al., 2018) Việc có thể ức chế hoạt tính của LPL là bởi cấu trúc đặc biệt của ANGPTL3 Vùng xoắn cuộn đầu N của ANGPTL3 tồn tại 3 amino acid quan trọng Aspartic acid (Asp), Histidin (His), Glutamine (Gln), 3 amino acid này có khả năng đính vào vùng glycosylphosphatidylinositol gắn liền với lipoprotein tỷ trọng cao đính protein 1 (Glycosylphosphatidylinositol Anchored High-density Lipoprotein Binding Protein 1, GPIHBP1), protein GPIHBP1 được biểu hiện ở tế bào nội mô mao mạch và vận chuyển LPL đến lòng mao mạch, gây ức chế quá trình vận chuyển LPL, bên cạnh đó hiệu quả ức chế LPL của ANGPTL3 được cải thiện khi kết hợp với ANGPTL8 (Hình I.7) (Quagliarini et al., 2012)

Hình I.7 Vai trò của ANGPTL3 trong việc ức chế LPL (Chen et al., 2021)

Chú thích: Capillary lumen: Lòng mao mạch; Free fatty acids: Các acid béo tự do; TGRL

(Trgliceride-rich lipoprotein): Các lipoprotein giàu triglyceride; GPIHBP1: glycosylphosphatidylinositol gắn liền với lipoprotein tỷ trọng cao đính protein 1; HSGP: Heparan sulfate proteoglycans

4.3 Tính chất đột biến trên gene ANGPTL3 liên quan đến một số bệnh lý

Các đột biến mất chức năng của gene ANGPTL3 được tìm thấy ở người bệnh với tình trạng nồng độ triglyceride cực kỳ thấp và các nhà khoa học khám phá đột biến mất chức năng của gene ANGPTL3 có khả năng bảo vệ khỏi bệnh xơ vữa động mạch, bởi vì khi đột biến xảy ra ANGPTL3 không còn khả năng ức chế LPL do đó các LPL di chuyển vào các lòng mao mạch thực hiện chức năng của mình là phân hủy các lipoprotein (Ruhanen et al., 2020)

Nghiên cứu của Pisciotta và các cộng sự (2012) đã thực hiện quy trình PCR và giải trình tự trên 4 cá thể của 3 gia đình khác nhau, và kết quả thu nhận được 3 biến thể trên gene ANGPTL3: c.1198+1G>T (p.G400VfsX5) thuộc intron 6, c.55delA

(p.I19LfsX22) và c.439_442delAACT (p.N147X) đều thuộc exon 1 Ba biến thể này được tiếp tục phân tích sinh hóa cho thấy ba biến thể này liên quan đến thiếu sự hiện diện của ANGPTL3, từ đó liên quan đến giảm lượng triglyceride chứa trong lipoprotein và mức độ HDL trong máu (Pisciotta et al., 2012)

Nghiên cứu của Musunuru và các cộng sự (2010) đã thực hiện đã thực hiện phương pháp giải trình tự exon, tập trung ở các vùng exon, vùng mã hóa các protein trên trên 38 thành viên của 3 thế hệ một gia đình mắc bệnh cao lipid máu tổ hợp mang tính gia đình (FCHL) Kết quả nghiên cứu cho thấy hai trường hợp bệnh nhân là hai anh em ruột có mang 2 dạng đột biến vô nghĩa đều thuộc exon 1 trên gen ANGPTL3: E129X và S17X Nhóm nghiên cứu thực hiện thêm phân tích tương quan giữa 2 đột biến S17X và E129X đến FCHL, kết quả cho thấy mức độ LDL và TG trong máu thấp (33 mg/dl [0,9 mmol/l] và 21 mg/dl [0,2 mmol/l]), nghiên cứu kết luận hai đột biến E129X và S17X cho thấy sự giảm nồng độ LDL-C trong máu

Nghiên cứu của Noto và các cộng sự (2012) xác định đột biến trên một số gene

ANGPLT3, APOB, PCSK9, và MTP tương quan với bệnh cao lipid trong máu Kết quả không tìm thấy đột biến ở các gene APOB, PCSK9, và MTP trong các mẫu nghiên cứu Kết quả phân tích trình tự gene ANGPTL3 xuất hiện các biến thể đột biến trong

