dòng hóa biểu hiện và tinh chế protein huỳnh quang rhau30 cfp ứng dụng trong xác định cấu trúc g quadruplex song song

Đặng Thanh Dũng Học viên thực hiện: Trần Hoàng Bảo Trân Lớp: DH17YD01 Ngày sinh: 07/12/1999 Nơi sinh: Bình Định Tên đề tài: Dòng hóa, biểu hiện và tinh chế protein huỳnh quang RHAU30-CFP

TỔNG QUAN

Cấu trúc G-quadruplex

Cấu trúc của phân tử DNA được cấu tạo hình thành nên chuỗi xoắn kép, được biết đến là mô hình xoắn kép của Watson-Crick Tuy nhiên, vào khoảng thời gian sau thập niên 80 của thế kỉ trước, các nhà nghiên cứu đã tìm thấy trong bộ gene của eukaryote có sự hình thành mô hình cấu trúc DNA mới tồn tại ở dạng xoắn tứ diện được gọi là G- quadruplex G-quadruplex hình thành ở vùng trình tự DNA hoặc RNA giàu guanine ở dạng cấu trúc bậc hai hình thành dạng gấp cuộn với bốn sợi được tạo nên từ các mặt phẳng G-tetrad (G-G-G-G tetrad) song song và chồng lên nhau (Heddi và cộng sự., 2015) Mỗi G-tetrad chứa 4 phân tử guanine, ở trung tâm mặt phẳng có các cation hóa trị 1 thường là Na + hoặc K + giúp mặt phẳng giữ được sự ổn định (Chambers và cộng sự., 2015) Cấu trúc G-quadruplex được thể hiện trong Hình 1.1

Mặt phẳng hình vuông G-tetrad được tạo bởi sự kết hợp của bốn gốc guanine (Hình

1.2A) Nhờ vào các liên kết hydrogen Hoogsteen giữa các guanine (N1 - O6, N2 - N7) với các nguyên tử O6 hướng vào tâm để tạo thành một khu vực anion lưỡng cực và kết

5 hợp các ion kim loại xen vào vùng trung tâm để giữ được sự ổn định cho cấu trúc (Phan và cộng sự., 2006)

Các guanine trong mỗi G-tetrad liên kết với gốc đường trong nucleotide có thể là syn glycosidic hoặc anti glycosidic như trong Hình 1.2B Ở trung tâm là nhân kim loại hóa trị I (Li + , Na + hoặc K + ) tích điện dương với bán kính nguyên tử khác nhau có tác động lên cấu trúc liên kết được gấp lại của các G-tetrad xếp chồng lên nhau và ảnh hưởng đến tính ổn định của G-quadruplex (Phan và cộng sự., 2006)

(A) Các liên kết trong cấu trúc G-tetrad (B) Guanine liên kết với gốc đường ở dạng anti glycosidic và syn glycosidic

Nhân G-tetrad được tạo nên từ nhiều kiểu như là song song (bốn sợi cùng chiều), (3+1) ba sợi cùng chiều, đối song (hai sợi cùng chiều lên, hai sợi còn lại cùng chiều xuống)

Hình 1.3 Cấu trúc nhân của G-tetrad (Nguồn Magdalena Malgowska)

(A): G-tetrad song song; (B): G-tetrad đối song;

(C): G-tetrad đối song; (D): Kiểu (3+1) của nhân G-tetrad

Hình 1.2.Các liên kết trong cấu trúc G-quadruplex (Nguồn Collie, G.W and Parkinson)

1.1.4 Vị trí hình thành G-quadruplex

Trong bộ gene người có hơn 300.000 trình tự có thể hình thành nên cấu trúc G- quadruplex, được nhận thấy qua sự mô phỏng của phần mềm máy tính (Rhodes và cộng sự., 2015) Ngoài ra, G-quadruplex cũng được tìm thấy trong DNA của vi khuẩn hay RNA của virus (Norseen và cộng sự., 2009) (Sundquist và cộng sự., 1993) Trong bộ gene, G4 tồn tại nhiều ở các telomere nơi chứa khoảng 5.000 đến 10.000 đoạn trình tự lặp lại giàu Guanine (TTAGGG) (Phan và cộng sự., 2006) (Luu và cộng sự., 2006) (Wang và cộng sự., 2011) Bên cạnh đó, trong promoter của một số gene cũng thấy sự tồn tại của G-quadruplex (Cogoi và cộng sự., 2006) (Patel và cộng sự., 2007) G- quadruplex cũng được tìm thấy trong RNA đặc biệt là những vùng không dịch mã của RNA thông tin (Bugaut và cộng sự., 2012) Sự hình thành G-quadruplex có liên quan đến nhiều quá trình sinh học trong hệ thống tế bào như sự sao chép, duy trì telomere, phiên mã, và dịch mã (Hình 1.4)

(A) Phiên mã; (B) Duy trì telomere; (C) Sao chép DNA; (D) Dịch mã

1.1.5 Chức năng của cấu trúc G-quadruplex với sự duy trì telomere Ở động vật có vú, các đầu tận cùng của nhiễm sắc thể được bảo vệ bằng các telomere tức là những cấu trúc đặc biệt gồm các chuỗi 6 nucleotide (TTAGGG) được lặp lại, song song và kế tiếp nhau Tuy nhiên, trong quá trình phân chia tế bào, phần cuối của các chuỗi DNA lại không có khả năng sao chép, vì vậy sau mỗi lần phân chia, các

Hình 1.4 Sự hình thành cấu trúc G-quadruplex trong các quá trình sinh học

7 nhiễm sắc thể bị ngắn đi do mất một số lượng DNA của telomere (khoảng 50-100 bp) Khi đó các nhiễm sắc thể sẽ trở nên kém bền vững do các telomere quá ngắn Dẫn đến việc các nhiễm sắc thể không bám vào được màng nhân tế bào, có hình dạng kỳ dị và bị dính chùm vào nhau, hậu quả là các tế bào dẫn đến quá trình apoptosis Việc duy trì chiều dài của telomere có nhiệm vụ bảo đảm sự bền vững của các chromosome, ngăn cản quá trình apoptosis, chống lại sự tái tổ hợp sai lệch và có vai trò điều hòa gene Telomerase là một enzyme có vai trò giúp các phân tử DNA sao chép toàn bộ nhiễm sắc thể mà không bị mất đi đoạn cuối cùng Telomerase tham gia vào quá trình phân chia của tế bào, giúp duy trì chiều dài phần cuối của nhiễm sắc thể Thành phần RNA của telomerase ở người có 445 nucleotid, trong đó vị trí các nucleotid 46-56 là vị trí gắn vào đầu tận cùng của telomere, được sử dụng làm khuôn để từ đó thêm vào các DNA của telomere Cơ chế bảo vệ telomere là enzyme telomerase sẽ nhận dạng đầu tận cùng của telomere thông qua các hoạt động giữa telomere và cả hai tiểu đơn vị hTR và hTERT của telomerase, sau đó thêm vào các chuỗi sáu base TTAGGG ở đầu tận cùng này giúp kéo dài thêm telomere và cứ thế tiếp tục Ở tế bào ung thư, đây chính là cơ chế giúp chúng trở nên bất tử

