Nghiên ứu hiết xuất một số hợp phần từ lá đu đủ ariapapayal và khảo sát hoạt tính gây độ tế bào ung thư ủa á phân đoạn hất hiết

VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN CHẤT CHIẾT LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬTCHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hướng dẫn: PGS.TS Đỗ Thị Hoa Viên Trang 2

- ***** -

ĐỖ SƠN TÙNG

NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT MỘT SỐ HỢP PHẦN TỪ LÁ ĐU ĐỦ

CARICA PAPAYA L VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO

UNG THƯ CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN CHẤT CHIẾT

Đặ ấ t v n đ : 1 ề

Mục đích và yêu cầu: 2

M ục đích nghiên cứ u: 2

Yêu cầu: ……… 3

CHƯƠNG I: TỔ NG QUAN V TÀI LI U 4 Ề Ệ I.1 Gi i thi ớ ệ u chung về cây đu đủ 4

I.1.1 Ngu n g c và phân b [26]……… 4 ồ ố ố I.1.2 Phân lo i:……… 5 ạ I.1.3 Tình hình di n tích tr ng và s n xuệ ồ ả ất của cây đủ đủ ……… 5

I.1.4 Đặc tính th c v t c a các giự ậ ủ ống đu đủ ồ tr ng Vi t Nam [12]……… 6 ở ệ I.1.5 Thành ph n hóa h c và tính chầ ọ ất dược lý của cây đủ đủ ……… 8

I 1.5.1 Thành ph n hóa h ầ ọ c của cây đủ đủ [6][23]……… 8

I.1.5.2 M ộ t số dượ c tính chính c ủa cây đủ đủ [6]……… 9

I.2 Gi i thi ớ ệ u chung về ợp chấ h t: flavonoid và alkaloid 10

I.2.1 T ng quan v flavonoid [2][3][13]……… ổ ề 10 I.2.1.1 Khái ni m: ệ ……… 10

I.2.1.2 Phân b : ố ……… 10

I.2.1.3 Phân lo i: ạ ……… 11

I 2.1.4 Tính ch ấ t củ a flavonoid………11

I.2.2.2 Phân b : ố ……… 13

I.2.2.3 Phân lo i: ạ ……… 13

I.2.2.4 Tính ch t c a alkaloid… ấ ủ ……… 14

I.3 Tình hình nghiên cứu chống ung thư của cây đu đủ 16

I.3.1 Các nghiên c u trên th gi i……… 16 ứ ế ớ I.3.2 Các nghiên cứu trong nước……… 17

I.4 Các phương pháp chiết xu t h p ch t t nhiên t th c v t[1][28] 17 ấ ợ ấ ự ừ ự ậ I.4.1 Phương pháp ngâm dầm trong dung môi……… … 19

I.4.2 Phương pháp ngâm kiệt đơn giản……… 20

I.4.3 Phương pháp ngâm kiệt phân đoạn……… 21

I.4.4 Phương pháp chiết xu t Soxholet:……… 22 ấ I.4.5 Phương pháp chiết xu t h tr t ấ ỗ ợ ừSiêu Âm 22

I.4.6 Phương pháp chiết xu t h tr t vi sóng……… 23 ấ ỗ ợ ừ I.5 Phương pháp chiết phân đoạn b ng dung môi có phân cằ độ ực tăng dần 24

I.6 Các phương pháp thử nghi m ho t tính chệ ạ ống ung thư của các h p ch t 25 ợ ấ I.6.1 Phương pháp thử nghi m v hoệ ề ạt tính gây độ ếc t bào [14][15]……… 25

CHƯƠNG II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U 26

II.1 Nguyên li u, hóa ch t và thiệ ấ ết bị 26

II.2.1 Phương pháp thiế ết k thí nghi m……… 27 ệII.2.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tri t xu t……… 27 ế ấII.2.2.1 Kh o sát trả ạng thái chi t xuế ất các hợp phầ ừ lá đu đủ ằng phương pháp n t bchi t ngâm d m……… 27 ế ầII.2.2.2 Kh o sát t l nguyên li u/dung môi chi t xu t thích h pả ỷ ệ ệ ế ấ ợ ……….… 29II.2.2.3Khảo sát ờ th i gian chi t xu t thích h p……….……… 29 ế ấ ợII.2.2.4 Kh o sát nhiả ệt độ chi t xu t thích h p………ế ấ ợ ……… 30 II.2.3 Phân đoạn chất chiế ằt b ng dung môi phân c c………… ……… 31 ựII.2.4 Kh o sát ho t tính chả ạ ống ung thư của các phân đoạn chất chi t……… 32 ế

II.2.4.1 V t li u ậ ệ ……… 32

II.2.4.2 Phương pháp nuôi cấ y tế bào in vitro……… 32

II.2.4.3 Phép th ử sinh học xác định tính độc tế bào (cytotoxic assay)………… 33 II.2.5 nh tính flavonoid và alkaloid Đị ở các phân đoạn ch t chi t……… 35 ấ ế

III 2 K t qu ế ả phân đoạn ch t chiấ ết bằng dung môi phân c c 45ự III.3 K t qu th hoế ả ử ạt tính gây độc tế bào ưng thư ở các phân đoạn chi t 47ế III.3.1 Kết quả xác định hoạt tính gây độc tế bào trên dòng t ế bào ung thư KB (ung

thư biểu mô)……… 47

III.3.2 Kết quả xác định hoạt tính gây độc tế bào trên dòng t ế bào ung thư LU-1 (ung thư phổi)……… 48

III.6.3 Kết quả xác định hoạt tính gây độc tế bào trên dòng t ế bào ung thư Hep – G2 ( ung thư gan)……… … 49

III.4 K t qu th ế ả ử định tính flavonoid và alkanoid trong các phân đoạn 49

III.4.1 Định tính flavonoid……… 49

III.7.2 Định tính alkaloid……… 52

CHƯƠNG V: KẾ T LU N VÀ KI N NGH 54 Ậ Ế Ị TÀI LI U THAM KH O 56 Ệ Ả

M Ở ĐẦ U

Đặ ấ t v n đ : ề

T ừ xa xưa cây đu đủ (có tên khoa h c là Carica papaya L.ọ ) đã được s d ng ử ụtrong m t sộ ố các bài thuốc dân gian ở nước ta để ch a mộ ố ệnh như ho, mấữ t s b t tiếng, nướ ắc lá đu đủc s dùng g t v t máu trên v i, r a vộ ế ả ử ết thương…Trong thời gian gần đây,

một số bài thuố đã ử ụng nước c s d chiết từ lá đu đủ để ỗ ợ điều trị ung thư h tr và được nhiều người áp dụ Tuy nhiên, các bài thuốc trên hoàn toàn dựa trên kinh nghiệm ng

hoặc được truy n cho nhau ề mà chưa có một nghiên c u, ki m tra ứ ể hướng d n c th nào ẫ ụ ể

v ề thành phầ các ợp phầ có trong lá đu đủ cũng như quy trình, liều lượng dùng, cơ n h n

chế tác động c a viủ ệc h tr ỗ ợ điều trị ung thư từ nước chiế ủt c a lá đu đủ Ngày nay, khi khoa h c công nghọ ệ ngày càng phát tri n thì ể ở ộ m t số nước tiên ti n trên thế ế ới như gi :

