Nghiên ứu tuyển họn á hủng xạ khuẩn ưa nhiệt, hịu axit, sinh tổng hợp xenlulaza ao để nâng ao hiệu quả xử lý bã thải hế biến dứa thành phân bón hữu ơ

Trang 1 B ỘGIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI H C BÁCH KHOA HÀ NỘI ỌĐÀO THỊ MINH H NH ẠNGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG X KHU N ƯA ẠẨNHIỆT, CH U AXIT, SINH TỊỔNG H P XENLULAZA CAO ĐỂ ỢNÂNG CA

B Ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐÀO THỊ MINH H NH Ạ

NGHIÊN C Ứ U TUYỂ N CH Ọ N CÁC CHỦ NG X KHU N ƯA Ạ Ẩ

NÂNG CAO HI Ệ U QU X LÝ BÃ TH I CHẾ Ả Ử Ả BIÊN D Ứ A

THÀNH PHÂN BÓN HỮU CƠ

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Hà Nội, 2007

B Ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐÀO THỊ MINH H NH Ạ

NGHIÊN C Ứ U TUYỂ N CH Ọ N CÁC CHỦ NG X KHU N ƯA NHI T, Ạ Ẩ Ệ

HI Ệ U QUẢ Ử LÝ BÃ THẢI CHẾ X BIÊN D A Ứ

THÀNH PHÂN BÓN HỮU CƠ

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Các nhà máy chế biến dứa và rau quả ở Việt Nam hiện nay 6

Bảng 1.2 Thành phần hoá học của phế thải dứa 7

Bảng 1.3.Thành phần nguyên liệu chế biến thức n gia súc từ bã dứa ă 8

Bảng 2.1 Sơ đ ồ thí nghiệm và các chất bổ sung 45 Bảng 3.1 Hoạt tính xenlulaza của các chủng XK đã phân lập 47

Bảng 3.2 Đặc điểm hình thái của các chủng XK tuyển 48

Bảng 3.3 Khả năng sử dụng các nguồn ờng của các chủng XK đư

Bảng 3.12 Ảnh h ởng của nguồn cacbon lên sinh tổng hợp amylaza của các ư

Bảng 3.17 Sự biến ộng của một số nhóm VSV trong bình xử lý bã dứa ở đ

Bảng 3.18 Sự biến ộng của đ độ ẩm và pH trong quá trình ủ ở 450C 71

Bảng 3.19 Khả năng phân giải bã dứa của các chủng XK tuyển chọn ở điều

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.2 Cơ chế phân giải xenluloza tự nhiên 12 Hình 3.1 Hoạt tính xenlulaza của các chủng XK tuyển chọn ( DH3, DH7,

Hình 3.2 Khuẩn lạc của một số chủng xạ khuẩn tuyển chọn 49

Hình 3.3 Cuống sinh bào tử của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn 49

Hình 3.4 Khuẩn lạc của chủng XK DH3, DH14, DH25 nuôi ở 370C, 450C

Hình 3.12 Sự giảm thể tích của bã dứa trong quá trình ủ xử lý 71

Hình 3.13 Bã dứa sau 30 ngày ủ ở 450C 73

MỤC LỤC

Lời cam đoan

Lời cảm ơn

Danh mục các bảng ii

Danh mục các hình iv

Mục lục v

Đ ặt vấn đề 1

Phần I Tổng quan tài liệu 3

1.1 Tình hình sản xuất và chế biến dứa 3

1.1.1 Nguồn gốc, đặc iểm sinh đ lý và giá trị dinh dưỡng của cây dứa 3

1.1.2 Tình hình trồng và chế biến dứa trên thế giới và trong nước

1.2.Tình hình sử dụng phế liệu trong chế biến dứa 6 1.2.1 Sử dụng phế liệu để sản xuất axit xitric 7

1.2.2 Sử dụng phế liệu để sản xuất chế phẩm bromelin 8

1.2.3 Sử dụng bã dứa để sản xuất thức n gia súc ă 8

1.2.4 Sử dụng bã dứa để sản xuất phân hữu c ơ 9

1.3 Xenluloza và sự phân giải xenluloza 9

1.3.1 Cấu tạo của xenluloza 9

1.3.2 Phức hệ enzim xenlulaza và cơ chế tác dụng 11

1.3.3 Sinh tổng hợp xenlulaza của VSV 12

1.3.4 Các nhóm VSV phân giải xenluloza 13

xử lý rác thải bằng VSV 151.4.1 Sự phân giải hợp chất cacbon trong tự nhiên 151.4.2 Cơ chế hình thành mùn rác nhờ VSV 171.4.3 Bản chất của phương pháp xử lý phế thải hữu c bằng vi ơ

sinh vật 171.5 Xạ khuẩn (XK) 191.5.1 Tổng quan về xạ khuẩn 191.5.2 Đặc iểm hình thái và kích th ớc đ ư 201.5.3 Cấu tạo tế bào 221.5.4 Bào tử và sự hình thành bào tử (khả năng sinh sản) 23 1.5.5.Đặc iểm phân loại đ 241.5.6 Khả năng phân huỷ xenluloza của xạ khuẩn ưa nhiệt 29 1.6 Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh tr ởng, phát triển ư 31

và sinh tổng hợp xenlulaza của VSV

1.6 1 Ảnh h ởng của pH ư 311.6 2 Ảnh hưởng của nhiệt độ 311.6 3 Ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl 321.6 4 Ảnh h ởng của nguồn cacbon ư 32

2.2.6 Phương pháp xác định hoạt lực enzim ngoại bào (xenlulaza,

amylaza) bằng ph ng pháp khuếch tán trên thạchươ 39 2.2.7 Nghiên cứu ảnh hưởng của iều kiện nuôi cấy lên sinh đ

trưởng và phát triển và sinh tổng hợp enzim của XK 39

2.3.1 Thử nghiệm trong phòng thí nghiệm (bình lên men 5 lít) 43

3.1 Phân lập và tuyển chọn các chủng XK a nhiệt, chịu axit sinh tổng hợư p xenlulaza 453.2 Một số đặc iểm phân loại của các chủng XK tuyển chọn đ 47 3.3 Ảnh hưởng của nhiệt ộ lên sinh tr ởng và sinh tổng hợp xenlulaza của đ ư

3.3.2 Ảnh hưởng của nhiệt ộ lên sinh tổng hợp xenlulaza đ 52 3.4 Ảnh hưởng của pH lên sinh trưởng và sinh hoạt tính enzim của các

chủng XK tuyển chọn 53 3.4.1 Ảnh hưởng của pH lên sinh trưởng của các chủng XK tuyển chọn 53 3.4.2 Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính enzim của các chủng XK 54 3.5 Ảnh hưởng của nguồn cacbon lên sinh tr ởng và sinh enzư im của các

chủng XK tuyển chọn 57 3.6 Ảnh hưởng của nguồn nit lên sinh tr ởng và sinh tổng hợp enzim của ơ ư

các chủng XK đã tuyển chọn 613.7 Ứng dụng các chủng XK tuyển chọn ể xử lý bã dứa trong iều kiện đ đ

phòng thí nghiệm 663.7.1 Nghiên cứu sự biến động của một số nhóm VSV trong qúa trình xử lý

bã ủ dứa ở điều kiện phòng thí nghiệm 66

3.7.3 Hiệu quả phân huỷ bã dứa ở qui mô phòng thí nghiệm 71

3.8 Ứng dụng các chủng XK tuyển chọn để xử lý bã dứa ởqui mô pilot

(55kg) 74

3.8.1 Nghiên cứu sự biến động của một số nhóm VSV trong ủ xử lý 74

3.8.2 Khả năng phân huỷ bã dứa của các chủng XK tuyển chọn ở

Tài liệu tham khảo 80

Phụ lục 86

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin trân trọng cảm ơn Viện Công nghệ môi trường, Trung tâm đào tạo sau đại học - Trường đại học Bách khoa Hà Nội, đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận văn thạc sỹ

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Tăng Thị Chính đã hướng dẫnchu đáo, tận tình, trong suốt thời gian nghi n cê ứu t đề ài

