TỔNG QUAN
GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CHI CORDYCEPS
1.1.1 Định nghĩa và phân loại chi Cordyceps
Các loài nấm thuộc chi Cordyceps như C sinensis, C militaris, C pruinosa và C ophioglossoides là nguồn nguyên liệu quý giá trong dược học, đặc biệt là Cordyceps sinensis, hay còn gọi là Đông Trùng Hạ Thảo Loài nấm này phát triển trên ấu trùng và có sự thay đổi theo mùa: vào mùa đông, ấu trùng nhiễm nấm trở thành sâu sống trong đất, trong khi vào mùa hè, stroma phát triển trên đầu ấu trùng có hình dáng giống cỏ Đông Trùng Hạ Thảo đã được sử dụng làm thuốc trong y học cổ truyền Trung Quốc hàng ngàn năm qua.
1.1.2 Hoạt tính các hợp chất có trong chi Cordyceps
Chi Cordyceps chứa nhiều thành phần hóa học quan trọng như cordycepin, ergosterol, polysaccharide, glycoprotein và peptides với aminoisobutyric acid Những hợp chất này có hoạt tính sinh học đa dạng, bao gồm kháng ung thư, kháng đột biến, ức chế miễn dịch, kháng oxy hóa, kháng viêm, diệt sâu bọ, kháng khuẩn, hạ lipit trong máu, hạ đường huyết, chống lão hóa, và bảo vệ hệ thần kinh cùng thận Nghiên cứu gần đây cho thấy polysaccharide trong C sinensis thể hiện các hoạt tính sinh học như chống oxy hóa, ức chế miễn dịch, chống xơ vữa động mạch, và cordycepin có khả năng ức chế sự phát triển khối u.
NHỮNG NGHIÊN CỨU HÓA HỌC CỦA CÁC LOÀI NẤM THUỘC CHI CORDYCEPS
Các hợp chất như Cordycepin (3’-deoxyadenosine), 3’-amino-3’- deoxyadenosine, homocitrullyl aminoadenosine, adenine, cordycepic acid và D- mannitol đã được cô lập từ các loài nấm thuộc chi Cordyceps từ những năm 1950 1
Khóa Luận Tốt Nghiệp Lê Tấn Lộc
(Cunningham và cộng sự, 1950 [6] ; Chatterjee và cộng sự, 1957 [3] ; Kredich và
Guarino, 1961 [16] ; Kaczka và cộng sự, 1964 [10] ; Liu và cộng sự 1989 [20] ).
Nghiên cứu gần đây cho thấy sự khác biệt rõ rệt về thành phần và hàm lượng hóa chất giữa nấm tự nhiên và nấm nuôi cấy Cụ thể, nấm nuôi cấy có hàm lượng polysaccharide, adenine và adenosine cao hơn so với các loài nấm tự nhiên.
Li và cộng sự cũng tìm thấy nấm C sinensis nuôi cấy có hàm lượng nucleoside cao hơn loài tự nhiên.
Ergosterol được tìm thấy trong C sinensis đã được xác định thông qua phương pháp sắc ký bảng mỏng (Li và Li 1991; Li và cộng sự 2004) Boros và cộng sự (1994) đã công bố ophiocordin, một hợp chất có tính kháng nấm và kháng khuẩn, được chiết xuất từ C ophioglossoides, với cấu trúc tương tự như balanol từ Verticillium balanoides (Kneifel và cộng sự 1977).
Bioxanthracenes (55-67) được cô lập từ C pseudomilitaris (Isaka và cộng sự,
2001 [8] ) Ngoài ra các hợp chất cordypyridones A-D (68-71) cũng được cô lập từ loài nấm trên bởi cùng nhóm tác giả (Isaka và cộng sự, 2001 [9] ).
Các hợp chất chứa vòng 10 carbon cepharosporolides C, E và F (71-73), cùng với cordycepin, pyridine-2, 6-dicarboxylic acid và 2-carboxymethyl-4-(30- hydroxybutyl) furan (73-74) được cô lập từ C militaris bởi Rukachaisirikul và cộng sự
(2004) [24] Krasnoff và cộng sự (2005) [15] công bố cicadapeptins I và II (các peptides chứa thành phần aminoisobutyric acid) và myriocin (kháng nấm) (51-53) từ C. heteropoda.
