GIỚI THIỆU VỀ THỂ ĐƠN BỘI Ở THỰC VẬT
Thể đơn bội ở thực vật và ứng dụng
Sự phát triển của thực vật bao gồm hai giai đoạn chính: giao tử thể và bào tử thể Ở thực vật bậc cao, giai đoạn bào tử thể kéo dài và chiếm phần lớn chu trình phát triển, trong khi giai đoạn giao tử thể rất ngắn và tồn tại dưới dạng tế bào giao tử Phần lớn các loài thực vật ở giai đoạn bào tử thể có bộ nhiễm sắc thể lưỡng bội (2n), nhưng cũng có trường hợp thực vật bào tử thể chứa bộ NST giao tử (n), được gọi là thể đơn bội Thể đơn bội đầu tiên được ghi nhận ở cây bông vào năm 1920, và cây cà độc dược lùn là thực vật hạt kín đơn bội đầu tiên được xác nhận bằng chứng tế bào học vào năm 1921 Nghiên cứu về cây đơn bội đã mở rộng đến các đối tượng như thuốc lá và ngũ cốc, và đến năm 1963, đã ghi nhận thể đơn bội ở ít nhất 71 loài thuộc 39 chi và 16 họ thực vật hạt kín, cũng như nhiều cây đơn bội ở thực vật hạt trần.
Thể đơn bội ở thực vật với bộ NST (n) có thể hình thành từ tế bào giao tử đực hoặc cái một cách ngẫu nhiên hoặc nhờ các yếu tố nhân tạo Ban đầu, các nhà khoa học đã sử dụng phương pháp lai xa để tạo ra cây đơn bội, sau đó áp dụng các yếu tố gây stress để kích thích quá trình này Nhờ sự phát triển của kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật, việc tạo ra cây đơn bội đã trở nên khả thi ở nhiều loại cây trồng (Maluszynski et al., 2003).
Thể đơn bội ở thực vật đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu lý thuyết và ứng dụng, đặc biệt là trong chọn tạo giống cây trồng Mặc dù cây đơn bội không có giá trị lớn trong quá trình chọn tạo giống, nhưng việc nhân đôi bộ NST của chúng tạo ra các thể đơn bội kép (Doubled haploid – DH) với 100% các locus ở trạng thái đồng hợp tử Điều này biến chúng thành nguồn vật liệu quý giá cho các chương trình chọn tạo giống ở thực vật (Seguí-Simarro, 2021).
Trong quần thể thực vật, hầu hết các gen tồn tại ở trạng thái dị hợp tử, dẫn đến việc các gen lặn không được biểu hiện Do đó, việc tạo ra các dòng đơn bội hoặc đơn bội kép sẽ thúc đẩy nhanh chóng quá trình chọn lọc các gen lặn có lợi cho con người.
Trong việc chọn tạo giống lai F1 ở loài giao phấn, việc phát triển các dòng thuần bố mẹ mang tính trạng quý là rất quan trọng Tuy nhiên, phương pháp truyền thống thường yêu cầu 5-7 thế hệ tự thụ phấn kết hợp với chọn lọc để tạo ra các dòng đồng hợp tử ổn định Một thách thức khác là sức sống của mỗi thế hệ tự thụ phấn thường suy giảm so với thế hệ trước Do đó, việc tạo ra cây đơn bội kép đồng hợp tử chỉ trong một thế hệ sẽ là giải pháp hiệu quả, giúp giảm chi phí và thời gian trong quá trình chọn tạo giống.
Dòng đơn bội kép có thể được ứng dụng trong chọn lọc và dự đoán hệ gen nhờ vào sự phát triển của công nghệ giải trình tự thế hệ mới (Next Generation Sequencing – NGS) và các công cụ tin sinh học Các chỉ thị phân tử hay chỉ thị DNA cho phép phân tích thử nghiệm một số dòng đơn bội kép in silico và dự đoán kết quả lai với ưu thế lai cao nhất Điều này giúp đánh giá các hiệu ứng tương tác bổ trợ và trội giữa các locus, từ đó lựa chọn các dòng đơn bội kép có giá trị đơn bội tối ưu để áp dụng trong công tác chọn tạo giống mới.
Đột biến đóng vai trò quan trọng trong việc cải thiện giống cây trồng hiện có và phát triển giống mới Tế bào đơn bội là đối tượng lý tưởng cho việc thực hiện các đột biến nhân tạo, giúp phát hiện và củng cố các đột biến này một cách hiệu quả (Weyen, 2021).
Các quần thể cây đơn bội và đơn bội kép có thể được tạo ra nhanh chóng và với số lượng lớn, đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu di truyền thực vật.
Quần thể đơn bội kép thường được áp dụng để xây dựng bản đồ nhóm liên kết phân tử ở nhiều loài khác nhau Trong quần thể này, các dòng đồng hợp tử tuyệt đối có khả năng nhân giống ổn định qua nhiều thế hệ tự thụ phấn.
HÌNH 1.1 Sơ đồ tạo dòng thuần ở thực vật (Teingtham, 2017)
A- Phương pháp tự thụ phấn, B- Phương pháp tạo cây đơn bội kép tính hiệu quả và độ tin cậy của bản đồ nhóm liên kết phân tử với độ chi tiết cao sẽ được đảm bảo (Shariatpanahi & Ahmadi, 2016; Weyen, 2021; Seguí-Simarro, 2021)
Việc sử dụng quần thể đơn bội và đơn bội kép giúp thu thập thông tin chính xác về tần số trao đổi chéo và các đặc điểm di truyền liên quan đến sự bắt cặp của nhiễm sắc thể, cũng như một số đặc điểm khác trong quá trình giảm phân.
• Thông qua các quần thể đơn bội kép đã xác định được nhiều locus tính trạng số lượng (Filiault et al�, 2017; Weyen, 2021)
Các quần thể đơn bội và đơn bội kép đóng vai trò quan trọng trong việc phát triển các chỉ thị phân tử liên quan đến nhiều tính trạng nông học ở cây trồng Chúng hỗ trợ xác định vị trí của các gen và chỉ thị phân tử trên bản đồ liên kết của loài Đặc biệt, ở loài Brassica rapa L, một bản đồ nhóm liên kết phân tử đã được xây dựng với sự sử dụng các quần thể cây đơn bội kép, đạt tới 1160 chỉ thị phân bố trên 10 nhóm liên kết (Choi et al., 2007; Kim et al., 2009).
Thể đơn bội là đối tượng quan trọng trong nghiên cứu giải trình tự hệ gen của nhiều loài thực vật, chẳng hạn như táo, đào và cà phê (Asakawa, 2014; Daccord et al., 2017).
Tế bào đơn bội là lựa chọn lý tưởng cho việc chuyển giao gen ngoại lai thông qua kỹ thuật di truyền Việc sử dụng tiểu bào tử hoặc phôi phát triển từ tiểu bào tử giúp cố định các gen được chuyển trong trạng thái đồng hợp tử (Seguí-Simarro, 2021).
Phương pháp tạo thể đơn bội giúp rút ngắn quá trình chuyển gen giữa các loài thông qua lai xa và lựa chọn dựa trên chỉ thị phân tử.
Phương pháp tạo thể đơn bội
Haploidy refers to the presence of a single set of chromosomes (n) derived from haploid cells that originate from male gametes through androgenesis or female gametes via gynogenesis.
• Đối với trường hợp sinh sản đơn tính đực, thể đơn bội có thể phát sinh từ các tế bào trong kỳ cuối của phân bào giảm phân
II, từ các tiểu bào tử, hoặc từ nhân sinh dưỡng, nhân sinh sản, hoặc các tinh tử của hạt phấn
Sinh sản đơn tính cái xảy ra khi thể đơn được hình thành từ các tế bào sinh giao tử cái, có thể phát sinh từ đại bào tử hoặc các tế bào đơn bội trong túi phôi, bao gồm tế bào đối cực và tế bào trứng.
