CÁC PHƯƠNG PHÁP xác ĐỊNH dư LƯỢNG CHLORAMPHENICOL TRONG THỦY sản

Bài trình bày về "CÁC PHƯƠNG PHÁP xác ĐỊNH dư LƯỢNG CHLORAMPHENICOL TRONG THỦY sản"

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

MỞ ĐẦU v

Chương 1 TỔNG QUAN VỀ CHLORAMPHENICOL 1

1.1 Tính chất hóa lí 2

1.2 Nguồn gốc: 2

1.3 Phân bố 2

1.4 Cơ chế kháng khuẩn 3

1.5 Tác dụng và tác hại: 3

1.5.1 Tác dụng 3

1.5.2 Tác hại 3

1.6 Tiêu chuẩn 4

Chương 2 CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG CAP TRONG THỦY SẢN 5

2.1 Tổng quan về sự phát triển của những phương pháp phân tích lượng dư CAP trong thủy sản 6

2.2 Sắc kí lỏng (LC) 7

2.2.1 LC/APCI/MS [3] 7

2.2.1.1Chuẩn bị mấu 7

2.2.1.2 Cài đặt thiết bị 7

2.2.1.3 Kết quả 8

2.2.2 LC/MS/MS [7] 8

2.2.2.1Thiết bị: 8

2.2.2.2 Điều kiện phân tích: 8

2.2.2.3 Kết quả: 9

2.2.3 LC/MS/MS ESI (-)[2] 10

2.2.3.1 Quy trình chuẩn bị mẫu 10

2.2.3.2 Điều kiện thiết bị 11

2.2.3.3 Kết quả: 12

2.3 Sắc kí khí (GC) 15

2.3.1 GC/MS/MS [1] 16

2.3.1.1 Chuẩn bị mẫu 16

2.3.1.2 Thông số 17

2.3.1.3 Kết quả 18

2.4 Phương pháp Kít Elisa [4]: 19

2.4.1 Tóm tắt quy trình 19

2.4.2 Kết quả: 20

2.4.3 Kết luận 24

2.4.4 Ưu và nhược điểm 24

KẾT LUẬN 25

TÀI LIỆU THAM KHẢO 26

Danh mục hình ảnh

Hình 1 1: Cấu trúc phân tử CAP 2

Hình 2 1: Kết quả phân tích CAP 8

Hình 2 2: Đường chuẩn CAP (0.1 – 1 ppb) 9

Hình 2 3: Phổ đồ ioin m/z 151.9 ở nồng độ CAP 10

Hình 2 4: Phân tích CAP (5 ng/mL) 12

Hình 2 5: Lượng thấp nhất (0.1 ng/mL hoặc 0.01 ng/g của mô tôm) của tiêu chuẩn chiết của CAP (321.2/152) và tiêu chuẩn nội chuẩn (326/157) 13

Hình 2 6: Đường cong tiêu chuẩn CAP từ 0.1 ng/mL đến 200 ng/mL 14

Hình 2 7: Đường cong hiệu chuẩn chiết xuất tuyến tính trong khoảng nồng độ từ 0.1 đến 200 ng/mL (0.01 đến 20 ng/g tôm) với giá trị R 2 = 0.9997 14

Hình 2 8: Quy trình chuẩn bị mẫu 16

Hình 2 9: Nguyên tắc phân mảnh của CAP-TMS ether trong chế độ NCI: (1) m/z 304, (2) m/z 322; (3) m/z 358; (4) m/z 394; và (5) m/z 430 18

Hình 2 10: Xác định CAP 18

Danh mục bảng biểu Bảng 1 1: Yêu cầu của các thị trường về giới hạn phát hiện của CAP 4

Bảng 2 1: Sự phát triển của những phương pháp phân tích dư lược CAP trong thủy sản 6

Bảng 2 2: Thông số GC cho việc phân tích CAP bằng GC-MS 2 17

Bảng 2 3: Thông số khối phổ cho phân tích CAP bằng GC-MS 2 17

Bảng 2 4: Kết quả tỉ lệ dương tính giả trên các mẫu 19

Bảng 2 5: Tương quan giữa nồng độ CAP xác định bằng ELISA và tỉ lệ dương giả 20

Biểu đồ 2 1: Mẫu tôm 21

Biểu đồ 2 2: Cá fillet 22

Biểu đồ 2 3: Mẫu nhuyễn thể 22

Biểu đồ 2 4: Mẫu ghẹ, cua 22

Biểu đồ 2 5: Mẫu thủy sản tẩm bột 23 Biểu đồ 2 6: Mẫu chả giò, há cảo 23 Biểu đồ 2 7: Mẫu đồ khô 23

