HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU TÁI TỔ HỢP GEN PCBER-SDR TỪ NẤM NỘI SINH Penicillium herquei SINH ENZYME KHỬ PHENYLCOUMARAN BENZYLIC ETHER BIỂU HIỆN TRONG VI KHUẨN E coli HÀ NỘI - 2022 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU TÁI TỔ HỢP GEN PCBER-SDR TỪ NẤM NỘI SINH Penicillium herquei SINH ENZYME KHỬ PHENYLCOUMARAN BENZYLIC ETHER BIỂU HIỆN TRONG VI KHUẨN E coli Sinh viên thực hiện: Nguyễn Mai Hƣơng Mã số: 637235 Lớp: K63CNSHC Giảng viên hƣớng dẫn: PGS.TS Phạm Bích Ngọc GS.TS Phan Hữu Tôn HÀ NỘI - 2022 LỜI CAM ĐOAN Em xin cam đoan báo cáo khóa luận tốt nghiệp đề tài “Nghiên cứu tái tổ hợp gen PCBER-SDR từ nấm nội sinh Penicillium herquei sinh enzyme khử phenylcoumaran benzylic ether biểu vi khuẩn E coli” em thời gian qua Những số liệu kết nghiên cứu trung thực, hồn tồn đƣợc thực Phịng cơng nghệ ADN Ứng dụng, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, không chép nguồn khác Ngoài ra, báo cáo có sử dụng số nguồn tài liệu tham khảo đƣợc trích dẫn nguồn thích rõ ràng Em xin hồn tồn chịu trách nhiệm trƣớc môn, khoa nhà trƣờng cam đoan Hà Nội, ngày … tháng… năm 2022 Sinh viên thực Nguyễn Mai Hƣơng i LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận này, lời đầu tiên, em xin tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Phạm Bích Ngọc, tạo điều kiện cho em đƣợc hồn thành khóa luận Phịng ln tận tình hƣớng dẫn, đƣa lời khun nhƣ kiến thức thực tế suốt trình thực đề tài khóa luận tốt nghiệp em Em chân thành cảm ơn thầy GS.TS Phan Hữu Tơn hỗ trợ em suốt q trình hồn thành khóa luận, nhƣ q thầy, khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam tận tình truyền đạt kiến thức năm em học tập Với vốn kiến thức đƣợc tiếp thu q trình học khơng tảng cho q trình nghiên cứu khóa luận mà cịn hành trang quý báu để em bƣớc vào đời cách vững tự tin Em chân thành cảm ơn anh, chị nghiên cứu viên phịng Cơng nghệ ADN Ứng dụng, Viện công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam giúp đỡ em suốt trình thực đề tài Phịng Cuối em kính chúc q thầy, cô dồi sức khỏe thành công nghiệp cao q Đồng kính chúc cơ, chú, anh, chị phịng Cơng nghệ ADN Ứng dụng ln dồi sức khỏe, đạt đƣợc nhiều thành công tốt đẹp công việc Hà Nội, ngày … tháng… năm 2022 Sinh viên thực Nguyễn Mai Hƣơng ii iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iv DANH MỤC VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG BIỂU vii DANH MỤC HÌNH ẢNH viii CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn dề 1.2 Tính đề tài 1.3 Mục đích yêu cầu CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Podophyllotoxin 2.2 Các vi nấm nội sinh sinh hoạt chất Podophyllotoxin 2.3 Con đƣờng sinh tổng hợp Podophyllotoxin 10 2.4 Các enzyme tham gia vào trình sinh tổng hợp Podophyllotoxin 12 2.4.1 Coniferyl alcohol 13 2.4.2 Protein dirigent 14 2.4.3 Pinoresinol-lariciresinol reductase 15 2.4.4 Secoisolariciresinol dehydrogenase 17 CHƢƠNG 3: PHƢƠNG PHÁP VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 17 3.1 Vật liệu nghiên cứu 17 3.1.1 Chủng nấm Penicillium herquei (12C) 17 3.1.2 Hệ thống vector tách dòng vector biểu 17 3.1.3 Các chủng E coli 20 3.1.4 Các cặp mồi sử dụng 21 3.2 Hóa chất 21 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 22 3.3.1 Phƣơng pháp tách chiết RNA tổng số 22 3.3.2 Phƣơng