HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KH A LU N T T NGHIỆP ĐỀ TÀI: “ PHÂN L P VÀ THIẾT KẾ CẤU TRÚC T-DNA BIỂU HIỆN GEN OSNRAMP2 LIÊN QUAN TỚI Q TRÌNH TÍCH LŨY KIM LOẠI Ở LÚA ” Hà Nội, tháng 3/2022 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KH A LU N T T NGHIỆP ĐỀ TÀI: “ PHÂN L P VÀ THIẾT KẾ CẤU TRÚC T-DNA BIỂU HIỆN GEN OSNRAMP2 LIÊN QUAN TỚI Q TRÌNH TÍCH LŨY KIM LOẠI Ở LÚA ” Tên sinh viên : Lê Viết Hùng Ngành : Công nghệ sinh học Giảng viên hƣớng d n : TS Nguyễn Duy Phƣơng TS Ninh Thị Thảo Hà Nội, tháng 3/ 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan báo cáo thời gian qua Những số liệu kết nghiên cứu trung thực, hoàn toàn đƣợc thực môn Bệnh học Phân tử Viện Di truyền Nông nghiệp, không chép nguồn khác Ngồi ra, báo cáo có sử dụng số nguồn tài liệu tham khảo đƣợc trích dẫn nguồn thích rõ ràng Tơi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với lời cam đoan trên! Hà Nội, ngày 15 tháng 03 năm 2022 Sinh viên thực Lê Viết Hùng i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành tốt đề tài tốt nghiệp này, ngồi nỗ lực thân, tơi cịn nhận đƣợc quan tâm giúp đỡ nhiều tập thể cá nhân Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tri ân sâu sắc tới TS Nguyễn Duy Phƣơng - Viện Di truyền Nông nghiệp TS Ninh Thị Thảo - Bộ môn Công nghệ Sinh học Thực vật - Khoa Công nghệ Sinh học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam tạo điều kiện cho tơi, hƣớng dẫn tận tình, chu đáo giúp tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp Bên cạnh đó, tơi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ qu báu, nhiệt tình tập thể cán thuộc môn Bệnh học phân tử - Viện Di truyền Nông nghiệp, nơi tơi tiến hành khóa luận tốt nghiệp Cuối cùng, tơi gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy cô Bộ môn Công nghệ Sinh học Thực vật - Khoa Công nghệ Sinh học - Học viện Nơng nghiệp Việt Nam có kiến đóng góp để tơi hồn thành khóa luận cách hồn thiện Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 15 tháng 03 năm 2022 Sinh viên thực Lê Viết Hùng ii MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH ẢNH viii TÓM TẮT ix MỞ ĐẦU 1 ĐẶT VẤN ĐỀ MỤC ĐÍCH, YÊU CẦU VÀ Ý NGHĨA CỦA ĐỀ TÀI 2.1 Mục đích 2.2 Yêu cầu 2.3 Ý nghĩa đề tài CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 DINH DƢỠNG VI CHẤT Ở LÖA GẠO 1.1.1 Một số vi chất quan trọng lúa gạo gen liên quan 1.1.2 Ảnh hƣởng hàm lƣợng vi chất đến chất lƣợng lúa gạo 1.1.3 Nghiên cứu cải thiện hàm lƣợng vi chất lúa gạo 1.2 VAI TRÕ CỦA PROTEIN NRAMP ĐỐI VỚI Q TRÌNH TÍCH LŨY KIM LOẠI Ở THỰC VẬT 1.2.1 Đặc tính chức protein vận chuyển kim loại NRAMP 1.2.2 Mơ hình điều hịa biểu NRAMP thực vật 1.2.3 Chức NRAMP thực vật 11 1.3 CHUYỂN GEN THỰC VẬT VÀ HỆ THỐNG VECTOR CHUYỂN GEN12 1.3.1 Giới thiệu chung chuyển gen thực vật 12 1.3.2 Phƣơng pháp chuyển gen gián tiếp thực vật thông qua A tumefaciens 14 1.3.2.1 Giới thiệu chung vi khuẩn A tumerfaciens 14 1.3.2.2 Cơ chế phân tử trình chuyển gen thơng qua A tumefaciens 15 iii 1.3.3 Hệ thống vector chuyển gen vào tế bào thực vật 16 1.3.3.1 Hệ thống vector biến nạp gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens 16 CHƢƠNG V T LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 NGUYÊN LIỆU 18 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 18 2.1.2 Mẫu thực vật chủng vi sinh vật 18 2.1.3 Các vector oligonucleotide 18 2.1.4 Hóa chất 19 2.1.5 Thiết bị 20 