Ký hiệu

ACPI: atmospheric pressure chemical ionization

ECD: đầu dò cộng kết điện tử

ESI: ion electronspray

ESI (-): negative ion electronspray

GC: sắc kí khí

LC: sắc kí lỏng

LOD: giới hạn phát hiện

MS: khối phổ

MỞ ĐẦU

Chloramphenicol (CAP) có đặc tính kháng khuẩn nên thường được sử dụng

để chữa bệnh trong tôm và được sử dụng trực tiếp để bảo quản nguyên liệu Tuy nhiên, việc sử dụng CAP không đúng cách gây ra hiện tượng kháng thuốc và tích

tụ trong thủy sản gây nên những nguy hiểm cho sức khỏe con người Hiện nay, ở Việt Nam đã có nhiều loài thủy hải sản đã bị cảnh báo và cấm xuất khẩu do sử dụng CAP quá liều lượng

Vì vậy việc xác định CAP trong thủy sản là cần thiết để tránh gây tác hại cho người tiêu dùng

Trong tiểu luận này, em xin trình bày về “Những phương pháp xác định hàm lượng Chlorophenicol trong thủy sản”

Chương 1 TỔNG QUAN VỀ CHLORAMPHENICOL

1.2 Nguồn gốc:

Năm 1947 Burlcholder đã phát hiện ra CAP từ môi trường nuôi cấy xạ khuẩn có tên là Streptomyces Veneduela Chỉ hai năm sau người ta đã tổng hợp được kháng sinh này Dưới tác động của của quá trình chuyển hóa, CAP có thể chuyển hóa thành dạng D-threo-2-amino-(p-nitrophenyl)-1,3-propanediol và dạng D-glucuronide Gần 90% lượng CAP sẽ bài tiết bằng đường niệu dưới dạng chuyển hóa, 15% bài tiết dưới dạng ban đầu

1.3 Phân bố

CAP được phân bố rộng khắp trong cơ thể từ tim, gan, phổi thận, lá lách, huyết thanh, huyết tương đến dịch màng phổi, dịch cổ trướng, tinh dịch, nước bọt, nước tiểu Nó có khả năng thẩm thấu nhanh qua dạ dày và phân tán nhanh trong cơ thể CAP cũng rất dễ hấp thụ vào cơ thể nên khi dùng CAP chữa bện hoăc thêm vào thức ăn gia súc sẽ tồn dư trong thịt, sữa, trứng

Khi thải vào môi trường, CAP hiện diện dưới dạng thể khí là chủ yếu CAP phát tán trong không khí chủ yếu bởi lắng khô, bám trên các lớp trầm tích và chất lắng sinh học sống trong nước Khả năng thay đổi của CAP trong đất cao nhưng nó không bốc hơi, kể cá đất khô lẫn đất ẩm Dưới tác động phân giải của vi sinh vật,

CAP có thể bị phân giải trong đất và nước CAP cũng bị phân giải bởi các vi sinh

vật đường ruột theo đường phân hủy thành gốc amine Sự hấp thu và bài tiết: CAP

được hấp thu qua hệ tiêu hóa, và được được bài tiết chủ yếu qua thận

1.4 Cơ chế kháng khuẩn

CAP có thể xâm nhập vào tế bào vi khuẩn và gắn với phần 50S của Ribosom ức chế tổng hợp protein làm cho vi khuẩn không tổng hợp được protein dẫn đến yếu đi và chết Trong vi lập thể của động vật có vú cũng có Ribosom 50S nên sẽ bị ảnh hưởng Điều này lý giải độc tính cao của CAP

1.5 Tác dụng và tác hại:

1.5.1 Tác dụng

CAP là kháng sinh có hoạt phổ rộng, tác dụng lên phần lớn các vi khuẩn và một số loại virut CAP có nhiều khả năng kháng khuẩn hơn Peniciline và Steptomycine, diệt được nhiều loai vi khuẩn Gram dương và Gram âm, xoắn khuẩn Ricketsia và với cả những vi khuẩn đã kháng Peniciline và Streptomycine

Ở người, CAP được dùng để chữa thương hàn, viêm não, ít được dùng cho các trường hợp khác do độc tính cao Ngoài ra, CAP còn được bổ sung vào thuốc

mỡ bôi mắt nhằm điều trị bệnh nhiễm trùng mắt như viêm kết mạc, viêm giác mạc hoặc có trong thành phần thuốc mỡ bôi cục bộ để điều trị vết thương ngoài da và tai Đôi khi CAP được điều chế ở dạng viên uống hoặc có thể tiêm vào tĩnh mạch trị các bệnh