Trong nhiễm sắc thể ở người, sợi đơn ở đầu 3' của telomere (khoảng 100 - 280 nucleotide) được cho là rất thuận lợi để hình thành cấu trúc G-quadruplex Sự hình thành cấu trúc G-quadruplex đã ngăn cản telomerase không thể bám và tương tác với telomere khiến chúng bị ức chế hoạt tính, dẫn đến telomere càng lúc càng ngắn lại (Lattmann và cộng sự., 2011) (Martadinata và cộng sự., 2011) Vì vậy, kiểm soát chiều dài của telomere trên cơ sở can thiệp cấu trúc G-quadruplex gần đây đã mở ra một hướng mới trong phương pháp trị liệu bệnh ung thư

Ngoài ra, G-quadruplex cũng đóng một vai trò quan trọng trong sự tái bản, phiên mã và dịch mã Có khoảng một nửa tổng số gene ở người có cấu trúc G-quadruplex nằm ở gần vùng promoter liên quan đến điều hòa biểu hiện của gene (Martadinata và cộng sự., 2011) Sử dụng những phân tử nhỏ hay protein để kiểm soát cũng như làm ổn định cấu trúc G-quadruplex là tiền đề quan trọng giúp điều hòa các quá trình sinh học của tế bào Đặc biệt, một cơ chế sinh học được quan tâm nhiều hiện nay là RNA G-quadruplex (r(UUAGGG) lặp lại gọi là TERRA) có liên kết đặc hiệu với protein RHAU (RNA Helicase Associated with AU-rich Element) và bị protein này tháo xoắn (Hình 1.4) Trong những nghiên cứu gần đây người ta đã chứng minh được rằng protein RHAU

8 không chỉ liên kết được với RNA G-quadruplex mà còn liên kết được với cả DNA G- quadruplex (Heddi và cộng sự., 2015).

Protein RHAU

RHAU (RNA Helicase Associated with AU-rich Element) là một trong số những protein có ái lực mạnh và đặc hiệu đối với cấu trúc G-quadruplex Đây là họ RNA helicase có ở người bao gồm 1008 amino acid thuộc họ DEAH-box mã hóa bởi gene DHX36 Theo nghiên cứu của Booy EP (Heddi và cộng sự., 2015) năm

2012, protein RHAU có khả năng gắn lên và tháo xoắn G-quadruplex ở đầu 5’ của RNA telomerase người trong điều kiện in vitro Trong đó, đầu N của protein RHAU là vùng trình tự bảo tồn có vai trò là domain gắn với motif đặc hiệu là RHAU specific motif (RSM) Trình tự này có 13 amino acid (từ amino acid 54 đến 66) tính từ đầu N Đây là yếu tố chính để protein RHAU gắn đặc hiệu lên cấu trúc G-quadruplex

Protein này gồm 3 vùng như trong Hình 1.5:

- Vùng NTR (vùng đầu N N-Terminal Region) kéo dài từ amino acid 1 đến 203 và chứa trình tự RSM (RHAU-specific motif) có khả năng tương tác đặc hiệu với G-quadruplex

- Vùng HCR (vùng lõi Helicase Core Region) gồm các motif từ I tới VI thể hiện hoạt tính ATPase hoặc helicase và kéo dài từ amino acid 204 đến 615

- Vùng CTR (vùng đầu C C-Terminal Region) kéo dài từ amino acid 616 tới 1008.

Sự tương tác giữa G-quadruplex và protein

Trong tế bào, hệ thống protein RHAU (thuộc nhóm helicase) được tổng hợp để nhận diện và tháo xoắn cấu trúc G-quadruplex (Vaughn và cộng sự., 2005) Ở người, protein RHAU gồm có 1008 amino acid, protein này cũng có liên kết với vùng trình tự giàu Adenine và Uracil của RNA (Vaughn và cộng sự., 2005) (Norseen và cộng sự., 2009) Khi tế bào chịu áp lực căng thẳng, protein RHAU sẽ liên kết với RNA thông tin (mRNA) và tạo thành phức hợp protein và RNA có nồng độ cao để giúp bảo vệ RNA khỏi bị phân hủy trong những điều kiện không thuận lợi đối với tế bào (Bugaut và cộng sự., 2012) Ngoài ra, những nghiên cứu gần đây cho thấy, khi có sự hiện diện của ATP, protein RHAU được kích hoạt sẽ nhận diện và bám lên cấu trúc DNA, RNA G-

Hình 1.5 Protien RHAU ở người (nguồn: commons.wikimedia.org)

9 quadruplex song song mục tiêu và thực hiện chức năng là mở xoắn các cấu trúc G- quadruplex này (Lattmann và cộng sự., 2011)

Protein RHAU có khả năng nhận diện và bám vào được cả DNA và RNA với ái lực cao là nhờ trình tự peptide đặc hiệu ngắn (RSM, RHAU54-66) ở vùng đầu N của protein (Lattmann và cộng sự., 2010) Vì trình tự RHAU peptide nhận biết được và bám đặc hiệu vào cấu trúc song song của G-quadruplex DNA hoặc RNA nên nó có thể được xem là một ligand tiềm năng đặc hiệu cho cấu trúc G-quadruplex song song Tuy nhiên khảo sát ái lực tương tác cho thấy giữa RHAU peptide 18 aa (vị trí amino acid từ 53 đến 70) hay RHAU peptide 23 aa (vị trí amino acid từ 53 đến 75) đối với G-quadruplex song song có ái lực tương tác yếu Điều này làm giới hạn khả năng ứng dụng của những RHAU peptide này trong quá trình nghiên cứu tương tác giữa ligand với G-quadruplex trong các quá trình sinh học của tế bào Trong đó, đoạn trình từ RHAU dài 30 amino aicd (từ vị trí amino acid 53 tới 82) có chứa vùng RSM và được chứng minh là có ái lực mạnh với G-quadruplex (đề tài sẽ gọi là RHAU30) được chọn sử dụng để nghiên cứu tạo dòng và biểu hiện để tạo tiền đề cho việc phát hiện cấu trúc G-quadruplex song song.

