Khóa K04 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA LÂM HƯNG KIM HỒN CƠNG NGHỆ SINH HỌC NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ, BÌNH TUYỂN VÀ XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CÂY MẸ ƯU TÚ PHỤC VỤ CÔNG TÁC CHỌN TẠO GIỐNG SÂM NGỌC LINH (PANAX VIETNAMENSIS HA ET GRUSHV) CHẤT LƯỢNG CAO TẠI QUẢNG NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ LÂM HƯNG KIM HỒN CƠNG NGHỆ SINH HỌC Đà Nẵng,08/2022 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA LÂM HƯNG KIM HỒN NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ, BÌNH TUYỂN VÀ XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CÂY MẸ ƯU TÚ PHỤC VỤ CÔNG TÁC CHỌN TẠO GIỐNG SÂM NGỌC LINH (PANAX VIETNAMENSIS HA ET GRUSHV) CHẤT LƯỢNG CAO TẠI QUẢNG NAM Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Mã số : 107180388 LUẬN VĂN THẠC SĨ NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS NGUYỄN HOÀNG TRUNG HIẾU TS ĐINH XUÂN TÚ Đà Nẵng,08/2022 i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn thạc sĩ này, xin bày tỏ cảm ơn chân thành đến trường Đại học Bách Khoa Đà Nẵng, ban lãnh đạo khoa Hóa thầy thuộc môn Công nghệ sinh học tạo điều kiện cho tơi học tập suốt hai năm qua Và đặc biệt xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới thầy Nguyễn Hoàng Trung Hiếu thầy Đinh Xuân Tú định hướng, trực tiếp dẫn dắt, hướng dẫn hỗ trợ tận tình cho tơi suốt thời gian thực đề tài nghiên cứu khoa học Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến anh chị trung tâm Kỹ thuật Nông nghiệp, huyện Nam Trà My, tỉnh Quảng Nam hỗ trợ tạo điều kiện nhiệt tình để tơi thu thập sử dụng số liệu cho nghiên cứu Sau cùng, xin tỏ lòng biết ơn đến người thân, bạn bè, đồng nghiệp bên cạnh ủng hộ, động viên tơi sống thời gian hồn thành luận văn thạc sĩ Xin chân thành cảm ơn tất người! Đà Nẵng, ngày 28 tháng năm 2022 Học viên thực Lâm Hưng Kim Hoàn THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Lưu hành nội ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài “Nghiên cứu đánh giá, bình tuyển xây dựng tiêu chuẩn mẹ ưu tú phục vụ công tác chọn tạo giống sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv) chất lượng cao Quảng Nam” cơng trình nghiên cứu riêng tơi hướng dẫn khoa học TS Nguyễn Hoàng Trung Hiếu TS Đinh Xuân Tú Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố công trình khác Người cam đoan Lâm Hưng Kim Hồn THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Lưu hành nội iii Nghiên cứu đánh giá, bình tuyển xây dựng tiêu chuẩn mẹ ưu tú phục vụ công tác chọn tạo giống sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv) chất lượng cao Quảng Nam Học viên: Lâm Hưng Kim Hoàn Chuyên ngành: Cơng nghệ Sinh học Mã số: 8420201 Khóa: K40 Trường Đại học Bách khoa - ĐHĐN Tóm tắt – Từ 15 quần thể sâm Ngọc Linh thu thập qua tuyển chọn sơ bao gồm 150 cá thể, tiến hành nghiên cứu để xây dựng tiêu mẹ ưu tú Giám định mẫu sâm Ngọc Linh chuẩn theo thị phân tử cho thấy 100% mẫu sâm chuẩn Đánh giá đa dạng quần thể qua 36 đặc điểm hình thái cho thấy quần thể có đồng cao Mối quan hệ di truyền thể qua hệ số tương đồng di truyền 15 quần thể sâm Ngọc Linh nghiên cứu dao động từ 0,43 - 0,88 Dựa đặc điểm sinh trưởng tốt nghiên cứu chọn quần thể sâm Ngọc Linh ưu tú M1, M3, M9, M14, tiếp tục tuyển chọn dựa vào hàm lượng dược liệu cao chọn cá thể sâm ưu tú S1 S6 Hàm lượng dược liệu mẫu sâm ưu tú xác định cao nhiều so với dược điển Việt Nam Đề xuất tiêu chuẩn mẹ ưu tú có đặc điểm sinh trưởng phát triển tốt, hàm lượng dược liệu cao bao gồm 17 tiêu Từ khóa – Sâm Ngọc Linh Panax vietnamensis Ha et Grushv, tiêu chuẩn mẹ ưu tú Research, evaluate, select and standardization of excellent