Thể đơn bội có thể phát sinh từ nhiều loại tế bào khác nhau, nhưng các công nghệ tạo thể đơn bội chủ yếu sử dụng tiểu bào tử hoặc tế bào trứng chưa thụ tinh Thể đơn bội hình thành từ các tế bào đơn bội có thể xảy ra tự phát hoặc dưới tác động của các điều kiện kích ứng nhân tạo Hiện nay, nhiều phương pháp tạo cây đơn bội đã được nghiên cứu và phát triển, và chúng có thể được chia thành hai nhóm chính.
HÌNH 1.2 Con đường phát sinh cây đơn bội và đơn bội kép từ giao tử đực
HÌNH 1.3 Con đường phát sinh cây đơn bội và đơn bội kép từ giao tử cái
(Seguí-Simarro, 2021) in vivo và in vitro phụ thuộc vào sự hình thành và phát triển của phôi in vivo hay in vitro (Hình 1.4.)
1.2.1 Tạo thể đơn bội in vivo
Các phương pháp tạo thể đơn bội in vivo đã được phát triển từ những năm 1970, với ưu điểm là không cần nhiều trang thiết bị hiện đại và kỹ thuật cao Tuy nhiên, hiện tại, số lượng các phương pháp in vivo vẫn còn hạn chế, chỉ có một số ít được hoàn thiện và sử dụng để sản xuất số lượng lớn cây đơn bội Các phương pháp này được chia thành hai loại chính: lai xa và lai gần.
Thể đơn bội được hình thành khi hai loài khác nhau giao phối, dẫn đến sự không tương hợp giữa giao tử đực và giao tử cái sau quá trình thụ phấn Hợp tử được tạo ra từ hai loài có hệ gen khác nhau, gây ra tính không ổn định về mặt di truyền Trong quá trình phát triển phôi, một bộ nhiễm sắc thể từ giao tử sẽ bị loại bỏ, thường là từ giao tử đực, mặc dù cũng có trường hợp giữ lại hệ gen từ giao tử đực và loại bỏ từ giao tử cái Phương pháp lai xa này chủ yếu được áp dụng cho thực vật một lá mầm thay vì hai lá mầm.
HÌNH 1.4 Sơ đồ phân loại các phương pháp tạo thể đơn bội
Phương pháp lai xa đầu tiên được đề xuất là “Bulbosum” vào năm
Vào năm 1970, phương pháp sản xuất cây đơn bội kép ở đại mạch (H vulgare) đã được phát triển và hiện nay được áp dụng rộng rãi (Satpathy et al., 2021) Quá trình thụ phấn cho cây đại mạch diễn ra bằng cách sử dụng hạt phấn từ loài hoang dại H bulbosum, dẫn đến việc hình thành hợp tử lai Sau khi hợp tử được hình thành, bộ NST từ giao tử đực của H bulbosum sẽ bị loại bỏ, tạo ra phôi đơn bội mang hệ gen của H vulgare Để tạo ra thể đơn bội kép, cần tiến hành nhân đôi bộ NST dưới sự tác động của các yếu tố khác nhau.
HÌNH 1.5 Phương pháp “Bulbosum” tạo thể đơn bội
Hạt phấn của ngô (Zea mays) có tính bất tương hợp thấp và khả năng hình thành hợp tử lai khi thụ phấn với nhiều loài cây ngũ cốc khác nhau, đã được ứng dụng để kích thích sự phát sinh thể đơn bội ở nhiều loài cây Các phôi đơn bội ở lúa mì (Triticum aestivum) và tiểu hắc mạch (×Triticosecale) đã được tạo ra thông qua phương pháp này.
Các phương pháp lai khác loài thường chỉ áp dụng cho một số loài cây trồng nhất định Tuy nhiên, khi phương pháp này được hoàn thiện, nó có thể được áp dụng cho nhiều kiểu gen khác nhau trong cùng một loài Điều này khác biệt so với các phương pháp in vitro, vốn phụ thuộc nhiều vào từng kiểu gen cụ thể.
Một hạn chế của phương pháp lai khác loài là phôi và nội nhũ có thể không phát triển tốt, dẫn đến việc loại bỏ nhiễm sắc thể trong giai đoạn phát triển của phôi Do đó, trong một số trường hợp, phôi đơn bội cần được cứu bằng cách nuôi cấy in vitro trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo.
Lai gần là phương pháp kết hợp hai cá thể thực vật cùng loài nhằm tạo ra cây đơn bội Phương pháp này áp dụng hai kỹ thuật chính: sử dụng hạt phấn đã xử lý và các dòng cảm ứng để tạo thể đơn bội Tùy thuộc vào phương pháp lựa chọn và loài đối tượng, phôi đơn bội có thể được chia thành hai loại khác nhau.
• Phôi đơn bội mang hệ gen và tế bào chất từ tế bào trứng;
Phôi đơn bội chứa tế bào chất từ tế bào trứng và hệ gen nhân từ giao tử đực, cho phép chuyển giao nhanh chóng các tính trạng do gen trong tế bào chất quy định từ dòng này sang dòng khác, như tính bất dục đực (cytoplasmic male sterility – CMS).
Thụ phấn bằng hạt phấn xử lý hóa học và vật lý, đặc biệt là chiếu xạ, tạo ra phôi đơn bội với toàn bộ vật chất di truyền và tế bào chất của tế bào trứng Phương pháp này đã được phát hiện ở khoảng 15 loài thực vật khác nhau, nhưng khả năng ứng dụng còn hạn chế do tỷ lệ cây đơn bội được tạo ra rất thấp so với các phương pháp khác.
Dòng cảm ứng đơn bội là hiện tượng hiếm gặp ở thực vật, chủ yếu được áp dụng trong chương trình chọn giống ngô và khoai tây Hiện tại, nghiên cứu đang mở rộng ứng dụng của dòng cảm ứng này sang các loại cây trồng khác, dựa trên dòng cảm ứng CENH3 (Centromeric histone H3).
Research on Arabidopsis thaliana is focusing on CENH3 inducible lines, which have been engineered to lack the centromeric histone protein CENH3 The absence of CENH3 results in chromosomal instability and loss during embryonic development (Wang et al., 2021).
HÌNH 1.6 Sử dụng dòng cảm ứng CENH3 tạo cây đơn bội
Hạn chế chính trong việc sử dụng các dòng cảm ứng là tỷ lệ tạo cây đơn bội thấp và cần có phương pháp phân biệt hạt đơn bội giữa các hạt được tạo ra Sau 20 năm nghiên cứu và phát triển, tỷ lệ tạo cây đơn bội ở ngô hiện chỉ đạt khoảng 10%.
1.2.2 Tạo thể đơn bội in vitro
CƠ CHẾ PHÁT SINH PHÔI TỪ TIỂU BÀO TỬ NUÔI CẤY IN VITRO
Sự hình thành hạt phấn
Sự hình thành hạt phấn diễn ra qua hai giai đoạn chính: giai đoạn hình thành tiểu bào tử và giai đoạn tạo thành hạt phấn từ tiểu bào tử Tiểu bào tử được hình thành từ các tế bào sinh giao tử đực qua quá trình giảm phân, được gọi là microsporogenesis Từ một tế bào sinh giao tử ban đầu, quá trình này dẫn đến sự hình thành tiểu bào tử.
Microsporogenesis được chia thành hai loại: liên tiếp và song song, phụ thuộc vào thời gian bắt đầu phân chia tế bào chất (cytokinesis) của tế bào mẹ Nếu quá trình phân chia tế bào chất diễn ra sau giảm phân I, thì gọi là loại liên tiếp, dẫn đến việc tạo ra 02 tế bào con sau giảm phân I và 04 tế bào sau giảm phân II Ngược lại, loại song song chỉ tạo ra các tế bào con mới sau giảm phân II.