Trong thú y, CAP được cho vào thức ăn của gia súc để phòng bệnh và cho vào môi trường sống để chữa bệnh

Tuy nhiên, do có một số hiệu ứng phụ không mong muốn nên việc ứng dụng CAP trong điều trị có xu hướng giảm dần

1.5.2 Tác hại

Khi sử dụng trong chăn nuôi, một phần kháng sinh chưa đào thải sẽ tồn dư sang sản phẩm thực phẩm và một lượng đáng kể trong thức ăn thừa sẽ thoát ra và lắng động vào môi trường, theo thời gian có thể dẫn tới các biến đổi về hệ sinh thái Vì CAP có thể tồn tại lâu trong thực phẩm, khi thường xuyên sử dụng thực phẩm này, con người có thể gặp những nguy cơ như: hệ sinh vật cũng như quá

trình tổng hợp vitamin ở ruột bị thay đổi làm cho các vi khuẩn gây bệnh lờn thuốc

Do đó muốn tiêu diệt được cần phải có liều kháng sinh càng ngày càng cao khiến người bị nhiễm bệnh ngày càng nặng hơn, khó chữa trị hơn Ngoài ra, CAP đi vào

cơ thể trẻ sơ sinh có thể gây ra triệu chứng xanh tái dần rồi trị tim mạch và tử vong (do chưa có đủ men gan để khử CAP); suy tủy, phá hủy cấu trúc tủy xương dẫn đến thiếu máu, có thể dẫn đến tử vong; có thể tương tác với AND, ARN dẫn đến những sai lệch về di truyền; gây bạch cầu, giảm hồng cầu, sự thay đổi thành phần máu xảy ra nếu hàm lượng CAP trong máu lớn hơn 25µg/ml; gây viêm lưỡi, miệng

do thiếu vitamin B2 và PP, bồn nôn, ói, tiêu chảy

Vì vậy việc xác định CAP trong thủy sản là cần thiết để tránh gây tác hại cho người tiêu dùng

1.6 Tiêu chuẩn

Bảng 1 1 : Yêu cầu của các thị trường về giới hạn phát hiện của CAP

Kháng sinh Kí hiệu Giới hạn phát hiện tối thiểu

Chương 2

CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG CAP TRONG THỦY SẢN

2.1 Tổng quan về sự phát triển của những phương pháp phân tích lượng dư CAP trong thủy sản

Bảng 2 1:Sự phát triển của những phương pháp phân tích dư lược CAP trong thủy sản

Phương pháp Thực phẩm nền LOD (µg/kg) Tham khảo

LC-MS Một số loài thủy sản 0.1 Van de Riet (1992)

Sự phát triển của đầu dò ion hóa áp suất khí quyển (atmospheric pressure ionization - API) kết hợp với HPLC đã trở thành kĩ thuật đáng tin cậy và phổ biến nhất trong phân tích lượng dư CAP Sự kết hợp này của sắc kí lỏng và khối phổ (LC-MS) có thể định tính và định lượng những hợp chất phân cực không bay hơi (như CAP) mà không cần đồng phân hóa

Neuhaus và những cộng sự đã mô tả phương pháp LC-MS/MS với LOD 0.08 µg/kg và LOQ 0.3 µg/kg trong tôm Mottier và những cộng sự đã phát triển phương pháp dùng LC(ESI)-MS/MS cho thủy sản với giá trị LOD và LOD tương ứng là 0.003 µg/kg và 0.01 µg/kg

Impens và những cộng sự đã mô tả phương pháp sàn lọc bằng ELISA và xác định dư lượng CAP bằng GC-MS/MS và LC-MS/MS cả hai kĩ thuật đều cho LOD là 0.1 µg/kg