Nhật Bả , Mỹn , Úc… cũng đã có nhiều nghiên cứu, thí nghiệm và đã có công bố các

kết quả ề hoạt tính chống ung thư ừ nước chiế lá đu đủ nhưng những kết quả v t t này

mới chỉ được thực hiện trong phòng thí nghiệm mà chưa có quy trình thử nghiệm trên người Chính vì th , vi c s dế ệ ử ụng nước chi t t ế ừ lá đu đủ trong vi c h tr đi u tr ung ệ ỗ ợ ề ịthư trên cơ thể con người còn là m t câu hộ ỏi mà chưa có câu trả ờ l i

Theo th ng kê cố ủa Tổ chức nghiên cứu ung thư thế ớ gi i (International Agency for Research on Cancer, IARC) trên toàn thế gi i hàng ớ năm ước tính có khoảng 11 triệu người mới mắc bệnh ung thư [30] Hiện nay, ở nước ta ỷ ệ người dân bị ung thư t l đang ngày càng tăng lên theo năm, nguyên nhân gây ung thư rất đa dạng như: ôi nhi m ễmôi trường, l i s ng không lành m nh… Theo s li u th ng kê m i nh t c a Hi p h i ố ố ạ ố ệ ố ớ ấ ủ ệ ộUng thư Việt Nam, mỗi năm cả nước có thêm kho ng 150 000 ca m c b nh m i và ả ắ ệ ớ

75000 ca tử vong do ung thư Nếu cộng thêm với số ệnh nhân đã mắc tính đến thời bđiểm hi n t i, c ệ ạ ả nước có kho ng 240 ả 000 – 250 000 bệnh nhân b ị ung thư đang điều

tr [25]ị Tại bệnh viện K thì mỗi năm số lượng bệnh nhân ung thư vào viện tăng 10 –

20 % so với năm trước Trước những thực trạng trên thì việc tìm ra những loại thuốc,

phương pháp điều trị ung thư là rất cần thiết và cấp bách Hiện nay đã có một số các , phương pháp điều trị ung thư song chi phí điều trị còn khá cao, một số các loại thuốc điều trị ung thư còn phải nhập ngoại Theo xu hướng mới hiện nay, thì các nhà nghiên cứu đã hướng tới việc chiết xuất các hợp phần có nguồn gốc từ tự nhiên mà các hợpphần này có hoạt tính chống ung thư và được chiết xuất từ thảo dược để có thể giảm bớt chi phí điều trị cho các bệnh nhân ung thư

Trong khi đó, ở nước ta cây đu đủ đã được trồng khá lâu và diện tích đang ngày càng được mở rộng do giá trị kinh tế ngày càng cao của cây đu đủ mang lại Cây đu đủ

là một trong những cây dễ trồng, dễ nhân giống, ra quả sớm, sản lượng cao, chu kỳ kinh tế ngắn, thích nghi tốt với các điều kiện khí hậu ở các vùng miền Diện tích trồng

đu đủ của cả nước ước khoảng 10 000 ha – 17 000 ha với sản lượng khoảng 200 – 350 ngàn tấn quả [12] Đây thực sự là một nguồn nguyên liệu phong phú để thu nhận, chiết xuất các hợp chất từ lá đu đủ và khảo sát hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất này là hoàn toàn có thể thực hiện được Điều này có ý nghĩa khoa và tính thực tiễn cao, góp phần vào những nghiên cứu tiếp theo về khả năng chống ung thư từ lá đu đủ

và làm tăng giá trị kinh tế cho cây đu đủ ngoài việc thu hái quả

Từ những lý do trên, chúng tôi l a ch n và th c hiự ọ ự ện đề tài “Nghiên cứu chi t ế

xuất một số ợp phần từ h lá đu đủ Carica papaya L và khảo sát hoạt tính gây độc tế

bào ung thư của các phân đoạn ch t chi t” ấ ế

Mục đích nghiên cứu:

Đưa ra phương pháp chiết xuất, điều kiện chiết xuất, tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết từ đó đưa ra điều kiện chiết xuất thích hợp và khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thư

Từ những mục đích trên thì việc đưa ra điều kiện chiết xuất và luận cứ khoa học cho việc sử dụng nước chiết từ lá đu đủ trong việc hỗ trợ điều trị ung thư là có khả năng và cũng làm cơ sở tiền đề cho những hướng nghiên cứu tiếp theo về cây đu đủ

Yêu cầu:

- L ựa chọn phương pháp chiết xuất, xác định điều kiện chiết xuấ và ối ưu hóa t tcác yế ố ảnh hưởu t ng n quá trình chi t xu t đế ế ấ các hợp ph n có ầ trong lá đu đủ

- Kh o sát kh ả ả năng gây độ ế bào ung thưc t trên m t s dòng t ộ ố ế bào ung thư

- Định tính một số nhóm chất trong các phân đoạn chất chiế (định tính 2 nhóm t chất flavonoid và alkaloid)

CHƯƠNG I: T NG QUAN V TÀI LI U Ổ Ề Ệ

I.1 Gi i thiớ ệu chung về cây đu đủ

I.1.1 Nguồn gốc và phân bố [26]

Cây đu đủ có tên khoa h c: ọ Carica papaya L

Cây đu đủ nguồn gốc ừ Trung Mỹt và b ở ờ biển các nư c Panama và Colombia ớ

đã được nhà báo Oviedo người Tây Ban Nha mô t vào ả năm 1526 Cây đ đủu là m t ộ

giống cây lớn, với thân cây thẳng đ ng và không phân nhánh với chiều cao từứ 5 – 7 m

Lá to m c so le t p trung ọ ậ ở ng n ọ có kích thước lớn với đường kính từ 50 – 17 cm, hình chân v t, x sâu v i 7 thùy Hoa giị ẻ ớ ống như hoa sứ Plumeria nhưng nhỏ hơn mọc ở nách lá Qu hình bả ầu dục thon dài có đường kính từ 5 – 15 cm, dài 20 – 40 cm, trọng lượng qu t 0,5 – 4 kg ả ừ

Hiện nay đu đủ được trồ, ng chủ ế ở các nước vùng nhiệt đới và vùng nhiệt y u

đớ ẩi m châu Á trong ph m v 32ạ ị o Bắc và 32o Nam, nhở ững nơi có nh ệt độ bình quân itrong năm không thấp hơn 15oC Tuy nhiên, với nh ng ti n b trong công tác ch n và ữ ế ộ ọ

t o giạ ống đã tạo ta một số ống tương đố gi i ch u l nh ị ạ

Trên thế gi i, các nướ ớc trồng nhiểu đu đủ là: Ấn Độ, Trung Qu c, Thái Lan, ốPhilipin (Châu Á); Tazania, Uganda (Châu Phi); Brazil , Mỹ (Châu Mỹ); Úc,

Newzealand (Châu Đại Dương) Ở Việt Nam, đu đủ được trồng h u h t miầ ế ở ền B c và ắ

miền Nam, chúng được trồng nhiề ở các tỉnh đồng bằng như Hà Tây, Hà Nam, Hưng u Yên, Bình Dương, Tiền Giang [12]

I.1.2 Phân loại:

Hiện nay trên thế gi i ớ các giống cây đu đủ được phân biệt theo các loại chính sau đây [19]:

- CandamarcencisHook (hill papaya) Có trong tự nhiên trên các dãy núi

ở Columbia và Ecuador, cây cao 2,5 – 3,0m qu màu vàng và nh ả ỏ

- Carica QuercifoliaBenth and Hook Trồng phía Nở am Mỹ cây cao 1,5 – 2m qu ả nhỏ có màu vàng, chi u dài qu 2,5 – 5,0 cm ề ả

- Carica microcarpa, Carica monoica, Carica cauliflora…

Trên th giế ới trồng chủ ếu các giống lai có nguồn gốc như trên để có thể ạo ra y t

gi ng ố cho năng suất cao, phẩm chất quả ố cây trồng chống chịu tốt vớ t t, i các đi u kiện ềngoại cảnh, bệnh tậ …Cây đu đủ được du nhập vào V ệt Nam từ ất lâu và hiện nay t i rđang được tr ng ph bi n trên c ồ ổ ế ả nước

I.1.3 Tình hình diện tích trồng và sản xuấ ủt c a cây u đ đủ

Cây đu đủ là m t trong nhộ ững nhóm cây được tr ng vùng nhiồ ở ệt đới và c n ậnhiệt đớ Theo báo cáo của Carmo và Sousa Jr (2003) diện tích trồng cây đu đủ tăng i 151% (16 012 tri u ệ ha vào năm 1990 lên đến 40 202 tri u ệ ha vào năm 2000) [20]

Năm 2004 thì trên toàn thế ới đã thu được gi 7 triệu tấn quả và diệ tích trồng lên đến n

389 990 tri u hệ a (FAO 2004)

Trong đó, các trang tr i phía nam M chi m đ n 47%, Châu Á chi m 30% và ạ ở ỹ ế ế ế20% ở Nam Phi Brazil đứng đầu thế giới về chế ến đu đủ và đang ngày càng phát bitri n ể

B ng 1.1ả : Sản xuất đu đủ ở các khu v c trên th gi i ự ế ớ (Nguồn: FAOSTAT, 2006)

STT Qu c Gia ố Di n tích (tri u ha) ệ ệ S n xu t (tri u t n) ả ấ ệ ấ

M ỹ (0,14%), và Châu Đại Dương (0,13%) (FAOSTAT 2012) Các nước sản xuất đu

đủchính là Ấn Độ, Brazil, Indonesia, Nigeria, và Mexico Các nước này chi m 55 % ế

t ng sổ ản lượng toàn c u ầ giai đoạn 2008 – 2010 [16]

Ở nước ta hi n nay, ệ đu đủ được tr ng h u h t các t nh mi n B c và mi n ồ ầ ế ở ỉ ề ắ ề

Nam Tuy nhiên, chúng được trồng nhiề ở các tỉnh đồng bằng, dọc theo các con sôu ng, trên các loại đất phù sa, dốc tụ, phù sa c và nhi u loổ ề ại đất khác Di n tích trệ ồng đu đủ

của cả nước ư c khoảng 10 000 ớ – 17 000 ha với sản lượng khoảng 200 350 ngàn tấn –

Đu đủ Solo: Gi ng này còn có tên khác là Hawai, giố ống đu đủ M Thân cây ỹ

đạt chi u cao trung bình th p t 1,5 – 3,5m Là gi ng yêu c u nhi t cao vì th ề ấ ừ ố ầ ệ độ ế được

trồng nhiề ở các tỉnh phía Nam Thuộc giống sinh trưởng khỏe, chống chịu với sâu và u

bệnh hại tốt Giống có tỷ ệ cây lưỡng tính và cây cái cao, nếu tự thụ l phấn sẽ cho ra 1/3 cây cái và 2/3 cây lưỡng tính Qu hình qu lê trả ả ọng lượng trung bình t 0,8 – 2,0 ừ

kg, th t qu màu vàng ph m chị ả ẩ ất và hương vị ố t t, v ỏ khá dày

Đu dủ Trung Qu c: Là gi ng nh p n i t Quố ố ậ ộ ừ ảng Đông và gần đây là Quảng Tây – Trung Quốc Nhìn chung các giống đu đủ có mức sinh trưởng trung bình song năng ấ ạsu t l i khá cao Lá thường có màu xanh đậm, chia thùy sâu, phi n lá dày Qu ế ảdài ho c thuôn dài, thặ ịt quả dày trung bình và màu th t qu t ị ả ừ vàng đến đỏ ẫ s m

Đu đủ Thái Lan: Nhóm này bao g m các giồ ống được nh p trong th i gian g n ậ ờ ầđây như giống: Tainung, Sunrise, Knowyou… qua các công ty bán h t giạ ống Do được chú ý đến s n xu t nên các giả ấ ống này cho năng suất cao, qu to, ru t màu vàng và ả ộ

ph m ch t khá ẩ ấ

Đu đủ Đài Loan: Là giống mới được nh p trong th i gian gậ ờ ần đây từ Đài Loan chúng đều là các gi ng lai Thân cây trung bình thố ấp t 1,5 – 2,5m cây ừ sinh trưởng

khỏe, ễ ẫ d m n cảm với các bệnh đốm lá và đặc biệ ệnh đố trên quả Là giống có tỷt b m

l ệ cây cái cao (đạt trên 60%) G ống yêu cầu thâm canh cao, thích hợp trồi ng ở các tỉnh phía b c Còn ắ ở miền nam thì giống đu đủ Trạng Nguyên được tr ng nhiồ ề ởu các t nh ỉ

miền tây như: Đồng Nai, Bình Dương, Bến Tre… Giống đu đủ này là giống lai, cây

sinh trưởng mạnh và cho năng su t cao, ph m ch t t t, ch u nhi t, chấ ẩ ấ ố ị ệ ất lượng th t qu ị ả

t t ố

Hình 2: M t s hình nh v ộ ố ả ề cây đu đủ

I.1.5 Thành phần hóa học và tính chấ t dư ợc lý của cây đủ đủ

I 1.5.1 Thành phần hóa học của cây đu đủ [6 23] ][

Qu ả đu đủ chín chứa kho ng ả 90% nước, các chất đường trong đó chủ ếu là yglucoza 8,5%, một ít protein, chất béo, một ít muối vô cơ (canxi, photpho, sắt) vitamin

A, B và C Năm 1964, Solano Salcedo đã nghiên cứu qu ả đu đủ ở châu m cho th y: ỹ ấtoàn bộ axit chi m ế 7%, axit bay hơi chi m ế 1,3%, axit không bay hơi là 6,1%, nước chi m ế 64%, xeluloza 0,9 – 11%, đường 4,3 – 7% và chất có nitơ ( Nx0,65) 0,6 – 0,86%, protein tinh chế 0,35% – 0,64% Không phải protein 0,035%, protein tiêu hóa được 0,38 0,47%, photpho 0,223%, canxi 0,245%, magie, s – ắt, thiamin, riboflavin và vitamin C

Qu ả đu đủ xanh và các bộ phận khác của cây như thân, rễ lá đều chứa nhựa mủ, (latex), nhiều nhấ ở quả xanh Một quả xanh chứa chừng 4% trọng lượng nhựa mủ t