Sau khi hình thành, tiểu bào tử trải qua các giai đoạn phát triển để tạo thành hạt phấn chín, quá trình này được gọi là microgametogenesis Sự phát triển này bao gồm việc tăng kích thước tế bào, hình thành không bào, tổng hợp sporopollenin và cấu trúc thành hạt phấn Trong quá trình này, nhân của tiểu bào tử di chuyển từ trung tâm ra gần thành tế bào Giai đoạn hạt phấn được đánh dấu bởi lần nguyên phân đầu tiên của nhân tiểu bào tử, tạo thành tế bào hai nhân không đồng đều, trong đó nhân lớn là nhân sinh dưỡng sau này.
HÌNH 2.1 Quá trình phát sinh tiểu bào tử (Simpson, 2019).
A–loại liên tiếp, B–loại song song
Phát sinh tiểu bào tử
B từ đó phát triển thành ống phấn, với nhân nhỏ còn lại là nhân sinh sản Ở hầu hết các loài thực vật hạt kín, nhân sinh sản sẽ phân chia thành hai tinh tử sau khi ống phấn hình thành Do đó, những loài này chứa hạt phấn hai nhân trong giai đoạn nở hoa, trong khi giai đoạn ba nhân chỉ bắt đầu khi hạt phấn tiếp xúc với bầu nhụy Tuy nhiên, một số loài thực vật có thể có hạt phấn ba nhân xuất hiện ngay từ giai đoạn nở hoa.
Trước khi hình thành hạt phấn với 02 nhân, tiểu bào tử trải qua nhiều giai đoạn phát triển khác nhau, bao gồm giai đoạn đơn nhân sớm, giữa và muộn Mỗi bao phấn có thể chứa nhiều giai đoạn phát triển của tiểu bào tử (Nguyen et al., 2019) Giai đoạn đơn nhân sớm được đặc trưng bởi nhân gần trung tâm và không có không bào, trong khi giai đoạn đơn nhân giữa có không bào nhỏ và nhân ở trung tâm Cuối cùng, tiểu bào tử ở giai đoạn đơn nhân muộn có nhân lệch ra ngoại vi, không bào lớn và thành tế bào dày.
HÌNH 2.3 Giai đoạn phát triển của tiểu bào tử
A–Đơn nhân sớm, B- Đơn nhân giữa, C- Đơn nhân muộn
HÌNH 2.2 Hạt phấn hai nhân và hạt phấn ba nhân (Simpson, 2019).
Nhân sinh sản Hai nhân tinh tử
Hai nhân Ba nhân Đơn nhân sớm Đơn nhân giữa Đơn nhân muộn Hạt phấn 2 nhân sớm n n n n
Phát sinh phôi đơn bội từ tiểu bào tử
Tính toàn năng (totipotency) ở thực vật rất quan trọng, cho phép tái tạo một cơ thể hoàn chỉnh từ một tế bào hoặc cụm tế bào Quá trình tái tạo này có thể diễn ra qua hình thành các mô sẹo (callus), phát sinh cơ quan sinh dưỡng (organogenesis) hoặc hình thành phôi (embryogenesis) Dưới những điều kiện nhất định, cơ quan hoặc phôi có thể được hình thành từ tế bào thuộc các loại mô khác nhau như rễ, thân, lá và hoa Về mức độ đồng nhất giữa cơ thể tái sinh và cơ thể ban đầu, có thể xảy ra hai trường hợp khác nhau.
• Thứ nhất, các cơ thể tái sinh từ các tế bào, mô sinh dưỡng có cùng số lượng NST (2n) và vật chất di truyền như cây mẹ ban đầu
• Thứ hai, sự hình thành phôi từ các tế bào giao tử, sẽ có bộ NST (n/2n) và đặc điểm di truyền khác với cây mẹ ban đầu
Nhiều nghiên cứu hiện nay đã tập trung vào cơ sở tế bào và phân tử của quá trình hình thành phôi từ tiểu bào tử, tuy nhiên, vẫn còn nhiều vấn đề chưa được giải quyết Để thay đổi con đường phát triển tự nhiên của tiểu bào tử, cần có sự tác động của các yếu tố kích ứng Kết quả từ nhiều nghiên cứu cho thấy, phôi phát sinh theo con đường sinh sản đơn tính đực có thể được hình thành từ các giai đoạn phát triển khác nhau của tiểu bào tử (Soriano et al., 2013).
• Cấu trúc đa nhân được hình thành từ sự phân chia của tiểu bào tử đơn nhân
Cấu trúc đa nhân hình thành từ sự phân chia các nhân sinh dưỡng hoặc sinh sản của hạt phấn trong giai đoạn phát triển sớm, từ đó có khả năng cao hình thành callus.
• Sự dung hợp của nhân sinh sản và sinh dưỡng của hạt phấn ở giai đoạn phát triển sớm
Trong môi trường dinh dưỡng nuôi cấy nhân tạo, nhiều kiểu phát sinh phôi xuất hiện với tỉ lệ khác nhau Tỉ lệ này phụ thuộc vào giai đoạn phát triển của tiểu bào tử tại thời điểm cấy ban đầu và phương pháp xử lý bằng yếu tố kích ứng.
Cho đến nay, vẫn chưa có sự đồng thuận rõ ràng về cơ chế hình thành phôi từ tiểu bào tử Một số nghiên cứu cho rằng quá trình phát sinh phôi từ tiểu bào tử có thể được chia thành ba giai đoạn (Seguí‐Simarro & Nuez, 2008; Soriano et al., 2013).
Dưới tác động của các yếu tố kích ứng, quá trình phát triển của tiểu bào tử bị biến đổi, dẫn đến sự kìm hãm trong quá trình biệt hóa thành hạt phấn.
• Giai đoạn 2: Sự cảm ứng và nuôi cấy khởi đầu
Dấu hiệu khởi đầu của quá trình tạo phôi từ tiểu bào tử là sự phân chia nhân đối xứng, khác với phân chia bất đối xứng trong nguyên phân đầu tiên của hạt phấn Sau đó, sẽ diễn ra nhiều lần phân chia nhân ngẫu nhiên trong thành exine của tiểu bào tử Khi cấu trúc đa nhân hình thành, nó sẽ phá vỡ lớp exine bao bọc, giải phóng khối hình cầu không có cấu trúc rõ ràng, phân thành cực rễ và cực đỉnh như phôi hợp tử, với sự tồn tại của lớp mô phân sinh tiền bì (protoderm) Vỡ exine là một đặc điểm quan trọng trong sự phát triển phôi từ tiểu bào tử, và sự phát triển phôi không thành công có thể do nhân tiểu bào tử ngừng phân chia trước khi lớp exine bị vỡ hoặc lớp này bị vỡ quá sớm Vị trí vỡ exine đóng vai trò quan trọng trong việc thiết lập phân cực của phôi, với phần các cụm tế bào đa nhân còn sót lại dấu vết của lớp exine sẽ là cực rễ, trong khi cực chồi sẽ là vị trí bắt đầu vỡ của lớp exine.
Giai đoạn thứ 3 trong sự phát triển của phôi được đặc trưng bởi sự tiến triển từ tiểu bào tử qua các giai đoạn như phôi hữu tính, bao gồm giai đoạn hình cầu, hình tim, hình thủy lôi, phôi lá mầm, và quá trình tái sinh các mô và cơ quan.
HÌNH 2.4 Các giai đoạn phát sinh phôi từ tiểu bào tử ở cây cải dầu (Brassica napus)
Tiểu bào tử có cấu trúc phức tạp, bao gồm hạt phấn hai nhân với một nhân sinh dưỡng lớn và một nhân sinh sản nhỏ, cùng với hạt phấn ba nhân có một nhân sinh dưỡng lớn và hai nhân sinh sản nhỏ Cấu trúc giống callus phát sinh từ tiểu bào tử cho thấy sự phân chia nhân đối xứng thành hai nhân có kích thước giống nhau Bên trong lớp exine của tiểu bào tử, có sự hiện diện của cấu trúc đa nhân không rõ ràng Giai đoạn phôi hình thành thể hiện rõ protoderm, và phôi đã có sự phân cực rõ ràng.