Protein huỳnh quang CFP

Cyan Fluorescent Protein (CFP) là một protein huỳnh quang màu lục lam dễ biểu hiện và có tính bền Đầu dò protein này có thể liên kết chọn lọc và hình dung cấu trúc song song G4 ở ái lực cao, cho phép dễ dàng quan sát hình ảnh song song G4 của RHAU-CFP trong ống nghiệm bằng cách sử dụng Gel Doc thông thường hoặc bằng mắt thường (Truong và cộng sự,2018) Cấu trúc gần đây của phức hợp peptide G4 RHAU đã cung cấp cấu trúc cơ sở cụ thể cho việc nhận dạng giữa RHAU và G4 (Jin và cộng sự, 2020) Mặt khác, G4 có thể gắn đặc hiệu vào RHAU30 peptide và sự liên kết chặt chẽ của RHAU30 peptide với protein CFP cho phép G4 lựa chọn để gắn và tạo thành phức hợp RHAU30-CFP Việc tạo ra đầu dò RHAU30-CFP giúp cải tiến khả năng bám đặc hiệu vào cấu trúc G4 song song, từ đó có thể xác định được cấu trúc G4 song song hiệu quả cao hơn

PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Vật liệu nghiên cứu

- Bàn soi gel UV (Imagemaster VDS)

- Bộ điện di DNA (Cleaver Scientific)

- Bộ điện di protein (BioRad)

- Máy đo pH (TRANS Instrument)

- Máy đo quang phổ (Eppendorf)

- Máy đo quang phổ chuyên dụng (Nanodrop®)

- Máy phá tế bào bằng sóng siêu âm (Qsonica)

- Máy khuấy từ gia nhiệt (Benchmark)

- Máy ly tâm lạnh (Hermle)

- Máy ly tâm eppendorf (Hermle)

- Máy đọc đĩa CLARIOStar (BMG Labtech)

- Cột Histrap HP (GE Healthcare)

- Bộ Pipet, tip dùng riêng cho thao tác RNA

- Máy chụp hình gel Polyacrylamide (Gel company)

- Các vật liệu khác: eppendorf, tip,

2.1.2 Hóa chất sửa dụng trong các thí nghiệm

2.1.2.1 Hóa chất dùng trong PCR

- Buffer Taq DNA polymerase (Fermentas)

- Deep Vent®Buffer 10X (Thermo Scientific)

- Deep Vent®DNA Polymerase (Thermo Scientific)

2.1.2.2 Hóa chất điện di DNA

- Dung dịch điện di DNA TAE 1X

2.1.2.3 Hóa chất dùng trong phản ứng cắt giới hạn và nối

2.1.2.4 Hóa chất dùng trong tạo tế bào E.coli khả nạp

2.1.2.5 Hóa chất dùng tạo dòng biểu hiện và tinh chế prontein

- Lysis Buffer: 25 mM Tris-HCl pH 8,0; 250 mM Succrose

- Binding Buffer: 30 mM Tris-HCl pH 8,0; 500 mM NaCl; 5% glycerol

- Dung dịch bảo quản protein: 100 mM KCl; 20 mM potassium phosphate pH 7,4

2.1.2.6 Hóa chất dùng trong điện di SDS - PAGE

- Dung dịch nạp mẫu SDS-PAGE 5X: 250 mM Tris-HCl pH 6,8; 10% SDS; 30% glycerol; 500 mM DTT; 0,02% bromophenol blue

- Dung dịch chạy SDS-PAGE 1X: 25 mM Tris base; 192 mM glycine; 0,1% SDS

- Dung dịch bảo quản protein: 100 mM KCl; 20 mM potassium phosphate pH7,4

- Gel gom: 4% acrylamide/bis-acrylamide 29:1; 125 mM Tris-HCl pH 6,8; 0,1% SDS; 0,07% APS; 0,1% TEMED

- Gel phân tách: 12% acrylamide/bis-acrylamide 29:1; 375 mM Tris-HCl pH 8,8; 0,1% SDS; 0,07% APS, 0,1% TEMED

- Dung dịch nhuộm gel SDS-PAGE: 50% acid acetic; 25% ethanol; 0,25% Coomassie Brilliant Blue

- Dung dịch giải nhuộm: Ethanol tuyệt đối 100 ml; Glacial Acetic 100 ml pha trong 1 lít dung dịch

- Kháng sinh: Amp 200 mg/ml được bổ sung vào môi trường nuôi cấy E coli với nồng độ cuối là 100 μg/ml Kháng sinh được giữ ở -20 o C

- IPTG: 1 mM (hòa tan trong nước cất vô trùng), bảo quản ở -20 o C

- Chủng E coli DH5𝛼: F– φ80lacZΔM15 Δ(lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17(rK–, mK+) phoA supE44 λ– thi-1 gyrA96 relA1 (Invitrogene): sử dụng cho dòng hóa tạo vecter tái tổ hợp pRHAU30-CFP

- Chủng E coli BL21 (DE3): F- ompT hsdSB (rB-mB-) gal dcm (DE3) (Invitrogene): sử dụng cho biểu hiện protein RHAU30-CFP dưới sự cảm ứng của IPTG

- pTD2: Chứa gene mã hóa cho protein RHAU30 (được cung cấp bởi Trung tâm khoa học và công nghệ sinh học Trường Đại học KHTN, TP HCM)

- pRHAU30-CFP: Chứa gene mã hóa protein RHAU30-CFP

Plasmid pTD2 có chứa T7 promoter dung hợp với gene mã hóa cho peptide RHAU có chiều dài 30 amino acid được dùng làm vector khung sườn cho dòng hóa T7 promoter là một promoter mạnh, sau vài tiếng đã cảm ứng 50% tế bào tổng hợp protein mục tiêu T7 promoter chỉ nhận diện một loại RNA polymerase duy nhất là T7 RNA polymerase, vì vậy RNA polymerase khác của E coli không thể bám vào vùng T7 promoter và cảm ứng biểu hiện protein mục tiêu.