pháp tổng hợp cDNA – phƣơng pháp RT-PCR 23 iv 3.3.3 Phƣơng pháp tách chiết DNA tổng số từ chủng nấm 12C 23 3.3.4 Phƣơng pháp tách dòng, biến nạp vào E coli 10G đọc trình tự 24 3.3.5 Phƣơng pháp phân tích trình tự DNA 25 3.3.6 Thiết kế vector tách dịng vector biểu mang gen PCBER-SDR mã hóa sinh tổng hợp enzyme khử phenylcoumaran benzylic ether 25 3.3.7 Kiểm tra biểu E coli 27 3.3.8 Kỹ thuật lai miễn dịch Western Blot 28 CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 4.1 Tách chiết DNA RNA tổng số từ chủng nấm Penicillium herquei 28 4.2 Kết khuếch đại gen PCBER-SDR đọc trình tự 29 4.3 Thiết kế vector tách dòng vector biểu cho gen PCBER-SDR mã hóa sinh enzyme khử phenylcoumaran benzylic ether 35 4.3.1 Thiết kế vector tách dòng cho gen PCBER-SDR mã hóa sinh enzyme khử phenylcoumaran benzylic ether 35 4.3.2 Thiết kế vector biểu cho gen PCBER-SDR mã hóa sinh enzyme khử phenylcoumaran benzylic ether 37 4.4 Kết biểu protein PCBER-SDR chủng biểu E coli BL21 43 4.5 Kết đánh giá biểu protein tái tổ hợp phƣơng pháp lai miễn dịch Western Blot 44 KIẾN LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 v DANH MỤC VIẾT TẮT Ký hiệu chữ viết tắt µl 12C Penicillium herquei Bp Base pair DAB Diaminobenzidine DIR Protein dirigent DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxyribo nucleotide triphosphate E coli Escherichia coli HRP Horseradish peroxidase 10 IgG Immunoglobulin G 11 Kb Kilobase 12 kDa Kilodalton 13 LB Luria-Bertani medium 14 mg Milligram 15 nm nanomet 16 OD Optical density 17 PBS Phosphate-buffered saline 18 PCR 19 PLR Pinoresinol-lariciresinol reductase 20 RNA Ribonucleic acid 21 RT-PCR 22 SDH 23 SDS-PAGE STT Chữ viết đầy đủ Microlitre Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) Reverse transcription polymerase chain reaction Secoisolariciresinol dehydrogenase Sodium dodecyl sulfate - polyacrylamide gel vi electrophoresis DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng Các loại nguồn cung cấp Podophyllotoxin Bảng Danh sách số chủng nấm nội sinh có khả sinh Podophyllotoxin Bảng Liệt kê cặp mồi đƣợc sử dụng nghiên cứu 21 vii DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 2.1 Cấu trúc hóa học Podophyllotoxin Hình 2.2 Con đƣờng sinh tổng hợp (-) - Podophyllotoxin P hexandrum 11 Hình 2.3 Dự đốn đƣờng sinh tổng hợp Podophyllotoxin vi nấm nội sinh 12 Hình 2.4 Con đƣờng tổng hợp từ Coniferyl alcohol đến matairesinol Podophyllum hexandrum Anthriscus Sylvestris 14 Hình 2.5 Phản ứng xúc tác DIR 15 Hình 2.6 Các phản ứng đƣợc xúc tác PLR từ F intermedia (PLR-FI1), T plicata (PLR-TP1 PLR-TP2), L Album (PLR-LA1), L Perenne (PLR-LP1) L Usitatissimum ( PLR-Lu1) PrRS từ A thaliana (ATPRR1 ATPRR2) 16 Hình 2.7 Phản ứng đƣợc xúc tác Secoisolariciresinol dehydrogenase (SDH) 17 Hình 3.1 Vector pJET cho q trình tách dịng đọc trình tự 18 Hình 3.2.Sơ đồ Topo TA Vector cho q trình tách dịng 19 Hình 3.3 Vector biểu pET21(a+) cho trình biểu vi khuẩn E coli BL21 20 Hình 3.4 Sơ đồ bƣớc tách chiết RNA từ chủng nấm Penicillium herquei (đã có cải biến bƣớc) 22 Hình 4.1 Hình ảnh điện di RNA DNA sau trình tách chiết 29 Hình 4.2 Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu (g4902Fw/g4902-Rv) tinh gel agarose 1,5% 30 Hình 4.3 Bản đồ chiến lƣợc tạo dịng vector pJET DNA đích 31 Hình 4.4 Kết PCR khuẩn lạc