HÌNH 2.5 Sự hoàn thiện của phôi phát sinh từ tiểu bào tử ở cây cải dầu (Brassica napus) (Seguí‐Simarro và Nuez, 2008)
A, B, phôi ở giai đoạn phát triển sớm mới được giải phóng khỏi lớp vỏ exine, phôi hình cầu mang thể treo, D – Phôi chuyển từ giai đoạn hình cầu muộn chuyển sang giai đoạn hình tim, E – Phôi hình thủy lôi, F – Giai đoạn phôi lá mầm, e – Phần vùng phôi, s – Vùng thể treo, ex – Vỏ exine
Trong điều kiện cảm ứng in vitro, chỉ khoảng 40% tiểu bào tử của B napus có khả năng phát triển thành phôi, với năng suất phôi cuối cùng chỉ đạt khoảng 5-10% (Soriano et al., 2013) Phần lớn các cấu trúc đa nhân thường ngừng phát triển sau vài lần phân chia, dẫn đến cái chết hoặc hình thành các cấu trúc tương tự như callus.
Sự phát triển của phôi từ tiểu bào tử khác biệt đáng kể so với phôi hợp tử, chủ yếu là do phôi tiểu bào tử không có nội nhũ để cung cấp các chất điều hòa sinh trưởng Do đó, các chất điều hòa sinh trưởng như auxin và cytokinin đóng vai trò quan trọng trong quá trình nuôi cấy tiểu bào tử.
So sánh biểu hiện gen trong quá trình hình thành hạt phấn và phôi từ tiểu bào tử cho thấy sự giảm biểu hiện của gen sinh tổng hợp tinh bột, trong khi các gen liên quan đến thủy phân đường và tinh bột lại tăng lên khi có sự phát sinh phôi (Magnard et al., 2000; Bommert & Werr, 2001).
Thể đơn bội có thể hình thành ở một số loài thông qua quá trình phát sinh callus, do thiếu tín hiệu điều hòa từ nội nhũ Trong nuôi cấy tiểu bào tử, sự phát triển của callus không thay thế cho sự hình thành phôi và không phụ thuộc vào kiểu gen của cây cung cấp tiểu bào tử Sự tạo thành callus chủ yếu xảy ra khi điều kiện nuôi cấy tiểu bào tử chưa tối ưu cho việc hình thành phôi vô tính Thông thường, việc tạo phôi từ tiểu bào tử phức tạp hơn so với việc tạo callus Tất cả các loài đã thu được cây đơn bội qua con đường phát sinh phôi đều quan sát thấy sự phát sinh callus.
Trong nghiên cứu về một số loài ngũ cốc như lúa mạch, lúa mì và lúa, tỷ lệ phát sinh phôi ban đầu thấp hơn so với tỷ lệ phát sinh callus.
QUY TRÌNH NUÔI CẤY TIỂU BÀO TỬ
Quy trình nuôi cấy tiểu bào tử tách rời
Nuôi cấy tiểu bào tử tách rời là một kỹ thuật quan trọng trong nghiên cứu sinh học phân tử, cho phép nuôi cấy tiểu bào tử sau khi tách ra từ bao phấn trong môi trường dinh dưỡng lỏng in vitro Kỹ thuật này không chỉ hỗ trợ việc tạo phôi từ tiểu bào tử mà còn giúp sản xuất nhanh chóng một lượng lớn cây đơn bội kép, từ đó thúc đẩy quá trình chọn tạo giống cây trồng Năm 1974, Nitsch đã thành công trong việc nuôi cấy tiểu bào tử của Nicotiana, trong khi Lichter (1982) đã phát triển phương pháp tách tiểu bào tử từ nụ hoa Brassica, mở ra hướng nghiên cứu mới Các nghiên cứu tiếp theo đã tập trung vào việc nâng cao tỉ lệ phát sinh phôi cho các loài cảm ứng và phát triển quy trình cho các loài chưa có khả năng phát sinh phôi.
Trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu đã được thực hiện về nuôi cấy tiểu bào tử tách rời ở các loài thực vật khác nhau Các nghiên cứu này đã dẫn đến việc tạo ra nhiều giống cây trồng mới, đặc biệt là từ các dòng đơn bội kép ở lúa mì (Triticum aestivum L.) và lúa mạch (Hordeum vulgare).
L), tiểu mạch (×Triticosecale), lúa (Oryza sativa L), cây họ Cải (Brassica), cà tím (Solanum melongema L), ớt (Capsicum annuum
L), măng tây (Asparagus officinalis L), thuốc lá (Nicotiana tabacum L) (Maluszynski et al�, 2003)
Kỹ thuật nuôi cấy tiểu bào tử tách rời đang được ưu tiên phát triển để tạo ra cây đơn bội và đơn bội kép, nhờ vào năng suất cao hơn so với các phương pháp khác Tuy nhiên, hiệu quả ứng dụng thực tiễn của công nghệ này hiện chủ yếu đạt được ở các loài ngũ cốc và cây họ Cải (Brassica) Đối với nhiều loài cây khác, khả năng cảm ứng tạo cây đơn bội từ tiểu bào tử vẫn còn thấp, dẫn đến chi phí cao trong việc chọn tạo giống, và trong một số trường hợp, như ở Arabidopsis, không có sự cảm ứng nào.
Nghiên cứu cho thấy mỗi loài thực vật cần một quy trình nuôi cấy tiểu bào tử tách rời, tuy nhiên, các quy trình này có thể bao gồm những bước chung như: trồng cây mẹ để cung cấp tiểu bào tử, thu và tiền xử lý cụm hoa hoặc nụ hoa, tách tiểu bào tử, nuôi cấy và kích ứng tiểu bào tử, phát triển phôi và tái sinh cơ quan, thích nghi và trồng cây con, cùng với việc kiểm tra mức độ bội thể và nhân đôi bộ NST nếu cần thiết.
3.1.1 Trồng cây mẹ cung cấp tiểu bào tử Điều kiện tiên quyết để nuôi cấy tiểu bào tử thành công là cây mẹ cung cấp vật liệu phải ở trạng thái sinh lý tốt và không bị sâu bệnh
Để nuôi cấy tiểu bào tử tạo cây đơn bội/đơn bội kép hiệu quả, cần chú ý đến khoảng cách trồng cây nhằm đảm bảo ánh sáng, dinh dưỡng và tưới tiêu đầy đủ, cùng với các biện pháp phòng chống sâu bệnh hiệu quả Địa điểm trồng cây mẹ có thể là cánh đồng, nhà kính, nhà lưới hoặc phòng tăng trưởng thực vật, trong đó phòng tăng trưởng với điều kiện kiểm soát chặt chẽ (nhiệt độ, độ ẩm, quang kỳ và cường độ ánh sáng) sẽ giảm thiểu tỷ lệ sâu bệnh Việc thu mẫu từ cây mẹ trồng ngoài tự nhiên có thể làm tăng nguy cơ nhiễm vi sinh vật, ảnh hưởng tiêu cực đến khả năng phát sinh phôi từ tiểu bào tử Các điều kiện trồng cây không chỉ tác động đến quá trình hình thành phôi mà còn đến giai đoạn tái sinh phôi thành cây và phát triển tại vườn ươm Cây lúa mạch trồng trong phòng tăng trưởng thực vật cho phép tạo ra nhiều cây đơn bội kép bình thường hơn so với cây trồng trong nhà kính, điều này đặc biệt quan trọng với các loại cây ngũ cốc do tỉ lệ bạch tạng cao ở cây đơn bội kép.