mother plants for the selection and breeding of high quality Ngoc Linh ginseng (Panax vietnamensis Ha et Grushv) in Quang Nam Abstract - From 15 populations of Ngoc Linh ginseng collected through preliminary selection, including 150 individuals, we conducted research to build a set of excellent mother plants Examination of standard Ngoc Linh ginseng samples according to molecular indicators showed that 100% of standard ginseng samples Evaluation of the diversity of the population through 36 morphological characteristics showed that the population had high homogeneity The genetic relationship shown by the genetic similarity coefficient between 15 populations of Ngoc Linh ginseng ranged from 0.43 to 0.88 Based on good growth characteristics, the research has selected excellent populations of Ngoc Linh ginseng: M1, M3, M9, M14, and continued to select based on high medicinal content, individuals THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Lưu hành nội iv have been selected is S1 and S6 The medicinal content of the elite ginseng samples was determined to be much higher than that of the Vietnamese pharmacopoeia Proposing a set of standards for an excellent mother plant with good growth and development characteristics and high medicinal content, including 17 criteria Key words – Panax vietnamensis Ha et Grushv, mother tree standard THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Lưu hành nội v MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu nghiên cứu Đối tượng phạm vi nghiên cứu 3.1 Đối tượng nghiên cứu 3.2 Phạm vi nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu Các bước nghiên cứu tiến hành sau: Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 5.1 Ý nghĩa khoa học 5.2 Ý nghĩa thực tiễn .4 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Sâm Ngọc Linh 1.1.1 Nguồn gốc lịch sử phát triển sâm Ngọc Linh 1.1.2 Đặc điểm hình thái, sinh trưởng phát triển Sâm Ngọc Linh 1.1.3 Đặc điểm thành phần hóa học sâm Ngọc Linh 1.1.4 Giá trị dược liệu sâm Ngọc Linh 12 1.2 Cơ sở lý thuyết phương pháp PCR đa mồi (multiplex PCR) 13 1.2.1 Khái niệm .13 1.2.2 Các loại phản ứng multiplex PCR .14 1.2.3 Thiết kế mồi cho phản ứng multiplex PCR 15 1.2.4 Ưu điểm phương pháp multiplex PCR 15 1.2.5 Tối ưu hóa thành phần cho phản ứng multiplex PCR 16 1.2.6 Ứng dụng phản ứng multiplex PCR 18 1.3 Cơ sở lý thuyết diện di THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG 18 Lưu hành nội vi 1.3.1 Khái niệm .18 1.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng 19 1.3.3 Sự rây phân tử .20 1.3.4 Điện di gel 21 1.3.5 Thiết bị cho điện di gel 21 1.3.6 Linh độ tương đối 22 1.3.7 Quan sát vùng phân tách 22 1.4 Chỉ thị phân tử 23 1.4.1.Khái niệm đặc điểm 23 1.4.2 Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeats) 23 1.4.3 Expressed Sequence Tag (EST) 23 1.5 Tổng quan tình hình nghiên cứu ngồi nước có liên quan đến đề tài 224 1.5.1 Tình hình nghiên cứu nước 25 1.5.2.Tình hình nghiên cứu nước .27 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 2.1 Nguyên vật liệu 29 2.2 Phương pháp nghiên cứu 31 2.2.1 Thu thập mẫu tách chiết ADN tổng số 32 2.2.2 Giám định mẫu sâm Ngọc Linh chuẩn kỹ thuật PCR 33 2.2.3 Đánh giá khả sinh trưởng phát triển, đặc điểm hình thái 34 2.2.4 Phân tích định lượng saponin củ sâm Việt Nam .35 2.2.5 Xây dựng tiêu chuẩn mẹ ưu tú 36 2.2.6 Phương pháp thống kê 37 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 38 3.1 Kết thu thập giám định mẫu sâm Ngọc Linh chuẩn thị phân tử Error! Bookmark not defined 3.1.1 Thu thập mẫu sâm Ngọc Linh 38 THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Lưu hành nội vii 3.1.2 Kiểm định tính giống