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.2.1 Các phƣơng pháp chung dùng sinh học phân tử 20 2.2.1.1 Tách chiết DNA tổng số từ mô thực vật 20 2.2.1.2 Tách chiết DNA plasmid từ tế bào vi khuẩn 21 2.2.1.3 Kĩ thuật PCR (dùng để khuếch đại đoạn gen mục tiêu kiểm tra khuẩn lạc mang gen mục tiêu) 21 2.2.1.4 Xử lí với enzym cắt giới hạn 22 2.2.1.5 Điện di DNA gel agarose 1% 22 2.2.1.6 Tinh DNA từ gel agarose 22 2.2.1.7 Gh p nối DNA b ng T4 DNA ligase 23 2.2.1.8 Biến nạp DNA plasmid vào tế bào vi khuẩn 23 2.2.1.9 Giải trình tự DNA 24 2.2.2 Phân lập OsNRAMP2-TBR kĩ thuật PCR 24 2.2.3 Nhân dòng OsNRAMP2-TBR vào vector pJET1.2 26 2.2.4 Thiết kế vector chuyển gen tế bào thực vật mang cấu trúc biểu OsNRAMP2-TBR225 27 2.2.5 Tạo chủng A tumefaciens tái tổ hợp 27 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LU N 29 3.1 PHÂN LẬP GEN OsNRAMP2-TBR225 TỪ DNA TỔNG SỐ 29 3.1.1 Tách chiết DNA tổng số lúa TBR225 29 iv 3.1.2 Phân lập OsNRAMP2-TBR kĩ thuật PCR 30 3.1.2.1 Nhân vùng exon mang trình tự mã hóa OsNRAMP2-TBR 30 3.2.1.2 Nhân khung đọc mở OsNRAMP2-TBR 32 3.2 NHÂN DÕNG VÀ GIẢI TRÌNH TỰ OsNRAMP2-TBR 34 3.2.1 Nhân dòng OsNRAMP2-TBR vào vector pJET1.2 34 3.2.1.1 Gh p nối OsNRAMP2-TBR vào vector pJET1.2 34 3.2.1.2 Sàng lọc thể biến nạp b ng kĩ thuật PCR trực tiếp khuẩn lạc 35 3.2.1.3 Kiểm tra plasmid tái tổ hợp pJET/OsNRAMP2-TBR 36 3.2.2 Giải trình tự OsNRAMP2-TBR 38 3.3 THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN OsNRAMP2-TBR TRONG TẾ BÀO THỰC VẬT 39 3.3.1 Ghép nối OsNRAMP2-TBR vào vector pCAM-Ubi 39 3.3.2 Kiểm tra vector tái tổ hợp pCAM-Ubi/OsNRAMP2-TBR 41 3.4 TẠO CHỦNG A tumerfaciens LBA4404 TÁI TỔ HỢP MANG VECTOR pCAM-Ubi/OsNRAMP2-TBR 42 KẾT LU N VÀ ĐỀ NGHỊ 44 Kết luận 44 Kiến nghị 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 Tài liệu tiếng anh : 45 Trang web 49 v DANH MỤC VIẾT TẮT A tumefaciens Agrobacterium tumefaciens Bp base pair (cặp bazơ nitơ) CTAB Cetyltrimethylammonium bromide DNA Deoxy ribonucleotide Acid dNTP Deoxynucleotide triphosphate E coli Escherichia coli EtBr Ethidium bromide Fe Sắt Kb Kilobase Mn Mangan Nu Nucleotide NRAMP2 OsNRAMP2 NRAMP2-TBR OsNRAMP2-TBR225 PCR Polymerase chain reaction (phản ứng chuỗi trùng hợp) TAE Tris acetate (đệm điện di) T–DNA Transfer–DNA (DNA chuyển) Ti–plasmid Tumor inducing plasmid (plasmid gây khối u) Zn Kẽm vi DANH MỤC BẢNG Trang Bảng Các cặp oligonucleotide dùng phản ứng PCR 19 vii DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 2.1: Sơ đồ phân lập OsNRAMP2-TBR 26 Hình 2.2: Sơ đồ thiết kế vector pCAM-Ubi/OsNRAMP2-TBR 28 Hình 3.1: Tách chiết DNA tổng số lúa TBR225 29 Hình 3.2: Nhân trình tự DNA chứa exon 1, exon 2-3 exon OsNRAMP2-TBR PCR 30 Hình 3.3: Nhân đoạn exon 1, 2, OsNRAMP2 PCR 31 Hình 3.4: Xử l E1-OsNRAMP2-TBR, E2-OsNRAMP2-TBR, E3- OsNRAMP2-TBR E4-OsNRAMP2-TBR BsaI 33 Hình 3.5: Nhân đoạn gen OsNRAMP2-TBR PCR 33 Hình 3.6: Sơ đồ vector pJET1.2 vị trí enzyme giới hạn 34 Hình 3.7: Biến nạp vector pJET/OsNRAMP2-TBR vào E coli DH5α 35 Hình 3.8 : PCR trực tiếp khuẩn lạc biến nạp pJET/OsNRAMP2-TBR 36 Hình 3.9 : Kiểm tra plasmid tái tổ hợp pJET/OsNRAMP2-TBR 37 Hình 3.10: Giải trình tự nucleotide OsNRAMP2-TBR 38 Hình 3.11: Xử l vector pJET/OsNRAMP2-TBR pCAM-Ubi enzyme cắt giới hạn 39 Hình 3.12: PCR trực tiếp khuẩn lạc đƣợc biến nạp vector pCAMUbi/OsNRAMP2-TBR 40 Hình 3.13: Kiểm tra vector pCAM-Ubi/OsNRAMP2-TBR 41 Hình 3.14: PCR trực tiếp khuẩn lạc A