Tôi xin trân thành cảm ơn Th.S Nguyễn Thị Ho , KS Hoàng à Thị Dung,

KS Trần Hà Ninh, cùng tập thể cán bộ nhân viên Viện Công nghệ môi trường

đã nhi tình giúp đỡ tôi trong thời gian qua ệt

Trong thời gian học t và ập nghiên cứu tđề ài, t i nhận được s ô ự giúp đỡnhiệt tình ủa c Đảng ỷ, Ban giám u hiệu, các thầy cô giáo trường Cao đẳng

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi

Các số liệu và kết quả trong luận văn là trung thực và chưa được ai công

bố trong bất kỳ công trình khoa học nào khác

Tác giả luận văn

Đào Thị Minh Hạnh

Đ ẶT VẤN ĐỀ

Nước ta là một n ớc nông nghiệp có khí hậu nhiệt ới nóng ẩm, trong ư đnhững n m gần đây nền nông nghiệp n ớc ta phát triển, việc thâm canh tạo ra ă ưcác loại cây trồng cho n ng suất chất l ợng cao, nếu chỉ sử dụng cho mục đíă ư ch

ăn t i thì d thừa và giá trị kinh tế không cao gây thiệt hại cho ng ời nông ươ ư ưdân Bên cạnh đó, các mặt hàng chế biến nông sản đang được khách hàng trong

và ngoài nước có nhu cầu tiêu thụ rất lớn, với giá trị kinh tế cao Tr ớc vấn ề ư đthời sự như vậy, các nhà máy chế biến nông sản đã ra đời, cùng với sự phát triển của các nhà máy chế biến nông sản như: dứa, vải, nhãn, cà chua , thì lượng phế liệu từ quá trình chế biến thải ra môi tr ờng với 1 l ợng rất lớn gây ô nhiễm ư ưmôi trường Phần lớn các loại phế liệu này có thành phần các chất hữu c rất ơcao, có thể sử dụng làm thức n cho gia súc hoặc xử lý ể làm phân bón… ă đThông thường các nhà máy này chỉ xử lý phế liệu bằng cách đào hố ổ phế liệu đ

để cho phân huỷ một cách tự nhiên Biện pháp này gây ô nhiễm môi tr ờng ưkhông khí, nguồn n ớc ngầm, thời gian xử lý dài, tốn diện tích, chất l ợng mùn ư ưthu được không cao

Trong thành phần của bã thải dứa, ngoài xenluloza còn có chứa các loại đường và các axit hữu cơ pH của bã dứa thường rất thấp, nhiệt ộ ống ủ trong đ đquá trình xử lý Do đó nhiều loài vi sinh vật phân huỷ bã dứa khó phát triển, nên trong tự nhiên quá trình phân huỷ bã dứa th ờng xảy ra rất chậm ể giải quyết ư Đnhững vấn ề trên chúng tôi chọn đ đề tài: "Nghiên cứu tuyển chọn các chủng

xạ khuẩn a nhiệt, chịu axit sinh tổng hợp xenlulaza cao ể nâng cao hi ư đ ệu quả xử lý bã thải ch ế biến dứa thành phân bón h ữu cơ” với các nội dung

sau:

- Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn ưa nhiệt sinh tổng hợp xenlulaza cao

- Nghiên cứu một số đặc iểm sinh hoá của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn đ

- Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng lên sinh tr ởng và sinh tổng hợp xenlulaza ưcủa các chủng xạ khuẩn tuyển chọn: nhiệt ộ, pH, nguồn cacbon, nguồn nitđ ơ

- Sử dụng các chủng xạ khuẩn tuyển chọn để xử lý bã dứa thành phân bón hữu

c ơ

PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TèNH HèNH SẢN XUẤT VÀ CHẾ BIẾN DỨA

1.1.1 Nguồn gốc, đ ặc đ iểm sinh lý và giỏ trị dinh d ỡng của cõy dứa ư

Dứa (cú tờn khoa học là Ananas comosus)cú xuất xứ từ phớa Nam chõu

Mỹ và được trồng từ rất lõu đời ở Colombia Hiện nay dứa được trồng ở hơn 70 nước trờn thế giới nhưng chủ yếu tập trung ở chõu Á

Dứa là cõy thõn bụi, thảo mộc, cõy cao khoảng 0,75 1,5 m, bụi rộng – khoảng 0,9 – 1,2m, lỏ nhỏ, dài, cứng và cú gai ở rỡa lỏ [54]

Hiện nay trờn thế giới cú rất nhiều giống dứa nhưng cú thể chia thành ba nhúm chớnh [8]:

- Nhóm Cayenne là giống dứa được trồng nhiều nhất để phục vụ cho ngành chế biến dứa đồ hộp Dứa Cayenne trỏi to (1,5 4,5 kg/quả) cú mắt - phẳng và nông, vỏ vàng cam, thịt quả kém vàng, nhiều nước và vị hơi chua rất thớch hợp cho chế biến nước giải khỏt và cỏc loại đồ hộp dứa khỏc Nhóm dứa này đợc trồng hầu hết các vùng dứa lớn của thế giới (Thái lan, Hawai, Philipin )

- Nhúm Hoàng hậu (Queen): quả tương đối nhỏ, mắt lồi, chịu vận chuyển Thịt quả vàng đậm, giũn, hương thơm, vị chua ngọt ậm đà Nhúm này cú chất đlượng cao nhất, trờn thế giới th ờng dựng ư đ ăể n tươi

- Nhúm Tõy Ban Nha (Spanish): Trỏi lớn hơn dứa Queen, mắt sõu, thịt quả vàng nhạt, cú chỗ trắng, vị chua, ớt thơm Nhúm này cú chất l ợng kộm nhất.ư

Về mặt dinh dưỡng dứa được xem là “Hoàng Hậu” trong cỏc loại quả vỡ hương vị thơm ngon và giàu chất dinh dưỡng Thịt quả chứa nhiều nước, hương thơm, vị ngọt và hơi chua Chính vì vậy, một phần sản lợng dứa dùng để ăn tơi, còn phần lớn dùng để chế biến đồ hộp, đông lạnh, nớc giải khát, rợu quả, mứt, kẹo, cồn, dấm, sản xuất axit xitric, chế phẩm bromelin Ngoài ra trong vỏ,

lá, lõi quả dứa còn chứa rất nhiều enzim Bromelin rất tốt cho việc tiêu hoá, lµm thøc ¨n gia sóc vµ ph©n bãn

Trong các loại dứa thì dứa Cayenne có vỏ mỏng, mắt nông h n so với hai ơloại dứa trên Vì vậy, phế liệu thải ra từ loại dứa này là thấp và loại dứa này rất phù hợp cho sản xuất công nghiệp Phế liệu của các nhà máy sản xuất rau, quả

có những đặc điểm chung sau:

Phế liệu nhà máy chế biến rau quả khá đồng nhất và ợc ặc trđư đ ưng rất rõ cho từng nhà máy, nh phế thải nhà máy đóng hộp dứa có l ợng chất thải lớn ư ưnhất trong số các nhà máy chế biến rau quả Chất thải của nhà máy chế biến dứa bao gồm: vỏ, lõi, lá non và chồi dứa Ở các nhà máy đóng hộp dứa xuất khẩu, chất thải từ quá trình chế biến dứa khá ồng nhất, không bị lẫn các chất thải đkhác Tính chất này rất quan trọng cho việc ịnh hình công nghệ xử lý chất thải.đCác chất thải từ nhà máy chế biến rau quả là những chất dễ lên men chua (tạo axit), không lên men thối (phân giải protein) Do đó vấn đề ô nhiễm không khí do quá trình lên men tạo ra không nghiêm trọng như các chất thải từ nhà máy chế biến thịt cá Tuy nhiên, nếu các chất thải nhà máy chế biến rau quả không được xử lý ngay sẽ gây ra ô nhiễm đất rất nghiêm trọng Trong quá trình lên men các chất thải từ nhà máy chế biến rau quả l ợng axit hữu cư ơ sẽ ợc tạo đưthành rất nhiều