3.1.2 Thu mẫu cụm và nụ hoa
Thu mẫu hoa đóng vai trò quan trọng trong kỹ thuật nuôi cấy tiểu bào tử tách rời, ảnh hưởng trực tiếp đến tỉ lệ tạo phôi đơn bội hoặc đơn bội kép Việc lựa chọn giai đoạn phát triển của tiểu bào tử cần được chú ý, bao gồm thời gian thu mẫu trong ngày và điều kiện chăm sóc cây mẹ trước khi thu mẫu Điều này đảm bảo thu được nụ hoa chứa tiểu bào tử ở giai đoạn phát triển phù hợp, và giai đoạn này có thể khác nhau tùy thuộc vào từng loài và kiểu gen (chi tiết được trình bày ở chương 4).
Việc lựa chọn tiểu bào tử ở giai đoạn phát triển thích hợp thường dựa vào việc chọn lọc nụ hoa chứa các bào tử này Mặc dù một nụ hoa hoặc bao phấn có thể chứa tiểu bào tử ở nhiều giai đoạn khác nhau, nhưng sẽ có một giai đoạn phát triển chiếm ưu thế Nghiên cứu cho thấy chiều dài nụ hoa có mối quan hệ chặt chẽ với giai đoạn phát triển của tiểu bào tử: nụ hoa dài hơn thường chứa tiểu bào tử ở giai đoạn phát triển muộn Cụ thể, ở mướp đắng, nụ hoa dài 4,0 – 4,5 mm chứa 60,19% tiểu bào tử ở giai đoạn đơn nhân sớm, trong khi nụ dài 4,6 – 5,0 mm chủ yếu chứa tiểu bào tử ở giai đoạn đơn nhân giữa Tương tự, ở dưa lưới, tiểu bào tử ở giai đoạn đơn nhân sớm chiếm ưu thế ở nụ hoa dài 4,0 – 4,9 mm, trong khi các giai đoạn khác phân bố theo chiều dài nụ hoa từ 5,0 – 8,9 mm Đặc biệt, mối liên hệ này cũng khác nhau giữa các giống khác nhau trong cùng một loài.
Nghiên cứu cho thấy ở một số loài, giai đoạn phát triển của tiểu bào tử chiếm ưu thế với các đặc điểm hình thái của nụ hoa như màu sắc và tỷ lệ giữa chiều dài của đài hoa và nụ hoa Cụ thể, ở loài táo tây (Malus×domestica Borkh), tiểu bào tử ở giai đoạn đơn nhân sớm và giữa chủ yếu được thu từ nụ hoa được bao phủ hoàn toàn bởi đài hoa Khi nụ hoa bắt đầu hé mở và cánh hoa màu hồng lộ ra ở phần đỉnh, thì tiểu bào tử đơn nhân muộn xuất hiện nhiều nhất (Zhang et al., 2013).
Trước khi bắt đầu quy trình nuôi cấy tiểu bào tử, cần đánh giá mối liên hệ giữa giai đoạn phát triển của tiểu bào tử và đặc điểm hình thái của nụ hoa cũng như bao phấn.
Để xác định tiêu chí chọn lọc tiểu bào tử một cách đơn giản và chính xác, cần phân biệt rõ ràng các giai đoạn phát triển Việc nhuộm tiểu bào tử bằng dung dịch aceto-carmine hoặc thuốc nhuộm huỳnh quang (DAPI) sẽ giúp quan sát dưới kính hiển vi Số lượng nụ hoa được sử dụng trong phân tích nên từ 10 trở lên.
Để thu được tiểu bào tử ở giai đoạn thích hợp, từ đơn nhân sớm đến hạt phấn hai nhân sớm, việc tưới nước đầy đủ là rất quan trọng.
HÌNH 3.2 Hình thái của nụ hoa (A’-G’) và bao phấn (A’’-G’’) tương ứng với các giai đoạn phát triển chiếm ưu thế của tiểu bào tử (A-G) ở ca (Parra-Vega, et al., 2013).
A – Kỳ sau giảm phân II,
Hạt phấn được phân loại thành ba loại: E – hạt phấn hai nhân sớm, F – hạt phấn hai nhân giữa, và G – hạt phấn chín Kích thước thanh Bar từ A-G là 10 àm, trong khi A’-G’ và A’’-G’’ là 1 mm Để thu mẫu, cần chọn các cây mẹ vào buổi sáng sớm từ 5 đến 9 giờ Thời gian thu mẫu tối ưu là vào sáng sớm, vì sau thời gian này, hầu hết các nụ hoa sẽ có khả năng cảm ứng tạo phôi thấp hoặc các tiểu bào tử đã chuyển sang giai đoạn hai nhân muộn.
Sau khi thu mẫu, nụ hoa hoặc cụm hoa cần được tiền xử lý trong các điều kiện khác nhau để nâng cao khả năng cảm ứng tạo phôi của tiểu bào tử Đối với hầu hết các loài, việc tiền xử lý nụ hoa ở nhiệt độ thấp từ 4 – 10°C trong thời gian tối đa 72 giờ là phương pháp thường được áp dụng.
Tách tiểu bào tử từ nụ hoa là quy trình quan trọng quyết định tỉ lệ hình thành thể đơn bội và đơn bội kép, phụ thuộc vào độ sạch, mật độ và tỉ lệ sống của tiểu bào tử Mỗi loài hoặc kiểu gen có quy trình tách tiểu bào tử riêng, tùy thuộc vào kích thước, số lượng nụ hoa và môi trường phát triển thích hợp Quy trình chung bao gồm khử trùng mẫu nụ hoa, nghiền mẫu nụ hoa và bao phấn, tinh sạch tiểu bào tử, đếm mật độ tế bào và điều chỉnh về mật độ cần thiết, sau đó chuyển tiểu bào tử vào dụng cụ nuôi.
So sánh kỹ thuật nuôi cấy tiểu bào tử tách rời và nuôi cấy bao phấn
3.1 Quy trình nuôi cấy tiểu bào tử tách rời
Nuôi cấy tiểu bào tử tách rời là kỹ thuật nuôi cấy các tiểu bào tử tách ra từ bao phấn trong môi trường dinh dưỡng lỏng in vitro, phù hợp cho nghiên cứu sự cảm ứng tạo phôi và nhiều lĩnh vực sinh học phân tử khác Phương pháp này cho phép sản xuất nhanh chóng số lượng lớn cây đơn bội kép, góp phần vào quá trình chọn tạo giống cây trồng Năm 1974, Nitsch đã thành công trong việc nuôi cấy tiểu bào tử Nicotiana trong môi trường lỏng, và vào năm 1982, Lichter đã phân lập tiểu bào tử từ nụ hoa Brassica, mở ra hướng nghiên cứu mới Từ đó, các nghiên cứu đã tập trung vào việc tăng tỉ lệ phát sinh phôi cho các loài cảm ứng và phát triển quy trình cho các loài chưa có cảm ứng phát sinh phôi (Ferrie et al., 2011).
Trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu đã được thực hiện về nuôi cấy tiểu bào tử tách rời ở các loài thực vật khác nhau Kết quả là đã tạo ra nhiều giống cây trồng mới dựa trên các dòng đơn bội kép ở lúa mì (Triticum aestivum L) và lúa mạch (Hordeum vulgare).