Một cây có khoảng 100g nhựa trong một năm Trong nhựa mủ có men papain, chất cao su, ch t nh a, các axit amon, leuxin, lytrosin, ch t béo, axit malic và men thấ ự ấ ủy phân, ch t mấ ỡ Chất men papain có tác d ng làm tiêu hóa các ch t th t, proteinụ ấ ị giđể ải phóng các axit amin như glycocola, alanin, acginin, typtophan Tác d ng tiêu hóa th t ụ ị

của men papain tiến hành ở môi trường axit trung tính hoặc hơi kiềm, tốt nhất là pH = 6,4 – 6,5 Nhiệt độ thích hợp khá cao có thể ới 80 t oC – 85oC nhưng cao hơn 90oC thì

s mẽ ất tác dụng nhiỞ ệt độ thường, khi cho tiếp xúc v i ớ men papain với lòng trắng

trứng thì lòng trắng trứng mất tính chất sánh sền sệt Men papain ta trong nướn c, b ị

cồn làm kết tủa, cho các phả ứng của albumin Men papain không để được lâu Sau 7 n năm nem papain có thể m t ho t tính tiêu hóa proteinấ ạ Người ta thường k t tinh ếpapain Thành ph n c u t o c a papain có 52,1% C; 7,12% H; 15% N; 1,2% S ầ ấ ạ ủ Nh ng ữvitamin như: vitamin C (60 – 70 mg/100g), vitamin A (100 microgrammes/100 g) Mủ

trắng latex lấy được ở những đường rạch của những trái còn xanh, nó đông đặc rất nhanh, người ta thu th p b ng cách cậ ằ ạo và phơi khô Mủ hi n di n b i nh ng m nh ệ ệ ở ữ ả

nh trỏ ắng trắng đến nâu, mùi gần như thịt nướng và hương vị hơi mặn và đắng Latex được tìm th y trong t t c các b phấ ấ ả ộ ận thân cây đặc bi t trong lá ệ

Trong thân và r ễ chứ :a papain, phytokinase, acide malique

Trong m ng latex ch a chymopapain ủ trắ ứ :

Lá có các hợp chất như: alkaloid, flavonoid, saponins, cardiac glucoside,

saccharose 0,85 %, dextrose 2,6 %, phlobatinis

Trong h tạ : hiện di n m t s ệ ộ ố tinh dầu bay hơi

I.1.5.2 Một số dược tính chính của cây đu đủ [6]

Men papain có tác dụng như men pesin của dạ ầ và nhất là giống men trypsin d y

của tụ ạy t ng để tiêu hóa các chất thị Nó làm mộ ốt t s vi khu n ẩ Gram dương và Gram

âm ng ng phát triừ ển Những vi sinh vậ như t Staphyllococus, vi trùng thương hàn rất

nh y cạ ảm đố ớ tác dụi v i ng c a papain ủ

Papain có tác dụng làm đông sữa và tác dụng giảm độc đ i với toxin và ốtoxanbumin:18mg papain trong dung dịch 2% trung hòa được 10mg rixin là chất độc trong h t th u d u (= 10 liạ ầ ầ ều độc rixin), 2mg papain trung hòa được 4 liều độc của toxin u n ván và 10 liố ều độc của toxin yế ầu Papain còn trung tính đượt h c đ c của ộ độalkaloid như 12,5g papain trung tính được 1 liều độc stricnin = 2,5mg

Nhựa đu đủ được coi là v thuị ốc giun ở nhiều nơi Nó có tác dụng trên giun đũa, giun kim, sán lợn (trichine) nhưng không tác dụng đố ới v i giun móc (ankylostome)

Chất carpaine làm chập nhịp tim, có người đã dùng thay thế thuốc chữa tim

digitalis Gần đây, người ta đã phát hiện thấy hạt đu đủ có tính ch t kháng sinh m nh ấ ạI.2 Gi i thiớ ệu chung về ợp chấ h t: flavonoid và alkaloid

I.2.1 Tổng quan về flavonoid [2][3][13]

I.2.1.1 Khái niệm:

Flavonoid là m t nhóm hộ ợp chất lớn thường g p trong thặ ực vật Hơn một nửa rau quả thường dùng có chứa flavonoid Flavonoid cũng là thành phần hay g p trong ặdược li u có ngu n g c th c v t ệ ồ ố ự ậ

I.2.1.2 Phân bố:

Flavonoid được phân b ch y u m t s b ph n cố ủ ế ở ộ ố ộ ậ ủa cây như lá, hoa… Hàm lượng flavonoid có th ể thay đổi theo gi ng, mùa vố ụ, điều ki n th ệ ổ nhưỡng, khí hậu, địa chất và nơi mọc

Ngành hạt trần: số lượng lavonoid cũng không nhiều nhưng cũng có đủ các fnhóm: anthocyanidin, leucoanthocyanidin, flavanon, flavon Ngoài ra còn có nhiều dẫn chất biflavonoid

Ngành hạt kín 2 lá mầm: Có rất nhiều họ chứa lavonoid và đủ f các loại flavonoid Dẫn chất flavon, flavonol: gặp trong các chi gymnosperma, ageratum,

rutaceae Các dẫn chất thuộc nhóm iflavonoid thường trong họ abaceae b f

lavonoid

Ngành 1 lá mầm: Chỉ trên dưới 10 họ tìm thấy sự có mặt f

I.2.1.3 Phân loại:

Độ tan: Các flavonoid có độ tan khác nhau, thường flavonoid glycoside không tan trong ete, tan được trong nước nóng, tốt nhất là trong ethanol nóng Flavonoid glycoside và flavonoid sunfat là những hợp chất phân cự nên ít tan hoặc có thểc không tan trong dung môi hữu cơ, nhưng tan trong nước, t t nh t là tan trong c n ố ấ ồ

Tính ch t hóa h c: ấ ọ

Tác dụng v i FeClớ 3: Tùy theo nhóm lavonoid và tùy theo sf ố lượng vị trí nhóm

OH trong phân t cho màu l c, xanh, nâu ử ụ

Tác dụng v i ki m: nhỏ ịớ ề d ch chiết trên mi ng l ammoniac thì có màu vàng ệ ọtăng lên tùy theo nồng đ flavonộ oid và tùy theo nhóm flavonoid, flavon và flavonol cho màu vàng sáng, anthocyanidin cho màu xanh dương

Tác dụng của NaOH đậm đặc và đun nóng (phân h y ki m) ủ ề

Tác dụng v i Hớ 2SO4đậm đặc

Tác dụng c a antimoin pentachlorid (ph n ng Martini Bettolo) ủ ả ứ

Phả ứn ng Cyanidin (ph n ng Shinoda hay Willstater) ả ứ

Tính chất sinh học:

Tác dụng chống độc của Flavonoid th hi n làm giể ệ ảm thương tổ ởn gan, b o v ả ệđược chức năng gan khi m t s ch t ộ ố ấ độc được đưa vào cơ th ( ng v t thí nghi m) ể độ ậ ệCCl4, ethanol… dưới tác d ng c a fụ ủ lavonoid ngưỡng ascorbic đượ ổn định đồc ng th i ờlượng glycogen trong gan tăng Sự tích l ỹ glycogen có ý nghĩa quan trọng trong vi c ệnâng cao chức năng giải độc cho gan

Tác dụng kích thích tiết mật thể hiện ở các chất thuộc nhóm flavanon, flavon, flavonol…