sau biến nạp từ cDNA DNA tổng số 32 Hình 4.5 Kết đọc trình tự cDNA DNA tổng số đƣợc tổng hợp từ mRNA từ chủng nấm 12C 34 Hình 4.6 Bản đồ chiến lƣợc ghép nối vector tách dịng Topo với gen đích 36 Hình 4.7 Kết PCR khuẩn lạc Topo/PCBER-SDR (điện di gel agarose 1%, Marker DNA 1kb) 37 viii Hình 4.6 Bản đồ chiến lược ghép nối vector tách dịng Topo với gen đích (Thermo sciencific) Hình 4.6, vector Topo đƣợc lựa chọn làm vector tách dòng nghiên cứu Đoạn gen đƣợc nối với vector Topo dựa vào Kit cloning Topo đƣợc nêu phần phƣơng pháp Đoạn gen PCBER-SDR sau thực phản ứng nối tiếp tục đƣợc chọn dịng dựa vào phƣơng pháp PCR khuẩn lạc Kết PCR khuẩn lạc đƣợc thể hình 4.7 36 Hình 4.7 Kết PCR khuẩn lạc Topo/PCBER-SDR (điện di gel agarose 1%, Marker DNA 1kb) Từ kết điện di (hình 4.7), chúng tơi khẳng định tạo đƣợc thành cơng vector tách dịng tái tổ hợp Topo/PCBER-SDR chuẩn bị cho trình thiết kế vector biểu 4.3.2 Thiết kế vector biểu cho gen PCBER-SDR mã hóa sinh enzyme khử phenylcoumaran benzylic ether Dịng vi khuẩn E coli 10G chứa vector tái tổ hợp Topo/PCBER-SDR sau nuôi lỏng qua đêm đƣợc tách plasmid tinh Sản phẩm plasmid chứa vector tách dòng Topo/PCBER-SDR vector pET21(a+) đƣợc sử dụng để xử lý với hai enzyme cắt giới hạn BamHI HindIII Sau trình xử lý kết thúc, sản phẩm cắt đƣợc kiểm điện di DNA gel agarose 1% đƣợc thơi gel tinh sau 37 Hình 4.8 Kết điện di thơi gel plasmid tái tổ hợp Topo/PCBER-SDR vector biểu pET21(a+) gel agarose 1% với thể tích giếng 50 µl 10 µl loading dye 6x, sử dụng marker DNA 1kb A Điện di gel plasmid tái tổ hợp Topo/PCBER-SDR xử lý enzyme cắt giới hạn BamHI HindIII B Điện di gel vector pET21(a+) xử lý enzyme cắt giới hạn BamHI HindIII Kết điện di từ hình 4.8A 4.8B cho thấy, trình cắt enzyme đạt đƣợc chất lƣợng tối ƣu sau đo Nanodrop đạt đƣợc độ tinh cao (sản phẩm plasmid vector pET21(a+) đạt độ tinh A260/A280 > 1.8) với sản phẩm điện di băng vạch sáng rõ kích thƣớc dự đoán (đối với vector biểu pET21(a+) 5443bp plasmid tái tổ hợp Topo/PCBERSDR 825bp 825bp) Sau gel, sản phẩm đƣợc điện di kiểm tra lần gel agarose 1% để xác định chắn rõ ràng nồng độ cho thí nghiệm Hình 4.9 Kết điện di kiểm tra plasmid tái tổ hợp Topo/PCBER-SDR vector biểu pET21(a+) gel agarose 1% với thể tích giếng µl µl loading dye Purple 6x, sử dụng marker DNA 1kb 38 A Điện di gel plasmid tái tổ hợp Topo/PCBER-SDR xử lý enzyme cắt giới hạn BamHI HindIII B Điện di gel vector biểu pET21(a+) xử lý enzyme cắt giới hạn BamHI HindIII Đối với hình 4.9A 4.9B, nhận thấy đƣợc băng điện di lên sáng rõ với kích thƣớc dự đốn (đối với vector biểu pET21(a+) 5443bp plasmid tái tổ hợp Topo/PCBER-SDR 825bp) Dựa vào đồ vector biểu pET21(a+) trình tự đoạn gen PCBER-SDR, thực thiết kế đoạn gen vector với hai đầu dính BamHI HindIII (hình 4.10) Sau thiết kế thành cơng đoạn gen vector với hai đầu dính hai enzyme cắt giới hạn, thực phƣơng pháp ligation (ghép nối) hai đoạn gen với thực chọn dịng dựa vào PCR khuẩn lạc 39 Hình 4.10 Bản đồ thiết kế vector biểu pET21(a+)/PCBER-SDR (SnapGene) Sau xử lý thành công hai enzyme BamHI HindIII đoạn gen vector biểu pET21(a+), đoạn gen vector đƣợc nối với nhờ enzyme nối T4 DNA ligase đƣợc nối theo tỷ lệ 1:7 (vector biểu : plasmid chứa đoạn gen) Sản phẩm nối đƣợc biến nạp vào chủng biểu E coli BL21, khuẩn đƣợc ni qua đêm 37oC, đƣợc