tumefaciens đƣợc biến nạp vector pCAM-Ubi/OsNRAMP2-TBR 43 viii (Hình 3.9A, giếng 5) phù hợp với kích thƣớc l thuyết đoạn DNA cần nhân Để khẳng định chắn OsNRAMP2-TBR đƣợc chèn vào vector pJET1.2, tiến hành kiểm tra plasmid tái tổ hợp lần hai cách xử l với enzyme cắt giới hạn Enzyme BglII có hai vị trí nhận biết OsNRAMP2-TBR (đƣợc thiết kế thêm trình tự mồi nhân gen) vị trí vector pJET1.2 nằm gần vị trí chèn DNA Sản phẩm cắt giới hạn đƣợc điện di kiểm tra gel agarose 1% Kết thu đƣợc cho thấy băng DNA thứ có kích thƣớc khoảng 3,0 kb khung nguyên vector pJET1.2; băng lại đoạn gen OsNRAMP2-TBR có kích thƣớc khoảng 1,7 kb (Hình 3.9B, giếng 2) Các kết thu đƣợc khẳng định chắn việc nhân dịng thành cơng OsNRAMP2-TBR vào vector pJET1.2 Hình 3.9 : Kiểm tra plasmid tái tổ hợp pJET/OsNRAMP2-TBR Ghi chú:(A) Sản phẩm PCR kiểm tra plasmid tái tổ hợp pJET/NRAMP2 điện di gel agarose 1%; giếng 1-2: mồi pJET-F/pJET-R; giếng 3-4: mồi BglII E1-F/ BglII E4-R; giếng 5-6: mồi BsaI E2-F/BsaI E3-R; giếng 2, 6: đối chứng âm (khơng có DNA khn); giếng 1, 6: khn vector pJET/NRAMP2.(B) Sản phẩm cắt giới hạn điện di gel agarose %; giếng 1: vector pJET/OsNRAMP2-TBR nguyên bản; giếng 2: sản phẩm cắt giới hạn pJET/OsNRAMP2-TBR b ng BglII Giếng M: thang chuẩn DNA kb 37 3.2.2 Giải trình tự OsNRAMP2-TBR Để khẳng định xác đoạn DNA đƣợc nhân dòng vào vector pJET1.2 đoạn gen OsNRAMP2-TBR mong muốn, vector pJET/OsNRAMP2-TBR đƣợc gửi giải trình tự nucleotide Kết giải trình tự sau đƣợc phân tích lại phần mềm BioEdit so sánh với trình tự OsNRAMP2 giống lúa Nipponbare công bố Ngân hàng Gen Thế giới (mã số XM_015777087.2) Kết phân tích cho thấy OsNRAMP2 phân lập đƣợc từ giống TBR225 có chiều dài 1767 bp, trình tự nucleotide tƣơng đồng 97,3% với trình tự OsNRAMP2 đƣợc cơng bố Hình 3.10: Giải trình tự nucleotide OsNRAMP2-TBR Ghi chú: A: Một phần kết giải trình tự b ng mồi pJET-F; B: Một phần kết giải trình tự b ng mồi pJET-R Từ kết trên, khẳng định OsNRAMP2 đƣợc phân lập nhân dòng thành từ lúa TBR225 Sản phẩm nhân dòng đƣợc sử dụng cho nghiên cứu thiết kế vector biểu OsNRAMP2-TBR 38 3.3 THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN OsNRAMP2-TBR TRONG TẾ BÀO THỰC V T 3.3.1 Ghép nối OsNRAMP2-TBR vào vector pCAM-Ubi Trong nghiên cứu này, để thiết kế vector biểu OsNRAMP2-TBR dựa hệ vector thƣơng mại pCAMBIA1301, vector pCAM-Ubi phòng Bệnh học phân tử thiết kế đƣợc sử dụng làm nguyên liệu cho thí nghiệm Trên cặp mồi đặc hiệu sử dụng thí nghiệm phân lập OsNRAMP2-TBR, chúng tơi thiết kế đƣa vào trình tự nhận biết enzyme cắt giới hạn BglII Trong đó, vùng đa điểm cắt pCAM-Ubi có vị trí nhận biết BamHI Do đó, để gắn trình tự OsNRAMP2-TBR vào vector pCAM-Ubi, hai vector pJET/OsNRAMP2-TBR pCAM-Ubi đƣợc xử lí lần lƣợt với BglII BamHI để tạo mảnh DNA có đầu dính bổ sung với Sau đó, sản phẩm cắt giới hạn đƣợc điện di gel agarose 1%, băng DNA 1,7 kb tƣơng ứng với đoạn gen OsNRAMP2-TBR (Hình 3.11, giếng 1) 11 kb tƣơng ứng vector pCAM-Ubi mạch thẳng (Hình 3.11, giếng 2) đƣợc tinh từ gel agarose 1% để làm nguyên liệu cho phản ứng ghép nối DNA Hình 3.11: Xử lý vector pJET/OsNRAMP2-TBR pCAM-Ubi b ng enzyme cắt giới hạn Ghi chú: Sản phẩm cắt giới hạn tinh b ng kit GenJET-TM Gel Extraction điện di kiểm tra gel agarose 1%; giếng 1: sản phẩm cắt giới hạn OsNRAMP2-TBR; giếng 2: sản phẩm cắt giới hạn vector pCAM-Ubi; giếng M: thang DNA chuẩn kb 39 Đoạn gen OsNRAMP2-TBR (1,7 