Flavonoid thể ệ hi n tác d ng ch ng co th t nh ng tụ ố ắ ữ ổ ch c cơ nhứ ẵn (túi mậ ốt, ng

d n m t…) ẫ ậ

Tác dụng ch ng loét c a flavonoid và chalcon glycoside của cam thảo được ố ủ

ứng d ng ch a b nh ụ để ữ ệ đau dạ dày, m t s d n chộ ố ẫ ất khác như catechin, 3 – O – methyl catechin, naringenin cũng đã được th nghi m th y có tác d ng ch ng loét ử ẹ ấ ụ ố

Tác dụng ch ng viêm c a nhiố ủ ều lavonoid thuộc nhóm f flavon, flavanon, dihydrofllavonol, anthocyanin, flavan 3 – ol, chalcon… đều được chứng minh bằng

th c nghiự ệm do các chất flavonoid này ức chế sinh tổng hợp prostaglandin

Một số tài liệu gần đây còn nói đến tác dụng chống ung thư của một số chất như: leucoanthocyanidin, leucopelargonidin, leucodelphinidin và tác dụng kháng HIV của một số dẫn chất nhóm lavon như f chrysin, acacetin 7– O–b–D– galactophyranosid I.2.2 Tổng quan về alkaloid [9 13][19]][

I.2.2.1 Khái niệm:

Alkaloid là những hợp chất hữu cơ có chứa dị vòng, có phả ứng kiềm, thườn ng

gặp trong thực vật và đôi khi có trong động vật, thường có hoạt tính sinh ọ ất cao h c r

đố ới cơ thể con người và đội v ng v t, nhậ ất là đố ớ ệ ầi v i h th n kinh

I.2.2.2 Phân bố:

Alkaloid thường phân bố trong các bộ phận của cây như hoa, lá, rễ, hạt, vỏ Đôi khi trong cùng m t bộ ộ phận này r t giàu ấ alkaloid mộ ố ột s b phận khác l i không có ạLượng alkaloid và t l thành ph n các alkaloid trong cây có th thay đ i tùy theo mùa ỷ ệ ầ ể ổthu hái, điều ki n khí h u, th ệ ậ ổ nhưỡng…

I.2.2.3 Phân loại:

Các alkaloid thông thường được phân loại theo đặc trưng phân tử chung của chúng, d a trên ự trao đổi chất được sử ụng để ạ d t o ra phân t Các nhóm ử alkaloid hi n ệnay bao g m: ồ

- Nhóm Pyridin: gồm piperin, conniin, trigonellin, arecaidin…là hợp chất dịvòng chứa nitơ, có công thức phân t ử là C5H5N5

- Nhóm Pyrrolidin: g m hygrin, cuscohygrin, nicotin ồ

- Nhóm Tropan: atropine, cocain, ecgonin, scopolamine…

- Nhóm Quinolin: quinine, quinidin, dihydroquin, dihydroquinidin…

- Nhóm Isoquinolin: các alkanoid g c thu c phiố ộ ện như morphin, codein,

- Nhóm Purin: các xanthin, caffein, theobromin, theophyllin…

I.2.2.4 Tính chất của alkaloid

Tính ch t v t lýấ ậ :

Phần l n alkaloid ớ trong công thức cấu tạo có oxy thường th rở ể ắn trong điều

kiện nhiệt độ thường Các alkaloid th rở ể ắn thường kết tinh được và có đi m chảy rõ ểràng, nhưng cũng có một số alkaloid không có điểm chảy vì bị phân hủ ởy nhiệt độtrước khi ch y Nh ng alkaloid th lả ữ ở ể ỏng hay hơi được và thường b n v ng, không b ề ữ ịphân h y nhiủ ở ệt độ sôi nên được lấy ra khỏi dược li u bệ ằng bay hơi nước

Mùi vị: Đa số các alkaloid không có mùi, có v ng và m t s ít có v ị đắ ộ ố ị cay

Màu sắc: Hầu hết các alkaloid đều không màu hoặc có màu trắng, trừ ộ m t số ít

có màu vàng Ngoài ra có một số alkaloid d ng bazơ ở ạ không màu nhưng muối của nó

Tính ch t hóa h cấ ọ :

Alkaloid có công thức hóa học là C28H50N2O4 Alkaloid nói chung là có tính

kiềm yếu là do trong có phân tử có nitơ Người ta có thể tính đượ c độ kiềm của các alkaloid và chia thành các nhóm ki m sau: ề

- Alkaloid có độ ề ki m m nh khi giá tr ạ ị pKB <3

- Alkaloid có độ kiềm trung bình khi giá trị pKB: 3 – 7 (alkaloid trong họ cà, thuộc phiện)

- Alkaloid có độ kiềm yếu khi có giá trị pKB: 7 – 10 (alkaloid trong vỏ cây canhkina)

- Alkaloid có độ kiềm rất yếu khi có giá trị pKB: 10 – 12 (alkaloid có nhân purin) Bên cạnh đó cũng có alkaloid không có tính kiềm như: ricinin, colchicin, theobromin

Tác dụng với acid thường t o muạ ối tan trong nước và kết tinh Khi d ng ở ạ

muối, các alkaloid bền vững hơn và không bị phân hủy hoặc chuyển màu trong quá trình b o quả ản Người ta sử ụ d ng tính ch t t o mu i cấ ạ ố ủa các alkaloid để trích ly, tinh

chế alkaloid Các alkaloid kết hợp với kim loại nặng (Hg, Bi, Pb…) tạo ra các muối

ph c ứ Các alkaloid có phả ứng tương tự nhau như đối với một sốn thuốc thử, gọi tên chung là thu c thố ử alkaloid Những phả ứng này đượn c chia làm 2 loại: Ph n ả ứng tạo màu, ph n ng t o kả ứ ạ ết tủa

Trong số alkaloid có ch t gây tê t i ch : cocain, có chấ ạ ỗ ất có tác dụng như: d –tubocurarin có chất làm giãn cơ trơn, chống co th t: papaverin ắ

Có alkaloid làm tăng huyết áp ephedrine, hydrastin), có tác ụng hạ ( d huyết áptrên tim như ajmalin, quinidine và – α fagarin được dùng làm thu c ch a lo n tim ố ữ ạ

Có alkaloid diệt ký sinh trùng: quinine độc đ i với ký sinh trùng sốt rét: emetin ố

và conexin đố ới amip dùng đểi v ch a ly, iữ sopellrtierin, arecolon, dùng để ị tr sán

I.3 Tình hình nghiên cứu chố ng ung thư c ủa cây đu đủ

I.3.1 Các nghiên cứu trên thế ớ gi i

Hiện nay trên thế giới có rất nhiều nước đã và đang nghiên cứu về ịch chiết d

t ng s ổ ố có trong lá đu đủ và ho t tính chạ ống ung thư như:

Các chiết xuất từ đu đủ có thểlàm chậm s ự tăng trưởng của tế bào ung thư Đu

đủ đã được s d ng trong y h c c truy n Cử ụ ọ ổ ề ở hâu Á và Úc Bs.Ts Nam Dang, từ Đại

học Florida (M ) ỹ và các đồng nghiệ đãp nghiên c u chiứ ết xuấ ừt t lá đu đủ để xác đị nh

cơ chế hoạt động và vai trò tiềm năng của nó trong vi c c chế ựệ ứ s phát tri n c a các ể ủdòng tế bào khối u Nhóm nghiên c u th ứ ấy r ng hằ ợp ch t tấ ừ lá đu đủ có khả năng làm chậm l i s phát tri n củ mườạ ự ể a i lo i t bào ạ ế ung thư, bao gồm ung thư ổ ử, c t cung,

ph i, gan và tuyổ ến tụy

Ngoài ra đu đủ òn có ợ làm thay đổ ệ ố c l i i h th ng miễn dịch, các nhà nghiên cứu cho r ng: “chi t xuằ ế ất từ lá đu đủ khcó ả năngcung cấp các phương ệ để điề ti n u trị và phòng ng a ừ ung thư ố, r i lo n d ng khác nhau ạ ị ứ ở trên con người’’ [23]

Một nghiên cứu khác ề độc tính của nước chiết xuất từ là đu đủ ảnh hưở v ng

đến máu và các ph n ng hóa sinh trên chu t b ch t ng (Oduol Adeniyi ả ứ ộ ạ ạ a, 2007) [19] I.3.2 Các nghiên cứu trong nước.

Nước ta hi n nay có m t s nghiên cệ ộ ố ứu như: Phạm Kim Mãn đã chứng minh cao chiết với cồn từ lá đ đủ có tác dụu ng c chế ựứ s phát tri n u báng gây b i t bào UT ể ở ếSarcoma TG – 180 chu t nh t tr ng [8]ở ộ ắ ắ

Theo Đỗ Th Th o c n chi t methanol c a lá ị ả ặ ế ủ đu đủ có tác dụng gây độ ếc t bào ung thư phổ ới v i IC50 = 19,2 μg/ml, đồng thời cặn chiết metanol cũng không gây độc

với tế bào gốc tách từ phôi chuột [10 Tuy nhiên các nghiên cứu mới chỉ áp dụng trên ]

động v t mà chưa có thửậ nghiệm trên người và cũng chưa có ộ m t nghiên cứu đầy đủnào về các h p chấợ t và các tính chất, cơ ch tác d ng c a các hợp chất có trong lá đu ế ụ ủ

đủ để ứ ng d ng vào vi c h tr ụ ệ ỗ ợ điều tr ị ung thư

Theo nghiên c u mứ ới nhấ ủt c a nghiên c u sinh Hứ ồ Th ị Hà thì k t qu sàng lế ả ọc

hoạt tính gây độc tế bào của phân đoạn chiết thấy rắng: Sau quá trình chiết, phân đoạn

và thử định tính alkaloid thì tất cả các phân đoạn có alkloid đều thể ệ hi n ho t tính gây ạ

độ ế bào ung thư KB rấc t t m nh v i ICạ ớ 50 t ừ 6,58 đến 4,51 ng/ml[13]

I.4 Các phương pháp chiết xu t h p ch t t nhiên t th c v t ấ ợ ấ ự ừ ự ậ [1][28]

Chi t xuế ất là phương pháp sử ụng dung môi để ấy các chấ d l t hòa tan ra khỏi các

mô thực vật S n phả ẩm thu được của quá trình chi t xu t là m t dung d ch cế ấ ộ ị ủa các chất hòa tan trong dung môi Dung môi này được gọi là d ch chi t Có ba quá trình quan ị ế

trọng đồng th i x y ra trong chi t xu t là: ờ ả ế ấ

- S hòa tan cự ủa chất tan vào dung môi

- S khuự ếch tán của chất tan trong dung môi

- S d ch chuy n cự ị ể ủa các phân tử chất tan qua vách t ế bào thực vật

Các yếu tố ảnh hưởng đến ba quá trình này (b n chả ất của chất tan, dung môi, nhiệt độ, áp suất, cấu tạo của vách tế bào…) sẽ quyết định chất lượng và hiệu quả ủa cquá trình chi t xu t ế ấ

Nguyên liệu trước khi chi t xu t c n ki m tra vế ấ ầ ể ề ặ m t thực vật xem có đúng loại ,

cần ghi rõ nơi thu hái, thời gian thu hái Tùy theo trường hợp mà đặt vấn đề ề thời vụ v thu hái, để đả m b o ho t ch t mong muả ạ ấ ốn có hàm lượng cao nh t M u nguyên li u ấ ẫ ệđược làm khô ho c đ tươi đ chi t Nhi u ho t ch t r n r t d bi n i trong quá trình ặ ể ể ế ề ạ ấ ắ ấ ễ ế đổ

làm khô hoặc ngay khi còn tươi nếu không xử lý để diệt enzym Kích thước của bột nguyên liệ cũng là mộu t y u tế ố quan tr ng ọ ảnh hưởng đến chất lượng và hi u quệ ả ủ c a quá trình chi t ế

Dung môi chiết cũng tùy theo từng lo i hoạ ạt chất mà chọn cho thích hợp Về nguyên tắc, để chi t các chấế t phân c c (các glycosiự de, các muố ủa alki c aloid, các hợp chất polyphenol…) thì ph i s d ng các dung môi phân cả ử ụ ực Để chi t các chất kém ếphân cực (chất béo, tinh d u, carotenoid, các ầ triteroen và streroid t do…) thì ph i sự ả ử

dụng các dung môi kém phân cực Trên thực tế, cồn với các độ cồn khác nhau là dung môi hay được dùng chi t Còn có th để ế ể hòa tan được nhi u nhóm ho t ch t, không ề ạ ấ

độc, r ti n và d ki m Trong mẻ ề ễ ế ột vài trường h p mợ ẫu được th t t trong c n sôi ả ừ ừ ồ

vừa để ị d ch enzym vừa để hòa tan ho t ch ạ ất

Có r t nhi u kấ ề ỹ thuật và thi t bế ị chiết khác nhau được áp dụng cho hai phương pháp chiết như trên như: chi t ởế nhi t đ ệ ộ thường (ngâm l nh, ngâm kiạ ệt ở nhi t đ ệ ộthường) hay nhiệt độcao (chiết nóng, hãm, s c, ngâm ki t nóng); chi t v i các thi t b ắ ệ ế ớ ế ịsoxhlet, kumagawa… tùy yêu cầu, điều ki n mà ch n k thu t chi t thích h p ệ ọ ỹ ậ ế ợ

Trong điều kiện chiết xuất, dựa vào trạng thái của nguyên liệu và đặc tính của dung môi chi t xuế ất, người ta chia chi t xu t thành 2 lo i [1] ế ấ ạ

- Chiết xuất tĩnh: là trong suốt quá trình c ết xuất nguyên liệu và dung môi hikhông được đảo tr n Nguyên liộ ệu được ngâm trong dung môi trong m t th i gian nh t ộ ờ ấ

định trong su t quá trình chi t xu t ố ế ấ

- Chiết xuất động: dung môi và nguyên liệu chuyển đ ng hoặc cả hai cùng ộchuyển động nhờ cánh khuấy làm tăng khả năng tiếp xúc, nhờ đó hiệu suất chiết xuất cao s ẽ hơn

