HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ………………………………… BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ VIỆT NAM NGUYỄN ĐÌNH LUYỆN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT LIÊN KẾT VỚI RONG SỤN KAPPAPHYCUS ALVAREZII Ở VÙNG BIỂN NHA TRANG, KHÁNH HÒA, ĐỊNH HƯỚNG SỬ DỤNG TRONG Y DƯỢC HỌC LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ………………………………… Hà Nội - 2022 NGUYỄN ĐÌNH LUYỆN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT LIÊN KẾT VỚI RONG SỤN KAPPAPHYCUS ALVAREZII Ở VÙNG BIỂN NHA TRANG, KHÁNH HÒA, ĐỊNH HƯỚNG SỬ DỤNG TRONG Y DƯỢC HỌC Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9.42.02.01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.TS Lê Mai Hương PGS TS Phan Văn Kiệm Hà Nội - 2022 PA LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây cơng trình nghiên cứu riêng tơi hướng dẫn khoa học GS.TS Lê Mai Hương PGS.TS Phan Văn Kiệm Các số liệu kết thu luận án hoàn toàn trung thực chưa công bố cơng trình khác Tác giả luận án LỜI CẢM ƠN Lời Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc trân trọng đến GS.TS Lê Mai Hương Viện hóa học hợp chất Thiên nhiên PGS.TS Phan Văn Kiệm Viện Hóa sinh biển- người Thầy ln tận tình giúp đỡ, hướng dẫn khoa học định hướng nghiên cứu suốt q trình tơi thực hồn thành luận án Luận án hoàn thành Viện Hóa học Hợp chất Thiên nhiên Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, với hỗ trợ kinh phí đề tài NĐT11.GER/16 Em xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện hóa học Hợp chất Thiên nhiên, đồng nghiệp anh chị phịng sinh học thực nghiệm ln ủng hộ tạo điều kiện thuận lợi để em tập trung nghiên cứu hoàn thành luận án Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban lãnh đạo Học Viện Khoa học Công nghệ Thầy, Cô anh, chị chuyên viên Học Viện tận tình hướng dẫn giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho em thời gian học tập nghiên cứu Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Thầy, Cô Viện Công nghệ sinh học giảng dạy, cung cấp kiến thức để em hoàn thành học phần chuyên đề chương trình đào tạo Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, người thân bạn bè quan tâm, hỗ trợ động viên suốt thời gian qua để em hồn thành tốt nhiệm vụ học tập công tác chuyên môn Em xin trân trọng cảm ơn! Nghiên cứu sinh MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii MỞ ĐẦU 1.1 Tổng quan rong biển giới 1.2 Tình hình rong biển Việt nam 1.3 Giới thiệu Rong Sụn 2.1 Vi sinh vật biển cộng sinh chất có hoạt tính sinh học 2.2 Vi sinh vật cộng sinh với rong 10 2.3 Khoa học metagenomics nghiên cứu khu hệ VSV liên kết 13 2.4 Sự đa dạng vi sinh vật cộng sinh với rong biển 18 2.5 Các chất có hoạt tính từ vi sinh vật liên kết với rong biển 22 2.5.1 Các chất có hoạt tính từ vi khuẩn cộng sinh rong 22 2.5.2 Các chất có hoạt tính sinh học từ vi nấm cộng sinh rong 27 2.6 Tiềm triển vọng từ vi sinh vật liên kết với rong 32 PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35 Vật liệu môi trường nghiên cứu 35 2.1.1 Thu thập