Ngày nay, GC-MS và LC-MS/MS là kĩ thuật đáng tin cậy nhất để xác định

dư lượng CAP trong thủy sản nói riêng và trong mô động vật nói chung

2.2 Sắc kí lỏng (LC)

2.2.1 LC/APCI/MS [3]

2.2.1.1Chuẩn bị mấu

1 Cân 5 g thịt cá và 5 g sodium sulfate

2 Thêm 10 mL ethyl acetate

3 Đồng nhất trong 20 giây

4 Ly tâm mẫu trong 5 phút tại 6000 rpm

5 Tách cặn và lặp lại bước 2 đến 4

6 Kết hợp 2 dung dịch chiết từ ethyl acetate và sấy khô với rotovap tại 400C

7 Hoàn nguyên với 1 mL acetonitrile, thêm 1 mL, lắc và loại bỏ lớp hexane

8 Thêm 1 mL hexane khác, lắc và loại bỏ lớp hexane

9 Sấy khô acetonitrile và hoàn nguyên với 10% acetonitrile trong 10mM ammonium acetate

10 Lọc vào lọ đựng mẫu tự động

2.2.1.2 Cài đặt thiết bị

* Điều kiện LC

Cột: Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18, 3x 150 mm, 5 µm

Dung môi A: Nước với 10 mM ammonium acetate

Dung môi B: Methanol

Gradient: 90/10 A/B 15 phút đến 70/30A/B

Nhiệt độ cột: 400C

Thể tích mẫu: 20 µL

Tốc độ dòng: 0.5 mL/phút

* Điều kiện MSD

Ion hóa: APPI (Negative)

Chế độ quét: 100-400 m/z cho sự tối ưu hóa

SIM ion: 321 m/z (M-H)-

Nhiệt độ hóa hơi: 3500

C

2.2.2.2 Điều kiện phân tích:

* Điều kiện đầu dò MS/MS:

Nguồn tạo ion Turbo Spray

Kiểu tạo ion âm, kiểu scan: MRM

Điện thế ion hóa: 4200V

Nhiệt độ ống mao quản: 5000C

2.2.2.3 Kết quả:

* Định lượng CAP dựa trên phân mảnh ion:

CAP được xác nhận dựa trên phân ion phân tử m/z=321; hai ion xác nhận m/z = 151,9 và m/z=256,9; và chúng được định lượng dựa trên m/z = 151,9

 Đường chuẩn định lượng CAP

Đường chuẩn được xây dựng dựa trên 6 điểm chuẩn với các nồng độ chuẩn 0.1 ppb; 0.2 ppb; 0.3 ppb; 0.4 ppb; 0.5 ppb; 1 ppb

Hình 2 2 : Đường chuẩn CAP (0.1 – 1 ppb)

Hình 2 3: Phổ đồ ioin m/z 151.9 ở nồng độ CAP

Phương trình đường chuẩn y = 23596 x + 1270.2; đường chuẩn có hệ số tương quan R2= 0.9939; giới hạn định lượng của phương pháp là 0.03 ng/g, hiệu suất thu hồi của phương pháp 87.93 – 116.80 %

2.2.3 LC/MS/MS ESI (-) [2]

2.2.3.1 Quy trình chuẩn bị mẫu

Mẫu tôm được chuẩn bị như sau:

1 Đồng nhất mẫu: 100 g tôm được rã đông, thêm nước và xay bằng máy xay

sinh tố

2 Cân 5 g mẫu tôm đã được đồng nhất cho và ống polypropylene 15 mL

3 Thêm 50 µL dung dịch nội chuẩn CAP –d5 (ISTD) và khuấy trộn kỹ để

đảm bảo sự phân bố đồng đều của ISTD trong mẫu

4 Thêm 2 mL nước và khuấy trôn kỹ

5 Thêm 5 mL ethyl acetate Cho vào ống để khuấy cơ và khuấy kĩ khoảng 30

phút

6 Ly tâm ở 7000 rpm trong 15 phút

7 Chuyển phần nổi trên bề mặt vào ống polypropylene 15 mL

8 Thêm 5 mL Ethyl acetate vào tissue pellet ở bước 7 và lập lại quy trình

chiết

9 Sấy bã dưới khí N2 ở 550C

10 Hoàn nguyên với 300 µL methanol và pha loãng thành 10 mL với nước

Tại thời điểm này, mẫu đã sẵn sàng để chiết pha rắn (SPE)

2.2.3.2 Điều kiện thiết bị

Sấy: >10’’ Hg trong 5-10 phút để loại bỏ lượng nước dư

Chiết: 3 x 1.0 mL Ethyl acetate (1mL/phút)

Thể tích tiêm: 0.4 mL/phút

Nhiệt độ: 250

C Mẫu: 1 CAP, 2 CAP-d5

Đầu dò: API 4000~ MS/MS, ESI-

Chế độ quét: MRM

Nhiệt độ: 450

Mẫu: 1 Chloramphenicol

2 Chloramphenicol-d5

2.2.3.3 Kết quả:

Việc sử dụng kỹ thuật Kinetex ® cho phép việc rửa giải rất nhanh của CAP

ở 2.15 phút (hình 2.4) Trong chế độ ESI, CAP được phát hiện bằng việc quan sát

sự chuyển đổi khối lượng 321.2/152 và chất nội chuẩn CAP-d5 bằng việc quan sát

sự chuyển đổi khối lượng 326.0/157.0 Sự chuyển đổi khối lượng 321.2/152 được chọn cho việc định lượng bởi vì m/z 152 cho cường độ ion sản phẩm mạnh nhất sự chuyển đổi khối lượng 321.2/257.2 cung cấp sản phẩm ion lớn thứ 2 và được chọn cho việc xác nhận