1.1.2 Tình hình trồng và chế biến dứa trên thế giới và trong nước

Lịch sử phát triển của cây dứa cho thấy sau 100 năm kể từ khi quả dứa trở thành hàng hoá xuất khẩu, dứa đã trở thành một trong những loại hoa quả đứng đầu về kim ngạch buôn bán thế giới Ngày nay, ở các nước vùng nhiệt đới dứa đứng vị trí thứ ba về mặt xuất khẩu hoa quả sau chuối và quả có múi Theo thống kê của tổ chức nông lương thế giới (FAO), nếu những năm năm mươi của

lượng dứa trên thế giới đã đạt gần 14 triệu tấn/năm Những nước sản xuất dứa chính là Thái Lan: 2.311.332 tấn/năm, Philipin 1.520.715 tấn/năm, Brazil 1.505.493tấn/năm, Trung Quốc 1.181.169 tấn/năm, Ấn Độ 1.535.000 tấn/năm, Nigeria 800.000 tấn/năm… [54]

Trong những năm gần đây, nền sản xuất nông nghiệp Việt Nam đã đạt được nhiều thành tích to lớn, là một trong những nước đứng đầu thế giới về kim ngạch xuất khẩu gạo, cà phê và hạt tiêu Bên cạnh việc tăng cường phát triển các cây công - nông nghiệp mũi nhọn, ngày nay nhà nước ta cũng đang rất cố gắng phát triển các cây công nghiệp khác nhằm đa dạng hoá các sản phẩm nông nghiệp Dứa cũng là một trong những cây trồng đang được nhà nước quan tâm phát triển Theo thống kê của Bộ Kế hoạch và ầu tư đến tháng 1 năm 2005 cả Đnước ta có tổng diện tích trồng dứa là 32.000 ha, với sản lượng xấp xỉ 1,5 triệu tấn/năm Dự kiến đến năm 2010 diện tích trồng dứa sẽ đạt 40.000 ha và sản lượng đạt 2 triệu tấn/năm Dứa được trồng chủ yếu ở các tỉnh khu bốn cũ, vùng Duyên Hải miền Trung và vùng đồng bằng Sông Cửu Long

Hiện nay, cả nước ta đã xây dựng 9 dây chuyền chế biến dứa miếng đóng hộp với tổng công suất 42.000 tấn/năm, 6 dây truyền chế biến nước dứa cô đặc với tổng công suất 26.000 tấn/năm Các nhà máy chế biến dứa hiện nay ở nước

ta nhìn chung đều nhập thiết bị và công nghệ tiên tiến, do vậy các sản phẩm sản xuất ra đều đạt tiêu chuẩn xuất khẩu Tuy nhiên, hầu hết các nhà máy mới chỉ sản xuất được một phần công suất thiết kế, nguyên nhân chủ yếu là do chưa có

đủ nguồn nguyên liệu

Bảng 1.1 Các nhà máy chế biến dứa và rau quả ở Việt Nam hiện nay

(nguồn Bộ kế hoạch và đầu tư) [31]

STT Tên nhà máy, công ty

Dứa đóng hộp (tấn/năm)

Nước dứa

cô đặc (tấn/năm)

Dứa bảo quản lạnh (tấn/năm)

4 Nhà máy chế biến hoa quả Bắc Giang 4.000

6 Nhà máy chế biến dứa cô

7 Nhà máy chế biến rau qủa Hà Tĩnh 3.000

10 Cty TPXK Tân Bình- TP HCM 10.000

1.2.Tình hình sử dụng phế liệu trong chế biến dứa [8]

Phế liệu trong chế biến dứa gồm hai đầu, vỏ, lõi, mắt, miếng vụn, được loại ra khi chế biến dứa nước đường, bã dứa sau khi ép trong chế biến nước dứa

cô đặc, đồ hộp n ớc dứa… Các phế thải nói trên có thể tận dụng ư để sản xuất

cồn, r ợu vang dứa, giấm, axit xitric, chế phẩm bromelin, thứư c ăn gia súc, phân bón hữu c cho cây trồng ơ

Thành phần của phế thải dứa bao gồm:

- Phần hai đầu của quả dứa được thải ra khi cắt chiếm tỷ lệ 15-20% khối

Bảng 1.2 Thành phần hoá học của phế thải dứa [8]

-1.2.1 Sử dụng phế liệu ể sản xuất axit xitric [8] đ

Ở Hawai, dùng phế liệu dứa để sản xuất axit xitric với số l ợng lớn Toàn ư

bộ phế liệu dứa được ép để thu dịch dứa Cho lên men dịch dứa ể phân huỷ đđường và phân giải pectin, lọc rồi bổ sung dung dịch Ca(OH)2 nóng vào Lượng

dung dịch Ca(OH)2 được tính theo lượng axit xitric có chứa trong dịch dứa, sau khi đun sôi canxi xitrat kết tủa và lắng xuống Gạn bỏ pha lỏng, rửa sạch kết tủa bằng n ớc sôi Axit hoá xitrat bằng axit sunfuric 36ư 0Be, đun sôi 30 phút và để trong 3 giờ Canxi sunfat sẽ kết tủa, còn axit xitric sẽ tạo thành tan trong dung dịch, lọc loại bỏ kết tủa, cô ặc dung dịch trong chân không tới nồng ộ 40đ đ 0Be rồi ể kết tinh trong 3 ến 5 ngày Phân li bằng máy li tâm, đưđ đ ợc axit xitric tinh thể Axit thu được còn lẫn tạp chất, cần tinh chế lại bằng nước sạch và than hoạt tính để có axit tinh khiết

1.2.2 Sử dụng phế liệu ể sản xuất chế phẩm bromelin [17] đ

Bromelin là nhóm enzim thuỷ phân protein, có trong các bộ phận của cây dứa Bromelin còn có những hoạt tính sinh học khác, nên không những được sử dụng trong nấu n ớng trong công nghiệp thực phẩm mà còn ư được nghiên cứu sử dụng trong y học và trong những ngành khác

Trong cây, lá, quả, chồi, ngọn của dứa đều có chứa bromelin nh ng hoạt ưlực tăng dần từ trên xuống d ới (theo vị trí cây dứa và trên quả dứa) và từ trong ư

ra ngoài (đối với quả) ể chiết rút bromelin, phế liệu được nghiền nhỏ và ép Đlấy dịch dứa, sau đó cho (NH4)2SO4 hay axeton để kết tủa enzim Rửa sạch kết tủa, sấy nhẹ ở nhiệt ộ 50 đ - 600C cho đến khô ta thu được chế phẩm bromelin

1.2.3 Sử dụng bã dứa ể sản xuất thức đ ăn gia súc [19]

Phế liệu dứa sau khi thu gom về được trộn với các nguyên liệu bổ sung như: cám gạo, bột sắn và VSV theo tỷ lệ được trình bày ở bảng 1.3