mẫu, chủng vi sinh vật kiểm định dòng tế bào 35 2.1.2 Mơi trường nghiên cứu 35 2.1.3 Hóa chất thiết bị nghiên cứu 36 2.2 Phương pháp nghiên cứu 37 2.2.1 Phương pháp thu thập mẫu 37 2.2.2 Phân lập vi khuẩn nấm liên kết với rong biển 37 2.2.3 Định danh chủng vi khuẩn vi nấm tiêu biểu 38 2.2.3.1 Định danh chủng vi khuẩn dựa vào trình tự gen 16S rARN 38 2.2.3.2 Định danh chủng nấm dựa vào trình tự gen vùng ITS/28S rDNA 39 2.2.4 Phân tích đa dạng vi khuẩn vi nấm 40 2.2.4.1 Tách chiết DNA tổng số 40 2.2.4.2 Phân tích meta(taxo)genomic quần thể vi khuẩn 40 2.2.4.3 Phân tích meta(taxo)genomic quần thể Nấm 41 2.2.5 Hoạt tính đối kháng VSVKĐ chủng vi khuẩn nấm phân lập 42 2.2.6 Lên men, thu nhận cao chiết dịch lên men từ chủng lựa chọn 43 2.2.6.1 Thử hoạt tính đối kháng vi sinh vật phiến vi lượng 96 giếng 43 2.2.6.2 Hoạt tính gây độc tế bào 45 2.2.6.3 Hoạt tính chống oxy hố 47 2.2.7 Xác định điều kiện lên men rắn thích hợp cho sinh tổng hợp chất kháng sinh chủng Aspergillus micronesiensis 48 2.2.7.1 Khảo sát động học thời gian lên men 48 2.2.7.2 Khảo sát động học nồng độ muối 49 2.2.7.3 Khảo sát động học pH môi trường 49 2.2.8 Quy hoạch thực nghiệm tối ưu hóa q trình lên men 50 2.2.9 Phân lập xác định cấu trúc hóa học hợp chất hữu 51 2.2.9.1 Phương pháp phân lập hợp chất 51 2.2.9.2 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học hợp chất 52 PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 54 3.1 Phân lập chủng vi khuẩn vi nấm 54 3.1.1 Phân lập chủng vi khuẩn 54 3.1.2 Phân lập chủng vi nấm 55 3.2 Sàng lọc hoạt tính đối kháng VSV chủng phân lập 56 3.2.1 Hoạt tính đối kháng VSV chủng vi khuẩn 56 3.2.2 Hoạt tính đối kháng VSVKĐ chủng vi nấm 58 3.2.3 Đặc điểm hình thái chủng vi khuẩn vi nấm tuyển chọn 61 3.2.3.1 Đặc điểm hình thái chủng vi khuẩn 61 3.2.3.2 Hình thái chủng vi nấm lựa chọn 64 3.2.4 Phân loại chủng vi khuẩn vi nấm lựa chọn dựa kỹ thuật sinh học phân tử 65 3.2.5 Đánh giá đa dạng cấu trúc quần thể vi sinh vật rong sụn Kappaphycus alvarezii 68 3.2.5.1 Quần thể vi khuẩn 68 3.2.5.2 Quần thể nấm 72 3.2.6 Hoạt tính sinh học từ cặn chiết thô chủng 75 3.2.6.1 Hoạt tính đối kháng VSV cặn chiết ethylacetate 75 3.2.6.2 Hoạt tính chống oxy hóa của cặn chiết ethylacetate 80 3.2.6.3 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư cặn chiết ethylaxetat 81 3.2.7 Nghiên cứu điều kiện nuôi tối ưu cho hoạt tính kháng VSVKĐ chủng vi nấm Aspergillus micronesiensis 84 3.2.7.1 Ảnh hưởng thời gian lên men 85 3.2.7.2 Ảnh hưởng nồng độ muối 86 3.2.7.3 Ảnh hưởng pH môi trường 3.2.8 Quy hoạch thực nghiệm tối ưu hóa q trình lên men 87 88 3.2.8.1 Phần thực nghiệm 88 3.2.8.2 Thiết kế ma trận kế hoạch thực nghiệm 88 3.2.8.3 Xây dựng mơ hình kế hoạch thực nghiệm tối ưu hóa quy trình 89 3.2.8.4 Tối ưu hóa thơng số cơng nghệ q trình 92 3.3 Phân lập xác định cấu trúc hóa học hợp chất từ chủng nấm Aspergillus micronesiensis 94 3.3.1 Phân tách hợp chất từ chủng Aspergillus micronesiensis 94 3.3.2 Thông số vật lý kiện phổ hợp chất phân tách từ chủng Aspergillus