sâm Ngọc Linh kỹ thuật PCR 39 3.2 Kết đánh giá nguồn gen dựa vào đặc diểm hình thái sâm Ngọc Linh 41 3.3 Nghiên cứu mối quan hệ di truyền quần thể sâm Ngọc Linh thị EST-SSR 49 3.3.1 Xác định nhiệt độ gắn mồi tối ưu cho phản ứng PCR 50 3.3.2 Xác định allen đa hình số PIC 51 3.3.3 Mối quan hệ di truyền quần thể sâm Ngọc Linh phân loại 57 3.4 Kết đánh giá đặc điểm sinh trưởng quần thể tuyển chọn mẹ 69 3.4.1 Đánh giá đặc điểm sinh trưởng 69 3.4.2 Đánh giá hàm lượng dược liệu mẫu ưu tú .72 3.4.3 Đề xuất tiêu chuẩn mẹ đầu dòng .75 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 77 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 78 THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Lưu hành nội viii DANH MỤC VIẾT TẮT ADN : Deoxyribonucleic acid KHCN : Khoa học công nghệ PCR : Polemerase Chain Reaction PIC : Polymorphic Information Content Pi : Tần số xuất alen thứ i PCA : Principal Components Analysis THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Lưu hành nội 79 Hương, Nguyễn Thị Thu Hương, Nguyễn Phúc Huy, Trần Công Luận, Vũ Quốc Luận, Nguyễn Bá Nam, Phạm Bích Ngọc, Dương Tấn Nhựt, Hồng Thanh Tùng, Trần Đình Phương (2015), “Đánh giá tác dụng tăng lực saponin rễ tơ chuyển gen sâm Ngọc Linh (Panax Vietnamensis Ha et Grushv.)”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 13(1), tr.75-82, [Online] Available: https://www.researchgate.net/publication [Truy cập ngày: 21.11.2021] [10] Chu Hồng Hà, Trịnh Thị Hương, Phạm Bích Ngọc, Dương Tấn Nhựt (2016), “Đánh giá khả sinh trưởng tích lũy saponin rễ bất định rễ tơ sâm Ngọc Linh Panax Vietnamensis et Grushv.)”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 14(2), tr.231-236, [Online] Available: https://www.researchgate.net/profile/Huong- Tt/publication [Truy cập ngày: 21.11.2021] [11] Đỗ Đăng Giáp, Lê Tấn Đức, Nguyễn Văn Kết, Trần Thị Ngọc Hà, Nguyễn Thị Ngọc Hân, Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Đức Minh Hùng, Phan Tường Lộc, Bùi Đình Thạch, Phạm Đức Trí, Mai Trường, Trần Trọng Tuấn (2014), “Tạo nhân phôi soma sâm Ngọc Linh Panax Vietnamensis et Grushv.) môi trường lỏng”, Tạp chí Khoa học Phát triển, 12(7), tr.1085-1095 [12] Lê Tấn Đức, Đỗ Đăng Giáp, Trần Thị Ngọc Hà, Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Đức Minh Hùng, Nguyễn Văn Kết, Trần Cơng Luận, Phan Tường Lộc, Bùi Đình Thạch, Nguyễn Thị Thanh, Phạm Đức Trí, Mai Trường, Trần Trọng Tuấn (2013), “Nghiên cứu ni cấy mơ sẹo có khả sinh phôi mô phôi soma sâm Ngọc Linh (Panax Vietnamensis et Grushv.)”, Tạp Chí Sinh Học, 35(3), 145-157 [Online] Available: http://vci.vnu.edu.vn/upload/15022/pdf/575f83d67f8b9aaf8b8b458c.pdf [Truy cập ngày: 21.11.2021] [13] Nguyễn Quốc Bình, Vũ Thị Đào, Hà Thị Loan, Nguyễn Hồng Qn, Dương Hoa Xơ, Nguyễn Hồng Qn, Nathalie Pawlicki-Jullian, Eric Gontier (2014), “Nghiên cứu tạo rễ tóc sâm ngọc linh Panax Vietnamensis phương pháp chuyển gen Rol nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes”, Tạp Chí Sinh Học, 36(1), tr.293-300 [Online] Available: http://vci.vnu.edu.vn/upload/15022/pdf/575f83b57f8b9ad0888b45cf.pdf [Truy cập ngày: 21.11.2021] [14] Chu Đức Hà, Lê Hùng Lĩnh, Khuất Thị Mai Lương, Đinh Văn Phê, Lê Thị Ngọc Quỳnh, Hà Minh Tâm, Phạm Phương Thu (2021), “Hình thái hoạt tính sinh học giống sâm Panax ginseng tiếng Hàn Quốc Việt Nam”, Tạp chí Khoa học THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Lưu hành nội 80 Công Nghệ Việt Nam, [15] Bộ Y tế (2017), Dược điển Việt Nam V tập 1, Hà Nội [16] Nguyễn Đức Thành (2014) “Các kỹ thuật thị DNA nghiên cứu chọn lọc thực vật, Tạp chí Sinh học, 36(3), tr.265-294 Tiếng Anh [17] Duc N.M., R Kasai, K Ohtani, A Ito, N.T.Nham, K Yamasaki and