Nghiên cứu đa dạng loài giun đất ở vùng Đông Nam Bộ (Việt Nam) dựa vào dữ liệu hình thái và sinh học phân tử.Nghiên cứu đa dạng loài giun đất ở vùng Đông Nam Bộ (Việt Nam) dựa vào dữ liệu hình thái và sinh học phân tử.Nghiên cứu đa dạng loài giun đất ở vùng Đông Nam Bộ (Việt Nam) dựa vào dữ liệu hình thái và sinh học phân tử.Nghiên cứu đa dạng loài giun đất ở vùng Đông Nam Bộ (Việt Nam) dựa vào dữ liệu hình thái và sinh học phân tử.Nghiên cứu đa dạng loài giun đất ở vùng Đông Nam Bộ (Việt Nam) dựa vào dữ liệu hình thái và sinh học phân tử.Nghiên cứu đa dạng loài giun đất ở vùng Đông Nam Bộ (Việt Nam) dựa vào dữ liệu hình thái và sinh học phân tử.Nghiên cứu đa dạng loài giun đất ở vùng Đông Nam Bộ (Việt Nam) dựa vào dữ liệu hình thái và sinh học phân tử.Nghiên cứu đa dạng loài giun đất ở vùng Đông Nam Bộ (Việt Nam) dựa vào dữ liệu hình thái và sinh học phân tử.Nghiên cứu đa dạng loài giun đất ở vùng Đông Nam Bộ (Việt Nam) dựa vào dữ liệu hình thái và sinh học phân tử.
GIỚI THIỆU
Đặt vấn đề
Giun đất, thuộc ngành Giun đốt (Annelida) và lớp Giun ít tơ (Oligochaeta), là nhóm động vật phổ biến trong môi trường đất, với vai trò quan trọng trong việc quyết định tính chất vật lý, hóa học và sinh học của đất Nhiều loài giun đất được ứng dụng trong chăn nuôi, xử lý rác thải, cải tạo đất, sản xuất phân hữu cơ và y học dân gian Chúng cũng là chỉ thị cho tình trạng ô nhiễm đất và tính chất đất Hiện nay, các chất chiết xuất từ giun đất có khả năng chống đông máu, kháng viêm và kháng oxy hóa, được sử dụng trong các loại thuốc chữa bệnh.
Trên toàn cầu, có khoảng 6.200 loài giun đất thuộc 23 họ (Csuzdi & Szlávecz, 2016), trong khi tại Việt Nam, nghiên cứu của Nguyen et al (2016a) đã ghi nhận 212 loài thuộc 24 giống trong 8 họ Tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu chỉ tập trung vào khu vực từ miền Trung phía Nam đến các tỉnh phía Bắc và Đồng bằng sông Cửu Long Đặc biệt, khu vực Đông Nam Bộ, với diện tích lớn 23.607,8 km² (chiếm 7,1% diện tích cả nước), mới chỉ được ghi nhận 18 loài giun đất do thiếu nghiên cứu hệ thống và sâu rộng (Perrier, 1872, 1875; Omodeo, 1957; Bái và ctv., 2004; Nhi, 2014; Mai và ctv., 2015; Nguyen et al., 2015a, 2015b).
Nghiên cứu phân loại học giun đất hiện nay chủ yếu dựa vào đặc điểm hình thái, dẫn đến một số hạn chế như khó xác định giá trị phân loại ở từng đặc điểm và khó phân biệt giữa các loài đồng hình hoặc cá thể của loài đa hình Giun đất có sự phổ biến dị lớn, ngay cả đặc điểm cơ quan sinh dục cũng không ổn định như ở nhiều nhóm sinh vật khác Vì lý do này, vẫn còn nhiều tranh luận về vị trí phân loại của một số taxon bậc giống và bậc họ, đặc biệt là họ Megascolecidae, nhóm chiếm ưu thế ở Việt Nam.
Gần đây, kỹ thuật phân tích và so sánh trình tự DNA đã trở thành công cụ quan trọng trong nghiên cứu phân loại, đa dạng di truyền và tiến hóa của giun đất Việc xác định loài thông qua so sánh trình tự DNA đạt độ chính xác cao, dẫn đến việc cơ sở dữ liệu gen toàn cầu đã được cập nhật với hơn 206 triệu trình tự, trong đó nhóm giun đất chiếm hơn 200.000 trình tự Nguồn dữ liệu này rất quý giá cho việc giải quyết các vấn đề liên quan đến phân loại, đánh giá đa dạng sinh học và mối quan hệ giữa các loài Hiện nay, mã vạch DNA dựa trên gen ty thể (gen COI) đang được áp dụng để hỗ trợ nghiên cứu này.