L), tiểu mạch (×Triticosecale), lúa (Oryza sativa L), cây họ Cải (Brassica), cà tím (Solanum melongema L), ớt (Capsicum annuum
L), măng tây (Asparagus officinalis L), thuốc lá (Nicotiana tabacum L) (Maluszynski et al�, 2003)
Kỹ thuật nuôi cấy tiểu bào tử tách rời đang được ưu tiên phát triển để tạo ra cây đơn bội và đơn bội kép nhờ vào năng suất cao hơn so với các phương pháp khác Tuy nhiên, hiệu quả ứng dụng của công nghệ này hiện tại chủ yếu đạt được ở các loài ngũ cốc và cây họ Cải (Brassica) Đối với các loài cây khác, khả năng cảm ứng tạo cây đơn bội từ tiểu bào tử vẫn còn thấp, dẫn đến chi phí cao trong việc chọn tạo giống, và một số loài như Arabidopsis thậm chí không có khả năng cảm ứng.
Nghiên cứu cho thấy mỗi loài thực vật cần một quy trình nuôi cấy tiểu bào tử tách rời, dựa trên kiểu gen khác nhau Tuy nhiên, các quy trình này thường bao gồm những bước chung như: trồng cây mẹ để cung cấp tiểu bào tử, thu và tiền xử lý cụm hoa hoặc nụ hoa, tách tiểu bào tử, nuôi cấy và kích ứng tiểu bào tử, phát triển phôi và tái sinh cơ quan, thích nghi và trồng cây con, cũng như kiểm tra mức độ bội thể và nhân đôi bộ NST nếu cần thiết.
3.1.1 Trồng cây mẹ cung cấp tiểu bào tử Điều kiện tiên quyết để nuôi cấy tiểu bào tử thành công là cây mẹ cung cấp vật liệu phải ở trạng thái sinh lý tốt và không bị sâu bệnh
Để nuôi cấy tiểu bào tử tạo cây đơn bội/đơn bội kép hiệu quả, cần chú ý đến khoảng cách trồng cây nhằm đảm bảo ánh sáng, dinh dưỡng và tưới tiêu đầy đủ, cùng với các biện pháp phòng chống sâu bệnh hiệu quả Địa điểm trồng cây mẹ có thể là cánh đồng, nhà kính, nhà lưới hoặc phòng tăng trưởng thực vật Trong đó, phòng tăng trưởng thực vật với điều kiện kiểm soát chặt chẽ về nhiệt độ, độ ẩm, quang kỳ và cường độ ánh sáng sẽ giúp giảm thiểu tỷ lệ sâu bệnh Việc thu mẫu từ cây mẹ trồng tự nhiên có thể làm tăng nguy cơ nhiễm vi sinh vật, ảnh hưởng tiêu cực đến khả năng phát sinh phôi từ tiểu bào tử Các điều kiện trồng cây không chỉ ảnh hưởng đến quá trình hình thành phôi mà còn đến giai đoạn tái sinh phôi thành cây và phát triển tại vườn ươm Nghiên cứu cho thấy, cây lúa mạch được trồng trong phòng tăng trưởng thực vật cho phép tạo ra nhiều cây đơn bội kép bình thường hơn so với cây trồng trong nhà kính, điều này đặc biệt quan trọng đối với các loại cây ngũ cốc do cây đơn bội kép có tỉ lệ bị bạch tạng cao.
3.1.2 Thu mẫu cụm và nụ hoa
Thu mẫu hoa đóng vai trò quan trọng trong kỹ thuật nuôi cấy tiểu bào tử tách rời, ảnh hưởng trực tiếp đến tỷ lệ tạo phôi đơn bội hoặc đơn bội kép Việc lựa chọn giai đoạn phát triển của tiểu bào tử là rất cần thiết, cùng với việc chú ý đến thời gian thu mẫu trong ngày và điều kiện chăm sóc cây mẹ trước khi thu mẫu Điều này đảm bảo thu được nụ hoa chứa tiểu bào tử ở giai đoạn phát triển phù hợp Giai đoạn phát triển thích hợp của tiểu bào tử có thể khác nhau tùy thuộc vào từng loài và kiểu gen.
Việc lựa chọn tiểu bào tử ở giai đoạn phát triển thích hợp thường thông qua việc chọn lọc nụ hoa, tuy nhiên, trong một nụ hoa có thể chứa tiểu bào tử ở nhiều giai đoạn phát triển khác nhau Một giai đoạn phát triển sẽ chiếm ưu thế, do đó việc chọn lọc nụ hoa chỉ chứa một giai đoạn là không khả thi Nghiên cứu cho thấy có mối quan hệ chặt chẽ giữa chiều dài nụ hoa và giai đoạn phát triển chiếm ưu thế của tiểu bào tử; chiều dài nụ hoa càng lớn thì tiểu bào tử càng ở giai đoạn phát triển muộn Cụ thể, ở mướp đắng, nụ hoa dài 4,0 – 4,5 mm chứa 60,19% tiểu bào tử ở giai đoạn đơn nhân sớm, trong khi nụ hoa dài 4,6 – 5,0 mm chủ yếu chứa tiểu bào tử ở giai đoạn đơn nhân giữa Tương tự, ở dưa lưới, tiểu bào tử ở giai đoạn đơn nhân sớm chiếm ưu thế ở nụ hoa dài 4,0 – 4,9 mm, trong khi các giai đoạn đơn nhân giữa và muộn xuất hiện ở nụ hoa dài 5,0 – 8,9 mm Tuy nhiên, mối liên hệ giữa chiều dài nụ hoa và giai đoạn phát triển của tiểu bào tử có sự khác biệt giữa các giống khác nhau trong cùng một loài.
Nghiên cứu đã chỉ ra rằng ở một số loài cây, giai đoạn phát triển của tiểu bào tử có sự khác biệt rõ rệt, đặc biệt là ở loài táo tây (Malus×domestica Borkh) Tiểu bào tử ở giai đoạn đơn nhân sớm và giữa thường được thu thập từ những nụ hoa được bao phủ hoàn toàn bởi đài hoa Ngược lại, khi nụ hoa bắt đầu hé mở và cánh hoa màu hồng lộ ra ở phần đỉnh, thì tiểu bào tử đơn nhân muộn lại được tìm thấy với số lượng nhiều nhất (Zhang et al., 2013).
Trước khi bắt đầu quy trình nuôi cấy tiểu bào tử, cần đánh giá mối liên hệ giữa giai đoạn phát triển của tiểu bào tử và đặc điểm hình thái của nụ hoa, bao phấn.
Để phân biệt rõ ràng các giai đoạn phát triển của tiểu bào tử, cần xác định tiêu chí chọn lọc đơn giản và chính xác Việc nhuộm tiểu bào tử bằng dung dịch aceto-carmine hoặc thuốc nhuộm huỳnh quang (DAPI) sẽ giúp quan sát dưới kính hiển vi Số lượng nụ hoa trong phân tích nên từ 10 trở lên để đảm bảo tính chính xác.
Để thu được tiểu bào tử ở giai đoạn thích hợp từ đơn nhân sớm đến hạt phấn hai nhân sớm, việc tưới nước đầy đủ là rất quan trọng.
HÌNH 3.2 Hình thái của nụ hoa (A’-G’) và bao phấn (A’’-G’’) tương ứng với các giai đoạn phát triển chiếm ưu thế của tiểu bào tử (A-G) ở ca (Parra-Vega, et al., 2013).
A – Kỳ sau giảm phân II,
Hạt phấn hai nhân được phân loại thành ba loại: E – hạt phấn hai nhân sớm, F – hạt phấn hai nhân giữa, và G – hạt phấn chín Kích thước thanh Bar từ A-G là 10 àm, trong khi A’-G’ và A’’-G’’ có kích thước 1 mm Để thu mẫu hiệu quả, nên lấy từ các cây mẹ vào buổi sáng sớm, từ 5 đến 9 giờ, vì sau thời gian này, khả năng cảm ứng tạo phôi của các nụ hoa sẽ giảm, hoặc các tiểu bào tử đã chuyển sang giai đoạn hai nhân muộn.