kb) đƣợc chèn vào vị trí cắt mở vịng vector biểu pCAM-Ubi dƣới tác dụng T4 DNA ligase Do hai enzyme BglII BamHI có khả tạo sản phẩm có đầu dính giống nên OsNRAMP2-TBR ghép nối trực tiếp vào vector mạch thẳng pCAM-Ubi đƣợc xử lí với Alkaline Phosphatase để khử gốc phosphate nhằm loại bỏ khả tự đóng vịng phản ứng ghép nối Sau sản phẩm ghép nối đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E coli chủng DH5α Các thể biến nạp xuất mơi trƣờng chọn lọc có bổ sung kháng sinh kanamycin 50 µg/ml Các khuẩn lạc đƣợc sàng lọc PCR trực tiếp khuẩn lạc với cặp mồi Ubi-F/BsaI E2-R Kết thu đƣợc cho thấy tất sản phẩm PCR từ khuẩn lạc đƣợc điện di gel agarose 1% cho băng DNA có kích thƣớc xấp xỉ 0,9 kb (Hình 3.12, giếng - 4) tƣơng ứng với kích thƣớc theo l thuyết đoạn DNA cần nhân Kết chứng tỏ thể biến nạp thu đƣợc mang vector tái tổ hợp pCAMUbi/OsNRAMP2-TBR Hình 3.12 : PCR trực tiếp khuẩn lạc biến nạp vector pCAMUbi/OsNRAMP2-TBR Ghi chú: Sản phẩm PCR trực tiếp khuẩn lạc với cặp mồi Ubi-F/ BsaI E2-R điện di gel agarose 1% Giếng M: thang chuẩn DNA kb; Giếng 1-4: khuôn khuẩn lạc số – biến nạp pCAM/NRAMP2; giếng 5: đối chứng âm (khuôn khuẩn lạc không biến nạp DNA) 40 3.3.2 Kiểm tra vector tái tổ hợp pCAM-Ubi/OsNRAMP2-TBR Để khẳng định chắn có mặt OsNRAMP2-TBR vector tái tổ hợp thu đƣợc, khuẩn lạc dƣơng tính đƣợc chọn ngẫu nhiên để tách chiết plasmid sau kiểm tra phƣơng pháp PCR xử l với enzyme cắt giới hạn Phản ứng PCR kiểm tra plasmid cặp mồi UbiF/Nos-R (đặc hiệu cho vector pCAM-Ubi), cặp mồi BglII E1-F/BglII E4-R (đặc hiệu cho OsNRAMP2-TBR) cặp mồi Ubi-F/BsaI E2-R (đặc hiệu cho vector pCAM-Ubi OsNRAMP2-TBR) Sản phẩm PCR đƣợc điện di gel agarose 1% cho băng DNA có kích thƣớc lần lƣợt khoảng 1,8 kb; 1,7 kb; 0,9 kb (Hình 3.13A, giếng 1, 5) Kích thƣớc băng DNA thu đƣợc hồn tồn phù hợp với kích thƣớc theo tính tốn l thuyết đoạn DNA cần nhân Hình 3.13: Kiểm tra vector pCAM-Ubi/OsNRAMP2-TBR Ghi chú: (A) Sản phẩm PCR kiểm tra plasmid tái tổ hợp pCAM/NRAMP2 điện di gel agarose 1%; giếng 1-2: mồi Ubi-F/Nos-R; giếng 3-4: mồi BglII E1F/BglII E4-R; giếng 5-6: mồi Ubi-F/BsaI E2-R; giếng 2, 6: đối chứng âm (khơng có DNA khn); giếng 1, 5: khn vector pCAM-Ubi/OsNRAMP2-TBR.(B) Sản phẩm cắt giới hạn b ng HindIII/EcoRI điện di gel agarose 1%; giếng 1: sản phẩm cắt giới hạn vector pCAM/NRAMP2; giếng 2: vector pCAM-Ubi/OsNRAMP2-TBR nguyên Giếng M: thang chuẩn DNA kb 41 Tƣơng tự, xử lí plasmid tái tổ hợp HindIII/EcoRI, kết thu đƣợc băng DNA có kích thƣớc lần lƣợt 8,7 kb (khung vector pCAMBIA1300), 3,4 kb (promoter Ubiquitin 2,1 kb phần đoạn gen OsNRAMP2-TBR), 0,4 kb (một phần đoạn gen OsNRAMP2-TBR terminator NOS) 0,3 kb (một phần đoạn gen OsNRAMP2-TBR) (Hình 3.13B, giếng 1) tƣơng ứng với kích thƣớc theo tính tốn l thuyết (Hình 2.2) Kết chứng tỏ vector biểu pCAM-Ubi/OsNRAMP2-TBR đƣợc thiết kế thành công 3.4 TẠO CHỦNG A tumerfaciens LBA4404 TÁI TỔ HỢP MANG VECTOR pCAM-Ubi/OsNRAMP2-TBR Vector pCAM-Ubi/OsNRAMP2-TBR đƣợc biến nạp vào tế bào vi khuẩn A tumerfaciens LBA4404 phƣơng pháp xung điện để tạo vật liệu cho thí nghiệm chuyển gen vào lúa Bằng phƣơng pháp PCR trực tiếp khuẩn lạc sử dụng cặp mồi Ubi-F/NRAMP-t-R, số dòng tế bào vi khuẩn A tumefaciens có mang Ti–plasmid chứa cấu trúc vector biểu OsNRAMP2-TBR Cụ thể, sản phẩm PCR với khuôn khuẩn lạc A tumefaciens đƣợc biến nạp pCAM-Ubi/OsNRAMP2-TBR cho băng DNA có kích thƣớc khoảng 0,2 kb điện di (Hình 