micronesiensis VPN1.11 96 3.3.2.1 Hợp chất AM8A1: Aspersiensis A (hợp chất mới) 96 3.3.2.2 Hợp chất AM8B1: Aspersiensis B (hợp chất mới) 96 3.3.2.3 Hợp chất AM8B2: Aspersiensis C (hợp chất mới) 96 Epicoccone B (5,6,7-trihydroxy-4-methyl-1(3H)isobenzofuranone) 97 epicoccolides B 97 epicoccolide A 97 3.4 Cấu trúc hóa học hợp chất phân lập từ chủng Aspergillus micronesiensis 98 3.4.1 Hợp chất AM8A1: Aspersiensis A (hợp chất mới) 98 3.4.2 Hợp chất AM8B1: Aspersiensis B (hợp chất mới) 104 3.4.3 Hợp chất AM8B2: Aspersiensis C (hợp chất mới) 110 3.4.4 Hợp chất AM3A1: 4-hydroxybenzaldehyde 117 3.4.5 Hợp chất AM3D: (22E,24R)-5α,8α-epidioxy-24-methyl-cholesta-6,22-dien3β-ol) 118 3.4.6 Hợp chất AM4F1: 2-O-methylbutyrolactone II 122 3.4.7 Hợp chất AM6E1: 1,3-dihydro-4,5,6-trihydroxy-7 methylisobenzofuran 124 3.4.9 Hợp chất AM7H: epicoccolides B 127 3.4.10 Hợp chất AM8D: epicoccolide A 129 3.5.1 Kết thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định hợp chất 132 3.5.2.Kết xác định hoạt tính chống oxi hóa hợp chất 136 3.5.3 Hoạt tính gây độc tế bào hợp chất phân lập 138 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 141 KẾT LUẬN 141 KIẾN NGHỊ 143 CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 144 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tiếng anh VSVKĐ RYE Rice yeast extract medium ADN Acid deoxyribonucleic ITS Internal transcribed spacer ATCC American Type Culture Collection CFU Colony forming units Diễn giải Vi sinh vật kiểm định Môi trường gạo dịch chiết nấm men Axit deoxyribonucleic Vùng phiên mã nội Bảo tàng giống chuẩn Hoa Kỳ Đơn vị hình thành khuẩn lạc MIC Minimum inhibitory rDNA concentration Ribosomal DNA AND ribosom CC Chromatography column Sắc ký cột thường COSY Correlation spectroscopy Nồng độ ức chế tối thiểu Phổ tương tác hai chiều đồng hạt nhân 13 DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl C-NRM 13C-Nuclear magnetic resonance spectroscopy Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 Hep-G2 Human hepatocellular LU-1 carcinoma Human lung adenocarcinoma Ung thư biểu mô phổi Vero Vero cell Tế bào biểu mô thận khỉ MEME Minineal essential medium with Ung thư gan Môi trường nuôi cấy tế bào MCF-7 Eagle’s salts Human breast carcinoma cell Tế bào ung thư vú người FBS Fetal bovine serum Huyết bò DMEM Dullbecco’s modified Minimum Essential Medium Môi trường nuôi cấy tế bào H-NRM 1H- Nuclear magnetic resonance spectroscopy Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton HPLC High performance liquid HSQC chromatography Heteronuclear single quantum MeOH coherence Methanol DMSO Dimethylsulfoxide EtOAc Ethylacetate CS% Cell survival Phần trăm sống sót IC50 Inhibitory concentration 50% Nồng độ ức chế 50% TLC Thin layer chromatography Sắc ký lớp mỏng DEPT Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer Sắc ký lỏng cao áp Phổ tương tác hai chiều dị hạt nhân Phổ DEPT Spectroscopy HMBC Heteronuclear multiple bond Phổ tương tác đa liên kết ESI-MS correlation Electron spray ionzation mass hai chiều dị