Hình 2 4 : Phân tích CAP

Một đỉnh tạp chất, tách tại 3.0 phút, được thu trong các mẫu tôm chiết xuất nhưng được tách ra một cách dễ dàng với peak CAP (hình 2.5) Sự hiện diện của peak tạp chất tương tự đã được báo cáo trước đây bởi USFDA6 Tuy nhiên, với kĩ thuật vỏ-lõi Kinetex và những điều kiện sử dụng ở đây, tạp chất được tách tốt và không nhiễu vào lượng CAP Một lợi ích khác so với phương pháp USFDA là thời gian chu kì LC ngắn hơn một cách đáng kể (4.5 phút so với 20.5 phút), cho phép tăng đáng kể công suất và hiệu suất

Hình 2 5 : Lượng thấp nhất (0.1 ng/mL hoặc 0.01 ng/g của mô tôm) của tiêu chuẩn chiết

của CAP (321.2/152) và tiêu chuẩn nội chuẩn (326/157)

Mũi tạp chất tách tại 3.0 phút được tách tốt khỏi CAP và không ảnh hưởng đến việc định lượng 0.1 ng/g CAP trong tôm dùng ống Strata-X SPE và cột Kinetex C18 LC

Đường cong hiệu chuẩn tiêu chuẩn được dựng trong khoảng nồng độ từ 0.1 ng/mL đến 200 ng/mL bằng cách vẽ tương đối (diện tích mũi của CAP/ diện tích mũi của IS) so với nồng độ Khoảng nồng độ này tương ứng từ 0.1 ng/g – 20 ng/g (0.01 – 20 ppb) trong mô tôm Đường cong hiệu chuẩn tiêu chuẩn thì tuyến tính trong khoảng hiệu chuẩn với giá trị của R2

= 0.9998 (hình 2.6) Tại mức nông độ tiêu chuẩn thấp nhất (0.1 ng/mL) tín hiệu nhiễu là 115.9 (hình 2.5), vì vậy giới hạn định lượng (LOQ) được ước lượng là ≤ 0.01 ng/mL, điều này tương ứng từ ≤ 0.001 ng/g trong tôm hoặc ≤ 0.001 ppb

Hình 2 6:Đường cong tiêu chuẩn CAP từ 0.1 ng/mL đến 200 ng/mL.

Ion định lượng được dùng là 321.2/152 Phương trình tuyến tính y = 0.2663x + 0.2169 với R2 = 0.9998

Hình 2 7 : Đường cong hiệu chuẩn chiết xuất tuyến tính trong khoảng nồng độ từ 0.1 đến

200 ng/mL (0.01 đến 20 ng/g tôm) với giá trị R 2

= 0.9997

Kết quả thu được từ phương pháp này thì tốt hơn so với những phương pháp được cháp nhận hiện nay bởi USFDA do LOQ là 0.001 ng/g (0.3 ppb) và LOD là 0.08 ng/g (0.08 ppb) Dựa trên đường cong hiệu chuẩn tiêu chuẩn, phương pháp này cung cấp LOQ 0.001 ng/g (0.001 ppb) thấp hơn 300 lần so với báo cáo từ những phương pháp của USFDA

2.3 Sắc kí khí (GC)

Sự hiện diện của những nhóm chức phân cực trong phân tử CAP đòi hỏi cần

có 1 giai đoạn đồng phân hóa, thường là thông qua phản ứng sylic hóa trước khi phân tích sắc kí khí Việc đính thêm những nhóm chức đặc trưng trên phân tử CAP

có thể làm giảm LOD của đầu dò ECD và MS Phản ứng sylic hóa thường được xúc tác bởi axit hoặc bazơ Những tác chất thường được dùng để sylic hóa bao gồm:

- Hỗn hợp của hexamethyldisilazane (HMDS), trimethylchlorosilane (TMCS) và pyridine

tử CAP, GC-MS trong NCI là một trong những kĩ thuật đáng tin cậy nhất, nó cũng

là phương pháp thông dụng nhất cho việc xác định lượng dư của CAP GC-MS trong EI là chế độ ít nhạy nhất Tuy nhiên, nó tạo phổ của những phân mảnh, vì vậy có thể lưu trữ dữ liệu điện tử cho mục đích tham khảo