3.14) với kích thƣớc theo tính tốn l thuyết Ngƣợc lại, sản phẩm PCR từ vi khuẩn A tumefaciens không đƣợc biến nạp DNA không thu đƣợc DNA Kết chứng tỏ vector pCAM-Ubi/OsNRAMP2-TBR đƣợc biến nạp thành công vào tế bào vi khuẩn A tumefaciens Các thể biến nạp có kết PCR dƣơng tính đƣợc bảo quản để sử dụng cho thí nghiệm chuyển gen vào lúa sau 42 Hình 3.14: PCR trực tiếp khuẩn lạc A tumefaciens biến nạp vector pCAM-Ubi/OsNRAMP2-TBR Ghi chú: Sản phẩm PCR trực tiếp khuẩn lạc với cặp mồi Ubi-F/NRAMP2-t-R điện di gel agarose 1% Giếng M: thang chuẩn DNA kb; giếng 1, 3: khuôn khuẩn lạc số – biến nạp pCAM-Ubi/OsNRAMP2-TBR; giếng 4: đối chứng dương (khuôn vector pCAM-Ubi/OsNRAMP2-TBR); giếng 5: đối chứng âm (khuôn khuẩn lạc không biến nạp DNA) 43 KẾT LU N VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Từ kết chúng tơi đƣa kết luận nhƣ sau: Đã phân lập thành cơng trình tự mã hóa OsNRAMP2-TBR liên quan tới tích lũy kim loại lúa TBR225 Đã nhân dịng thành cơng đoạn gen OsNRAMP2-TBR vào vector pJET1.2 giải trình tự đầy đủ gen Trình tự nucleotide OsNRAMP2-TBR giống 97,3% so với trình tự OsNRAMP2 tƣơng đồng giống lúa Nipponbare công bố Ngân hàng Gen Thế giới (mã số XM_015777087.2) Đã thiết kế thành công vector tái tổ hợp pCAM-Ubi/OsNRAMP2TBR biểu tế bào thực vật Vector tái tổ hợp đƣợc kiểm tra phƣơng pháp PCR cắt enzyme giới hạn Đã tạo thành công chủng A tumefaciens tái tổ hợp mang vector pCAM-Ubi/OsNRAMP2-TBR Kiến nghị Trên sở kết luận thu đƣợc, đƣa số kiến nghị nhƣ sau: Tiếp tục thiết kế hệ vector biểu OsNRAMP2-TBR tế bào thực vật đƣợc điều khiển promoter hoạt động liên tục khác hay hoạt động cảm ứng Chuyển cấu trúc biểu OsNRAMP2-TBR vào lúa để nghiên cứu chức gen đích 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng anh : Armstrong, C.L and Green C.E (1985) Establishment and maintenance of friable, embryogenic maize callus and the involvement of L-proline, Planta, 164: 207-214 (Armstrong and Green, 2012) Bashir, K., Ishimaru, Y and Nishizawa, N K (2011a) Identification and characterization of the major mitochondrial Fe transporter in rice, Plant Signal, 6: 1591–1593 (Bashir et al., 2011a) Bashir, K., Ishimaru, Y., Shimo, H., Nagasaka, S., Fujimoto, M., Takanashi, H., et al (2011c) The rice mitochondrial iron transporter is essential for plant growth, Nat Commun, 2: 322 (Bashir et al., 2011c) Bashir, K., Nagasaka, S., Itai, R., Kobayashi, T., Takahashi, M., Nakannishi, H., Mori, S and Nishizawa, N.K (2007) Expression and enzyme activity of glutathione reductase tase is upregulated by Fe-deficiency in graminaceous plants, Plant Mol, 65: 277–284 (Bashir et al., 2007) Bashir, K., Takahashi,R., Nakanishi, H and Nishizawa N K (2013) The road to micronutrient biofortification of rice progress and prospects, Front Plant Sci, 4: 15 (Bashir et al., 2013) Belouchi, A., Kwan, T and Gros, P (1997) Cloning and characterization of the OsNramp family from Oryza sativa, a new family of membrane proteins possibly implicated in the transport of metal ions, Plant molecular biology, 33(6): 1085– 1092 Bennetzen, J (2002) The rice genome Opening the door to comparative plant biology, Science (New York, N.Y.), 296(5565): 60–63 Bereczky, Z., Wang, H Y., Schubert, V., Ganal, M and Bauer, P (2003) Differential regulation of nramp and irt metal transporter genes in wild type and iron uptake mutants of tomato, The Journal of biological chemistry, 278(27): 