Ở đây VSV là loài Aspergillus niger, Saccharomyces cerevirae có khả

năng phân giải tinh bột, xenluloza Nguyên liệu sau khi trộn đều được cho vào

túi nilông nén chặt ể không khí thoát hết ra ngoài Sau 45 ngày ủ thì hầu hết đ

các thành phần trong bã dứa được tạo thành là các loại chất dễ tiêu hoá như các

loại đường đơn, các axit hữu cơ như axit lactic, axit axetic

1.2.4 Sử dụng bã dứa ể sản xuất phân hữu c đ ơ

Các nhà máy và các cơ sở sản xuất các sản phẩm từ dứa, ng ời ta vẫn ư

chưa quan tâm đến vấn ề xử lý bã dứa, thưđ ờng em i chôn lấp hoặc ào hố đ đ đ

để bã dứa phân huỷ tự nhiên rồi sử dụng chúng làm phân bón, hoặc làm t ng ộ ă đ

phì nhiêu cho đất Các phương pháp này thường tốn diện tích và thời gian phân

huỷ dài, chất l ợng mùn tạo ra không cao ư Để hạn chế được những vấn đề trên

các nhà nghiên cứu đã đưa ra phương pháp bổ sung các loại VSV để phân huỷ

bã dứa, đặc biệt là bổ sung các chủng XK ể phân huỷ bởi ây là loại VSV chịu đ đ

được các điều kiện môi trường khắc nghiệt và có khả n ng phân huỷ đưă ợc

xenluloza cao, rút ngắn được thời gian phân huỷ và giảm khả năng gây mùi khó

chịu cho môi trường Đồng thời, còn bổ sung thêm kali, photpho làm t ng chất ă

lượng mùn cho phân bón hữu cơ từ phân huỷ bã dứa

1.3 Xenluloza và sự phân giải xenluloza

1.3.1 Cấu tạo của xenluloza

Xenluloza là hợp chất polysaccarit cao phân tử rất bền vững Chúng cấu

tạo bởi rất nhiều gốc D glucoza, liên kết với nhau nhờ dây nối - β-1,4 glucozit

-Mỗi phân tử xenluloza thường chứa từ 1400 ến 10.000 gốc glucoza Trọng đ

lượng phân tử của xenluloza rất khác nhau phụ thuộc vào từng loại thực vật (ở

bông 150.000 đến 1.000.000, còn ở sợi gai lên tới 1.840.000) [25] Trên mỗi

chuỗi glucan các đơn vị lặp lại không phải là glucoza mà là xenlobioza Mỗi

phân tử glucoza có dạng "ghế bành", phân tử này quay 1800 so với phân tử kia

và vị trí β của các nhóm hydroxyl ều ở mặt phẳng nằm ngang của phân tử đ(hình 1.1)

Hình 1.1 Cấu tạo phân tử xenluloza [25]

Xenluloza có cấu trúc lớp sợi song song, các chuỗi xenluloza gắn với nhau nhờ mạng l ới liên kết hydro, còn các lớp gắn với nhau nhờ lực Van ư -der-Van Trong tự nhiên, các chuỗi glucan của xenluloza có cấu trúc dạng sợi, đơn

vị sợi nhỏ nhất có đường kính nhỏ nhất khoảng 3nm Các sợi sơ cấp hợp lại thành vi sợi có đường kính từ 10 40nm, những vi sợi này hợp thành bó sợi to -

có thể quan sát d ới kính hiển vi quang học Toàn bộ lớp sợi này có một lớp vỏ ưhemixenluloza và lignin rắn chắc bao bọc bên ngoài Phân tử xenluloza có cấu trúc không đồng nhất gồm hai vùng: vùng kết tinh có trật tự cao, rất bền vững

và vùng vô định hình kém trật tự và kém bền vững hơn Vùng vô định hình có thể hấp thụ nước và trương lên, còn vùng kết tinh, mạng l ới liên kết hydrogen ưngăn cản sự trương này Xenluloza có cấu trúc đặc, bền chắc cùng với sự có mặt của lớp vỏ hemixenluloza lignin khiến cho sự xâm nhập của enzim vào cấu -

trúc hết sức khó khăn và làm tăng tính kị nước của chuỗi β-1-4 glucan, làm cản trở tốc độ của phản ứng thuỷ phân

Việc thuỷ phân xenluloza có thể thực hiện bằng ph ng pháp hoá học ươhoặc sinh học Nhưng phương pháp hoá học đòi hỏi sử dụng axit sunphuric đậm

đặc, ầu t thiết bị tốn kém và khó thu được ồng nhất, do vậy hiệu quả kinh tế đ ư đthấp Trong khi đó VSV sinh trưởng nhanh, nuôi cấy dễ, sinh enzim đặc hiệu cho nên có thể thu được sản phẩm tinh khiết ngay cả ở nhiệt độ thường và áp suất thường Theo h ớng này, tr ớc hết xenluloza được thuỷ phân thành ư ưxenlobiza sau đó dưới tác ộng của xenlobiaza thành glucoza, rồi từ glucoza có đthể làm thức ăn cho ng ời, gia súc (protein đơn bào), hoặc lên men tạo thành ưcác dung môi, chất dẻo và cồn [11], [32]

1.3.2 Phức hệ enzim xenlulaza và c chế tác dụng ơ

Sự phân giải xenluloza trong tự nhiên là một quá trình phức tạp có sự tham gia phối hợp của nhiều enzim khác nhau Reese lần đầu tiên đã đưa ra cơ chế chuyển hoá xenluloza trong tự nhiên thành đường tan nhờ phức hệ enzim

C1-CXnhư sau [48]:

C

Trong đó 1 là "nhân tố tiền thuỷ phân" hay enzim không đặc hiệu có tác dụng làm tr ng xenluloza tự nhiên (bông, giấy lọc) tạo thành các chuỗi ươxenluloza mạch ngắn, các chuỗi này tiếp tục bị tấn công bởi enzim CX Các VSV sinh trưởng trên môi tr ờng có xenluloza hoà tan th ờng chỉ tổng hợp ư ưđược enzim CX, trong khi các VSV sinh trưởng trên xenluloza có trật tự cao thì tổng hợp cả C1 và CX

Nhiều tác giả cho rằng, CX (endoglucanaza) tác động tuỳ tiện lên chuỗi xenlobioza, cho phép C1 (exoglucanaza) có tác dụng tiếp theo lên các chuỗi đã

Xenluloza

tự nhiên Xenluloza hoạt động

Đường tan (Xenlobioza)

Glucoza

mở Erikson và ctv, năm 1980 đã đưa ra mơ hình c chế tác dụng hiệp ồng của ơ đ

hệ enzim nhiều thành phần trên bề mặt của các phân tử xenluloza

1.3.3 Sinh tổng hợp xenlulaza của VSV

Quá trình phân giải xenluloza trong tự nhiên là một quá trình phức tạp địi hỏi sự tham gia của phức hệ enzim xenlulaza Sinh tổng hợp xenlulaza chịu sự

Xenluloza tự nhiên

Xenlobioza Xenlodextrin Glucoza

điều khiển của bộ máy di truyền, các chất cảm ứng và kìm chế trong quá trình trao đổi chất của VSV

Nhiều tác giả cho rằng, xenlulaza là enzim cảm ứng và chất cảm ứng tốt nhất là xenluloza và lactoza Nhưng một số khác lại đưa ra bằng chứng cho rằng xenlulaza là enzim cấu trúc, có thể sinh tổng hợp trên môi tr ờng không có ưxenluloza hay chất cảm ứng trên Tuy nhiên, trong thực tế VSV th ờng tổng ưhợp xenlulaza tên môi trường có chứa xenluloza hay chất cảm ứng thích hợp Shikates cho rằng: Xenluloza không phải là chất cảm ứng trực tiếp, mà trong tự nhiên chúng bị enzim phân huỷ thành một l ợng nhỏ xenlobioza, chất này có ưthể thẩm thấu qua màng tế bào VSV và được coi là chất cảm ứng, nh ng nếu ưnồng ộ xenlobioza cao thì lại ức chế sinh tổng hợp xenlulaza Vì vậy, đ để thu nhận xenlulaza cao người ta thường nuôi cấy trên môi trường có chứa các chất không dễ thuỷ phân như: bã mía, r m rạ, giấy kết hợp với các VSV ơ đồng hoá tốt xenlobioza [40], [45], [47], [50]

Spirodonov [44] nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon lên sinh tổng hợp xenlulaza của chủng XK Thermomonospora fusca cho thấy rằng, nguồn cacbon dễ tiêu (1%) glucoza, xelobioza và xyloza không ức chế sinh tổng hợp xenlulaza của VSV Tuy nhiên nếu nuôi trên môi tr ờng có xenluloza vi tinh thể ư(microcrystalline cellulose) thì sẽ cho hoạt lực xenlulaza cao nhất Hoạt lực xenlulaza sẽ thấp hơn từ 12-30 lần nếu trong môi tr ờng nuôi cấy không bổ ưsung glucoza và xyloza

Nhiều sản phẩm trung gian của chu trình Kreb là chất ức chế sinh tổng hợp xenlulaza của VSV Nguồn Nitơ trong môi trường cũng ảnh h ởng tới quá ưtrình sinh tổng hợp xenlulaza Nguồn Nit hữu cơ ơ và muối nitrat thường kích thích sinh tổng hợp xenlulaza ở nhiều loài VSV, còn muối amon thì lại ức chế quá trình sinh tổng hợp xenlulaza ở hầu hết các VSV [40], [45]