O Tanaka, “Newsaponins from Vietnamese ginseng: Highlightson biogenesis of dammarane triterpenoids”, Advances in Experimental Medicine andBiology, vol 404, 1996 [18] K L Vu-Huynh, H T Nguyen, T H Van Le, C T Ma, G J Lee, S W Kwon, J H Park, and M D Nguyen, “Accumulation of Saponins in Underground Parts of Panax vietnamensis at Different Ages Analyzed by HPLC-UV/ELSD”, Molecules, vol 25, no 13, p 3086, 2020 [19] Kyong Hwan Bang, A Yeon Seo, Young Chang Kim, Ick Hyun Jo, Jang Uk Kim, Dong Hwi Kim, Seon Woo Cha, Yong Gu Cho and Hong Sig Kim, “Variations of agronomic characteristics of cultivars and breeding lines in Korean Ginseng (Panax ginseng C A Mey.)”, Korean J Medicinal Crop Sci, Vol 20, No 4: 231−237, 2012 [Online] Available http://bx.doi.org/10.7783/KJMCS.2012.20.4.231 [Accessed Nov 21,2021] [20] Experts from the Republic of Korea, Panax ginseng C.A Mey “Guidelines for the conduct of tests for distinctness, uniformity and stability”, in Technical Working Party for Agricultural Crops 46 meeting, June.19-23, 2017, Hanover, Germany [Online] Available: https://www.upov.int/edocs/mdocs/upov/en/twa_46/tg_224_2_proj_1.pdf [Accessed Nov 21,2021] [21] LijuanChen, YeYang, JinGe, XiumingCui, YinXiong, “Study on the grading standard of Panax notoginseng seedlings”, Journal of Ginseng Research, vol 42, no 2, 208-217, April 2018 [22] Konoshima T., Takasaki M., Tokuda H., Nishino H., Duc N.M., Kasai R., Yamasaki K., “Anti-tumor-promoting activity of majonoside-R2 from Vietnamese ginseng, Panax vietnamensis Ha et Grushv”, Biol Pharm Bull, vol 21, p.834–838, 1998 [23] Tran, Q.L., Adnyana I.K., Tezuka Y., Nagaoka T., Tran Q.K., Kadota S.,“Triterpene saponins from Vietnamese ginseng (Panax vietnamensis) and their THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Lưu hành nội 81 hepatocytoprotective activity”, J Nat Prod, vol 64, p.456–461, 2001 [24] https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/11835531/ Accessed May 20, 2022 [25] http://www.premierbiosoft.com Accessed May 20, 2022 [26] http://www.chimicare.org Accessed May 20, 2022 THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Lưu hành nội THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Lưu hành nội THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Lưu hành nội THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Lưu hành nội THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Lưu hành nội THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Lưu hành nội THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Lưu hành nội THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Lưu hành nội THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Lưu hành nội THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Lưu hành nội THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Lưu hành nội THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Lưu hành nội THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG hành nội Lưu ... HƯNG KIM HỒN NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ, BÌNH TUYỂN VÀ XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CÂY MẸ ƯU TÚ PHỤC VỤ CÔNG TÁC CHỌN TẠO GIỐNG SÂM NGỌC LINH (PANAX VIETNAMENSIS HA ET GRUSHV) CHẤT LƯỢNG CAO TẠI QUẢNG NAM Chuyên... tài: ? ?Nghiên cứu đánh giá, bình tuyển xây dựng tiêu chuẩn mẹ ưu tú phục vụ công tác chọn tạo giống sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv) chất lượng cao Quảng Nam? ?? Mục tiêu nghiên cứu. .. NẴNG Lưu hành nội iii Nghiên cứu đánh giá, bình tuyển xây dựng tiêu chuẩn mẹ ưu tú phục vụ công tác chọn tạo giống sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv) chất lượng cao Quảng Nam Học