24697–24704 45 Berger, B.R and Christie, P.J (1994) Genetic complementation analys of the Agrobacterium tumefaciens virB operon: virB2 throught virB11 are essential virulence genes, Journal of Bacteriology, 176: 3646-3660 (Berger and Christie, 1994) 10 Briat, J.F (1996) Roles of Ferritin in Plants, J Plant Nutr, 19:1331–1342 11 Casey, J L., Hentze, M W., Koeller, D M., Caughman, S W., Rouault, T A., Klausner, R D and Harford, J B (1988) Iron-responsive elements: regulatory RNA sequences that control mRNA levels and translation, Science (New York, N.Y.), 240(4854): 924–928 12 Chen, X Z., Peng, J B., Cohen, A., Nelson, H., Nelson, N and Hediger, M A (1999) Yeast SMF1 mediates H(+)-coupled iron uptake with concomitant uncoupled cation currents, The Journal of biological chemistry, 274(49): 35089– 35094 13 Curie, C., Alonso, J M., Le Jean, M., Ecker, J R and Briat, J F (2000) Involvement of NRAMP1 from Arabidopsis thaliana in iron transport, The Biochemical journal, 347(3): 749–755 14 De Silva, D M., Askwith, C C., Eide, D and Kaplan, J (1995) The FET3 gene product required for high affinity iron transport in yeast is a cell surface ferroxidase, The Journal of biological chemistry, 270(3): 1098–1101 15 Dix, D R., Bridgham, J T., Broderius, M A., Byersdorfer, C A and Eide, D J (1994) The FET4 gene encodes the low affinity Fe(II) transport protein of Saccharomyces cerevisiae, The Journal of biological chemistry, 269(42): 26092– 26099 16 Ferro, M., Salvi, D., Riviere-Rolland, H., Vermat, T., Seigneurin-Berny, D., Grunwald, D., Garin, J., Joyard, J and Rolland, N (2002) Integral membrane proteins of the chloroplast envelope: identification and subcellular localization of new transporters, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 99(17): 11487–11492 17 Gunshin, H., Mackenzie, B., Berger, U V., Gunshin, Y., Romero, M F., Boron, W F., Nussberger, S., Gollan, J L and Hediger, M A (1997) Cloning and characterization of a mammalian transporter, Nature, 388(6641): 482–488 46 proton-coupled metal-ion 18 Gustavo, A., Cabrera, J (1998a) The Agrobacterium tumefaciens gene transfer to plant cell, Molecular Microbiology, 26: 1-14 (Gustavo et al., 1998a) 19 Hebbern, C A., Pedas, P., Schjo- erring, J K., Knudsen, L and Husted S (2005) Genotypic dif- ferences in manganese efficiency: field experiments with winter barley (Hordeum vulgare L.), Plant Soil, 272: 233–244 (Hebbern et al., 2005) 20 Hirayama, T and Alonso, J M (2000) Ethylene captures a metal! Metal ions are involved in ethylene perception and signal transduction, Plant & cell physiology, 41(5): 548–555 21 Hooykass, P.J.J., Schilperoort, R.A (1992) Agrobacterium and plant genetic engineering, Plant Molecular Biology, 35: 205-218 (Hooykass et al., 1992) 22 Ishimaru, Y., Bashir, K and Nishizawa,N (2011b) Zn uptake and transloca- tion in rice plants, Rice 4: 21–27 (Ishimaru et al., 2011b) 23 Kim, S A., Punshon, T., Lanzirotti, A., Li, L., Alonso, J M., Ecker, J R., Kaplan, J and Guerinot, M L (2006) Localization of iron in Arabidopsis seed requires the vacuolar membrane transporter VIT1, Science (New York, N.Y.), 314(5803): 1295–1298 (Kim et al., 2006) 24 Klausner, R D., Rouault, T A and Harford, J B (1993) Regulating the fate of mRNA: the control of cellular iron metabolism, Cell, 72(1): 19–28 25 Koo, A J and Ohlrogge, J B (2002) The predicted candidates of Arabidopsis