Ngoài ra plasmid pTD2 còn chứa vùng gene lacI, mã hóa cho lac repressor Khi chưa có chất cảm ứng IPTG, lac repressor sẽ bám vào lac operon không cho gene T7 tạo ra T7 RNA polymerase, lúc này gene mục tiêu vẫn chưa được biểu hiện IPTG là đồng phân của allolactose, có chức năng cảm ứng như lactose nhưng không bị phân cắt trong tế bào vì vậy có thể cảm ứng protein liên tục trong thời gian tế bào tăng trưởng Việc kết hợp gene lacI và chất cảm ứng tổng hợp IPTG sẽ dễ tầm soát sự biểu hiện protein Bên cạnh đó plasmid pTD2 còn chứa gene kháng kháng sinh Ampicillin để sàng lọc tế bào E coli BL21(DE3) mang gene mục tiêu Vùng gene mã hóa đuôi 6×His được dung hợp với protein RHAU là yếu tố quan trọng giúp tinh chế tốt protein mục tiêu.

- Protein RHAU30-CFP nhận từ trung tâm Khoa học và Công nghệ Sinh học, Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh

- Enzyme cắt giới hạn: Hai enzyme cắt giới hạn BamHI, XhoI được sử dụng trong thí nghiệm cắt và nối gene mục tiêu vào plasmid

Các trình tự mồi sử dụng trong đề tài được trình bày ở bảng 2.1:

Bảng 2.1 Các trình tự mồi sử dụng trong thí nghiệm

Hình 2.1 Sơ đồ plasmid pTD2

Tên Trình tự nucleotide của mồi (5’ – 3’) Mục đích

ON 1 AAGAGATCTGGCGGCGGCAGCATGG PCR thu gene

PCR thu gene PCR khuẩn lạc

Giải trình tự PCR khuẩn lạc

- Thang DNA 200bp (DNA Ladder 200bp HT200D400V, HT Biotech)

- Thang protein HT-P1(HT Biotech)

- Môi trường LB (Luria-Bertani): 10g trypton, 5g Yeast extract (cao nấm men), 5g NaCl, dH2O vừa đủ 1 lít

- Môi trường LB-Amp: gồm môi trường LB có bổ sung thêm kháng sinh Ampicillin để đạt nồng độ 100 μg/ml

- Môi trường LB-Amp agar: gồm môi trường LB-agar bổ sung thêm kháng sinh Ampicillin để đạt nồng độ cuối 100 μg/ml.

Phương pháp thực hiện

Một DNA tái tổ hợp được tạo ra bằng cách sử dụng các kỹ thuật di truyền để tổ hợp DNA từ hai hoặc nhiều nguồn khác nhau Ví dụ, nối gene của hai loài vi khuẩn khác nhau hoặc gắn chèn gene của người vào nhiễm sắc thể virus

Quy trình thí nghiệm để tạo ra vector mang gene RHAU30-CFP được thể hiên dưới hình 2.2

2.2.1 PCR thu gene CFP với cặp mồi đặc hiệu

CFP là một protein huỳnh quang được sử dụng phổ biến trong các thí nghiệm nhận biết và phát hiện mục tiêu Thí nghiệm này sử dụng kỹ thuật protein tái tổ hợp để tạo ra protein dung hợp với RHAU peptide (RHAU-CFP) có khả năng nhận biết đặc hiệu G- quadruplex

Nguyên tắc của phản ứng PCR:

PCR là kỹ thuật khuếch đại một đoạn trình tự DNA đặc hiệu trong ống nghiệm nhờ vào hoạt động xúc tác của enzyme DNA polymerase Sự khuếch đại này gồm 3 bước:

+ Biến tính: tách DNA mạch đôi thành hai mạch đơn bằng tác động của nhiệt

+ Bắt cặp: hai mồi bắt cặp với DNA bản mẫu

+ Kéo dài: mạch mới được tổng hợp kéo dài từ mồi

Thí nghiệm PCR thu gene CFP được thực hiện với cặp mồi đặc hiệu ON1; ON2 và khuôn là đoạn gene CFP, sản phẩm PCR dự đoán có chiều dài 749 bp Các thành phần trong phản ứng được thể hiện trong bảng 2.2:

Hình 2.2 Quy trình dòng hóa tạo vector tái tổ hợp chứa gene RHAU30-CFP

Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR

Thành phần Thể tích (μl)

Deep Vent DNA polymerase buffer 10X 10

Tiến hành PCR ở 40 o C với số chu kỳ lặp lại là 30, chu trình nhiệt PCR được thể hiện dưới hình 2.3:

Hình 2.3 Chu trình nhiệt PCR thu gene RHAU30-CFP

Sản phẩm thu được tiến hành chạy điện di để kiểm tra trên gel agarose 2% và được tinh sạch bằng QIAquick PCR Purification Kit

Quy trình tinh sạch mẫu bằng QIAquick PCR Purification Kit

− Bổ sung buffer PB vào sản phẩm PCR theo tỉ lệ 5:1 (v/v), trộn đều

− Chuyển dung dịch vào cột, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 30 – 60 giây, bỏ phần dịch qua cột

− Rửa cột với 750 àl buffer PE, ly tõm 13.000 vũng/phỳt trong 30 – 60 giõy, bỏ phần dịch sau khi qua cột

− Ly tâm lại 13.000 vòng/phút trong 1 phút để loại bỏ hoàn toàn buffer PE

− Chuyển cột sang một eppendorf 1,5 ml mới, vô trùng

− Thờm 30–50 àl MiliQ vào chính giữa cột

− Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút, thu phần dịch chứa gene và bảo quản ở -20 0

2.2.2 Tạo vector tái tổ hợp pRHAU30-CFP

Plasmid pTD2 chứa trình tự gene RHAU30 được cung cấp bởi trung tâm khoa học và công nghệ sinh học ( Center for Bioscience and Biotechnology)

2.2.2.1 Phản ứng cắt mở vòng vector

Plasmid pTD2 chứa trình tự gene RHAU30 được cắt bằng hai enzyme cắt giới hạn

BamHI và XhoI tạo đầu dính đồng thời đoạn gene mục tiêu cũng được xử lý với 2 enzyme trên nhằm mục đích nối đoạn gene CFP vào plasmid Vì enzyme có bản chất là protein nên cần giữ trong buffer để nâng cao hiệu quả của phản ứng nối, ở đây buffer 10X được sử dụng để thực hiện phản ứng cắt cho cả hai enzyme cắt giới hạn vì phù hợp với cả 2 enzyme

