(TIỂU LUẬN) tiểu luận CÔNG NGHỆ VI SINH TRONG sản XUẤT ENZYME PROTEASE

Protease bản chất là protein được sinh vật động vật, thực vật cho tới vi sinh vật tổng hợp nên, tham gia vào các phản ứng hóa sinh học, có những đặc tính: - Không độc hại, thân thiện với

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ĐÀ NẴNG

KHOA HÓA

CÔNG NGHỆ VI SINH TRONG SẢN XUẤT ENZYME

PROTEASE

Giảng viên hướng dẫn: TS Lê Lý Thùy Trâm Lớp: 18SH

Nhóm: 7 Sinh viên thực hiện: Cao Hoàng Minh Phượng

Nguyễn Phượng Hà Nguyễn Văn Nguyên Hoàng Thị Quyên Nguyễn Thị Trâm

1 Tổng quan

1.1 Enzyme protease

Protease hay còn gọi là Peptidase hay Proteinase Nó là một enzyme thủy phân có khả năng cắt đứt liên kết peptide trong phân tử Polypeptide, protein, một số cơ chất tương tự

Protease bản chất là protein được sinh vật (động vật, thực vật cho tới vi sinh vật) tổng hợp nên, tham gia vào các phản ứng hóa sinh học, có những đặc tính:

- Không độc hại, thân thiện với môi trường

- Tham gia phản ứng cả trong tế bào sống và ngoài tế bào sống (trong ống nghiệm)

- Tham gia xúc tác các phản ứng trong và ngoài cơ thể từ giai đoạn đầu đến giai đoạn cuối giải phóng hoàn toàn năng lượng dự trữ trong các hợp chất hóa học

- Phản ứng enzyme tiêu hao năng lượng rất ít, hiệu suất và tốc độ cao

- Có tính chọn lọc cao

- Chịu sự điều khiển bởi gen và các điều kiện phản ứng

Cơ chế xúc tác trong quá trình thủy phân: E + S ↔ ES ↔ E + P

1.1.1 Phân loại

Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 trong hệ thống phân loại

enzyme (E.C.3.4)

Phân loại protease

Với enzyme protease thì có nhiều cách phân loại nhưng ta chỉ dựa vào hai đặc điểm sau để phân loại chúng: Dựa vào vị trí tác dụng của protease lên các peptide trong phân tử protein, người ta chia protease làm 2 nhóm chính:

- Exopeptidase (Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide):

+ Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi polypeptide để giải phóng ra một acid amin, một dipeptide hoặc tri peptide

+ Carboxypeptide: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi

polypeptide và giải phóng ra một acid amin hoặc một dipeptide

- Endopeptidase (Dựa vào động học của cơ chế xúc tác):

+ Serine proteinase: là những protein chứa nhóm –OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và subtilisin Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật như chymotrypsin, trypsin, elastase Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi khuẩn như subtilisin Carlsberg, subtilisin BPN Các serine proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng

+ Cysteine proteinase: Các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động Cystein proteinase bao gồm các proteinase thực vật như papayin, bromelin, một vài protein động vật và protein kí sinh trùng Các cystein proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng

+ Aspartic proteinase: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin

Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin, renin Các aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính

+ Metallo proteinase: Metallo proteinase là nhóm proteinase được tìm thấy ở

vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn Các metallo proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA

Dựa vào thành phần amino acid và vùng pH tối ưu của protease, người ta chia làm các nhóm:

- Protease acid: pepsin, renin,… hoạt động ở vùng pH acid 2-4

- Protease kiềm: tryssin, chymmotrysin,… hoạt động ở vùng pH kiềm 9-11

- Protease trung tính: như papain từ quả đu đủ, bromelain từ quả dứa,… hoạt động ở vùng pH trung tính 7-8

1.1.2 Nguồn thu nhận: Protease chủ yếu được thu nhận từ 3 nguồn chính:

- Nguồn động vật:

+ Tụy tạng: đây là nguồn enzyme sớm nhất, lâu dài nhất và có nhiều enzyme nhất

+ Dạ dày bê: trong ngăn thứ tư của dạ dày bê có tồn tại enzyme thuộc nhóm Protease tên là renin Enzyme này từ lâu đã được dùng phổ biến trong công nghệ phomat Renin làm biến đổi casein thành paracasein có khả năng kết tủa trong môi trường sữa có đủ nồng độ Ca2+ Đây là quá trình đông tụ sữa rất điển hình, được nghiên cứu và ứng dụng đầy đủ nhất

+ Từ ruột cá basa: Dịch trích ly enzyme thu được từ ruột cá basa có tổng hoạt tính cao nhất là 15.78 UI/gCKNT trong điều kiện trích ly: tỷ lệ mẫu/dung môi: 1/1 (w/w),

pH 9.5: nhiệt độ 35oC: thời gian trích ly 10 phút

- Nguồn thực vật: Có 3 loại protease thực vật như Bromelain (thu được từ quả chồi dứa, vỏ dứa (pineapple pant)), Papain (thu được từ nhựa củ lá, thân, quả đu đủ (Carica papaya)) và Ficin (thu được từ nhựa cây cọ ( Ficus carica))

- Nguồn vi sinh vật: là nguồn thu nhận enzyme khổng lồ, enzyme protease phân bố

chủ yếu vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn,…gồm các loài thuộc Aspergillus, Bacillus, Penicillium, Clostridium, Streptomyces và một số loại nấm men.

- Nguồn vi khuẩn: Protease của động vật và thực vật chỉ chứa một trong hai loại endopeptidase hoặc exopeptidase, riêng vi khuẩn có khả năng sinh ra hai loại trên, do

đó protease của vi khuẩn có tính đặc hiệu cơ chất cao Chúng có khả năng phân hủy tới 80% các liên kết peptide trong phân tử protein Lượng protease sản xuất từ vi khuẩn được ước tính vào khoảng 500 tấn, chiếm 59% sản lượng enzyme được sử dụng

- Nguồn nấm: Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lượng lớn protease

được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm là các chủng: Aspergillus, A.terricola, A.saitoi,… Các nấm mốc này có khả năng cả ba loại protease: acid, kiềm và trung

tính Nấm mốc đen tổng hợp chủ yếu là các protease acid, có khả năng thủy phân

protein ở pH 2.5-3 Một số nấm mốc như A.candidatus, P.camerberti, P.roqueforti… cũng có khả năng tổng hợp protease có khả năng đông tụ sữa sử dụng trong sản xuất

phomat

- Nguồn xạ khuẩn: Về phương diện tổng hợp protease, xạ khuẩn được nghiên cứu ít hơn vi khuẩn và nấm mốc Tuy nhiên, người ta cũng đã tìm ra được một số chủng có

khả năng tổng hợp protease cao như: Streptomyces grieus, S.fradiae, S.Terimosus,…

1.1.3 Ứng dụng

- Chế biến thịt: làm mềm thịt, giảm thời gian chín

- Công nghiệp chế biến sữa: khả năng làm đông tụ sữa, ứng dụng sản xuất pho mát

- Công nghiệp sản xuất bia rượu:

+ Tăng tỉ lệ nguyên liệu thay thế

+ Giảm thời gian lên men

+ Hiệu suất thu hồi tăng

+ Bia, rượu thành phẩm đạt các chỉ tiêu quy định tốt hơn khoảng 30%

+ Nâng cao hiệu quả kinh tế, giảm chi phí sản xuất

- Công nghiệp sản xuất bánh quy: làm giảm thời gian đảo trộn, tăng độ dẻo và làm

nhuyễn bột, tạo độ xốp và nở tốt hơn.