nhân Phổ khối lượng phun mù điện tử OTU spectroscopy Operational taxonomic units Diversity index Chỉ số đa dạng loài Species richness Độ phong phú loài Shannon_ H’ Chao-1 Đơn vị phân loại loài 13.5 Phổ HSQC hợp chất AM6E2 201 Phụ lục 14 Hợp chất AM7H: epicoccolides B 14.1 Phổ HR-ESI-MS hợp chất AM7H PA 14.2 Phổ 1H-NMR hợp chất AM7H 14.3 Phổ 13C-NMR hợp chất AM7H 14.4 Phổ HMBC hợp chất AM7H 14.5 Phổ HSQC hợp chất AM7H 205 Phụ lục 15 Hợp chất AM8D: epicoccolide A 15.1 Phổ HR-ESI-MS hợp chất AM8D PA 15.2 Phổ 1H-NMR hợp chất AM8D 15.3Phổ 13C-NMR hợp chất AM8D 15.3 Phổ HMBC hợp AM8D 15.5 Phổ HSQC hợp chất AM8D Phụ lục 16 Hợp chất AM8A1: Aspersiensis A (hợp chất mới) NGUYỄN ĐÌNH LUYỆN LỜI CAM ĐOAN Tác giả luận án LỜI CẢM ƠN Nghiên cứu sinh MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT MỞ ĐẦU CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan rong biển giới 1.2 Tình hình rong biển Việt nam 1.3 Giới thiệu Rong Sụn Phân bố, sinh học Thành phần hóa học cúa Rong Sụn Ứng dụng Rong Sụn 2.1 Vi sinh vật biển cộng sinh chất có hoạt tính sinh học 2.2 Vi sinh vật cộng sinh với rong 2.3 Khoa học metagenomics nghiên cứu khu hệ VSV liên kết 2.4 Sự đa dạng vi sinh vật cộng sinh với rong biển 2.5 Các chất có hoạt tính từ vi sinh vật liên kết với rong biển 2.5.1 Các chất có hoạt tính từ vi khuẩn cộng sinh rong 2.5.2 Các chất có hoạt tính sinh học từ vi nấm cộng sinh rong 2.6 Tiềm triển vọng từ vi sinh vật liên kết với rong PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu môi trường nghiên cứu 2.1.1 Thu thập mẫu, chủng vi sinh vật kiểm định dòng tế bào Các chủng vi sinh vật kiểm định (VSVKĐ): 2.1.2 Môi trường nghiên cứu 2.1.3 Hóa chất thiết bị nghiên cứu 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp thu thập mẫu 2.2.2 Phân lập vi khuẩn nấm liên kết với rong biển 2.2.3 Định danh chủng vi khuẩn vi nấm tiêu biểu 2.2.4 Phân tích đa dạng vi khuẩn vi nấm 2.2.5 Hoạt tính đối kháng VSVKĐ chủng vi khuẩn nấm phân lập 2.2.6 Lên men, thu nhận cao chiết dịch lên men từ chủng lựa chọn 2.2.7 Xác định điều kiện lên men rắn thích hợp cho sinh tổng hợp chất kháng sinh chủng Aspergillus micronesiensis 2.2.8 Quy hoạch thực nghiệm tối ưu hóa q trình lên men 2.2.9 Phân lập xác định cấu trúc hóa học hợp chất hữu Sắc ký lớp mỏng (TLC) Sắc ký cột (CC) Phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR (Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy) Phổ lưỡng sắc trịn (CD) Phương pháp tính tốn phổ ECD lý thuyết PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập chủng vi khuẩn vi nấm 3.1.1 Phân lập chủng vi khuẩn 3.1.2 Phân lập chủng vi nấm 3.2 Sàng lọc hoạt tính đối kháng VSV chủng phân lập 3.2.1 Hoạt tính đối kháng VSV chủng vi khuẩn 3.2.2 Hoạt tính đối kháng VSVKĐ chủng vi nấm 3.2.3 Đặc điểm hình thái chủng vi khuẩn vi nấm tuyển chọn 3.2.4 Phân loại chủng vi khuẩn vi nấm lựa chọn dựa kỹ thuật sinh học phân tử (a) (b) 3.2.5 Đánh giá đa dạng cấu trúc quần thể vi sinh vật rong sụn Kappaphycus alvarezii 3.2.6 Hoạt tính sinh học từ cặn chiết thô