1.3.4 Các nhóm VSV phân giải xenluloza

Trong tự nhiên có rất nhiều loài VSV có khả n ng phân huỷ xenluloza ăbao gồm VK, XK và các loại nấm

* VK: là nhóm VSV được nghiên cứu nhiều N m 1975 lần ă đầu tiên L.Popov đã phát hiện ra rằng các vi khuẩn kị khí tham gia vào quá trình lên men xenluloza Thế kỷ 19 các nhà khoa học đã phân lập được một số VSV kị khí có khả n ng phân giải xenluloza từ phân và dạ cỏ của ộng vật nhai lại Nă đ ăm 1902, V.L Omelianski đã thuần khiết và mô tả 2 giống vi khuẩn phân giải xenluloza

và nêu ra 2 kiểu lên men xenluloza: Lên men Hydro do loài Bacillus cellulosae hydrogenicus và lên men metan-Bacillus cellulosae metanicus [4]

Đầu thế kỷ 20, ngoài những nhóm vi khuẩn kị khí ng ời ta phân lập được ưcác nhóm VK hiếu khí ưa ấm, ưa nhiệt có khả n ng phân giải xenluloza Hă ơn nữa trong môi tr ờng có ư độ ẩm cao hơn, khả n ng phân giải xenluloza và ăhemixenluloza của các nhóm VK cũng tăng lên [11], [35], [36], [45]

- VK hiếu khí: Azotobacter, Flavobacetrium, Archromobacter,

Pseudomonas, Bacillus, Cellulomonas, Vibrio, Cellvibrio, Cytophaga, Angioccocus, Polyangium, Sporocytophaga, Sorangium, Archangium, Promyxobacterium…

- VK kị khí: Người ta th ờng gọi quá trình phân giải xenluloza kị khí là ưquá trình lên men xenluloza Điển hình là VK trong khu hệ VSV trong dạ cỏ của động vật nhai lại: Ruminococcus flavofeciens, R albus, R.parvum, Bacteroides succinpgenes, Butyrivibrio fibriosolvens, Clostridium cellobioparum, Cillobacterium cellosolvens…

* XK: Là một nhóm VK đặc biệt, Gram dương, hiếu khí, tế bào ặc tr ng đ ưbởi sự phân nhánh, th ờng có mặt quanh nư ăm trong tất cả các loại ất đ

XK phân giải xenluloza được phân lập từ các mẫu đất, mùn rác, mẫu mùn

ở những nơi có chứa xenluloza

Các nhóm XK phân giải xenluloza: Micromonospora, Proactinomyces, Nocardia, Actinomyces, Streptomyces, Streptosporangium, Thermomonospora, Thermoactinomyces… [4], [11], [23], [56]

*Nấm: Có rất nhiều loài nấm phân giải xenluloza mạnh khi độ ẩm cao và

nhiệt độ 20 - 300C, pH trong khoảng từ 3,5 6, 6 Vì vậy, chúng th ờng phân - ưhuỷ xenluloza ở giai oạn cuối của bể ủ, khi nhiệt ộ bể ủ lạnh đ đ đi

*Vi nấm: Trichoderma, Fusarium, Chaetomium, Aspergillus,

Phanerochaete, Penicilium, Verticilium,…

- Tuy nhiên cũng có một số nấm ưa nhiệt (40 450C) có thể sinh tổng hợp xenlulaza chịu nhiệt Chúng sinh tr ởng và phát triển nhanh nh ng hoạt lực ư ưxenlulaza trong dịch nuôi cấy lại thấp [11], [41], [45], [53], [54]

1.4 Sự phân giải hợp chất cacbon trong tự nhiên và các biện pháp xử lý rác thải bằng VSV

1.4.1 Sự phân giải hợp chất cacbon trong tự nhiên

Tương tự như các quá trình phân giải các hợp chất hữu cơ trong tự nhiên

là quá trình sinh hoá phức tạp Nhờ hoạt ộng sống của VSV, mộtđ lượng lớn các chất hữu c bị phân giải và làm giảm trọng l ợng Trong quá trình này các ơ ưhyđratcacbon (xenluloza, pectin, hemixenluloza, lignin ) được phân giải thành những phần nhỏ hơn, sinh khối VSV mới được tạo thành, ồng thời tạo ra các đsản phẩm của quá trình trao đổi chất là các chất khí (NH3, CO2 ), các axit hữu

c ơ như: axit focmic, axit axetic, axit propionic, axit lactic, axit béo [11]

Chu trình chuyển hoá hợp chất cacbon trong tự nhiên được chuyển hoá qua hàng loạt các phản ứng hoá học, xúc tác mỗi phản ứng là một enzim Để duy trì sự sống, các VSV sử dụng các sản phẩm do chúng phân huỷ hay do VSV

khác tạo ra Trong quá trình chuyển hoá vật chất trong tự nhiên có nhiều loại VSV cùng tham gia, sản phẩm chuyển hoá của loài VSV này lại là cơ chất cho VSV khác, hoạt ộng của VSV diễn ra phức tạp và có mối liên quan chặt chẽ đvới nhau [49],[42]

Xenluloza là thành phần c bản của tế bào thực vật và là nguồn cacbon ơ

dự trữ lớn nhất trong tự nhiên Do vậy, sản phẩm của quá trình phân giải xenluloza là một phần c bản nhất tạo nên phân hữu c và mùn rác Chúng giữ ơ ơ vai trò to lớn trong sản xuất nông nghiệp

* Lên men xenluloza là quá trình phân giải kỵ khí xenluloza nhờ các VSV sinh metan hay VSV khử sunphat C chế hoá học của quá trình lên men ơ xenluloza phức tạp, song có thể tóm tắt theo phương trình phản ứng sau:

1 (C6H10O5)n + nH2O → nC6H12O6

2 nC6H10O5 →nCH3CH2CH2COOH +CH3COOH + H2 + CO2+ Kcal

3 nC6H10O5 →nCH3CH2CH2COOH +CH3COOH + CH4 + CO2+ Kcal

* Phân giải xenluloza hiếu khí có ý nghĩa quan trọng ối với cây trồng đCũng nh phân giải kỵ khí, trong phân huỷ hiếu khí xenluloza được phân giải ư thành các axit hữu cơ, thường là các axit uronic (axit mùn) và các oxit - axit n đơgiản h n Các chất này tiếp tục bị oxy hoá và sản phẩm cuối cùng là Cơ O2 và

H2O Cơ chế hoá học của quá trình phân giải xenluloza phức tạp song có thể tóm tắt theo phương trình sau:

1 (C6H10O5)n + nH2O → nC6H12O6

2 nC6H10O5 + O2 R-→ CHOHCOOH + H2O + CO2 + Kcal

3 R-CHOHCOOH + O2 →CO2 + H2O + Kcal

Qua các giai đoạn trong quá trình phân giải xenluloza hình thành các đường hoà tan và các axit hữu c , chúng là nguồn dinh d ỡng thích hợp cho các ơ ưloại VSV đất, ặc biệt là các VSV cố ịnh nit (đ đ ơ Azotobacter và Clostridium)

1.4.2 Cơ chế hình thành mùn rác nhờ VSV

VSV giữ vai trò quan trọng trong quá trình tạo ộ phì nhiêu cho đ đất, vì chúng không những tham gia vào quá trình hình thành ất, mà còn khoáng hoá đcác chất hữu c của xác thực, ơ động vật hình thành mùn (humus)

Cũng nh quá trình tạo ộ phì cho ư đ đất, các oxit - axit trong quá trình phân giải hydratcacbon tổ hợp với các protein và axit amin tạo thành mùn rác dưới sự tham gia trực tiếp của VSV Trong các axit mùn hình thành qua phân giải chất hữu c thực vật nhơ ư xenluloza thì axit humic hình thành trong quá trình lên men hiếu khí có giá trị tạo ộ phì cho đ đất cao nhất