- Công nghiệp sản xuất nước chấm (đặc biệt quan trọng là ngành sản xuất nước mắm):

+ Sử dụng enzyme từ các nguồn tự nhiên: động vật (trong nội tạng gia súc), thực vật

(đu đủ, khóm, ), vi sinh vật ( nấm mốc Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, )

+ Phương pháp sử dụng:

• Sử dụng dưới dạng thô: cho các nguyên liệu có enzyme đó vào chượp với tỉ

lệ nhất định

• Sử dụng dưới dạng chiết xuất: chiết enzyme từ các nguyên liệu trên thành dạng tinh chế sau đó cho vào trong chượp

1.2 Chủng nấm mốc Aspergillus Oryzae

A oryzae là một loại nấm mốc thuộc chi Aspergillus (họ Trichocomaceae, bộ

Eurotiales)

Đặc điểm:

- Cấu tạo đa bào thuộc loại vi hoàn khuẩn, có hình dáng đính bào tử

- Vi nấm thể, mọc thành các lớp mốc màu đen, vàng

- Cơ thể sinh trưởng hệ sợi, phân nhánh có vách ngăn chia sợi thành nhiều tế bào, sợi mảnh, chiều ngang khoảng 5-7µm

- Sinh sản bằng bào tử

- Giàu enzyme thủy phân nội bào và ngoại bào

2 Quy trình công nghệ

Phương pháp nuôi cấy:

a Phương phap nuôi cây bê măt:

Là phương pháp tạo môi trường để vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường Về

cơ bản, các nguyên liệu của môi trường dinh dưỡng phải cung cấp đủ chất dinh dưỡng như: nitro, carbon, vitamin, muối khoáng cho vi sinh vật phát triển Tuy nhiên, muốn

có môi trường dinh dưỡng tốt hơn có thể bổ sung thêm nito vô cơ hoặc nito hữu cơ và các chất cảm ứng khác tùy từng loại enzyme

Đôi tương sư dung: cac loai nâm môc như A oryzae, A niger

Trong nuôi cấy bề mặt, người ta sử dụng môi trường lỏng và môi trường đặc

Môi trương long:

• Vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường, tạo khuẩn lạc ngăn cách giữa pha lỏng và pha khí

• Vi sinh vật sử dụng chất dinh dưỡng từ dung dịch môi trường, oxy từ không khí, tiến hành tổng hợp enzyme Enzyme ngoại bào tách ra từ sinh khối và hòa tan vào dung dịch môi trường, enzyme nội bào nằm trong sinh khối vi sinh vật

• Chiều cao của môi trường lỏng phải được tính toán kỹ và khoảng 12-15 cm Nếu quá lớn thì vi sinh vật sẽ không đồng hóa hết được các chất dinh dưỡng ở phía đáy khay nuôi cấy Nếu chiều cao quá nhỏ, sẽ thiếu thành phần dinh dưỡng, hiệu suất thu hồi enzyme không cao

Môi trường đặc:

• Đây là môi trường được sử dụng ở phần lớn các nhà máy sản xuất enzyme.

• Vi sinh vật không chỉ phát triển trên bề mặt môi trường, mà còn nằm hẳn trong

lòng môi trường

• Vi sinh vật nhận chất dinh dưỡng từ hạt môi trường và sinh tổng hợp ra enzyme

ngoại bào và nội bào Các enzyme ngoại bào sẽ thấm vào trong các hạt môi trường,

còn các enzyme nội bào thì năm trong sinh khối vi sinh vật

• Môi trường nuôi cấy phải có độ ẩm thích hợp, có độ xốp cao Thông thường

người ta tạo độ ẩm khoảng 55-65% là hợp lý Nếu sử dụng cám là nguyên liệu chính

thì phải cho thêm 20-25% trấu để làm xốp môi trường, tạo điều kiện thuận lợi cho

không khí dễ dàng xâm nhập vào lòng môi trường

b Phương phap nuôi cây chim:

Trong nuôi cấy theo phương pháp chìm, người ta thường sử dụng môi trường lỏng và

được thực hiện trong những thùng lên men Trong các thiết bị lên men, thường lắp đặt

các hệ thống cánh khuấy, hệ thống cung cấp oxy, hệ thống điều chỉnh pH và nồng độ

các chất dinh dưỡng

Phương pháp này đòi hỏi phải được vô trùng tuyệt đối ở các khâu vệ sinh tổng hợp,

thanh trùng thiết bị, thanh trùng môi trường dinh dưỡng, thao tác nuôi cấy, không khí

cung cấp cho quá trình nuôi cấy

Đôi tương sư dung: cac loai vi khuân (Bacillus susbtilis, E.Coli), nâm men

(Kluyveromyces lactis, Saccharomyces fragilis)

