BỘ CƠNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHIỆP THÀNH PHĨ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN BẢO HƯNG NGHIÊN cứư QUY TRÌNH ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH CHƠNG OXI HĨA CỦA PEPTIDE PHE PRO - 5HTP - LEU(OH) CĨ NGUỒN GƠC TỪ LỒI ÉCH LITORIA RUBELLA BẰNG THựC NGHIỆM BẮT GÔC Tự DO HYDROXYL, ABTS VÀ FRAP Ngành: HỐ PHÂN TÍCH Mã ngành: 8440118 LUẬN VĂN THẠC sĩ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2023 Cơng trình hồn thành phịng D14 phân tích thí nghiệm trường Đại Học Cơng Nghiệp thành phố Hồ Chí Minh Người hướng dẫn khoa học: TS Trần Thị Thanh Nhã Luận văn thạc sĩ bảo vệ Hội đồng chấm bảo vệ Luận văn thạc sĩ Trường Đại học Cơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh ngày 07 tháng 10 năm 2023 Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: GS.TS Lê Văn Tán -Chủ tịch Hội đồng PGS.TS Trần Quang Hiếu .- Phản biện PGS.TS Trần Văn Mẩn - Phản biện TS Nguyễn Quốc Thắng - ủy viên TS Bùi Thị Thu Thủy - Thư ký (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ) CHỦ TỊCH HỘI ĐỊNG TRƯỞNG KHOA CƠNG NGHỆ HĨA HỌC GS.TS Lê Văn Tán PGS.TS Nguyễn Văn Cường BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỔ HỒ CHÍ MINH CỘNG HỊA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc NHIỆM VỤ LUẬN VÃN THẠC sĩ Họ tên học viên: Nguyễn Bảo Hưng MSHV: 20000381 Ngày, tháng, năm sinh: 01/03/1989 Nơi sinh: Đồng Nai Ngành: Hố phân tích Mã ngành: 8440118 I TÊN ĐỀ TÀI: Nghiên cứu quy trình đánh giá hoạt tính chống oxi hóa peptide Phe - Pro - 5htp - Leu - OH có nguồn gốc từ lồi ếch litoria rubella thực nghiệm bắt gốc tự Hydroxyl, ABTS FRAP NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: (1) Khảo sát quy trình bắt gốc tự Hydroxyl, ABTS khử sat (FRAP) peptide Phe-Pro-5HTP-Leu-OH phương pháp quang phổ UV-Vis, đáp ứng đầy đủ thông số thẩm định theo TCVN ISO 17025:2017 (2) Nghiên cứu quy trình đánh giá khả chống oxy hóa thực nghiệm cho thấy khả bắt gốc tự Hydroxyl, khả tương tác gốc tự ABTS khử sắt huyết tương Frap peptide Phe-Pro-5HTP-Leu-OH Những khảo sát bước đầu cho việc nghiên cứu peptide có khả chống oxy hoá để bảo quản thực phẩm phát triển y học II NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: III NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: IV NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Trần Thị Thanh Nhã Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 20 23 NGƯỜI HƯỚNG DẪN CHỦ NHIỆM Bộ MÔN ĐÀO TẠO (Họ tên chữ ký) (Họ tên chữ ký) TRƯỞNG KHOA CƠNG NGHỆ HĨA HỌC (Họ tên chữ ký) LỜI CẢM ƠN Luận văn Thạc sĩ ngành Hóa phân tích với đề tài “Đánh giá hoạt tính chống oxi hóa peptide Phe - Pro - 5htp - Leu - OH thực nghiệm bắt gốc tự Hydroxyl, ABTS khử sat FRAP” q trình cố gắng, nỗ lực khơng ngừng thân cộng vói giúp đỡ, khích lệ quý Thầy Cô, bạn bè người thân gia đình suốt trình nghiên cứu học tập trường Tôi xin chân thành cảm ơn TS Trần Thị Thanh Nhã trực tiếp hướng dẫn thực đề tài hướng dẫn tơi tận tình suốt q trình Tơi chân thành cảm ơn ban giám hiệu nhà trường toàn thể q thầy khoa Cơng Nghệ Hóa trường Đại Học Cơng Nghiệp Tp Hồ Chí Minh tạo điều kiện thuận lợi cho học tập thực nghiệm trường Tôi xin gửi lời cảm ơn thầy cô viện đào tạo quốc tế Sau Đại Học hỗ trợ, hướng dẫn nhiều học trường LỜI CAM ĐOAN Tôi tên là: Nguyễn Bảo Hưng, học viên cao học chuyên ngành Hóa Phân tích, lớp CHHOPTIOA, Trường