chọn dịng phƣơng pháp PCR khuẩn lạc với cặp mồi đặc hiệu g4902-BamHI-Fw T7 terminator-Rv Kết qủa trình chọn dịng đƣợc thể hình 4.11 40 Hình 4.11 Kết PCR khuẩn lạc với cặp mồi g4902-BamHI-Fw T7 terminator-Rv để chọn dòng vi khuẩn E coli BL21 Từ hình 4.11, kết PCR khuẩn lạc cặp mồi g4902-BamHI-Fw T7 terminator-Rv cho thấy đƣợc đoạn gen PCBER-SDR đƣợc nối thành công vào vector biểu pET21(a+) trình ghép nối đạt hiệu suất cao, băng điện di sáng đặc hiệu, kích thƣớc với tính tốn lý thuyết (khoảng 850bp) khơng có tƣợng dƣơng tính giả (bao gồm có dịng có dịng lên băng điện di kích thƣớc) Dịng đƣợc chọn đƣợc tách plasmid Plasmid sau đƣợc tách trở thành DNA khuôn phƣơng pháp PCR để kiểm tra chắn vector plasmid đƣợc nối với plasmid chứa đoạn gen mong muốn Tổng thể tích phản ứng 15 µl bao gồm: Master mix 2x, cặp mồi đặc hiệu g4902-Fw g4902-Rv, DNA khn 91.2 ng/µl Kết điện di đƣợc thể hình 4.12A dƣới 41 Hình 4.12 Kết qua cắt kiểm tra vector pET21(a+) tái tổ hợp xử lý với hai enzyme cắt giới hạn BamHI HindIII Hình 4.13 Kết điện di plasmid tái tổ hợp pET21(a+)/PCBER-SDR kiểm tra qua phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu g4902-Fw g4902-Rv Để khẳng định trình xử lý với hai enzyme cắt giới hạn đạt hiệu tốt, xử lý sản phẩm plasmid tái tổ hợp pET21(a+)/PCBER-SDR với hai enzyme BamHI HindIII Sau cắt kiểm tra hai enzyme cắt giới hạn, có xuất hai băng vạch rõ ràng bao gồm băng điện di kích thƣớc 825bp băng DNA băng điện di 5443bp vector biểu pET21(a+), đồng thời 42 kích thƣớc băng với dự đốn lý thuyết (hình 4.12) Plasmid sản phẩm q trình chọn dịng vi khuẩn E coli BL21 đƣợc sử dụng đọc trình tự với hai cặp mồi g4902-BamHI-Fw T7 terminator-Rv Hình 4.13 cho thấy đƣợc plasmid tái tổ hợp pET21(a+)/PCBER-SDR thể băng điện di với kích thƣớc theo tính tốn ban đầu 825bp Điều khẳng định đƣợc đoạn gen PCBER-SDR đƣợc biến nạp thành công vào chủng E coli BL21 4.4 Kết biểu protein PCBER-SDR chủng biểu E coli BL21 Dòng vi khuẩn BL21 mang vector tái tổ hợp pET21(a+)/PCBER-SDR đƣợc chọn để nuôi cảm ứng IPTG Protein tái tổ hợp biểu vi khuẩn E coli BL21 đƣợc kiểm tra phƣơng pháp điện di SDS-PAGE nhuộm Coomassie Brilliant Blue (Thermo scientific, Hoa Kỳ) Hình 4.14 Kết điện di pha tan (1), pha kết tủa (2), pha cặn lại (3), đối chứng dương – BSA (4000 ng) (4), sử dụng marker protein (10 kDa – 250 kDa) 43 Từ hình 4.14, mức độ biểu E coli chủng BL21 có biểu hầu hết pha Đặc biệt nhận thấy, pha tủa có biểu protein tái tổ hợp mạnh kích thƣớc dự đốn 33 kDa Đối với pha tan, lƣợng protein biểu yếu pha tủa pha cặn gần nhƣ khơng nhìn thấy biểu protein tái tổ hợp Bản điện di SDS-PAGE đƣợc nhuộm với Comassie Blue cịn số băng điện di khơng đặc hiệu pha tan cặn 4.5 Kết đánh giá biểu protein tái tổ hợp phƣơng pháp lai miễn dịch Western Blot Hình 4.15 Kết lai miễn dịch Western Blot pha tan (1), pha kết tủa (2), pha cặn lại (3), đối chứng dương (196,25 ng) (4) Sử dụng marker protein (10 kDa – 250 kDa) 44 Do protein tái tổ hợp PCBER-SDR đƣợc thiết kế nối với đuôi Histidine-tag đầu C, nên nghiên cứu này, kháng thể kháng Histidine-tag đƣợc sử dụng phản ứng lai miễn dịch để diện gen PCBER-SDR đƣợc xác nhận Đồng thời sử dụng anti-mouse IgG có gắn HRP (horseradish Peroxidase) làm kháng thể để cảm ứng với chất DAB để lai miễn dịch chuyển sang màu nâu Từ hình 