Nuôi cấy bề mặt

- Dễ thực hiện, quá trình công

- Đầu tư đơn giản ít tốn kém, vận hành đơn giản vì không cần dùng thiết bị phức tạp

- Lượng enzyme tổng hợp được cao hơn nhiều so với nuôi cấy chìm

- Chế phẩm enzyme thô sau thu nhận dễ sấy khô và bảo quản

- Trường hợp nhiễm vi sinh vật lạ, rất dễ xử lý vì là môi trường tĩnh

điểm

- Khó cơ giới, tự động hóa, cân nhiêu nhân công

Dựa vào bảng so sánh hai phương pháp thi phương pháp nuôi cấy bề mặt

thích hợp cho chủng nấm mốc A.Oryzae nên nhóm chọn sử dụng phương pháp này

THUYẾT MINH QTCN

a Xử lý nguyên liệu

- Mục đích: Việc chuẩn bị nguyên liệu và làm sạch nguyên liệu sẽ giúp quá trình

sản sinh enzyme đạt hiệu suất cao cũng như tránh tạp nhiễm và loại bỏ các chất

cặn bẩn, tạo kích thước tối ưu để quá trình lên men tốt hơn

- Tiến hành: Cám và trấu được mua trực tiếp từ xí nghiệp xay xát gạo Gentraco

(Cần Thơ) Trấu từ kho chứa sẽ được đưa đến thiết bị sàng để loại bỏ các tạp

chất Cám gạo từ bunke chứa được đưa đến máy nghiền khô để tránh hiện

tượng vón cục, tạo kích thước tối ưu

b Phối trộn

- Mục đích: Trộn đều các thành phần môi trường dinh dưỡng Tạo điều kiện

thuận lợi cho quá trình lên men sau này

- Cách tiến hành: Hỗn hợp cám gạo, trấu và gelatin được định lượng và trộn đều

theo tỉ lệ đã tính toán môi trường bao gồm 70% cám : 25% trấu : 5% gelatin bổ sung làm cơ chất cảm ứng Sau đó làm ẩm môi trường 60%

Máy trộn liên tục kiểu băng tải

c Hấp khử trùng

- Mục đích: tiêu diệt vi sinh vật

- Tiến hành: Hấp trong nồi hấp khử trùng ở nhiệt độ 121°C.

d Làm nguội, làm tơi

- Mục đích: Khối môi trường vừa hấp xong còn nóng và dính bết Vì vậy phải làm

nguội và làm tơi để thuận tiện cho việc gieo giống và phân phối vào các dụng cụ nuôi Yêu cầu thời gian này phải ngắn để hạn chế nhiễm khuẩn từ bên ngoài Nhiệt độ yêu cầu đạt được để gieo giống là 35 – 39° C

thiết bị làm nguội

e Giống

Aspergillus oryzae nhận được từ Viện Nghiên cứu và phát triển Công nghệ sinh học, Trường Đại học Cần Thơ được nuôi cấy trên bề mặt thạch môi trường PGA (Potato, Glucose, Agar) và đem ủ ở 30° C trong 3 ngày để tăng sinh

f Nuôi cấy

- Mục đích: Tạo điều kiện tối ưu cho vi sinh vật phát triển và sinh enzyme.

- Cách tiến hành: Tiến hành nuôi cấy nấm mốc trong các phòng thanh trùng, giống

sau quá trình nhân giống các cấp sẽ được đưa vào nuôi cấy trên các khay đã được khử trùng

Trong quá trình nuôi không cần điều chỉnh pH môi trường Đây là môi trường bán rắn nên sự thay đổi pH ở vị trí này không ảnh hưởng đến toàn bộ môi trường Độ ẩm 96%

÷ 98%

Thời gian nuôi cấy nấm mốc khoảng 30 ÷ 60 giờ, trung bình là 42 giờ

Quá trình nuôi cấy trong môi trường bán rắn nuôi bằng phương pháp bề mặt trải qua các giai đoạn sau:

• Giai đoạn 1 (Từ khi nuôi đến giờ nuôi thứ 10-12): trương nở bào tử và xuất hiện cuống nấm, W= 55-60%, φ =96-100%, T=30-32 C