Vì vậy, ph ng pháp ủ rác hiếu khí là cách nhận được các sản phẩm ổn ươ

định nhất, giống nh quá trình oxy hoá sinh học các chất hữu c diễn ra tự ư ơnhiên trong đất [55]

1.4.3 Bản chất của ph ươ ng pháp xử lý phế thải hữu c bằng vi sinh vật ơ

Ủ rác (composting) là phản ứng các VSV khoáng hoá các chất hữu cơ thành mùn rác ở điều kiện tối ưu Thời gian ủ không những phụ thuộc vào vòng

đời sinh học của VSV trong bể ủ, mà còn phụ thuộc vào các yếu tố môi tr ờng ư

và trạng thái di truyền của VSV Do đó, thời gian ủ cũng khó rút ngắn xuống dưới 1 tháng nếu không cải tiến hệ thống ủ và bổ sung các chủng VSV có hoạt tính phân giải cao [55]

Trong tự nhiên, các chất hữu c chuyển hoá nhờ VSV qua hàng loạt các ơ

bước một cách tự phát phụ thuộc vào thành phần của cơ chất và yếu tố môi trường Quá trình chuyển hoá chậm, không liên tục và không ồng nhất, muốn đquá trình ủ đáp ứng được qui mô công nghiệp cần phải:

- Rút ngắn quá trình xử lý (ủ) và chi phí năng lượng thấp.

- Bảo đảm sản phẩm cuối cùng không những an toàn sử dụng cho nông nghiệp mà phải thảo mãn yêu cầu phân bón hữu cơ

- An toàn vệ sinh cho cây trồng và các sản phẩm của cây trồng [55] Trong quá trình thu gom phế liệu thành đống, các VSV có sẵn trong đóbắt ầu hoạt đ động làm cho nhiệt ộ bể ủ bắt đ đầu tăng lên, mỗi loại VSV có khả năng sinh trưởng ở nhiệt ộ tối thiểu, tối thích và tối đa khác nhau, người ta chia đchúng thành 3 nhóm chính: ưa lạnh (d ới 25ư 0C), ưa ấm (20-250C) và ưa nhiệt (trên 450C) Một số tài liệu còn chia các VSV phát triển ở nhiệt ộ cao (trên đ

700C) thành nhóm cực ưa nhiệt [11], [34], [37]

Khi nhiệt đ độ ống ủ t ng lên cao (trên 50ă 0C) VSV ưa ấm ngừng hoạt

động hoặc chết i, chỉ còn VSV a nhiệt tồn tại và phát triển Các loại nấm đ ư(nấm mốc, nấm men, nấm sợi…) th ờng ít chịu nhiệt hư ơn Cho nên bị chết trong quá trình ủ ở nhiệt độ cao Trong số các loại VSV thì VK, XK có khả năng chịu nhiệt cao h n, chúng tồn tại và phát triển trong suốt quá trình ủ rác.ơ

Muốn thúc đẩy nhanh quá trình phân huỷ, ngoài việc tăng cường các iều đkiện lên men, cần phải bổ sung các chủng VSV phù hợp với nguồn cơ chất của

bể ủ và chịu được nhiệt độ cao của bể xử lý

Việc lựa chọn các chủng VSV bổ sung vào bể xử lý rác thải cần dựa trên các nguyên tắc cơ bản sau đây:

- Các chủng VSV phải có hoạt tính sinh học mạnh như khả năng sinh phức hệ enzim xenlulaza cao và ổn ịnh.đ

- Sinh trưởng tốt trong iều kiện thực tế của ống ủ, cạnh tranh được với đ đcác VSV có sẵn trong ống ủ và có khả n ng chịu nhiệt cao.đ ă

- Không độc cho ng ời, cây trồng, ộng vật và các VSV hữu ích.ư đ

- Nuôi cấy dễ dàng, sinh trưởng tốt trong môi tr ờng tự nhiên, thuận lợi ưcho quá trình nhân giống thu sinh khối

Trongphế liệu, VSV không những sử dụng các hợp chất cacbon hữu cơlàm nguồn dinh d ỡng ư để sinh tr ởng, ư mà còn cần các nguồn nit (hữu cơ ơ và vô

cơ), các nguyên tố a lưđ ợng nh : P, K, Mg, Ca, S… và các nguyên tố vi l ợng ư ưnhư: Mn, Mo, Fe, Zn… Vì vậy, trong quá trình ủ rác, ngoài việc cân đối các thành phần dinh d ỡng ể VSV phát triển nhanh, còn cần các ư đ điều kiện nuôi cấy tối ưu nh : đư ộ ẩm, pH, nhiệt ộ, tỷ lệ ôxy và khí cacbonic trong môi tr ờng ể đ ư đthúc đẩy nhanh quá trình phân giải và rút ngắn thời gian xử lý [49], [55]

Khả năng xử lý rác thải bằng VSV còn phụ thuộc vào tỷ lệ giữa các chất

có trong rác thải Ngày nay, trước khi a vào ủ, ngđư ười ta thường kiểm tra tỷ lệ cacbon: nitơ: photpho: kali có mặt trong các loại chất thải, tạo iều kiện thích đhợp cho các VSV phát triển tốt, rút ngắn thời gian xử lý, làm t ng số l ợng và ă ưchất lượng mùn tạo thành [49]

Tỷ lệ khối lượng các nguyên tố C, N, P, K trong sinh khối VSV gần bằng: C: N: P: K = 50: 10: 4: 1

Trong xử lý hiếu khí khoảng một nửa nguồn cacbon bị đồng hoá thành sinh khối VSV và phần còn lại tạo thành CO2 Do vậy, chất thải phải có tỷ lệ như sau: C: N: P: K = 100: 10: 4: 1

Trong xử lý kỵ khí, khoảng 90% nguồn cacbon bị phân huỷ sinh học chuyển hoá thành năng lượng, do vậy tỷ lệ đó như sau:

C: N: P: K = 500: 10: 4: 1

Đặc biệt, tỷ lệ giữa cacbon và nit giữ một vai trò hết sức quan trọng ơtrong quá trình ủ rác: nếu tỷ lệ C /N > 50 thì quá trình phân giải sẽ bị kéo dài và chất lượng mùn thấp, còn nếu tỷ lệ C /N < 30 thì nit sẽ bị i mất d ới dạng khí ơ đ ư

N2 hoặc NH3

1.5 Xạ khuẩn (XK)

1.5.1 Tổng quan về XK

XK là nhóm vi sinh vật đơn bào phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên: Có trong đất, n ớc, rác, phân chuồng bùn, các chất hữu c , thậm chí cả trong những ư ơ

c ơ chất mà VK và nấm mốc không thể phát triển được Nhiều vùng trên thế giới

số lượng XK trong đất chiếm từ 20%-40% tổng số các VSV đất Theo Waksman thì trong đất XK chiếm từ 9%-45% tổng VSV và trong 1g ất có đkhoảng 29.000 24.000.000 mầm XK Số l ợng XK trong ất không chỉ phụ - ư đthuộc vào loại ất mà còn phụ thuộc vào mức đ độ canh tác của ất và khả n ng đ ăbao phủ của thực vật ất giàu chất dinh d ỡng hữuĐ ư cơ, khoáng và lớp đất trên

bề mặt đến (40cm) th ờng gặp số l ợng lớn XK Trong 1g ư ư đất canh tác có thể phân lập được 5 triệu hoặc hơn mầm XK Đất vùng sa mạc, nóng, khô, độ ẩm thấp, nghèo chất dinh dưỡng, mật độ phân bố XK thấp hơn, thường dao ộng đtrong khoảng 10.000-100.000 mầm XK/1g đất

Sự phân bố của XK còn phụ thuộc nhiều vào ộ pH của môi tr ờng, đ ưchúng có nhiều trong lớp ất trung tính và kiềm yếu hoặc axit yếu, trong giới đhạn pH khoảng 6,0 8,0 XK không có nhiều trong lớp - đất kiềm hay axit và càng hiếm trong các lớp đất rất kiềm Số l ợng XK trong ất cũng thay ổi theo thời ư đ đgian trong năm