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng cắt

Vector pRHAU30 và gene mục tiêu được cắt trong dung dịch đệm buffer 10X ở

37 o C trong 3 giờ Sau đó, sản phẩm cắt được tinh sạch bằng bộ kit QIAquick PCR Purification Kit nhằm loại bỏ enzyme cắt giới hạn

2.2.2.2 Phản ứng nối gene mục tiêu CFP vào plasmid

Thực hiện phản ứng nối bằng enzyme T4 DNA ligase, enzyme này xúc tác phản ứng nối giữa hai đầu phân tử DNA bằng cách hình thành liên kết phosphodiester giữa

Thành phần Thể tích (μl)

Plasmid pTD2/ sản phẩm PCR 50 (5 μg)

20 đầu 5’-phosphate với đầu 3’-OH Thành phần của phản ứng nối được thể hiện dưới

Bảng 2.4 Thành phần phản ứng nối gene mục tiêu vào plasmid

Thành phần Thể tích (μl)

Gene CFP đã xử lý với enzyme cắt giới hạn 0,9 (150 ng) pTD2 đã xử lý với enzyme cắt giới hạn 1,1 (150ng)

Plasmid và sản phẩm PCR gene mục tiêu sau khi cắt sẽ được nối lại bởi enzyme T4

DNA ligase, ủ ở 37 o C trong vòng 1 giờ

Phương pháp biến nạp bằng hóa chất (hóa biến nạp) rất đơn giản và ít tốn kém Nguyên tắc của quá trình này là dựa trên sự xáo trộn của màng tế bào do thay đổi nhiệt độ đột ngột gây ra, tế bào và vector mục tiêu được ủ ở nhiệt độ thấp (4°C) , sau đó sốc nhiệt ở 42°C trong 90 giây Bước sốc nhiệt 42 o C làm màng tế bào dãn ra và vector tái tổ hợp dễ dàng đi vào bên trong Bước làm lạnh nhanh làm màng tế bào co lại giúp giữ vector tái tổ hợp bên trong tế bào Bên cạnh đó, ion Ca 2+ như một chất trung gian vừa có khả năng tương tác với DNA và màng tế bào giúp DNA bám lên màng tế bào dễ dàng hơn và tăng hiệu quả biến nạp Sau đó, nuôi tế bào trong môi trường LB ở nhiệt độ 37°C trong điều kiện lắc để hồi phục

- Chuẩn bị tế bào khả nạp

+ Nuôi cấy tế bào E coli DH5α trong 20 ml môi trường LB lỏng, lắc ở 37°C để qua đêm

+ Sau đó cấy chuyền sang 300 ml môi trường LB lỏng, tiếp tục lắc ở 37°C

+ Tiến hành đo OD600 nm của dịch nuôi cấy cho đến khi đạt giá trị là 0,6 Ly tâm ở

6000 vòng/phút trong 2 phút, thu sinh khối, đổ bỏ dịch

+ Huyền phù sinh khối trong 20 ml CaCl2 100 mM lạnh, ly tâm 6000 vòng/phút trong

2 phút, thu sinh khối, loại bỏ dịch (tiến hành trong bồn đá)

+ Tiếp tục thêm 6 ml CaCl2 100 mM lạnh và 600 μl glycerol (100%), huyền phù nhẹ Chia đều ra eppendorf, mỗi ống 300 μl, giữ ở -80°C ( tiến hành trong bồn đá)

- Sản phẩm nối được biến nạp vào chủng E coli khả nạp

+ Lấy 20 μl tế bào E coli khả nạp từ tủ -80 o C làm tan trong bồn đá

+ Hút 5 μl sản phẩm nối (pRHAU30-CFP) vào ống tế bào khả nạp Ủ trong bồn đá

+ Sau đó shock nhiệt bằng cách heat ở 42 o C trong 90 giây và tiếp tục ủ đá 5 phút

+ Thêm vào 250 μl môi trường LB không kháng sinh, lắc 250 vòng/37 o C/30 phút

+ Sau đó hút 70 μl trên trải đĩa LB agar có chứa kháng sinh ampicillin (100 μg/ml) Để ủ ở 37 o C, trong vòng 24h

2.2.3 Sàng lọc dòng tế bào E coli mang vector tái tổ hợp

Sau khi đã biến nạp tiến hành sàng lọc chủng E coli DH5α có chứa vector pRHAU30-CFP trên môi trường LB agar đã có bổ sung Ampicillin Do vector pTD2 có chứa gene kháng kháng sinh Ampicillin nên sau khi thực hiện quy trình biến nạp, các tế bào E coli được sàng lọc trên môi trường LB-Agar-Amp, những khuẩn lạc mọc được sẽ mang vector Tuy nhiên, sản phẩm của quá trình nối có thể là vector tái tổ hợp hoặc vector chèn sai gene, vector tự nối hay vector nối với vector Khi biến nạp những sản phẩm này vào E coli thì chúng cũng có khả năng sinh trưởng trên môi trường bổ sung kháng sinh Do đó, cần thực hiện PCR khuẩn lạc để xác định gene mục tiêu đã được gắn vào vector Sau khi có kết quả PCR khuẩn lạc, tiến hành giải trình tự gene của những khuẩn lạc mang gene mục tiêu RHAU30-CFP

Bảng 2.5 Thành phần phản ứng PCR khuẩn lạc

2.2.3.1 Phản ứng PCR khuẩn lạc

Trong PCR khuẩn lạc, DNA khuôn là plasmid tách chiết từ tế bào E.coli mọc trên đĩa môi trường sau khi biến nạp, mồi một và mồi hai lần lượt là ON30 và ON2 Trong đó, ON2 là mồi bám lên gene mục tiêu và ON30 là mồi bám lên plasmid gốc ở phía trước T7 promoter nhằm: kiểm tra gene mục tiêu có được chèn vào plasmid hay không, đồng thời xác định khả năng chèn vào đúng chiều của gene mục tiêu Kích thước sản phẩm là 937 bp

Chu trình luân nhiệt cho PCR khuẩn lạc tương tự như PCR thu gene Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 2% để kiểm tra Dòng tế bào cho kết quả dương tính chọn nuôi cấy, tách thu nhận plasmid bằng bộ Kit QIAprep Spin Miniprep (QIAGENE) và thực hiện các bước tiếp theo