Một glycoprotein với thành phần N-acetylgalactosamine [Gal-β(1→3)-Gal-N-Acol galactosyl-β(1→3)-N-acetyl-galactosaminitol] được cô lập từ C ophioglossoides
Nhiều nhóm tác giả đã cô lập thành công các polysaccharide từ nấm Cordyceps militaris Cụ thể, Kawaguchi và cộng sự (1986) đã ghi nhận sự hiện diện của các polysaccharide, trong khi Kim và cộng sự (2003) đã cô lập bốn exopolysaccharides với khối lượng phân tử từ 50 kDa đến 2260 kDa Ngoài ra, Yu và cộng sự (2004) cũng công bố bốn polysaccharides khác từ loài nấm này Nhiều nghiên cứu khác về polysaccharide từ Cordyceps cũng được thực hiện bởi các tác giả như Chun (2003), Methacanon (2005), và Wu, Sun và Pan (2006).
Yu và cộng sự, 2007 [31] ; Cheung và cộng sự, 2009 [4] Các nghiên cứu chỉ
Nghiên cứu gần đây của Yu và cộng sự (2009) đã áp dụng nhiều phương pháp để xác định cấu trúc của polysaccharide từ Cordyceps militaris, tập trung vào việc xác định thành phần các monosaccharide, khối lượng phân tử và hoạt tính sinh học của chúng.
Hình 1.1: Polysaccharide được xác định bởi Yu và cộng sự, 2009.
Recently, Yang and colleagues isolated cordysinins A-E along with 46 other known compounds from cultured Cordyceps sinensis These compounds include ergosterol, (17R)-17-methylincisterol, ergosterol peroxide, ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-one, fungisterol, and a mixture of β-sitosterol and stigmasterol, as well as β-sitosterol 3-O-acetate and stigmasterol 3-O-acetate, and 4,4-dimethyl-5α-ergosta.
The compounds 8,24(28)-dien-3β-ol, 3-O-ferulylcycloartenol, daidzein, p-hydroxybenzoic acid, vanillic acid, orobol, uracil, genistein, D-mannitol, p-methoxybenzoic acid, 3-hydroxy-2-methyl-4-pyrone, acetovanillone, p-hydroxyphenylacetic acid, cyclo(L-Pro-L-Val), syringic acid, cyclo(L-Phe-L-Pro), cyclo(L-Pro-L-Tyr), 2-furancarboxylic acid, p-methoxyphenol, glycitein, salicylic acid, methyl p-hydroxyphenylacetate, thymine, nicotinic acid, ergosteryl-3-O-β-D-glucopyranoside, flazin, 3′,4′,7-trihydroxyisoflavone, succinic acid, perlolyrine, 1-methylpyrimidine-2,4-dione, protocatechuic acid, 3,4-dihydroxyacetophenone, 4-hydroxyacetophenone, 2-deoxy-D-ribono-1,4-lactone, 1-acetyl-β-carboline, and adenosine represent a diverse array of bioactive compounds with potential health benefits, highlighting the significance of phytochemicals in nutrition and therapeutic applications.
O ergosterol peroxide (8) ergosta-4,6,8 ( 14 ) ,22-tetraen-3-one ( 9 )
Hình 1.2: Các hợp chất được cô lập từ loài nấm thuộc chi Cordyceps
O acetovanillone 26 p-hydroxyphenylacetic acid 27 clo- syringic acid 29 cyclo ( L -Phe -L -Pro ) ( 30 ) ( ) c L -Pro -L -Val 28
HO O N O OH HO H 3 CO O OH
2-furancarboxylic acid ( 32 ) p-methoxyphenol ( 33 ) HO O glycitein (34) salicylic acid (35)
H HO OH methyl p-hydroxyphenylacetate (36) thymine ( 37 )
OH O flazin ( 39 ) O nicotinic acid (40) 3',4',7-trihydroxyisoflavone (41) succinic acid (42) p erlol rine ( 43 )
Hình 1.2: Các hợp chất được cô lập từ loài nấm thuộc chi Cordyceps (tiếp)
Khóa Luận Tốt Nghiệp Lê Tấn Lộc
Hình 1.2: Các hợp chất được cô lập từ loài nấm thuộc chi Cordyceps (tiếp)
Khóa Luận Tốt Nghiệp Lê Tấn Lộc
THỰC NGHIỆM
HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ
Silica gel 0,04-0,06 mm, Himedia dùng cho cột sắc kí.