8 mẫu với tỉ lệ đột biến tổng thể là 10,25% Trong đó, tính chất đột biến ở những bệnh nhân người Ý có các đột biến lệch khung mới (p.E95del, p.N147fsX1, và p.E119fsX8 đều thuộc exon 1) và các đột biến vô nghĩa mới (p.F295L và p.G56V thuộc exon 1, p.R332Q thuộc exon 6) Đối với tính chất đột biến ở những bệnh nhân người Mỹ xác định được một đột biến ở gene ANGPTL3 lệch khung mới là p.N121fsX và 2 đột biến vô nghĩa và đã được công bố trước đây là p.S17X và p.E129X, những người mang đột biến này cho thấy có mức độ triglyceride, cholesteol toàn phần, LDL-C, HDL-C thấp hơn những người không mang biến thể

4.4 Các nghiên cứu về đột biến trên gene ANGPTL3 trên thế giới

Gene ANGPTL3 là một trong những gene quan trọng liên quan đến chuyển hóa lipid Nghiên cứu đột biến gene ANGPTL3 đang nhận được sự quan tâm rất lớn trên toàn thế giới, đặc biệt trong lĩnh vực nghiên cứu bệnh tim mạch và bệnh lý lipid máu Nghiên cứu của Dewey và các cộng sự (2017) đã thực hiện giải trình tự exon trên

58335 người tham gia Nhóm thực hiện khảo sát mối liên quan giữa các biến thể mất chức năng (LOF) ở gene ANGPTL3 và với bệnh xơ vữa động mạch trong 13102 bệnh nhân và 40430 ca chứng Nghiên cứu thu nhận được 13 biến thể mất chức năng với tỷ lệ xuất hiện là 0,33% ở người mang bệng xơ vữa động mạch và tỷ lệ xuất hiện 0,45% ở người bình thường (OR = 0,59; 95%, CI = 0,41 – 0,85; P=0,004) Kết quả xác định những người mang biến thể mất chức năng có nồng độ TG thấp hơn khoảng 27% đối với những người không mang (P=2,5×10−21), nồng độ LDL-C ở những người mang biến thể thấp hơn khoảng 9% đối với người không mang đột biến (P=2,8×10−5), và nồng độ HDL-C ở người mang đột biến thấp hơn 4% đối với người không mang đột biến (P=0,02) Từ đó cho thấy các biến thể LOF của gene ANGPTL3 có tiềm năng làm giảm nguy cơ bệnh lý tim mạch

Nghiên cứu của Yang và các cộng sự (2019) nghiên cứu thực hiện sàng lọc trên

80 bệnh nhân FH và 77 người lành bệnh, nghiên cứu thực hiện xác định đột biến trên

6 gene có khả năng gây ra bệnh FH là: LDLR, APOB100, PCSK9, ABCG5, ABCG8, và ANGPTL3 Nhóm nghiên cứu sử dụng phương pháp giải trình tự Sanger nhằm xác thực các đột biến có tiềm năng gây bệnh sau khi các đột biến này được xác định bởi phương pháp NGS Nhóm đã xác định được 41 biến thể trong 28 bệnh nhân, trong đó có 2 đột biến gene ANGPTL3: một được pháp hiện ở vùng exon c.A956G: p.K319R, đột biến còn lại được phát hiện ở vùng không dịch mã c.*249G>A Đột biến Nhóm nghiên cứu thực hiện khảo sát in silico về sự ảnh hưởng của đột biến K319R của ANGPTL3 nhằm xem xét sự ảnh hưởng của đột biến này lên bệnh FH, kết quả cho thấy đột biến K319R ảnh hưởng lên sự biểu hiện của ANGPTL3 và quá trính chuyển hóa cholesterol

Nghiên cứu của Aghasizadeh và các cộng sự (2021) thực hiện giải trình tự của

Phương pháp phân tích tổng hợp

Mục tiêu của hệ thống tổng quan (System reviews) là làm giảm các thiên kiến bằng cách xác định, thẩm định và tổng hợp những nghiên cứu có liên quan (Rodseth et al., 2016) Việc xây dựng hệ thống tổng quan là bước cơ bản để tổng hợp các ước lượng và ảnh hưởng của nghiên cứu, và quá trình này được gọi là phân tích tổng hợp (meta-analysis) (Hernandez et al., 2020) Phân tích tổng hợp là một quy trình thống kê tích hợp các kết quả từ các nghiên cứu độc lập, đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu thực chứng Phân tích tổng hợp được sử dụng để khảo sát, tổng hợp và phân tích tỷ lệ xuất hiện đột biến trên gene mục tiêu và con đường chuyển hóa cholesterol trong máu, xác định tương quan giữa tính chất đột biến trên gene mục tiêu và nguy cơ mắc bệnh cao lipid, cụ thể là nguyên nhân nguyên phát, thông qua chỉ số