4.15, lai miễn dịch Western blot đƣợc sử dụng để xác định đƣợc mức độ biểu protein đồng thời băng điện di đặc hiệu Tất pha bao gồm pha tan, pha tủa pha cặn có biểu kích thƣớc 33 kDa kết lai miễn dịch thể với kích thƣớc tính tốn lý thuyết 33 kDa Tuy nhiên, lai miễn dịch Western blot có pha tủa (đƣợc siêu âm mơi trƣờng binding buffer có bổ sung ure) đƣợc biểu mạnh (hình 4.12) Mức độ biểu protein pha tan yếu mức độ biểu pha tủa pha cặn xác định phần xác cịn sót lại vi khuẩn dẫn đến biểu protein Mặc dù, mức độ biểu protein pha tủa có số ƣu điểm định nhƣng protein đƣợc tạo thƣờng dễ bị hoạt tính sinh học bị cấu hình tự nhiên ban đầu trình tái tạo lại cấu trúc tƣơng đối phức tạp, việc khiến cho việc tinh protein đƣợc dễ dàng (protein dạng hòa tan dễ dàng việc tinh sạch) Do vậy, việc tối ƣu hóa hoạt tính pha tan cần thiết để phục vụ cho nghiên cứu sau Đối chứng dƣơng đƣợc sử dụng để kiểm tra trình chuyển màng lai miễn dịch diễn thành cơng Qua q trình biểu phƣơng pháp điện di SDS-PAGE kết đánh giá biểu protein tái tổ hợp phƣơng pháp lai miễn dịch Western Blot cho thấy đƣợc mức độ biểu protein tái tổ hợp PCBER-SDR vi khuẩn E coli chủng BL21 mạnh Sự biểu mạnh cho thấy đƣợc khả sinh enzyme khử phenylcoumaran benzylic ether chủng nấm Penicillium herquei cao tiền đề cho phát triển việc nghiên cứu sản xuất dẫn xuất chống ung thƣ từ nguồn vi nấm nội sinh có khả sinh podophyllotoxin 45 KIẾN LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Phân lập thành công gen PCBER-SDR từ mẫu nấm Penicillium herquei (12C) Đã thiết kế thành công đƣợc vector tách dòng vector biểu mang gen PCBER-SDR mã hóa sinh enzyme like phenylcoumaran benzylic ether reductase Đã kiểm tra đƣợc mức độ biểu chủng E coli BL21 Kiến nghị Qua trình nghiên cứu kết đạt đƣợc, để tiếp tục phát triển kết nghiên cứu hƣớng đến nghiên cứu mới, chúng tơi có số kiến nghị nhƣ sau: Tiếp tối ƣu quy trình biểu protein PCBER-SDR chủng E coli BL21 phục vụ cho tinh kiểm tra hoạt tính protein Mở rộng nghiên cứu enzyme khác đƣờng sinh tổng hợp Podophyllotoxin 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bộ Y Tế (2021) Tình hình ung thƣ Việt Nam https://moh.gov.vn/hoat-dong-cuadia-phuong/-/asset_publisher/gHbla8vOQDuS/content/tinh-hinh-ung-thu-tai-viet-nam Truy cập ngày: 10/07/2022 Tiếng Anh Abd-Elsalam K., Hashim A (2013) Hidden fungi as microbial and nano-factories for anticancer agents Fungal Genomics Biol Alam MA, Naik PK Impact of soil nutrients and environmental factors on podophyllotoxin content among 28 podophyllum hexandrum populations of Northwestern Himalayan region using linear and nonlinear approaches Commun Soil Sci Plant Anal 2009 Ayres DC, Loike JD Lignans: Chemical, Biological and Clinical Properties vol 30 Cambridge, NewYork, Port Chester, Melbourne, Sydney: Cambridge University Press; 1990 Bayindir Ü, Alfermann AW, Fuss E Hinokinin biosynthesis in Linum corymbulosum Reichenb Plant J 2008 Beaumier C.M., Gillespie P.M., Hotez P.J., Bottazzi M.E New vaccines for neglected parasitic diseases and dengue 2013 Berkowitz D B., Choi S., Maeng J H (2000) Enzyme-assisted asymmetric total synthesis of (–)-podophyllotoxin and (–)-picropodophyllin J Org Chem 65, 847–860 Canel C, Moraes RM, Dayan FE, Ferreira D Podophyllotoxin Phytochemistry 2000 Cao L., Huang J., Li J (2007) Fermentation conditions of Sinopodophyllum hexandrum endophytic fungus on production of podophyllotoxin Chandra S (2012) Endophytic fungi: novel sources of anticancer lead molecules Appl Microbiol Biotechnol 95, 47–59 10 Chang WC, Yang ZJ, Tu YH, Chien TC Reaction mechanism of a nonheme iron enzyme catalyzed oxidative cyclization via C-C bond formation Org Lett 2019 11 Chemler JA, Koffas MA Metabolic engineering for plant natural product biosynthesis in microbes Curr Opin Biotechnol 2008 12 Chen Z, Sun X, Li Y, Yan Y, Yuan Q Metabolic engineering of Escherichia coli for microbial synthesis of monolignols Metab Eng 2016 13 Christel L C Seegers, Rita Setroikromo and Wim J Quax (2017) Towards Metabolic Engineering of Podophyllotoxin Production 14 Cosima B.I.von Heimendahl, Katrin M Schäfer, Patrik Eklund, Rainer Sjöholmb, Thomas J.Schmid, Elisabeth Fuss (2005) Pinoresinol–lariciresinol reductases with different stereospecificity from Linum album and Linum usitatissimu 15 Cravens A, Payne J, Smolke CD Synthetic biology strategies for microbial biosynthesis of plant natural products Nat Commun 2019 47 16 Davin L B., Lewis N G (2000) Dirigent proteins and dirigent sites explain the mystery of specificity of radical precursor coupling in lignan and lignin biosynthesis Plant Physiol 123, 453–462 17 Decembrino D, Girhard M, Urlacher VB Use of Copper as a trigger for the in vivo activity of E coli laccase CueO: A simple tool for biosynthetic purposes ChemBioChem 2021 18 Decembrino D, Ricklefs E, Wohlgemuth S, Girhard M, Schullehner K, Jach G, Urlacher VB Assembly of plant enzymes in E.coli for the production of the valuable (−)−podophyllotoxin precursor (−)−pluviatolide ACS Synth Biol 2020 19 Decembrino D., Raffaele, A., Knöfel, R., Girhard, M., & Urlacher, V B (2021) Synthesis of (-)-deoxypodophyllotoxin and (-)-epipodophyllotoxin via a multi-enzyme cascade in E coli Microbial cell factories, 20(1), 183 20 Escudero-Martínez, J M., Pérez-Pertejo, Y., Reguera, R M., Castro, M Á., Rojo, M V., Santiago, C., Abad, A., García, P A., López-Pérez, J L., San Feliciano, A., & Balaña-Fouce, R (2017) Antileishmanial activity and tubulin polymerization inhibition of podophyllotoxin derivatives on Leishmania infantum 21 Eyberger A L., Dondapati R., Porter J R (2006) Endophyte fungal isolates from Podophyllum peltatum produce podophyllotoxin J Nat Prod 69, 1121–1124 22 Guerram M, Jiang ZZ, Zhang LY Podophyllotoxin, a medicinal agent of plant origin: past, present and future Chin J Nat Med 2012 23 Hazra, S., Bhattacharyya, D., & Chattopadhyay, S (2017) Methyl Jasmonate Regulates Podophyllotoxin Accumulation in Podophyllum hexandrum by Altering the ROS-Responsive Podophyllotoxin Pathway Gene Expression Additionally through the Down Regulation of Few Interfering miRNAs Frontiers in plant science, 8, 164 24 Heinonen S, Nurmi T, Liukkonen K, Poutanen K, Wähälä K, Deyama T, et al In vitro metabolism of plant lignans: new precursors of mammalian lignans enterolactone and enterodiol J Agric Food Chem 2001;49:3178-86 25 Hemmati S, Heimendahl CBI von, Klaes M, Alfermann AW, Schmidt TJ, Fuss E, et al Pinoresinol-Lariciresinol reductases with opposite enantiospecificity determine the enantiomeric composition of lignans in the different organs of Linum