Sắc kí bản mỏng loại Kieselgel 60F254 (20×20), Merck.
Dung môi dùng cho quá trình thí nghiệm gồm: hexane, ethyl acetate, acetic acid, chloroform, acetone, methanol, ethanol, và nước cất.
Thuốc thử hiện hình các vết chất hữu cơ trên bảng mỏng: sử dụng vanillin/H2SO4.
Các thiết bị dùng để giải ly, dụng cụ chứa mẫu.
Máy cô quay chân không.
Đèn soi UV: bước sóng 254 nm và 365 nm.
Phòng Phân tích Trung tâm trường Đại học Khoa học Tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh cung cấp các thiết bị ghi phổ NMR bao gồm 1 H-NMR (500 MHz), 13 C-NMR (125 MHz) và 2D-NMR Địa chỉ của trung tâm là số 227, Nguyễn Văn Cừ, Quận 5, thành phố Hồ Chí Minh.
NGUYÊN LIỆU
Loài nấm Cordyceps neovolkiana được cung cấp từ TS Đinh Minh Hiệp – Ban quản lý khu Nông nghiệp công nghệ cao thành phố Hồ Chí Minh.
QUY TRÌNH THỰC NGHIỆM
Sinh khối nấm tươi 3.5 kg được làm sạch, phơi khô và nghiền thành bột khô 700.0 g Sau đó, bột khô được ngâm trong ethanol ở nhiệt độ phòng, và sau khi quay ly tâm để thu hồi dung môi ở áp suất thấp, thu được 200.0 g cao ethanol thô.
Cao ethanol thô được hòa tan nhiều lần trong methanol, sau đó tách riêng phần kết tủa nặng 70.0 g, trong khi phần dịch methanol thô còn lại là 130.0 g Tiếp theo, thực hiện sắc ký cột cao methanol thô với hệ dung môi có độ phân cực tăng dần, từ đó thu được các loại cao tương ứng như trình bày trong bảng 2.1.
Bảng 2.1: Các phân đoạn của cao methanol thô
2.3.1 Rửa tủa trên phân đoạn cao A1
Từ phân đoạn cao A1 (1.56 g) trích riêng phần dầu DA1 (660.0 mg) và phần tủa
TA1 (0.9 g), sau đó tủa TA1 được rửa bằng acetone nhiều lần thu được hợp chất TT1
2.3.2 Sắc ký cột trên phân đoạn cao A3
Phân đoạn cao A3 (3.1 g) được tiến hành sắc ký cột với hệ dung môi H:EA:AcOH (4:1:0.2) thu được các phân đoạn A3.1 (150.0 mg), A3.2 (70.0 mg), A3.3 (256.0 mg), A3.4 (360.0 mg), A3.5 (210.0 mg), A3.6 (300.0 mg).
Tiếp tục tiến hành sắc ký cột trên phân đoạn A3.4 (360.0 mg) với hệ dung môi
(5:0.1) thu được hợp chất T3 (10.0 mg).
Khóa Luận Tốt Nghiệp Lê Tấn Lộc
- Cô quay thu hồi dung môi Cao ethanol Thô
150.0 mg 70.0 mg 256.0 mg 360.0 mg 210.0 mg 300.0 mg
Rửa bằng Ac nhiều lần C:Me
Sơ đồ 2.1: Quy trình cô lập hợp chất T3 và TT1
Khóa Luận Tốt Nghiệp Lê Tấn Lộc