XK thuộc loại cơ thể dị dưỡng Nguồn cacbon mà chúng th ờng sử dụng ư

là các loại đường, tinh bột, r ợu, axit hữu cư ơ, polysaccarit, lipit, axitamin, protein và nhiều hợp chất hữu c khác Nguồn nitơ ơ vô c thơ ường là các muối nitrat, muối amon…, nit hữu c : pepton, protein, cao ngô, cao nấm men… ơ ơPhần lớn XK là VSV ưa khí và ưa ẩm, XK ưa nhiệt thường ít gặp hơn [7]

1.5.2.Đ ặc iểm hình thái và kích th ớc [20] đ ư

-Xạ khuẩn có hệ khuẩn ty phát triển tốt, khuẩn ty không có vách ngăn và không tự đ đứt oạn, bắt màu Gram d ng, hiếu khí, hoại sinh, không hình thành ươnha bào, không có lông và giáp mô, a hình thái nhđ ư hình chuỳ, hình phân nhánh hay dạng sợi dài gọi là khuẩn ty (hypha) hay phân nhánh thành chùm, thành bó gọi là khuẩn ty thể (mycelium) Đường kính của khuẩn ty từ 0,2-2,5µm, kích thước và khối l ợng khuẩn ty thể th ờng không ổn ịnh, chúng phụ ư ư đthuộc vào từng loại và từng điều kiện nuôi cấy

- Các khuẩn ty non và các khuẩn ty có mang bào tử thường lớn h n so ơvới các khuẩn ty già và không mang bào tử Khi già XK thay ổi hình dạng rõ đrệt, chúng trở nên giòn, dễ gãy thành từng oạn nhỏ có kích th ớc khác nhau.đ ư

Nuôi cấy:

- XK phần lớn là VSV hiếu khí, một số loài sống trong điều kiện kỵ khí,

XK thu nhận được năng lượng oxy hoá từ các hợp chất hữu c Khi nuôi cấy ơtrong môi trường dịch thể, nó tạo thành dạng bông, nuôi lâu tạo thành kết tủa lắng xuống đáy, phần kết tủa này bao gồm các hạt li ti, đó là sản phẩm phân huỷ của màng nguyên sinh chất và vách tế bào XK Khi nuôi cấy trong môi trường đặc, khuẩn ty của XK phát triển thành hai loại: Một loại cắm sâu vào môi trường ể lấy n ớc và thức n gọi là khuẩn ty c chất (hay khuẩn ty dinh đ ư ă ơ

dưỡng), một loại phát triển ra bên ngoài không khí, trên bề mặt môi tr ờng gọi ư

là khuẩn ty khí sinh Ở a số các loài XK, khuẩn ty khí sinh phát triển theo hình đphóng xạ tạo thành nhiều vòng tròn ồng tâm Vì thế VSV này có tên gọi là đ

XK

Khuẩn ty cơ chất có thể cắm sâu vào môi trường từ 1-3mm, chúng mọc thành một vòng nhỏ xung quanh khuẩn lạc, khuẩn ty c chất có thể ví nh bộ rễ ơ ư của thực vật, chúng hút chất dinh d ỡng ể cung cấp cho toàn bộ cư đ ơ thể

Khuẩn lạc của XK : Khuẩn lạc của XK không trơn ướt nh VK và ở ư ởnấm men mà thường rắn chắc, thô ráp, dạng vôi, dạng nhung t , hay dạng mang ơdẻo, không trong suốt, do đó bề mặt của khuẩn lạc có thể nhẵn, có mấu lồi, có nếp nh n hoặc sần sùi nh vỏ cam sành Kích th ớc khuẩn lạc thay ă ư ư đổi tuỳ loại

XK và tuỳ điều kiện nuôi cấy, đường kính khuẩn lạc trung bình 0,5-2mm Khuẩn lạc của XK có nhiều màu sắc khác nhau như đ ỏ, da cam, vàng, lam, hồng, nâu, tím… Màu sắc của XK cũng là một tiêu chuẩn quan trọng để xác định tên các loài XK

Thành phần hoá học và sự phân nhánh của khuẩn ty:

- Màng khuẩn ty khí sinh chứa nhiều lipit, axit nucleic, enzim Hoạt tính của các enzim này mạnh hơn so với khuẩn ty c chất Khuẩn ty c ơ ơ chất chứa ít hoặc không chứa lipit

- Các loại XK đều có khả n ng phân nhánh Đầu tiên trên bề mặt xuất ăhiện những mấu lồi sau đó lớn lên thành chồi, chồi được kéo dài ra thành nhánh hình sợi, từ các nhánh mới này lại mọc ra các chồi mới và cứ như vậy chẳng bao lâu từ một nhánh có thể phát triển thành một nhóm dày đặc các sợi XK

1.5.3 Cấu tạo tế bào [6], [20]

Cấu tạo tế bào XK khá phức tạp bao gồm:

- Vách tế bào XK: Cấu tạo tương đối dày và khá vững chắc, đó là nguyên nhân làm cho khuẩn lạc của XK rắn chắc h n khuẩn lạc của VK Vách tế bào ơ

XK cấu tạo bởi 3 lớp:

-Lớp ngoài dày 60 120A- o, khi khuẩn ty già có thể dày tới 150-200Ao -Lớp giữa chắc hơn, dày 50Ao

-Lớp trong dày 50Ao

*Vách tế bào XK có cấu tạo hoá học là protein, lipit, mucopolysaccarit, ngoài ra còn chứa các hợp chất photpho, axit teitioic, nhiều enzim và các loại enzim này tham gia vào quá trình trao đổi chất của tế bào

- Bên ngoài màng tế bào còn có thể có vỏ nhày (capsule), lớp vỏ này cấu tạo từ polysaccarit và thường rất mỏng, ở một số XK lớp vỏ nhày được tạo thành trong quá trình hình thành bào tử

- Màng nguyên sinh chất của XK: Bên trong vách tế bào là một lớp màng mỏng bao phủ trực tiếp nguyên sinh chất gọi là màng nguyên sinh chất Màng này dày khoảng 7,5 10,0 nm, chúng có cấu tạo t ng tự nh- ươ ư màng nguyên sinh chất của VK Chức năng chủ yếu của màng nguyên sinh chất là iều hoà hấp thu đcác chất dinh dưỡng vào tế bào và tham gia vào quá trình hình thành bào tử

- Nguyên sinh chất và nhân của XK: Cũng t ng tự nhươ ư nguyên sinh chất

và nhân của VK, do đó người ta cho rằng XK cùng nhóm với VK XK nhóm

VK Gram dương, đặc biệt khác với nhóm không có nhân thật khác là tỷ lệ G +

C cao (> 70%) trong khi đó ở vi khuẩn là 25%-45%

Một trong những đặc iểm ng lưđ đá u tâm của XK là chúng không bền vững về di truyền và th ờng xảy ra sự sắp xếp lại trong phân tử ADN ư Điều này gây ra một số hiện t ợng kì lạ khác: Tạo ra tính a dạng của hình thái, tính ư đkháng thuốc do sự xuất hiện các plasmit H n nữa sự tự nhân lên của các oạn ơ đADN còn làm phức tạp thêm việc nghiên cứu di truyền ở XK

1.5.4 Bào tử và sự hình thành bào tử (khả n ng sinh sản)[6], ă [20]

*Bào tử của XK: Bào tử được hình thành trên khuẩn ty khí sinh, sợi bào

tử có thể có nhiều loại hình dạng khác nhau nh thẳng, l ợn sóng, xoắn, mọc ư ưvòng, một số XK có sinh nang bào tử, bên trong có chứa bào tử nang Bào tử của XK được hình thành theo ba phương thức sau:

- Phát triển toàn bộ: Toàn bộ hay một bộ phận của thành khuẩn ty tạo ra thành của bào tử

- Phát triển trong thành: Thành bào tử sinh ra từ tầng nằm giữa màng nguyên sinh chất và thành khuẩn ty (th ờng gặp ởư Planomonospora)

- Phát triển bào tử nội sinh thật: Thành khuẩn ty không tham gia vào quá trình hình thành bào tử (thường gặp ở Thermoactinomycetes)