Đại học Cơng nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh Tơi cam đoan kết nghiên cứu trình bày luận văn cơng trình tơi với hướng dẫn giảng viên hướng dẫn TS Trần Thị Thanh Nhã, Trường Đại học Cơng nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh Những kết nghiên cứu tác giả khác sử dụng luận văn có trích dẫn đầy đủ Học viên (Chữ ký) Nguyễn Bảo Hung 11 TÓM TẮT Êch đỏ Litoria rubella từ úc nghiên cứu vài thập kỷ cho thấy tuyến da lưng chúng tiết so peptide nhỏ chứa trình tự Pro-Trp, gọi peptide tryptophyỉỉin L Peptide Phe - Pro - Trp - Leu(NH2) nghiên cứu cho thấy khả phần chất chống oxy hóa da giúp ếch đối phó với thay đổi mạnh mẽ mức độ tiếp xúc với oxy độ ẩm, chúng sống khu vực rộng lớn úc với thay đổi khí hậu rộng rãi Mặc dù peptide từ nhiều chi ếch ức báo cáo có nhiều hoạt tính sinh học khác nhau, hoạt tính sinh học họ peptide chưa khám phá Trong nghiên cứu này, peptide Phe-Pro-5HTP-Leu-OH peptide khác có nguồn gốc từ lồi ếch có đặc điểm đặc biệt thay tryptophan 5-hydroxytryptophan (5HTP) 5-hydroxytryptophan amino acid chuyển hóa tryptophan nghiên cứu cho thấy khả chống oxi hóa cao đứng riêng rẽ Vì vậy, để xác định khả chống oxy hóa tồn diện peptide Phe-Pro-5HTP-Leu-OH, peptide tổng hợp đánh giá khả bắt gốc tự OH', ABTS + khử sắt (FRAP) Các thử nghiệm rang peptide Phe-Pro-5HTP-Leu-OH có khả bắt gốc tự Hydroxyl thể khả chống oxi hóa qua hai thử nghiệm bat gốc ABTS + khử sat FRAP Điều góp phần cho việc khám phá peptide ứng dụng cho phát triển y học bảo quản thực phẩm 111 ABSTRACT The red tree frog Litoria rubella from Australia has been studied for several decades showing that their dorsal skin glands secrete a number of small peptides containing a Pro-Trp sequence, known as tryptophylỉin L peptides, Phe - Pro - Trp - Leu(NH2) peptide was studied and shown to be part of a skin antioxidant that helps frogs cope with drastic changes in oxygen and moisture exposure, as they live over a large area of Australia with extensive climate variability Although peptides from several Australian frog genera have been reported to have a wide range of biological activities, the bioactivities of this peptide family have yet to be uncovered Phe-Pro- 5HTP-Leu-OH peptide, another peptide produced from the aforementioned frog species, is distinguished in this study by the substitution of tryptophan by 5hydroxytryptophan (5HTP) 5-hydroxytryptophan is a tryptophan amino acid metabolite that has been examined and demonstrated to have a strong antioxidant capability on its own To establish the overall antioxidant capability of the Phe-Pro- 5HTP-Leu-OH peptide, it was produced and tested for OH, ABTS+ free radical scavenging, and iron reduction (FRAP) ABTS+ radical scavenging and FRAP iron reduction tests reveal that the Phe-Pro-5HTP-Leu-OH peptide can scavenge Hydroxyl free radicals and exhibits antioxidant activity This aids in the disco very of novel peptides for medical applications IV MỤC LỤC ABSTRACT iv MỤC LỤC V DANH MỤC HÌNH ẢNH ix DANH MỤC BẢNG BIỂU xi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT xii MỞ ĐẤU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Đối tượng nhiệm vụ nghiên cứu Ý nghĩa đề tài CHƯƠNG 1.1 TỔNG QUAN VỀ LĨNH vực NGHIÊN CƯU Peptide .5 1.1.1 Phân loại peptide: 1.1.2 Danh pháp peptide: 1.1.3 ứng dụng peptide có hoạt tính chống oxi hóa 1.2 Gốc tự