plastid inner envelope membrane proteins and their expression profiles, Plant physiology, 130(2): 823–836 26 Kumari, K., Kumar, P., Sharma, V K and Singh, S K (2019) Genomic marker assisted identification of genetic loci and genes associated with variation of grain zinc concentration in rice, Journal of genetics, 98: 111 (Kumari et al., 2019) 27 Ling, H Q., Bauer, P., Bereczky, Z., Keller, B and Ganal, M (2002) The tomato fer gene encoding a bHLH protein controls iron-uptake responses in roots, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 99(21): 13938–13943 28 Ling, H Q., Koch, G., Bäumlein, H and Ganal, M W (1999) Map-based cloning of chloronerva, a gene involved in iron uptake of higher plants encoding nicotianamine synthase, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 96(12): 7098–7103 47 29 Marschner, H (1995) Mineral Nutri- tion of Higher Plants, London, Aca: demic Press 30 Narasimhulu, S.B., X.B Deng, R Sarria and S.B Gelvin (1996) Early transcription of Agrobacterium T-DNA genes in tobacco and maize, Plant Cell ,8: 873-886 (Narasimhulu et al., 1996) 31 Petit, J M., van Wuytswinkel, O., Briat, J F and Lobréaux, S (2001) Characterization of an iron-dependent regulatory sequence involved in the transcriptional control of AtFer1 and ZmFer1 plant ferritin genes by iron, The Journal of biological chemistry, 276(8): 5584–5590 32 Rhodes, D and Klug, A (1993) Zinc fingers, Sci, 268: 56–65 (Rhodes and Klug, 1993) 33 Supek, F., Supekova, L., Nelson, H and Nelson, N (1996) A yeast manganese transporter related to the macrophage protein involved in conferring resistance to mycobacteria, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 93(10): 5105–5110 34 Suzuki, M., Bashir, K., Inoue, H., Takahashi, M., Nakanishi, H and Nishizawa, N (2012) Accumula- tion of starch in Zn-deficient rice, Rice, 5: (Suzuki et al., 2012) 35 Tewari, R K., Kumar, P., Neetu and Sharma, P N (2005) Signs of oxida- tive stress in the chlorotic leaves of iron starved plants, Plant Sci, 169: 1037–1045 (Tewari et al., 2006) 36 Thomine, S., Lelièvre, F., Debarbieux, E., Schroeder, J I and Barbier-Brygoo, H (2003) AtNRAMP3, a multispecific vacuolar metal transporter involved in plant responses to iron deficiency, The Plant journal : for cell and molecular biology, 34(5): 685–695 37 Thomine, S., Wang, R., Ward, J M., Crawford, N M and Schroeder, J I (2000) Cadmium and iron transport by members of a plant metal transporter family in Arabidopsis with homology to Nramp genes, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 97(9): 4991–4996 38 Vallee, B L and Falchuk, K H (1993) The biochemical basis of zinc physiology, Physiol, 73: 79–118 (Vallee and Falchuk, 1993) 48 39 Vert, G., Briat, J F and Curie, C (2001) Arabidopsis IRT2 gene encodes a rootperiphery iron transporter, The Plant journal : for cell and molecular biology, 26(2): 181–189 40 Vert, G., Grotz, N., Dédaldéchamp, F., Gaymard, F., Guerinot, M L., Briat, J F and Curie, C (2002) IRT1, an Arabidopsis transporter essential for iron uptake from the soil and for plant growth, The Plant cell, 14(6): 1223–1233 41 Walkerpeach,C R and Velten, J (1994) Agrobacterium-mediated gene transfer to plant cells: Cointegrate and binary vector systems, Plant Molecular Biology Manual, B1: 1-19 (Walkerpeach and Velten, 1994) 42 Zhang, Y., Xu, Y H., Yi, H Y and Gong, J M (2012) Vacuolar