Bào tử trần (conidiospora) của XK có thể hình tròn, hình bầu dục, hình que, hình trụ,… Hình dạng và kích th ớc của bào tử có vai trò quan trọng trong việc ưđịnh tên XK

Cuống sinh bào tử hình thành các vách ngăn ngang Trước khi hình thành vách ngăn các chất nhân cũng được phân chia và tạo thành hạt cromatin phân bố đều thành một hàng dọc trên cuống sinh bào tử

Nguyên sinh chất và các chất ưa kiềm tập trung xung quanh hạt cromatin tạo thành tiền bào tử Nhờ việc hình thành các vách ng n ngang mà các tiền bào ă

tử lại biến thành bào tử thực sự Bào tử được hình thành theo kiểu này thường

có hình que hay hình viên trụ Trên mỗi cuống sinh bào tử có 30-100 bào tử, đôi khi tới 200 bào tử Kích th ớc bào tử (0,7ư -0,9)x( 0,7 1,9)µm Bề mặt bào tử có -thể trơn, nhẵn, cũng có thể xù xì hoặc có nhiều gai nhỏ

1.5.5.Đ ặc iểm phân loại [20] đ

Ngày nay, nhờ sự phát triển cao của sinh học phân tử, hoá sinh học, lý sinh học và những kiến thức phân loại XK đã có nhiều thay đổi cơ bản Do số

lượng các loại XK mới được mô tả ngày càng nhiều, ể việc phân loại nhanh và đchính xác về di truyền phân tử, người ta đã sử dụng ph ng pháp phân loại số, ươnghiên cứu chủng loại phát sinh Xong người ta vẫn dựa chủ yếu vào các đặc

điểm hình thái, nuôi cấy, các ặc iểm sinh lý, sinh hoá, miễn dịch học và sinh đ đ

Đặc iểm hình thái và tính chất nuôi cấy đ

Dựa vào ặc đ điểm hình thái và tính chất nuôi cấy, XK được chia thành 4 nhóm chính:

Nhóm 1: XK mang bào tử rõ rệt Đặc trưng của nhóm này là sinh sản bằng bào tử và phân hoá thành hệ sợi khí sinh và hệ sợi cơ chất

Nhóm 2: XK có các bào tử nang Đặc trưng của nhóm này là hệ sợi phân chia theo các hướng vuông góc với nhau, tạo ra cấu trúc tương tự mang bào tử

Nhóm 3: XK dạng Nocardia, sinh sản bằng cách phân đốt sợi

Nhóm 4: XK dạng t ng tự Corynebacter và dạng cầu, tế bào có hình chữ ươ

V, T hoặc dạng cầu thông th ờng không có sợi.ư

Về cuống sinh bào tử trước đây người ta vẫn dựa theo cách chia của Pridham và cộng sự gồm 3 nhóm: RF cho những cuống sinh bào tử thẳng và -

lượn sóng, RA cho những cuống sinh bào tử xoắn thô sơ và ngắn, S cho - - những cuống sinh bào tử phát triển mạnh và xoắn Tuy nhiên trong những năm gần đây việc nghiên cứa trên những môi tr ờng khác nhau đã làm cho nhiều tác ưgiả có khuynh h ớng chia nhỏ các nhóm trên Ví dụ nh chia cuống sinh bào tử ư ư thành 6 dạng sau:

S-type: “Spira” cuống sinh bào tử phần lớn là xoắn nhiều vòng

SRA-type: “Spira-Retinaculum-Apertum” cuống sinh bào tử xoắn ít vòng, ít móc hoặc một vòng

SRF-type: “Spira-Rectus-Flexibilis” cuống sinh bào tử xoắn ít, lượn sóng hoặc thẳng

RA-type: “Retinaculum-Apertum” cuống sinh bào tử dạng móc

RARF-type: “Retinaculum Apertum-Rectus Flexibilis” cuống sinh bào tử dạng móc, thẳng và l ợn sóng.ư

-RF-type: “Rectus-Flexibilis” cuống sinh bào tử thẳng đến lượn sóng.

Đặc iểm hoá phân loại (chemotaxonomy): Hoá phân loại chủ yếu dựa đvào các đặc iểm sau: đ

Typ thành tế bào chủ yếu dựa trên c sở phân tích axit amin trongơ thành phần peptid và đường trong thành tế bào hay các polysaccarit gắn vào thành tế bào

Typ Peptidoglucan (PG) dựa vào các thông tin về thành phần và cấu trúc của mạch tetrapeptit của PG, cầu nối peptit và các liên kết giữa các mắt xích của

PG Năm 1974 Steiner đã chia các PG thành hai nhóm cơ bản là A và B

Nhóm A: Liên kết chéo giữa hai mạch tetrapeptit qua axit diamonipimeli (ADP) ở vị trí thứ 3 và 4

Nhóm B: Hình thành liên kết chéo qua nhóm cacboxyl của D-glyxin và alanin ở vị trí 2 và 4 Ngoài ra còn kể ến sự khác nhau về axit ở vị trí thứ 3 của đcác chuỗi có kí hiệu A1,, A2…

Axit mycolic là các phần tử có mạch dài phân nhánh thuộc chi Nocardia, Rhodococcus, Mycobacterium, Cornebacter Đấy là ặc iểm phân loại c bản đ đ ơcho các chi đó

Axit béo thường được sử dụng trong phân loại là axit bão hoà mạch thẳng

và không bão hoà với mạch phân nhánh theo kiểu Iso và enteiso metyl hoá ở nguyên tử cacbon thứ 10 Sự có mặt của axit 10 metylloictade canoit (axit tuberculostearinoic) là đặc iểm ể phân loại chi đ đ

Menaquinon: XK giống VK Gram d ng ở chỗ tổng hợp menaquinon và ươdimetylmenaquinon, không tổng hợp ubiquinon Phần lớn các chi của XK có thành phần menaquinon xác ịnh.đ

Photpholipit: Năm 1977, Lechevalier đã sử dụng đặc iểm của đphotpholipit để phân loại XK có 5 typ photpholipit: PI, PII, PIII, PIV, PV có thành phần đặc trưng và có ý nghĩa cho phân loại XK.

Trong các đặc iểm trên typ thành tế bào là ặc iểm quan trọng nhất đ đ đtrong phân loại XK, khi muốn đưa ra một loài mới hoặc mô tả một loài có ý nghĩa nào đó, người ta không thể nào không xác ịnh typ thành tế bào Theo đhướng phân loại sinh hoá (chemotaxonomy) người ta đã chia thành tế bào XK thành 4 typ:

Thành tế bào có LADP glycin

Thành tế bào có mADP glycin

Thành tế bào có mADP

Thành tế bào có mADP arabinoza, galactoza

Đặc iểm sinh lý - đ sinh hoá

Khi phân loại XK ến loài ng ời ta sử dụng hàng loạt các đ ư đặc iểm sinh đ

lý, sinh hoá khác như khả n ng đồng hoá các nguồn cacbon và nitơ, nhu cầu các ăchất kích thích sinh tr ởng, khả n ng biến ổi các chất khác nhau nhờ hệ thống ư ă đenzim Các chỉ tiêu khác cũng được xác định nh mối quan hệ với pH, nhiệt ư độ, khả n ng chịu muối và các yếu tố khác của môi tr ờng, mối quan hệ với chất ă ưkìm hãm sinh trưởng và phát triển khác nhau, tính chất ối kháng và nhạy cảm đvới chất kháng sinh, khả n ng tạo thành chất kháng sinh và các sản phẩm trao ă

đổi chất ặc tr ng khác của XK đ ư

Tuy nhiên, Hopwood (1975) khẳng ịnh phần lớn các đ đặc iểm sinh lý, đsinh hoá cùng đặc iểm nuôi cấy dễ bị biến ộng và có giá trị thấp về mặt phân đ đloại Do tính không ổn ịnh và biến dị cao của XK mà ngày nay những nguyên đtắc sử dụng các đặc điểm sinh lý, sinh hoá ể phân loại XK cũng phải thay đ đổi