Sau khi thu mẫu, nụ hoa hoặc cụm hoa cần được tiền xử lý trong các điều kiện khác nhau để nâng cao khả năng cảm ứng tạo phôi của tiểu bào tử Đối với hầu hết các loài, việc tiền xử lý nụ hoa ở nhiệt độ thấp từ 4 đến 10°C trong thời gian tối đa 72 giờ là phương pháp thường được áp dụng.
Tách tiểu bào tử từ nụ hoa là quy trình quan trọng quyết định tỉ lệ hình thành thể đơn bội và đơn bội kép, phụ thuộc vào độ sạch, mật độ và tỉ lệ sống của tiểu bào tử Mỗi loài hoặc kiểu gen có quy trình tách tiểu bào tử riêng, dựa vào kích thước, số lượng nụ hoa và thành phần môi trường phù hợp cho sự phát triển của tiểu bào tử Quy trình tách tiểu bào tử bao gồm các bước chung như khử trùng mẫu nụ hoa, nghiền mẫu nụ hoa và bao phấn, tinh sạch tiểu bào tử, đếm mật độ tế bào và điều chỉnh về mật độ cần thiết, sau đó chuyển tiểu bào tử vào dụng cụ nuôi.
YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HIỆU QUẢ NUÔI CẤY TIỂU BÀO TỬ
Kiểu gen cây mẹ
Kiểu gen của cây mẹ đóng vai trò quan trọng trong kết quả của kỹ thuật nuôi cấy tiểu bào tử in vitro Nghiên cứu cho thấy khả năng tạo phôi từ tiểu bào tử trên môi trường nuôi cấy là tính trạng di truyền, được kiểm soát bởi nhiều gen lặn (Smykal, 2000) Sự khác biệt về phản ứng tạo phôi không chỉ xuất hiện giữa các họ, chi, loài khác nhau mà còn giữa các giống trong cùng một loài và cây thuộc cùng một giống (Seguı-Simarro & Nunes, 2008) Một số kiểu gen có khả năng tạo cây đơn bội rất tốt, trong khi một số khác lại không có phản ứng cảm ứng.
Khả năng tạo cây đơn bội từ loài Brassica napus cao hơn so với Brassica juncea, với các giống mùa đông cho phản ứng tạo phôi tốt hơn so với giống mùa xuân (Chanana et al., 2005) Trong nghiên cứu 21 giống lúa mì (Triticum aestivum), chỉ có 10 giống có khả năng tạo cây đơn bội Đối với lúa, giống japonica có khả năng tạo cây đơn bội cao hơn so với giống indica (Raina & Zapata, 1997) Một thí nghiệm tương tự trên các kiểu gen thuộc họ Citrus cho thấy chỉ có một giống clementine và một giống chanh hình thành callus đơn bội, mặc dù tất cả các giống được nuôi cấy trên cùng một môi trường nhân tạo với kỹ thuật tiền xử lý giống nhau (Germana, 2007).
Khả năng hình thành phôi vô tính từ tiểu bào tử phụ thuộc vào mối quan hệ giữa các gen trong tế bào chất và nhân, cùng với điều kiện môi trường Công nghệ nuôi cấy tiểu bào tử chủ yếu được áp dụng cho một số loài hoặc kiểu gen có khả năng tạo phôi cao Tuy nhiên, hiệu quả tạo phôi và chuyển đổi thành cây con khỏe mạnh vẫn còn thấp ở nhiều loài thực vật Đặc biệt, trong các loại ngũ cốc, tần suất cây tái sinh bị bạch tạng vẫn cao Nhiều cây trồng có giá trị nông nghiệp cao vẫn chưa có quy trình nuôi cấy tiểu bào tử hiệu quả để tạo cây đơn bội hoặc đơn bội kép.
Đặc điểm sinh lý của cây mẹ
Điều kiện sinh lý của cây ảnh hưởng đến số lượng tiểu bào tử trong bao phấn, cũng như mức độ chất kích thích sinh trưởng và dinh dưỡng của mô bao phấn (Heberle-Bors, 1985) Sự hình thành tiểu bào tử có khả năng tạo phôi thể hiện qua lớp màng exine mỏng, nhuộm màu yếu với aceto-carmine, sự hiện diện của không bào, không có tinh bột, và có thể liên quan đến sự thiếu hụt Nito (Heberle).
Đặc điểm sinh lý và độ tuổi của cây mẹ ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu quả phát triển của phôi đơn tính tạo thể đơn bội Nghiên cứu cho thấy tần suất sinh sản đơn tính đực thường cao hơn ở các bao phấn thu hoạch vào đầu thời kỳ ra hoa, nhưng giảm dần theo tuổi của cây Tuy nhiên, một số loài vẫn có sự khác biệt trong tần suất này.
B napus và B rapa thường sản xuất nhiều phôi hơn ở tiểu bào tử vào cuối giai đoạn phát triển so với cây mới ra hoa (Burnett et al., 1992) Trong khi đó, bao phấn từ các nhánh chính ở hầu hết các loại ngũ cốc, ngoại trừ lúa, cho phản ứng tạo phôi tốt hơn từ nhánh bên.
Các điều kiện sinh trưởng của cây, bao gồm nhiệt độ và ánh sáng, ảnh hưởng lớn đến quá trình sinh lý và khả năng phát sinh phôi từ tiểu bào tử (Prem et al., 2004; Campbell et al., 1998) Cây trồng trong môi trường kiểm soát như nhà lưới thường có phản ứng tái sinh cao hơn so với cây trồng ngoài đồng (Dwivedi et al., 2015) Đặc biệt, cây được cung cấp đủ Nitơ sẽ sản sinh bao phấn với khả năng phát sinh callus và phôi thấp hơn so với cây thiếu Nitơ Ngoài ra, sự không đồng nhất về nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng và chất dinh dưỡng trong điều kiện ngoài đồng có thể dẫn đến kết quả khác nhau khi áp dụng kỹ thuật nuôi cấy tiểu bào tử.
4.3 Giai đoạn phát triển của tiểu bào tử
Giai đoạn phát triển của tiểu bào tử có ảnh hưởng mạnh mẽ đến thành công trong nuôi cấy cây đơn bội và đơn bội kép Khả năng tái sinh theo con đường sinh sản đơn tính đực phụ thuộc vào giai đoạn phát triển này, với nuôi cấy tiểu bào tử in vitro chỉ hiệu quả khi chúng chưa hình thành hạt phấn chín Các giai đoạn có khả năng tạo phôi cao nhất là giai đoạn đơn nhân hoặc giai đoạn nguyên phân đầu tiên của tiểu bào tử, khi tiểu bào tử chỉ tăng sinh mà không có sự biệt hóa Khả năng hình thành phôi giảm dần khi hạt phấn chuyển sang giai đoạn tích lũy chất dự trữ Hạt phấn chín có lớp thành tế bào hoàn thiện có tỷ lệ chết thấp hơn so với tiểu bào tử trong nuôi cấy in vitro Sự cân bằng giữa mức độ biệt hóa thấp và khả năng chống lại các yếu tố kích ứng là cần thiết để tạo ra phôi Đối với lúa mì, giai đoạn đơn nhân sớm và giữa là thích hợp nhất cho nuôi cấy cây đơn bội, trong khi ở cây cải dầu, giai đoạn tốt nhất để phát sinh phôi nằm gần thời gian diễn ra kỳ nguyên phân đầu tiên, mặc dù tác động nhiệt vẫn có thể kích thích sự phân chia của các nhân sinh dưỡng.