Taq Buffer (có Mg 2+ ) 10X 1,5 dNTP (2 mM mỗi loại) 1,5

Taq DNA polymerase 0,1 dH2O vừa đủ Đủ 15 μl

Hình 2.4 Vị trí bắt cặp của mồi cho phản ứng PCR khuẩn lạc

2.2.4 Tinh sạch, thu nhận plasmid

− Huyền phù (vortex) sinh khối tế bào trong 250 μl dung dịch Solution Resuspension

− Thêm 250 μl dung dịch ly giải (Lysis Solution), hút trộn 4-6 lần đến khi dịch trong

− Thêm 350 μl dung dịch trung hòa (Neutralization Solution), hút trộn 4-6 lần Ly tâm

13000 vòng/phút trong vòng 10 phút

− Hút 800 μl dịch nổi cho qua cột Ly tâm 12000 vòng/phút trong 1 phút

− Đổ bỏ dịch, tiếp tục ly tâm khô 12000 vòng/phút trong 1 phút

− Thêm 50 μl dung dịch rửa (wash solution), ly tâm 12000 vòng/phút trong 1 phút

− Bỏ dịch, tiếp tục thêm 500 μl dung dịch rửa giải (wash solution), ly tâm 12000 vòng/phút trong 1 phút

− Bỏ dịch, ly tâm khô trong 1 phút để loại bỏ dung dịch rửa

− Ly tâm 13000 vòng/ phút, thu nhận plasmid

Các dòng tế bào mang vector đã được kiểm tra bằng PCR khuẩn lạc sẽ được nuôi cấy và thu nhận vector để gửi đi giải trình tự gene bằng phương pháp Sanger cải tiến tại công ty Macrogene Hàn Quốc với mồi đặc hiệu ON30 nằm phía trước T7 promotor Kết quả giải trình tự sẽ được so sánh với trình tự gene lý thuyết bằng phần mềm Clone Manager 9.0 để xác định chính xác từng nucleotide trong thực tế so với thiết kế

2.2.6 Biểu hiện protein tái tổ hợp

Dòng khuẩn lạc sau khi giải trình tự cho kết quả đúng sẽ được đem biểu hiện với các bước sau:

2.2.6.1 Biến nạp vector tái tổ hợp pRHAU30-CFP vào chủng biểu hiện E coli BL21(DE3)

Tiến hành biến nạp vector tái tổ hợp pRHAU30-CFP mang gene RHAU30-CFP vào chủng E coli khả nạp, sau đó nuôi cấy trên môi trường LB agar- Amp để sàng lọc Quy trình thí nghiệm như sau:

− Cho 20 μl vào plasmid vào 20 μl tế bào khả nạp Ủ đá trong 15 phút để làm lạnh

− Shock nhiệt ở 42 0 C trong 90 giây, tiếp tục ủ đá 5 phút

− Thêm vào 250 μl LB lỏng, nuôi lắc ở 37 0 C, 30 phút

− Ly tâm 250 vòng/phút trong 30 giây, đổ bỏ một phần dịch nổi Sau đó hút 70 μl trải đĩa LB-agar-Amp để sàng lọc

− Chuẩn bị mẫu điện di

 Hút 100μl dung dịch lysis buffer vào mẫu sinh khối đã thu nhận, vortex Sinh khối lúc này có giá trị OD600 nm=1,2

 Thêm 25 μl dung dịch sample buffer 5X, vortex Sốc nhiệt ở 95 o C, 5 phút

 Sau đó ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút

− Chạy điện di SDS-PAGE

 Nạp 2,5 μl thang protein vào giếng

 Hút 10 μl mẫu biển hiện ở mỗi pha tổng, tủa, tan vào giếng

 Tiến hành điện di trong điều kiện hiệu điện thế 300 V, cường độ dòng điện 25 mA/gel, trong 60 phút

 Nhuộm gel bằng dung dịch nhuộm gel SDS-PAGE và giải nhuộm bằng dung dịch giải nhuộm

Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) là kỹ thuật điện di biến tính trên gel polyacryamide Sodium dodecyl sulfate (SDS) cùng với những chất khử như DDT (dithiotheitol) hoặc β-mercaptoethanol giúp phá vỡ liên kết disulfide trong protein, biến protein từ dạng không gian về dạng thẳng Đồng thời SDS tích điện âm cho protein, làm cho điện tích của phân tử protein lớn hơn hẳn điện tích có sẵn của nó (tồn tại ở gốc R trong amino acid) SDS bám lên protein theo một tỷ lệ nhất định Điều này làm cho điện tích mới của phân tử protein tỷ lệ với khối lượng phân tử của nó

Gel cho điện di SDS-PAGE được chia làm 2 phần, phần trên là gel có nồng độ polyacrylamide thấp gọi là gel gom với buffer là Tris-HCl pH 6,8 và gel phần dưới có nồng độ polyacrylamide cao gọi là gel phân tách với buffer là Tris-HCl pH 8,8 Buffer cho dung dịch chạy điện di là Tris-Glycine pH 8,3

Gel gom có vai trò tập hợp tất cả các protein với các kích thước khác nhau về một vị trí để tất cả protein cùng đi vào gel phân tách tại một thời điểm Điều này là do khi bắt đầu quá trình điện di, các phân tử glycine tích điện âm trong đệm (có pH = 8,3) được đẩy vào trong lớp gel gom Tại đây, pH = 6,8, các phân tử glycine bị chuyển thành dạng trung hòa về điện tích, làm cho tốc độ di chuyển của chúng bị giảm đi đáng kể trong điện trường Trái ngược với glycine, các ion Cl - di chuyển nhanh hơn trong điện trường, và hình thành nên một lớp ion ở phía trước các phân tử glycine Toàn bộ các phân tử protein được tra vào giếng được cô lại giữa 2 lớp ion Cl - và glycine

KẾT QUẢ - THẢO LUẬN

Kết quả dòng hóa tạo vector pRHAU30-CFP

Trước khi nối gene mục tiêu vào plasmid tạo vector tái tổ hợp, tiến hành PCR thu nhận đoạn gene mục tiêu CFP với cặp mồi đặc hiệu ON1, ON2 và thực hiện điện di trên gel agarose 2% để kiểm tra sản phẩm Kích thước của sản phẩm PCR là 749 bp, kết quả điện di được thể hiện dưới Hình 3.1

Hình 3.1 Kết quả điện di sản phẩm PCR gene mục tiêu CFP M là thang DNA

Kết quả điện di cho thấy xuất hiện một vạch đậm và duy nhất ở giữa vị trí vạch

600 bp và 800 bp của thang chuẩn Vạch này tương ứng với kích thước dự đoán của gene mục tiêu CFP là 749 bp Như vậy, đã khuếch đại thành công đoạn gene CFP Sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch bằng bộ kit QIAquick PCR Purification để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo

3.1.2 Tạo vector tái tổ hợp pRHAU30-CFP Đoạn gene mục tiêu CFP và plasmid pRHAU30 (plasmid pTD2 chứa trình tự gene

RHAU30) được xử lý với enzyme cắt giới hạn để tạo đầu dính, tiếp theo thực hiện phản ứng nối bằng enzyme T4 DNA ligase để nối gene mục tiêu vào plasmid Sản phẩm nối sẽ được biến nạp vào tế bào E coli DH5α khả nạp và sàng lọc bước đầu bằng cách nuôi cấy dòng tế bào này trên môi trường LB bổ sung kháng sinh Ampicillin (LB-Amp)

Kết quả nuôi cấy E coli DH5α chứa vector tái tổ hợp pRHAU30-CFP trên môi trường LB-amp được thể hiện dưới hình 3.2

Hình 3.2 Nuôi cấy dòng tế bào E coli chứa vector tái tổ hợp trên môi trường

(A) Chủng E coli DH5α chứa vector tái tổ hợp

(B) Chủng E coli DH5α không chứa vector tái tổ hợp

Kết quả nuôi cấy ở đĩa A cho thấy, chủng E coli DH5α chứa vector tái tổ hợp xuất hiện nhiều khuẩn lạc màu trắng mọc được trên môi trường LB-Argar-Amp, chứng tỏ các chủng E coli này mang gene kháng kháng sinh Ampicillin Trong khi ở đĩa B đối chứng, chủng E coli DH5α không chứa vector tái tổ hợp thì không xuất hiện khuẩn lạc nào Như vậy, đề tài kết luận bước đầu đã thành công biến nạp được vector tái tổ hợp vào chủng E coli DH5α

Tuy nhiên, những vector không chứa gene mục tiêu CFP khi biến nạp vào E coli DH5α cũng có thể mọc được trên môi trường có bổ sung kháng sinh Ampicillin (gene kháng kháng sinh này có thể từ vector khung sườn pTD2, hoặc từ các sản phẩm nối không mong đợi khác) Cần xác định chính xác khuẩn lạc có mang vector tái tổ hợp bước tiếp theo đề tài này tiến hành PCR khuẩn lạc, điện di trên gel agarose 2%

Tiến hành chọn ngẫu nhiên 3 khuẩn lạc mọc trên đĩa để PCR, điện di để kiểm tra khuẩn lạc chứa gene mục tiêu đồng thời cấy chuyền các khuẩn lạc này vào một đĩa mới Kết quả điện đi được thể hiện dưới hình 3.3:

Hình 3.3 Kết quả điện di 3 sản phẩm PCR khuẩn lạc ngẫu nhiên từ đĩa nuôi cấy

Kết quả điện di trên cho thấy, cả 3 khuẩn lạc đều cho kết quả dương tính với phản ứng PCR khuẩn lạc Trên gel điện di của các khuẩn lạc này xuất hiện một vạch sáng nằm giữa vạch 800 bp và vạch 1000 bp của thang chuẩn DNA, phù hợp với kích thước lý thuyết của trình tự nhân bản là 937 bp Như vậy cả 3 khuẩn lạc này đều chứa vector mang gene mục tiêu RHAU30-CFP

Thông qua phương pháp PCR khuẩn lạc, đã sàng lọc thu nhận những khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp pRHAU30-CFP Tuy nhiên, để đảm bảo thu được protein mục tiêu, ta cần phải kiểm tra gene mục tiêu sau khi chèn vào vector khung sườn có xảy ra đột biến hay không Do đó, chọn ngẫu nhiên một khuẩn lạc trong số 3 khuẩn lạc cho sản phẩm PCR để nuôi cấy, tách chiết plasmid và giải trình tự gene mục tiêu

Với mục đích kiểm tra và khẳng định độ chính xác về trình tự pRHAU30-CFP so với thiết kế ban đầu cũng như sự đồng khung dịch mã Vector pRHAU30-CFP được xác nhận bằng phương pháp giải trình tự đoạn gene được chèn Kết quả giải trình tự bởi công ty Macrogene.Inc (Hàn Quốc) được so sánh với trình tự lý thuyết do trung tâm Khoa học và Công nghệ Sinh học cung cấp Kết quả sắp gióng cột được trình bày trong Hình

3.4 pRHAU30-CFP: trình tự lý thuyết, TD2_T7promoter: trình tự pRHAU30-CFP được giải bởi công ty (Macrogene, Hàn Quốc)

Kết quả sắp gióng cột cho trình tự gene RHAU30-CFP ở vector pRHAU30- CFP cho thấy có sự tương đồng 100% so với trình tự lý thuyết từ vị trí codon mở đầu đến vị trí codon kết thúc Từ đó, đề tài kết luận rằng đã tạo thành công vector tái tổ hợp pRHAU30-CFP có mang gene RHAU30-CFP.

Biểu hiện protein RHAU30-CFP

3.2.1 Sàng lọc chủng biểu hiện mang vector tái tổ hợp pRHAU30-CFP

Sau khi biến nạp vector pRHAU30-CFP vào tế bào biểu hiện E coli BL21(DE3)

Ta tiến hành sàng lọc bước đầu bằng cách nuôi cấy chủng trên môi trường LB có bổ sung kháng sinh Ampicillin (LB-Amp) Vì vector pRHAU30-CFP có mang gene kháng kháng sinh Ampicillin nên những khuẩn lạc nào mọc được trên đĩa môi trường chứng tỏ chúng có mang vector pRHAU30-CFP (Hình 3.5 A), còn những khuẩn không mọc

Hình 3.4 Kết quả giải trình tự với trình tự mồi ON30 pRHAU30-CFP: trình tự lý thuyết, TD2_T7promoter: trình tự pRHAU30-CFP được giải bởi công ty (Macrogene, Hàn Quốc)

34 được thì không mang vector mục tiêu (Hình 3.5 B)

Hình 3.5 Kết quả sàng lọc chủng biểu hiện mang vector pRHAU30-CFP

(A) chủng có mang vector mục tiêu, (B) chủng không mang vector mục tiêu

Kết quả cho thấy trên bề mặt môi trường xuất hiện nhiều khuẩn lạc đặc trưng cho vi khuẩn E coli BL21(DE3) (màu trắng trong, viền tròn, nhẵn, bóng), chứng tỏ các vi khuẩn này có gene mã hóa kháng kháng sinh Ampicillin nằm trên vector pRHAU30-CFP và ở đĩa chứng âm không có khuẩn lạc nào mọc được.