Proportion với khoảng tin cậy 95% (Confident interval, CI) và đồ thị Forrest plot Phân tích tổng hợp có nhiều lợi thế hơn những nghiên cứu phát hiện ảnh hưởng của yếu tố can thiệp lên kết quả, thông qua việc cho phép truy cập để xem xét các yếu tố khác nhau (sự thay đổi quần thể nghiên cứu, đối chứng, các yếu tố can thiệp, kết quả, ) như thế nào giữa các nghiên cứu với nhau (Hernandez et al., 2020)

Chỉ số Proportion thường được sử dụng để tổng hợp kết quả của các nghiên cứu về tỉ lệ của chủ thể trong một nhóm tham gia nghiên cứu Ví dụ như, xác định tỷ lệ xuất hiện đột biến trong gene mục tiêu gây ra bệnh tim mạch Chỉ số Proprotion được biểu diễn dưới dạng phần trăm Chỉ số này khi được đưa vào phân tích tổng hợp theo tỷ lệ giả định tính đồng nhất và ước tính trung bình trên nhiều quần thể khác nhau có thể ít được sử dụng trong lâm sàng Tuy nhiên để đánh giá hệ thống mục tiêu về các ca bệnh trên toàn cầu thì chỉ số Proportion vẫn phù hợp và hiệu quả Độ tin cậy của kết quả là một yếu tốt quan trọng để đánh giá tính chính xác và đáng tin cậy của kết quả tổng hợp, có thể được đánh giá thông qua việc sử dụng các giá trị thống kê như khoảng tin cậy (Cònidence interval, CI) và giá trị P (P-value) Khoảng tin cậy càng ngắn thì kết quả càng đáng tin cậy, và với cỡ mẫu càng lớn thì khoảng tin cậy càng ngắn đi Trong một số trường hợp, trung bình quần thể sẽ nằm chính giữa khoảng tin cậy, hoặc trung bình quần thể sẽ nằm trong khoảng tin cậy, tuy nhiên không đảm bảo chắc chắn rằng là trung bình quần thể luôn luôn thuộc khoảng tin cậy được tính ra từ mẫu nghiên cứu này

Trong phân tích tổng hợp có 2 mô hình chính được thực hiện chủ yếu là: mô hình ảnh hưởng bất biến (fixed) và mô hình ảnh hưởng ngẫu nhiên (Random) cho một tiêu chí nhị phân với khoảng tin cậy 95% (CI) Tiêu chí lựa chọn mô hình phân tích tổng hợp (Hernandez et al., 2020) dựa vào chỉ số I 2 (inconsistency) phản ánh tính bất đồng nhất về biến số khảo sát trong dữ liệu:

− I 2 < 50% và P ≥ 0,1: phân tích tổng hợp theo mô hình ảnh hưởng bất biến

− I 2 ≥ 50% và P < 0,1: phân tích tổng hợp theo mô hình ảnh hưởng ngẫu nhiên Các bước xây dựng hệ thống tổng quan phân tích tổng hợp được dựa theo sơ đồ của PRISMA (Hình phụ lục 1):

(1) Xây dựng câu hỏi nghiên cứu, đưa ra những phác thảo sơ bộ và đặt ra những tiêu chí nhằm lựa chọn và loại trừ các kết quả nghiên cứu

(2) Tìm kiếm sơ lược các nghiên cứu phù hợp với các tiêu chí đã đề ra từ các cơ sở dữ liệu lớn và phổ biến trên thế giới

(3) Lựa chọn và sàng lọc những nghiên cứu từ tiêu đề, phần tóm tắt và có thể đi sâu hơn vào nội dung của nghiên cứu

(4) Chọn lọc thông tin, xây dựng hệ thống tổng quan, thu thập dữ liệu từ các nghiên cứu

(5) Đánh giá độ tin cậy của dữ liệu và chiết xuất dữ liệu

(6) Xem xét các yếu tố không đồng nhất của các biến số trong bộ dữ liệu (7) Xây dựng mô hình bất biến hoặc ngẫu nhiên để xác định chỉ số Proportion với độ tin cập 95% (p