usitatissimum L Planta Med 2010 26 Hemmati S, Schmidt TJ, Fuss E (+)-Pinoresinol/(−)-lariciresinol reductase from Linum perenne Himmelszelt involved in the biosynthesis of justicidin B FEBS Lett 2007 27 Ionkova I, Antonova I, Momekov G, Fuss E Production of podophyllotoxin in Linum linearifolium in vitro cultures Pharmacogn Mag 2010 28 Kim KW, Moinuddin SGA, Atwell KM, Costa MA, Davin LB, Lewis NG Opposite stereoselectivities of dirigent proteins in arabidopsis and schizandra species J Biol Chem 2012 29 Kour A., Shawl A S., Rehman S., Sultan P., Qazi P H., Suden P., et al (2008) Isolation and identification of an endophytic strain of Fusarium oxysporum producing podophyllotoxin from Juniperus recurva World J Microbiol Biotechnol 24, 1115– 1121 48 30 Lata H, Mizuno CS, Moraes RM, in Protocols for in Vitro Cultures and Secondary Metabolite Analysis of Aromatic and Medicinal Plants (Springer, 2009) 31 Lau, W., & Sattely, E S (2015) Six enzymes from mayapple that complete the biosynthetic pathway to the etoposide aglycone Science (New York, N.Y.), 349(6253), 1224–1228 32 Lewis NG, Davin LB, Sarkanen S Lignin and lignan biosynthesis: distinctions and reconciliations 1998 33 Leyda Cortés-Maldonado, Jaime Marcial-Quino, Sẳl Gómez-Manzo, Francisco Fierro, Araceli Tomasini (2020) A method for the extraction of high quality fungal RNA suitable for RNA-seq, Journal of Microbiological Methods, Volume 170 34 Li J., Sun H., Jin L., Cao W., Zhang J., Guo C.-Y., et al (2013) Alleviation of podophyllotoxin toxicity using coexisting flavonoids from Dysosma versipellis 35 Marques, J V., Kim, K W., Lee, C., Costa, M A., May, G D., Crow, J A., Davin, L B., & Lewis, N G (2013) Next generation sequencing in predicting gene function in podophyllotoxin biosynthesis The Journal of biological chemistry, 288(1), 466–479 36 Merzouki A, Buschmann MD, Jean M, Young RS, Liao S, Gal S, et al Adva-27a, a novel podophyllotoxin derivative found to be effective against multidrug resistant human cancer cells Anticancer Res 2012;32:4423-32 37 Min T, Kasahara H, Bedgar DL, Youn B, Lawrence PK, Gang DR, et al Crystal structures of pinoresinol-lariciresinol and phenylcoumaran benzylic ether reductases and their relationship to isoflavone reductases J Biol Chem 2003 38 Moss GP Nomenclature of lignans and neolignans (IUPAC Recommendations 2000) Pure Appl Chem 2000;72:1493-523 39 Nadeem M., Ram M., Alam P., Ahmad M M., Mohammad A., Al-Qurainy F., et al (2012) Fusarium solani, P1, a new endophytic podophyllotoxin-producing fungus from roots of Podophyllum hexandrum Afr J Microbiol Res 6, 2493–2499 40 Nakatsubo T, Mizutani M, Suzuki S, Hattori T, Umezawa T Characterization of Arabidopsis thaliana pinoresinol reductase, a new type of enzyme involved in lignan biosynthesis J Biol Chem 2008 41 Pickel B, Constantin MA, Pfannstiel J, Conrad J, Beifuss U, Schaller A An enantiocomplementary dirigent protein for the enantioselective laccase-catalyzed oxidative coupling of phenols Angew Chemie Int Ed 2010 42 Puri S C., Nazir A., Chawla R., Arora R., Riyaz-Ul-Hasan S., Amna T., et al (2006) The endophytic fungus Trametes hirsuta as a novel alternative source of podophyllotoxin and related aryl tetralin lignans J Biotechnol 122, 494–510 43 Reguera R.M., Calvo-Álvarez