3.2.2 Cảm ứng biểu hiện protein RHAU30-CFP bới IPTG

Chọn ngẫu nhiên một khuẩn lạc mọc trên đĩa biến nạp mang đặc điểm hình thái của E coli để nuôi cấy cảm ứng biểu hiện protein RHAU30-CFP dưới sự điều hòa của T7 promoter và được cảm ứng biểu hiện bởi IPTG

Trong giới hạn đề tài này, mục tiêu đề ra dừng lại ở bước biểu hiện và protein RHAU30-CFP Vì vậy, nồng độ cảm ứng biểu hiện được thiết lập sử dụng cho thí nghiệm được kế thừa từ những nghiên cứu trước đó

Protein RHAU30-CFP được cảm ứng biểu hiện bởi IPTG ở điều kiện nhiệt độ 16 oC, nồng độ của chất cảm ứng là 0,1 mM IPTG, tốc độ lắc 250 rpm và thu mẫu sau cảm ứng qua đêm (Truong và cs, 2018) Kết quả kiểm tra sự biểu hiện của protein RHAU30-CFP bằng SDS-PAGE được trình bày như trong Hình 3.6

Hình 3.6 Kết quả biểu hiện của protein RHAU30-CFP M: thang protein chuẩn

Từ kết quả điện di SDS-PAGE, ta thấy chủng E coli BL21(DE3) có mang vector pRHAU30-CFP và được cảm ứng biểu hiện bằng IPTG hiện rõ một vạch đậm có kích thước khoảng 32 kDa ở tất cả các giếng, còn ở mẫu đối chứng (ĐC) lại không xuất hiện vạch tương tự Qua đó cho thấy, protein mục tiêu RHAU30–CFP trong E coli BL21

(DE3) mang plasmid pRHAU30-CFP đã được biểu hiện khi được cảm ứng bởi IPTG với nồng độ thấp 0,1 mM IPTG ở 16 о C Tiếp tục sử dụng các điều kiện trên để cảm ứng biểu hiện protein ở thể tích lớn hơn nhằm tinh chế protein mục tiêu ở các bước tiếp theo.

Tinh chế protein RHAU30-CFP

Sinh khối E coli tái tổ hợp thu được sau khi nuôi cấy thể tích lớn và cảm ứng biểu hiện trước đó được huyền phù trong dung dịch Binding buffer, bổ sung thêm chất ức chế protease (PMSF) và enzyme thủy phân phân tử DNA (DnaseI) để đảm bảo chất lượng protein trong quá trình tinh chế Sau khi xử lý phá tế bào bằng sóng siêu âm và ly tâm để loại bỏ xác tế bào Dịch nổi được lọc và cho qua cột Histrap, protein RHAU30-CFP chứa đuôi 6×His sẽ bám vào các phân tử Ni 2+ trên cột trong khi các protein khác không có tương tác ái lực với Ni 2+ sẽ đi ra khỏi cột Dịch protein trước cột và sau cột sẽ là chỉ thị để so sánh độ bám đặc hiệu của protein RHAU30-CFP trên cột Histrap Protein RHAU30-CFP được thu lại trong các phân đoạn dung ly binding buffer chứa các nồng độ Imidazole khác nhau lần lượt là 40, 80, 120, 160mM Các

36 phân đoạn dung ly của protein sẽ được điện di trên gel SDS-PAGE để kiểm tra khả năng bám cột cũng như tìm ra nồng độ Imidazole thu nhận được protein RHAU30- CFP Kết quả tinh chế protein RHAU30-CFP được thể hiện qua Hình 3.7

Hình 3.7 Kết quả tinh sạch protein RHAU30-CFP

Tiến hành thu nhận protein RHAU30-CFP bằng cách dung ly với dung dịch imidazole có nồng độ từ 40 đến 160 mM Sau đó sử dụng amicon để loại bỏ imidazole, tạp chất cũng như thay đổi nồng độ muối, pH để bảo quản và phù hợp với dung dịch đệm cho quá trình đánh giá hoạt tính sau này.

Kết quả SDS-PAGE cho thấy, ở nồng độ 40 mM xuất hiện vạch protein đậm, chứng tỏ ở nồng độ 40 mM thì protein mục tiêu bắt đầu bị đẩy ra khỏi cột Histrap Ở nồng độ 80 mM Imidazole cho 1 vạch protein có kích thước tương tự nhưng đậm và rõ nét hơn so với các nồng độ Imidazole khác, cho thấy protein mục tiêu được dung ly phần lớn ở nồng độ này Đề tài kết luận protein mục tiêu thu được nhiều nhất ở nồng độ 80 mM Imidazole.

Như vậy, sau quá trình tinh chế, protein RHAU30-CFP đã thu nhận được với độ tinh sạch cao ở nồng độ Imidazole tối ưu là 80mM Sau đó, sử dụng amicon có kích

37 thước 10 kDa để loại bỏ Imidazole ra khỏi dịch protein thu được Protein tinh sạch được bảo quản ở nhiệt độ -80 o C và chuẩn bị cho quá trình khảo sát hoạt tính.

Xác định G-quadruplex song song T95-2T bằng protein RHAU30-CFP

Hình 3.8 Nhận diện cấu trúc G-quadruplex song song

(2) RHAU30-CFP / Htelo- biotin/ Neutravidin

Kết quả nhận diện cấu trúc G-quadruplex song song từ hình trên cho thấy eppendorf (3) có tín hiệu huỳnh quang của CFP chứng tỏ protein RHAU30-CFP đã nhận diện và bám lên cấu trúc G-quadruplex song song T95-2T còn ở eppendorf (1) và (2) không có tín hiệu huỳnh quang của CFP chứng tỏ protein RHAU30-CFP không thể nhận diện và bám lên cấu trúc G-quadruplex không song song Htelo Những kết quả này chứng minh rằng protein RHAU30-CFP có thể nhận biết có chọn lọc cấu trúc G-quadruplex song song T95-2T và có thể sử dụng với vai trò như

38 mẫu dò để nhận diện cấu trúc G-quadruplex T95-2T, đây là tiềm năng để sử dụng xác định số phân tử G-quadruplex trong tế bào

PHẦN IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