Tiểu bào tử phát triển không đồng đều trong bao phấn, dẫn đến sự tồn tại của nhiều giai đoạn phát triển khác nhau (Nguyen et al., 2019) Một giai đoạn sẽ chiếm ưu thế và việc lựa chọn bao phấn, nụ hoa với tỉ lệ tiểu bào tử có khả năng cảm ứng tạo phôi đơn bội là yếu tố quan trọng cho thành công của quy trình nuôi cấy Bao phấn chứa các acid amin hỗ trợ phát triển tiểu bào tử, nhưng nếu thành bao phấn dày, sẽ làm chậm tác động của các yếu tố kích ứng và kìm hãm sự cảm ứng của tiểu bào tử Nuôi cấy bao phấn ở giai đoạn sớm giúp tăng cường hiệu quả của các yếu tố kích thích hình thành phôi Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn yêu cầu phát triển tiểu bào tử sớm hơn so với nuôi cấy tách rời Mô bao phấn cung cấp môi trường tốt cho sự phát triển của tiểu bào tử giai đoạn đầu, cung cấp dinh dưỡng và bảo vệ chống lại kích ứng Mối quan hệ giữa giai đoạn phát triển tiểu bào tử và kích thước bao phấn, nụ hoa là bước quan trọng trong quy trình nuôi cấy, đặc trưng cho từng kiểu gen Ví dụ, ở đậu tương, bao phấn kích thước 2,5–3 mm chủ yếu chứa tiểu bào tử đơn nhân, trong khi cây họ cải với nụ hoa 2–2,5 mm chứa nhiều tiểu bào tử đơn nhân muộn (Sumarmi et al., 2014; Kumari et al., 2015).
Yếu tố kích ứng đóng vai trò quan trọng trong việc kích thích sự cảm ứng tạo phôi từ tiểu bào tử Những yếu tố này thường gây ra stress và có thể được áp dụng trong quá trình chuẩn bị mẫu nuôi cấy hoặc trong quá trình nuôi cấy bao phấn và tiểu bào tử in vitro.
Kỹ thuật tiền xử lý nụ hoa và bao phấn bằng các tác nhân hóa học và vật lý có thể kích thích sự phát triển của tiểu bào tử theo con đường bào tử thể, đồng thời ngăn cản sự phát triển theo con đường giao tử thể (Germana, 2011) Quá trình tiền xử lý mẫu vật giúp kích thích sự phân chia đối xứng của tiểu bào tử, tạo ra các tế bào đa nhân, và sau đó giải phóng chúng khỏi lớp vỏ exine để chuyển hóa thành các phôi hoặc cấu trúc giống phôi.
Các tác nhân kích ứng trong nuôi cấy tiểu bào tử bao gồm các yếu tố vật lý như nhiệt độ, ly tâm và chiếu xạ, cùng với các yếu tố hóa học như chất điều hòa sinh trưởng, ethanol, đường sucrose, maltose, manitol, hàm lượng nitơ thấp, pH, kim loại nặng và chất kháng sinh.
Nhiệt độ thấp dưới 10 o C hoặc cao trên 30 o C được xem là biện pháp hiệu quả nhất trong quy trình nuôi cấy tiểu bào tử cho đa số cây trồng Để đạt hiệu quả tạo thể đơn bội cao, cần kết hợp cả ngưỡng nhiệt độ thấp và cao trong các bước khác nhau Nhiệt độ thấp thường được sử dụng trong bước tiền xử lý mẫu nụ hoa và bao phấn, trong khi nhiệt độ cao áp dụng sau khi cấy bao phấn hoặc chuyển tiểu bào tử vào môi trường dinh dưỡng Việc lựa chọn nhiệt độ tối ưu và phương pháp xử lý phù hợp với từng loại cây và kiểu gen là rất quan trọng, với thời gian xử lý có thể từ vài giờ đến vài ngày Nhiệt độ và thời gian xử lý có mối quan hệ chặt chẽ với kiểu gen, như tiền xử lý ở nhiệt độ 4 o C có thể làm tăng tỷ lệ tiểu bào tử tạo phôi và tái sinh cây ở các giống lúa mì khác nhau.
Nhiệt độ 4°C có khả năng tăng cường sự phát sinh callus ở một số loài cây, trong khi xử lý lạnh giúp làm chậm quá trình lão hóa của tiểu bào tử và tăng cường sự phân chia của chúng, cũng như giải phóng các chất cần thiết cho sự sinh sản đơn tính đực Tuy nhiên, nếu xử lý lạnh kéo dài, khả năng tạo phôi hoặc callus sẽ giảm do tiểu bào tử bị suy yếu Các tiểu bào tử ở giai đoạn phát triển khác nhau cần nhiệt độ tiền xử lý khác nhau; ví dụ, hạt phấn hai nhân sớm của cải dầu cần xử lý sốc nhiệt ở 32°C, trong khi hạt phấn hai nhân muộn cần 42°C Sốc nhiệt cũng hiệu quả trong việc kích thích tiểu bào tử đơn nhân tạo phôi ở cây thuốc lá, nhưng hạt phấn hai nhân ở giai đoạn sớm cần bổ sung điều kiện thiếu sucrose và Nito Khi nuôi cấy tiểu bào tử cải dầu ở 18°C, có 65,5% tiểu bào tử phát sinh phôi và 34,5% tạo hạt phấn chín Đối với cây carot, tỷ lệ tạo phôi tăng khi xử lý tiểu bào tử tách rời ở nhiệt độ 5°C và 32°C, trong khi sốc nhiệt ở 32°C không làm thay đổi tỷ lệ tạo phôi từ tiểu bào tử.
Các phương pháp xử lý stress cho cấy đậu gà đơn bội kép bao gồm nhiệt độ thấp (4°C) trong 4 ngày, sốc điện, ly tâm và nuôi cấy bao phấn trong môi trường lỏng với áp suất thẩm thấu cao (563 mmol) (Grewal et al., 2009).
4.4.2 Chất điều hòa sinh trưởng
Sự kết hợp giữa nguồn Nitơ và các chất điều hòa sinh trưởng như auxin hoặc cytokinin ảnh hưởng đến quá trình tái sinh cây từ tiểu bào tử, cả trực tiếp và gián tiếp qua callus Mặc dù chất điều hòa sinh trưởng ít được áp dụng cho tiểu bào tử trong quy trình nuôi cấy tách rời, nhưng lại được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy bao phấn Hiện nay, hầu hết các quy trình nuôi cấy tiểu bào tử tách rời được áp dụng chủ yếu cho ngũ cốc và cây họ Cải không cần sử dụng chất điều hòa sinh trưởng trong môi trường nuôi cấy.
Sự phát sinh callus, phôi từ bao phấn sẽ không thể hoặc khó có thể diễn ra trên môi trường không có chất kích thích sinh trưởng
Auxin và cytokinin, hoặc sự kết hợp của hai loại hormone này, đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển của tiểu bào tử Các loại auxin khác nhau cho phép tiểu bào tử phát triển theo những con đường khác nhau; ví dụ, 2,4-D kích thích sự phát sinh callus, trong khi IAA và NAA kích thích sự phát sinh phôi trực tiếp từ bao phấn ở ớt (Capsicum annuum L) Nghiên cứu cho thấy, tỉ lệ tiểu bào tử cảm ứng cao nhất đạt được khi bổ sung 0,2 mg/l NAA và 0,2 mg/l Kinetin Đối với mướp đắng (Momordica charantia L), tỉ lệ callus cao nhất được tạo thành khi bổ sung 2,4-D (1,0 mg/l) và BAP (1,5 mg/l) Hơn nữa, việc bổ sung IAA (1,0 mg/l) và Kinetin (0,5 mg/l) đã làm tăng số lượng cấu trúc phôi và cây con hình thành khi nuôi cấy bao phấn ở lúa mì (Triticum aestivum L).
4.4.3 Một số chất hóa học khác
Nhiễm vi sinh vật là một thách thức lớn trong kỹ thuật nuôi cấy tiểu bào tử, thường xảy ra do vi sinh vật ngoại sinh hoặc nội sinh Nguồn gốc của sự nhiễm này có thể từ bề mặt mẫu cấy, không gian nội bào trong mô thực vật, hoặc do điều kiện vô trùng kém trong quá trình thao tác trong tủ cấy.