E., Álvarez-Velilla R., Balaña-Fouce R Target-based vs phenotypic screenings in Leishmania drug discovery: a marriage of convenience or a dialogue of the deaf? Int J Parasitol Drugs Drug Resist 2014 44 Rutledge PJ, Challis GL Discovery of microbial natural products by activation of silent biosynthetic gene clusters Nat Rev Microbiol 2015 45 Shah, Z., Gohar, U F., Jamshed, I., Mushtaq, A., Mukhtar, H., Zia-Ui-Haq, M., Toma, S I., Manea, R., Moga, M., & Popovici, B (2021) Podophyllotoxin: History, Recent Advances and Future Prospects Biomolecules, 11(4), 603 49 46 Shiro Suzuki, Toshiaki Umezawa (2007) Biosynthesis of lignans and norlignans 47 Stähelin HF, von Wartburg A The chemical and biological route from podophyllotoxin glucoside to etoposide: ninth cain memorial award lecture Cancer Res 1991;51: 5-15 48 Ting CP, Maimone TJ CH bond arylation in the synthesis of aryltetralin lignans: a short total synthesis of podophyllotoxin Angew Chem Int Ed Engl 2014 49 Umezawa T Diversity in lignan biosynthesis Phytochem Rev 2003;2:371-90 50 Uzma, F., Mohan, C D., Hashem, A., Konappa, N M., Rangappa, S., Kamath, P V., Singh, B P., Mudili, V., Gupta, V K., Siddaiah, C N., Chowdappa, S., Alqarawi, A A., & Abd Allah, E F (2018) Endophytic Fungi-Alternative Sources of Cytotoxic Compounds: A Review Frontiers in pharmacology, 9, 309 51 von Heimendahl CBI, Schäfer KM, Eklund P, Sjöholm R, Schmidt TJ, Fuss E Pinoresinol–lariciresinol reductases with different stereospecificity from Linum album and Linum usitatissimum Phytochemistry 2005 52 Wang T., Ma Y.-X., Ye Y.-H., Zheng H.-M., Zhang B.-W., Zhang E.-H (2017) Screening and identification of endophytic fungi producing podophyllotoxin compounds in Sinopodophyllum hexandrum stems 53 Wikipedia (2022) Podophyllotoxin https://en.wikipedia.org/wiki/ Podophyllotoxin Truy cập ngày: 10/07/2022 54 Wikipedia (2022) Protein Dirigent https://en.wikipedia.org/wiki/Dirigent protein Truy cập ngày: 10/07/2022 55 Xia Z.-Q., Costa M A., Pelissier H C., Davin L B., Lewis N G (2001) Secoisolariciresinol dehydrogenase purification, cloning, and functional expression Implications for human health protection J Biol Chem 276, 12614–12623 56 Xia Z.-Q., Costa M A., Proctor J., Davin L B., Lewis N G (2000) Dirigent-mediated podophyllotoxin biosynthesis in Linum flavum and Podophyllum peltatum Phytochemistry 55, 537–549 57 Yamaguchi Hi, Arimoto M, Nakajima S, Tanoguchi M, Fukada Y Studies on the constituents of the seeds of Hernandia ovigera L V Syntheses of epipodophyllotoxin and podophyllotoxin from desoxypodophyllotoxin Chem Pharm Bull (Tokyo) 1986;34:2056-60 58 Youn B, Moinuddin SGA, Davin LB, Lewis NG, Kang C Crystal structures of apoform and binary/ternary complexes of podophyllum secoisolariciresinol dehydrogenase, an enzyme involved in formation of health-protecting and plant defense lignans J Biol Chem 2005 59 Zi, C T., Yang, L., Xu, F Q., Dong, F W., Yang, D., Li, Y., Ding, Z T., Zhou, J., Jiang, Z H., & Hu, J M (2018) Synthesis and anticancer activity of dimeric podophyllotoxin derivatives Drug design, development and therapy, 12, 3393–3406 60 Zong G, Barber E, Aljewari H, Zhou J, Hu Z, Du Y, et al Total synthesis and biological evaluation of ipomoeassin F and its unnatural 11 R -epimer J Org Chem 2015 50