membrane transporters OsVIT1 and OsVIT2 modulate iron translocation between flag leaves and seeds in rice, The Plant journal : for cell and molecular biology, 72(3): 400– 410 (Zhang et al., 2012) 43 Zhao, H and Eide, D (1996a) The ZRT2 gene encodes the low affinity zinc transporter in Saccharomyces cerevisiae, The Journal of biological chemistry, 271(38): 23203–23210 44 Zhao, H and Eide, D (1996b) The yeast ZRT1 gene encodes the zinc transporter protein of a high-affinity uptake system induced by zinc limitation, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 93(6): 2454– 2458 Trang web IRRI, Biofortification [Online] Available from, https://www.irri.org/biofortification/ (2021) Rice Knowledge Bank, IRRI Rice Quality Assessment Kit [Online] Available from, http://www.knowledgebank.irri.org/step-by-step-production/postharvest/milling/irririce-quality-assessment-kit (2021) https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi/ https://www.irri.org/ 49 PHỤ LỤC Kết giải trình tự mồi pJET-F CAATTCGGGAGGCTCGAGTTTTTCAGCAGATAGATCTCCCATCCAT TTCTTCCCACTCGTTTATATCTGTGCCATTCGTGGGGAGAAATCAG TTGGGGGTAGAAAGGCTTAGAAACCCTCTGCTAATCACCACCCCT GGAGGGGTTATGACAGCAAAGTACTATAGTCCTGCCGTCCCTATA GAAATCCAGGGGATTCCTTTTCCCTCGGACCTGATTCTGCTAGACA CCAAGAACTTGGATGTGATCCTTGGAATGAATTGGTTGGCTCAATT CCAAGGAGTAGTGGATTGCGCGAGGCGCACGGTCACTCTGTACCG AGGGCCGGAACAACCGGTTGTTTTCTTTGCACCCCCAACCTCTGTC AGAAGTTCAGAACTGCATCAGATAGGGCTGTCAGAAATCCCCATA GTCAGAGAGTTCATGGGCGCCCTGGTGCAGCTGCTCTCCGCGCGG CTCGGGGTCGCCACGGGGAAGCACCTCGCCGAGCTCTGCAGGGAG GAGTACCCGCCCTGGGCCACGCGCGCGCTCTGGGCCATGACCGAG CTCGCGCTCGTCGGCGCGGACATCCAGGAGGTGATTGGCAGCGCG ATTGCCATCAAGATCCTCTCCGCTGGCACCGTCCCGCTCTGGGGCG GCGTCGTCATCACCGCGTTCGATTGCTTCATCTTTTTATTCCTGGAG AACTATGGAGTGAGAAAATTGGAAGCATTTTTCGGAGTCCTGATTG CAGTCATGGCAGTATCATTTGCAATTATGTTTGGTGAAACAAAGCC AAGTGGCAAGGACCTTCTGATTGGTTTGGTGGTTCCAAAGTTGAGT TCAAGGACAATCAAACAAGCAGTTGGAATTGTGGGCTGCATAATC ATGCCCCACAATGTCTTCTTGCACTCAGCACTAGTGCAGTCAAGGA AGATTGACACAAACAAGAAATCCCGTGTTCAAGAAGCAGTGTTCT ATTACAACATTGAGTCCATTCTTGCCCTCATTGTCTCGTTCTTTATT TAACATCTGTGTCACAACAGTTTTTTGCCGAAAGGGATTTTTATGG ATCTGAACAGCTGATGCTATAGGTCTTTGAGGATTGCCTTGACCAG GTTACCTTACAGTCAGAAAATATGGGGCAACTGGCAATTTTCCT 50 Kết giải trình tự mồi pJET-R GAGGGGGGGAACTTCTAGAAAGATAGATCTTCATGTGCTCTTTGTC ATTGCTGAGCGGAGGCGAGAATACAGTGAGGTATTTTGCATGATA AGATAGACGATGAATGCAAGGTAAACTGCCAATACAACGCACAAG CTTGACCGAACCAATGCTCCCCGGACTTCAGTGGCATAGAAGGAC AGTATAAGATACCCATTGATGAGCATCAAGAATACTGTAGCAATC CAGCTAATCGCTTTTGTGGTAGGACCAACCGCAAATGATCCCATGA CTTGCTCCTTTGAGACGAGTGTGATGAGAGGAATCAGTGCAAATG GTATCTGTATGGATTGAAGAACATTGAGTGCCTCATTCAGAATGTC CATTGTAGGATCCTCCGTGTCAAAAAATAAAGCCACAATCATAGTT GGAATAATTGCAAAGCTTCGAGTAATCATTGCTCTTAACCACTTCT TCAACCGAAGATTAAGGAAGCCTCCCATAACAAATTGGCCTGCAT ATGTGCCAGTAATAGTGCTACTCTGTCCAGATGCTAACAGCCCAAT AGCCCAGATATACAGTATAGGAAAGAATGCAGTCCCATATTTCTG CTGTAAGTACTGTCCAGCATTCTCAAGACCTATACCATCAGCTTGT TCAGATCCATAAAATCCTTTCGCAAAAACTGTTGTGACACAGATGT TAATAAAGAACGAGACAATGAGGGCAAGAATGGACTCAATGTTGT AATAGAACACTGCTTCTTGAACACGGGATTTCTTGTTTGTGTCAAT CTTCCTTGACTGCACTAGTGCTGAGTGCAAGAAGACATTGTGGGGC ATGATTATGCAGCCCACAATTCCAACTGCTTGTTTGATTGTCCTTG AACTCAACTTTGGAACCACCAAACCAATCAGAAGGTCCTTGCCAC TTGGCTTTGTTTCACCAAACATAATTGCAAATGATACTGCCATGAC TGCAATCAGGACTCCGAAAAATGCTTCCAATTTTTCTCACTCCATA GTTCTCCAGGGAAATAAAAAAGATGAAGCAATCGAACGCGGTGAT GAACGACGCCGGCCCCAGAAGCGGACGGTTGCCAGCCGAGAGCAT CTTGGAATGGCAATTCGGCGGCTGGCCCTATCCACCCTCTCCTG 51