chất chống oxy hóa 1.2.1 Gốc tự 1.2.2 Ảnh hưởng gốc tự co thể sinh vật 1.2.3 Cơ chế hoạt động chất chống oxy hóa 10 1.2.4 Peptide chống oxy hóa nội sinh (GSH) khả chống oxy hóa tương đương Trolox(TEAC) 11 1.3 Tổng quan peptide Phe - Pro - 5HTP - Leu - OH 13 1.3.1 Giới thiệu ếch Litoria rubella 13 1.3.2 Tổng quan peptide tryptophyllin L tổng hợp từ da ếch Litoria rubella 16 1.3.3 Tổng quan peptide Phe - Pro - 5HTP - Leu - OH 18 1.4 Các phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa 19 1.4.1 Phương pháp khử sắt FRAP 20 V 1.4.2 Phương pháp bắt gốc ABTS+ 20 1.4.3 Phương pháp bat gốc Hydroxyl 20 1.5 Phương pháp phân tích ƯV-Vis 21 1.5.1 Nguyên tắc sở định lượng 21 1.5.2 Trang bị sơ đồ khối máy UV-VIS 22 CHƯƠNG 2.1 THỰC NGHIỆM 23 Nội dung nghiên cứu 23 2.1.1 Phương pháp khử sắt huyết tương FRAP peptide 23 2.1.2 Phương pháp bắt gốc tự ABTS peptide 25 2.1.3 Phương pháp bắt gốc tự Hydroxyl peptide 27 2.1.4 Đánh giá phương pháp phân tích 29 2.2 Khảo sát thông số tối ưu phương pháp FRAP 30 2.2.1 Khảo sát phổ hấp thu tối ưu phương pháp FRAP 30 2.2.2 Khảo sát thể tích hỗn hợp thuốc thử FRAP phương pháp FRAP 31 2.2.3 Xây dựng đường chuẩn phương pháp FRAP 31 2.3 Nghiên cứu khả khử sắt peptide theo phương pháp FRAP 32 2.3.1 Khảo sát khả khử sắt peptide theo nồng độ phương pháp FRAP 32 2.3.2 Khảo sát điểm kết thúc phản ứng phương pháp FRAP 33 2.3.3 Phân tích mẫu phương pháp FRAP 33 2.4 Khảo sát thông số tối ưu phương pháp ABTS 34 2.4.1 Khảo sát phổ hấp thu tối ưu phương pháp ABTS 34 2.4.2 Khảo sát ảnh hưởng thể tích hỗn hợp thuốc thử ABTS 35 2.4.3 Xây dựng đường chuẩn trolox phương pháp ABTS .36 2.5 Nghiên cứu khả bắt gốc tự ABTS Peptide theo phương pháp ABTS 2.5.1 ABTS Khảo sát khả bắt gốc tự 36 2.5.2 Khảo sát điểm kết thúc phản ứng 2.5.3 Phân tích mẫu phương pháp ABT 2.6 Khảo sát thông số bắt gốc tự HYDROXYL 39 VI 2.6.1 Khảo sát phổ hấp thu tối ưu phương pháp HYDROXYL 39 2.6.2 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ Deoxyrebose phương pháp HYDROXYL 39 2.6.3 Khảo sát ảnh hưởng pH phương pháp HYDROXYL 40 2.6.4 Khảo sát tỷ lệ hỗn hợp phản ứng sinh gốc tự HYDROXYL phương pháp HYDROXYL 41 2.6.5 Khảo sát thời gian ủ hỗn hợp phản ứng sinh gốc tự HYDROXYL phương pháp HYDROXYL 41 2.6.6 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ trình phản ứng sinh gốc tự HYDROXYL phương pháp HYDROXYL .? 42 2.6.7 Khảo sát thời gian bền màu phương pháp HYDROXYL 43 2.6.8 Nghiên cứu khả bắt gốc tự Peptide theo phương pháp HYDROXYL ? 44 CHƯƠNG 3.1 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45 Kết khảo sát thông số tối ưu phương pháp FRAP 45 3.1.1 Két khảo sát phổ hấp thu tối ưu phương pháp FRAP 45 3.1.2 Ket khảo sát tỉ lệ hỗn hợp thuốc thử FRAP phương pháp FRAP 45 3.1.3 Kết xây dựng đường chuẩn phương pháp FRAP 46 3.2 Ket nghiên cứu khả khử sắt peptide tối ưu phương pháp FRAP 47 3.2.1 Kết khảo sát khả khử sắt peptide theo nồng độ phương pháp FRAP 47 3.2.2 Kết khảo sát điểm két thúc phản ứng phương pháp FRAP 48 3.2.3 Ket phân tích mẫu phương pháp FRAP 49 3.3 Ket khảo sát thông số tối ưu phương pháp ABTS 50 3.3.1 Kết khảo sát phổ hấp thu tối ưu phương pháp ABTS 50 3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng tỉ lệ hỗn hợp thuốc thử ABTS phương pháp ABTS 51 3.3.3 Xây dựng đường chuẩn trolox phương pháp ABTS 52 3.4 Nghiên cứu khả bắt gốc tự ABTS Peptide theo phương pháp ABTS 52 vii