I.4.1 Phương pháp ngâm dầm trong dung môi

Nguyên liệu đã làm nhỏ ới độ t thích hợp và dung môi được chứa vào m t bình ộkín để ở nhiệt độ phòng Ngâm trong thời gian xác định, th nh tho ng có khu y tr n ỉ ả ấ ộ

ho c l c ặ ắ

Sau đó gạn, ép bã l y d ch chi t xu tấ ị ế ấ Để ắ l ng 24 – 36 ti ng nhiế ở ệt độ phòng để

loại bỏ ạp chất lơ lửng Gạn, lọc lấy dịch trong, có thể ngâm đơn giản hoặc ngâm tphân đoạn

- Ngâm dầm đơn giản: ngâm một lần với toàn bộ lượng nguyên liệu trong dung môi

- Ngâm dầm phân đoạn: chia dung môi ra làm nhiều phần rồi ngâm làm nhiều

l n vầ ới nguyên liệ , sau mỗi lần ngâm thì tiến hành gạn lấy dịu ch chiết xuấ , ép bã, lạt i cho dung môi mới vào ngâm và ti p t c tiế ụ ến hành như trên, các phần dịch chiết xuất đượ ậc t p h p lợ ại được g i là d ch chi t xu t ọ ị ế ấ

Với phương pháp này, cùng lượng dung môi sẽ chiết xuấ được hàm lượng hoạt t chất nhiều hơn so với phương pháp ngâm dầm đơn giả Phương pháp ngâm dần m l nh ạdùng cho các dược li u ch a ho t ch t d tan ho c d b phân h y nhiệ ứ ạ ấ ễ ặ ễ ị ủ ở ệt độcao

Ưu điểm:

- Phương pháp ngâm dầm trong dung môi là phương pháp dễ ự th c hi n ệ

- D ng c thí nghiụ ụ ệm đơn giản

- Chí phí thí nghiêm th p ấ

Nhược điểm:

- Để đạt được hi u su t chi t cao thì ph i chi t làm nhi u l n v i th i gian chi t ệ ấ ế ả ế ề ầ ớ ờ ếtương đối dài

I.4.2 Phương pháp ngâm kiệt đơn giản

Ngâm kiệt là phương pháp chiết xuất bằng cách cho dung môi ch y r t chả ấ ậm qua kh i nguyên liố ệu đựng trong m t d ng cộ ụ ụ đặc biệt gọi là bình ngâm ki t, quá trình ệchi t xu t không có kh y tr n ế ấ ấ ộ

Ngâm nh g t bao gỏ ọ ồm các giai đoạn sau:

Chuẩn bị nguyên liệu: Nguyên liệu được chia nhỏ đến độ ịn thích hợp có thể m

là nguyên li u khô hoệ ặc tươi

Làm ẩm nguyên liệu: mục đích của giai đoạn này để nguyên liệu hút dung môi

và trương nở hoàn toàn trước khi chuy n vào bình chi t xu t ể ế ấ (đối v i nguyên li u ớ ệkhô) Nếu nguyên liệu không được làm ẩm từ trước khi ta chuyển vào bình chiết xuất khó có thể đuổi h t không khí ra kh i nguyên li u dế ỏ ệ ẫn đến các kho ng tr ng làm cả ố ản

tr nguyên li u ti p xúc v i dung môi, làm gi m hi u su t chi t xu t ở ệ ế ớ ả ệ ấ ế ấ

Ngâm trung gian: nguyên liệu đã làm ẩm được cho bào bình t ng l p mừ ớ ột, nén

nh ẹ nhàng và san bằng trên khối nguyên liệu Nếu nguyên liệu được cho không đều sẽ

tạo ra các kênh, dung môi chảy theo các kênh đó mà không thấm đ u qua toàn bộềnguyên liệu Sau đó mở van dưới đáy bình, thêm dung môi đến khi không khí thoát ra

hết và dịch chiết xuấ ắt đầu chảy từ ừ Khóa van lại và thêm tiếp dung môi cho ngập t b tnguyên liệu, để ngâm kho ng 24 gi hoả ờ ặc lâu hơn tùy theo nguyên liệu

Rút dịch chiết xuất: m ởkhóa cho dịch chi t xuấế t chảy t ng gi t vào bình hừ ọ ứng Chú ý thường xuyên thêm dung môi để ng p m t nguyên li u 2 – 3cm T c đ rút d ch ậ ặ ệ ố ộ ịchiết xuấ phụt thuộc vào ối lượng và tính chất nguyên liệu sử ụng Rút dịkh d ch chiết

xu t ấ quá nhanh sẽ không chiết xuất kiệt hoạt chất, rút dịch chiết xuấ quá chậm dẫn t

đến th i gian chi t xu t b kéo dờ ế ấ ị ài và hao phí dung môi do bay hơi

- Phương pháp này thì yêu cầu d ng c thí nghi m ph c t p ụ ụ ệ ứ ạ

- Kích thước nguyên li u phệ ải đạt yêu c u ầ

I.4.3 Phương pháp ngâm kiệt phân đoạn

Nguyên liệu được chia ra làm nhiều bình, lượng đều hoặc nhỏ đần Tiến hành chiết xuất giống như phương pháp ngâm kiệt đơn giản nhưng dịch chiết xuấ ần thứt l

nhất của 1 bình để riêng, dịch chiết xuấ ần sau dùng được t l làm ẩm và chiết xuất ph n ầnguyên li u tiệ ế ởp bình 2 Dịch chiết xuấ ầt l n sau c a bình 2 bủ ằng lượng nguyên liệu trong bình và để riêng, dịch chiết xuất lần sau c a bình 2 l i làmủ ạ v i ớ dung môi chiết

xu t c a bình 3, ti n hành ti p tấ ủ ế ế ục cho đến hết các bình

Ưu điểm:

- Phương pháp này có ưu điểm t n ít dung môi ố

- Thu được d ch chi t xuị ế ất đậm đặc

Nhược điểm:

- Phương pháp này không chiết xu t kiấ ệt được ho t ch t có trong nguyên ạ ấ

li u ệ

I.4.4 Phương pháp chiết xu t Soxhletấ :

Chuẩn bị nguyên liệu, bọc giấy, bịt kín hai đầu rồi đặt vào trụ chiết xuấ Dùng tdung môi chiết xuất trong m t th i gian nhộ ờ ất định Sau khi thực hiện các chu trình chi t xu t l y d ch chi t xu t ế ấ ấ ị ế ấ đem ra cô chân không thu được cao chiết

Ưu điểm:

- Phương pháp này có ưu điểm là chi t xuế ất được ki t ho t ch t có trong nguyên ệ ạ ấ

li u ệ

- Th i gian chiờ ết được rút ng n ắ

- D ng c thí nghiụ ụ ệm đơn giản

Nhược điểm:

- Phương pháp này có nhược điểm là dưới tác d ng c a nhiụ ủ ệt độ thì các ho t ạ

chấ ễ ị ất d b m t ho t tính nhiạ ở ệt độcao

I.4.5 Phương pháp chiết xu t h tr t siêu âmấ ỗ ợ ừ : [28]

Trong quá trình chiết xu tấ , đôi khi sóng siêu âm cũng được áp dụng để tăng

hiệu quả chiết Sóng siêu âm với tần số trên 20 KHz thường được sử ụng Sóng siêu d

âm có tác dụng làm tăng ựs hòa tan của chất tan vào dung môi và tăng quá trình khuếch tán chất tan Sóng siêu âm cường độ cao cũng có thể phá vỡ ấu trúc tế c bào, thúc đẩy quá trình chi t ế