chủng 3.2.7 Nghiên cứu điều kiện ni tối ưu cho hoạt tính kháng VSVKĐ chủng vi nấm Aspergillus micronesiensis 3.2.8 Quy hoạch thực nghiệm tối ưu hóa q trình lên men 3.3 Phân lập xác định cấu trúc hóa học hợp chất từ chủng nấm Aspergillus micronesiensis 3.3.1 Phân tách hợp chất từ chủng Aspergillus micronesiensis 3.3.2 Thông số vật lý kiện phổ hợp chất phân tách từ chủng Aspergillus micronesiensis VPN1.11 3.4.1 Hợp chất AM8A1: Aspersiensis A (hợp chất mới) 3.4.2 Hợp chất AM8B1: Aspersiensis B (hợp chất mới) 3.4.3 Hợp chất AM8B2: Aspersiensis C (hợp chất mới) 3.4.4 Hợp chất AM3A1: 4-hydroxybenzaldehyde 3.4.5 Hợp chất AM3D: (22E,24R)-5α,8α-epidioxy-24-methyl-cholesta-6,22-dien- 3β-ol) 3.4.6 Hợp chất AM4F1: 2-O-methylbutyrolactone II 3.4.7 Hợp chất AM6E1: 1,3-dihydro-4,5,6-trihydroxy-7 methylisobenzofuran 3.4.8 Hợp chất AM6E2: epicoccone B 3.4.9 Hợp chất AM7H: epicoccolides B 3.4.10 Hợp chất AM8D: epicoccolide A 3.5 Kết thử hoạt tính hợp chất phân lập 3.5.1 Kết thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định hợp chất 3.5.2 Kết xác định hoạt tính chống oxi hóa hợp chất 3.5.3 Hoạt tính gây độc tế bào hợp chất phân lập KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN KIẾN NGHỊ CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TẠP CHÍ NƯỚC NGỒI TÀI LIỆU THAM KHẢO Phụ lục 1: Danh sách đặc điểm hình thái 48 chủng vi khuẩn phân lập Phụ lục Danh sách đặc điểm hình dáng 36 chủng vi nấm phân lập từ 03 mẫu rong Kappaphycus Phụ lục Đặc điểm sinh lý/ sinh hóa chủng Vi khuẩn phân lập Phụ lục Kết sàng lọc hoạt tính kháng chủng vi sinh vật kiểm định chủng vi khuẩn phân lập Phụ lục Kết sàng lọc hoạt tính kháng chủng vi sinh vật kiểm định chủng vi nấm phân lập Phụ lục Kết phân tích trình tự gene 16s rRNA chủng vi khuẩn Trình từ ITS Sequence hai chủng nấm Phụ lục Phụ lục hợp chất AM3A1: 4-hydroxybenzaldehyde 9.2 Phổ 13C-NMR hợp chất AM3A1 10.1 Phổ HR-ESI-MS hợp chất AM3D 10.4 Phổ HMBC hợp chất AM3D Phụ lục 11 Hợp chất AM4F1: 2-O-methylbutyrolactone II 11.4 Phổ HMBC hợp chất AM4F1 12.1 Phổ HR-ESI-MS hợp chất AM6E1 12.4 Phổ HMBC hợp chất AM6E1 13 Phổ HR-ESI-MS hợp chất AM6E2 13.2 Phổ 1H-NMR hợp chất AM6E2 13.4 Phổ HMBC hợp chất AM6E2 14.1 Phổ HR-ESI-MS hợp chất AM7H 14.4 Phổ HMBC hợp chất AM7H 15.1 Phổ HR-ESI-MS hợp chất AM8D 15.2 Phổ 1H-NMR hợp chất AM8D 15.3 Phổ HMBC hợp AM8D Phụ lục 16 Hợp chất AM8A1: Aspersiensis A (hợp chất mới) ... sát đặc điểm, đa dạng vi sinh vật hoạt tính sinh học từ vi sinh vật sống bám rong, tiến hành thực đề tài: ? ?Nghiên cứu đặc điểm hoạt tính sinh học số chủng vi sinh vật liên kết với rong sụn Kappaphycus. ..HỌC VI? ??N KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ………………………………… Hà Nội - 2022 NGUYỄN ĐÌNH LUYỆN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT LIÊN KẾT VỚI RONG SỤN KAPPAPHYCUS ALVAREZII. .. Kappaphycus alvarezii vùng biển Nha trang, Khánh hòa, định hướng sử dụng y dược học? ?? Mục tiêu nội dung nghiên cứu đề tài: Mục tiêu nghiên cứu: Đánh giá đa dạng vi sinh vật liên kết với rong Kappaphycus