• Giai đoạn 2 (kéo dài trong 10-18h): phát triển mạnh, dẫn đến hiện tượng kết bánh môi trường bị khô xốp, tăng hàm lượng CO2, T=38-40 C Để khống chế nhiệt độ thích hợp 28-30 C cần thông gió (quạt) và bão hoà ẩm không khí phòng nuôi

• Giai đoạn 3 (kéo dài trong 10-20h ): tạo ra enzyme nhiều nhất Cường độ trao đổi chất giảm đi chút ít, nhiệt toả ra ít hơn nên tốc độ bốc hơi nước của môi trường nuôi cấy cũng giảm theo

thiết bị nuôi cấy

g Chế phẩm thô

- Mục đích: Thu được chế phẩm enzyme protease, chế phẩm này được gọi là enzyme

thô vì ngoài thành phần enzyme chúng còn chứa sinh khối vi sinh vật, thành phần môi trường và nước

- Cách tiến hành: Để đảm bảo enzyme không bị mất hoạt tính nhanh người ta thường

sấy enzyme đến một độ ẩm thấp (thường dùng là máy sấy chân không) Nhiệt độ sấy khoảng 10-30°C Sau đó qua thiết bị đóng gói ta được enzyme thô

Tùy thuộc vào mục đích sử dụng mà ta có thể sử dụng ngay enzyme này mà không cần phải tinh sạch Trong những trường hợp khác ta phải tiến hành tinh sạch enzyme để bảo quản lâu hơn

máy sấy chân không

h.nghiền

- Mục đích: Vừa phá vỡ tế bào, vừa làm nhỏ các thành phần của chế phẩm enzyme

thô Khi thành tế bào bị phá vỡ, các enzyme bên trong sẽ dễ dàng giải phóng ra môi trường bên ngoài

- Cách tiến hành: Lượng canh trường sau nuôi cấy được vận chuyển lên bunke

chứa và cho vào máy nghiền trục

Máy nghiền trục

i. Lọc

- Mục đích: loại bã, lấy phần dịch lọc

- Tiến hành: lọc bằng thiết bị lọc chân không thùng quay và lọc lấy phần

dịch, phần bã được loại bỏ để làm thức ăn cho gia súc

Thiết bị lọc chân không thùng quay

j Kết tủa enzyme

- Mục đích: thu nhận enzyme tinh sạch

- Tiến hành:trong công nghiệp tinh chế enzyme, người ta sử dụng muối amoni sunfat hoặc dung môi ethanol

k Ly tâm

Mục đích: tách enzyme đã kết tủa khỏi dung môi

thiết bị ly tâm lắng

l. sấy

- Mục đích: nhằm thu enzyme kỹ thuật Tách nước ra khỏi dung dịch mà không làm thay đổi tính chất của enzyme nhằm bảo quản lâu hơn

thiết bị sấy chân không

KẾT LUẬN

Protease là một trong những enzyme được ứng dụng rất nhiều trong mọi lĩnh vực, trong đó, đặc biệt là công nghiệp thực phẩm Protease đã có những đóng góp rất to lớn trong việc phục vụ, nâng cao đời sống của con người

Hiện nay trên thế giới công nghệ thu nhận Protease từ vi sinh vật hiện đang phát triển nhanh chóng, tìm tòi nghiên cứu về khả năng ứng dụng vô vàn của enzyme Protease

Ở Việt Nam cũng có nhiều công trình công bố về việc nghiên cứu sử dụng Protease chủ yếu tập trung vào các Protease thực vật và động vật còn protease vi sinh vật chỉ được nghiên cứu trong hơn chục năm trở lại đây Công nghệ enzyme ở nước ta hiện còn rất mới mẻ, đang trong giai đoạn hưởng ứng và ngày hoàn thiện dần lĩnh vực này trong tương lai Do vậy việc đi sâu và tìm hiểu enzyme Protease, nguồn thu nhận Protease từ vi sinh vật cũng như những ứng dụng của nó là một đề tài mang tính thời đại, cấp thiết trong tình hình Việt Nam đang hội nhập mạnh mẽ với nền kinh tế thế giới