Chiết với sự ỗ ợ ủa sóng siêu âm thườ h tr c ng được sử ụng trong chuẩn bị ẫu d mphân tích thay cho phương pháp ngâm lạnh hay chi t Soxhlet cế ổ ển Khi đó, ngườ đi i ta nhúng bình chi t vào m t b siêu âm có chế ộ ể ứa nước, sóng siêu âm phát ra từ các đ u ầphát sẽ truyền qua môi trường nước và đi vào hỗn h p chi t Trong siêu âm, h n hợ ế ỗ ợp chi t v i dung môi phân cế ớ ực sẽ nóng lên

Tuy nhiên, người ta cũng có thể gia nhiệt để quá trình chiết được nhanh hơn Trong chi t xuế ấ ởt quy mô lớn hơn, đầu phát siêu âm thường được nhúng tr c ti p vào ự ế

bình chi t ch a nguyên li u Do khế ứ ệ ả năng xuyên sâu kém nên việc sử ụng thườ d ng ởquy mô phòng thí nghi m ệ

- Phương pháp này là dung môi khó được làm m i trong quá trình chi t ớ ế

- Th i gian lờ ọc và rửa kéo dài vi th dế ẫn đến tốn nhi u dung môi ề

I.4.6 Phương pháp chiết xu t h tr t ấ ỗ ợ ừ vi sóng [28]

Khi chiếu b c x ứ ạ điệ ừ ở ần t t n s ố 2450 MHz ( c x trong vòng vi sóng c a d i bứ ạ ủ ảsóng điện từ) vào môi trường các ch t phân c c, các phân t s chấ ự ử ẽ ịu đồng th i 2 tác ờ

động: s d n truy n ion và s ự ẫ ề ự quay lưỡng cực dưới tác d ng c a điụ ủ ện trường C hai ảtác động này làm sinh ra nhi t trong kh i v t ch t làm cho vi c gia nhi t nhanh và hi u ệ ố ậ ấ ệ ệ ệ

qu ả hơn rất nhi u so về ới phương pháp dẫn truy n nhi t truy n th ng ề ệ ề ố

Trong chiết xuất chiếu xạ vi sóng vào môi trường có chứa các tiể phân nguyên u

liệu và dung môi phân cực, các phân tử dung môi và các chất phân cực sẽ dao động và nóng lên nhanh chóng làm tăng khả năng hòa tan các ch t vào dung môi Thêm vào ấ

đó, vi sóng cũng làm phá hủy c u trúc vách t bào th c v t làm các ch t tan gi i phóng ấ ế ự ậ ấ ả

trực tiếp vào dung môi chiết làm quá trình chiết chuyển thành hòa tan đơn giản

Việc ỗ ợ vi sóngh tr vào việc chiết xuấ nguyên liệ ở quy mô phòng thí nghiệm t u được áp d ng thay th cho chi t xu t truy n th ng (ụ ế ế ấ ề ố như chiế ằt b ng Soxhlet) do nó rút

ngắn thời gian chiế phụt, thuộc vào các nguyên liệu khác nhau Cũng đã có chiết vi sóng quy mô l n ở ớ nhưng ầ c n có quy trình để loạ ại t p chất tiếp theo

Thiết bị ỗ ợ vi sóng đặc biệt thích hợp cho tinh cất tinh dầu bằng phương h tr pháp lôi cu i bố ằng hơi nước Thời gian chưng cất rút ngắn đáng kể, hàm lượng tinh dầu thu được thường cao hơn và chất lượng tốt hơn do thời gian tiếp xúc với nhiệt

ngắn Cũng có báo cáo về chiết xuất các nhóm hoạt chất khác bằng phương pháp này như chiết saponin, anthraquinon, kaloid… al

Ưu điểm :

- Phương pháp này là làm quá trình chiết nhanh hơn

- Ưu tiên cho việc áp dụng để chi t xu t tinh d u ế ấ ầ

Nhược điểm

- Phương pháp này là máy móc đắ ềt ti n ho c không có s n Vì th ph i cài ti n t ặ ẵ ế ả ế ừ

lò vi sóng

V ề nguyên tắc, để chiết các chất phân cực (các glycosi , các muối của dealkaloid, các hợp chất polyphenol…) thì phải sử ụng các dung môi phân cực Để dchiết các chất kém phân cực (chất béo, tinh dầu, carotenoid, các triterp và sen treroid tựdo…) thì phải sử ụ d ng các dung môi kém phân cự Trên thưc tếc , c n vồ ới các đ c n ộ ồkhác nhau là dung môi hay được dùng C n có th ồ ể hòa tan được nhi u ho t ch t, ề ạ ấkhông độc, r ti n và d ki m ẻ ề ễ ế

Trong m t vàiộ trường hợp, dược liệu tươi được thả ừ ừ t t trong c n sôi vồ ừa đ ể

diệt enzim vừa đ hòa tan hoạt chất Tiế theo đó ta có thểể p dùng các dung môi có độphân cực tăng dần đ chiể ết phân đoạn như: n – hexan D = 0, diclrodimetan D = 1,04

hoặc cloroform, etyl – axetat D = 1,78, n – butanol D = 1,63… (D là momen phân

cực)

I.6 Các phương pháp thử nghiệm hoạt tính chống ung thư của các hợp chất

Phương pháp thử độ độ ế c t bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa K ỳ(National Cancer Institute NCI) xác nh n là phép th– ậ ử độ độ c tế bào chu n nh m sàng ẩ ằ

lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt ế bào ung thư ởt điều ki n in vitro Phép th ệ ử này được th c hiự ện theo phương pháp của Monks (1991) Phép thử ến hành xác định hàm lượ ti ng protein t bào t ng sế ổ ố ự d a vào mật độ quang

học (OD Optical Density) đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm –

b ng Sulforhodamine B (SRB) Giá tr ằ ị OD máy đo được tỉ ệ l thuận với lượng SRB gắn

với phân tử protein, do đó lượng tế bào càng nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá

tr OD càng l n.ị ớ

CHƯƠNG II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

II.1 Nguyên li u, hóa ch t và thi t bệ ấ ế ị

II.1.1 Nguyên li u ệ

Cây Đu đủ (Carica papaya L.) giống đu đủ Đài Loan, được trung tâm gi ng ốcây ăn quả – Trường Đại H c Nông nghi p Iọ ệ – Hà Nội nh p h t và nhân gi ng Cây ậ ạ ốđược tr ng t i Nam H ng – ồ ạ ồ Đông Anh – Hà N i Lộ á thu hái vào tháng 10 năm 2012 Hái lá bánh t , lá không sâu b nh, không dẻ ệ ập nát

Sau khi thu hái lá đu đủ tươi ta ti n hành s y khô nguyên li u thu hái bế ấ ệ ằng phương pháp ấy thườs ng nhi t đ 40ở ệ ộ 0C – 500C Các mẫu tươi đều được làm khô đến

độ ẩ m 10,3% và xay nh lỏ ọt qua sàng có đường kính l sàng 1,0 mm Bỗ ột lá được đóng gói kín trong túi nilon tối màu, b o qu n trong t l nh kho ng nhiả ả ủ ạ ở ả ệt độ 00C –