16S rRNA là công cụ quan trọng trong việc xác định loài và đánh giá đa dạng sinh học, đặc biệt là ở động vật và giun đất (Rougerie et al., 2009).
Tại Hội nghị Quốc tế về Sinh thái Giun đất lần thứ 10, các nhà khoa học nhấn mạnh tầm quan trọng của việc kết hợp phân loại học truyền thống với hệ thống mã vạch DNA để nâng cao nghiên cứu về đa dạng và phân loại giun đất (Rougerie et al., 2009) Tuy nhiên, ở Việt Nam, nghiên cứu về sinh học phân tử đối với giun đất vẫn còn hạn chế và chưa phát triển mạnh mẽ.
Six studies have been published on various techniques in biological research Bái and colleagues (1996) utilized esterase isozyme electrophoresis, while Bình and Thế (2006) focused on sequencing the COI gene of A aspergillum and A robustus Nguyen et al (2012) employed SDS-PAGE protein electrophoresis and sequenced the COI gene of nine earthworm species from the Mekong Delta, including A polychaetiferus, A juliani, M posthuma, M bahli, M peguana, M houlleti, M cf campanulata, Po elongata, and Po taprobanae.
Năm 2013, nghiên cứu đã giải trình tự gen COI của 19 loài giun đất tại Đồng bằng sông Cửu Long Các tác giả Nguyen et al (2018) và Tran et al (2018) đã áp dụng kỹ thuật RAPD để khảo sát sự đa dạng di truyền của hai loài A rodericensis và A modigliani.
Từ những vấn đề trên, đề tài “Nghiên cứu đa dạng loài giun đất ở vùng Đông Nam
Đề tài nghiên cứu về giun đất tại Việt Nam dựa vào dữ liệu hình thái và sinh học phân tử đã cung cấp thông tin quan trọng về đa dạng, phân bố và tiềm năng sử dụng của loài này Kết quả nghiên cứu không chỉ hoàn thiện công tác điều tra cơ bản cho khu hệ giun đất Việt Nam mà còn định hướng cho các nghiên cứu ứng dụng trong tương lai Hơn nữa, đây là một trong những đóng góp đầu tiên cho việc xây dựng ngân hàng gen cho các loài giun đất tại Việt Nam, cung cấp dữ liệu hữu ích cho việc tái cấu trúc hệ thống phân loại của nhóm loài này trong tương lai.
Mục tiêu nghiên cứu
Đề tài "Nghiên cứu đa dạng loài giun đất ở vùng Đông Nam Bộ (Việt Nam)" được thực hiện nhằm mục tiêu phân tích hình thái và sinh học phân tử của các loài giun đất trong khu vực này Nghiên cứu này không chỉ cung cấp cái nhìn sâu sắc về sự đa dạng sinh học mà còn góp phần bảo tồn các loài giun đất quý hiếm tại Đông Nam Bộ.
1 Làm rõ mức độ đa dạng loài giun đất ở vùng Đông Nam Bộ và mối quan hệ phát sinh giữa các loài trong họ Megascolecidae ở khu vực nghiên cứu.
2 Xác định đặc điểm phân bố và đánh giá tiềm năng sử dụng giun đất ở vùng Đông Nam Bộ (Việt Nam).
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
Độ đa dạng của giun đất tại vùng Đông Nam Bộ, Việt Nam, được nghiên cứu thông qua việc thu thập các loài giun đất và tài liệu có sẵn Mối quan hệ phát sinh giữa các loài giun đất được xác định dựa trên hai gen COI và 16S rRNA của ty thể, tập trung vào họ Megascolecidae, chiếm ưu thế trong khu vực Tiềm năng sử dụng giun đất được đánh giá trên sáu loài có tần suất xuất hiện và độ phong phú cao trong nghiên cứu.
Nghiên cứu được thực hiện trong giai đoạn từ năm 2016 đến 2020 tại vùng Đông Nam Bộ, tập trung vào phần đất liền Mẫu giun đất được thu thập theo phương pháp định tính vào mùa mưa, từ cuối tháng 09 đến giữa tháng 10 hàng năm, thời điểm có số lượng cá thể trưởng thành cao nhất (Tùng, 2013).
Nội dung nghiên cứu
Để giải quyết 2 mục tiêu trên, luận án được thực hiện với 4 nội dung nghiên cứu chính như sau:
Đánh giá độ đa dạng loài giun đất ở Đông Nam Bộ được thực hiện thông qua việc thu thập tài liệu và mẫu vật ngoài thực địa Các mẫu vật được định loại dựa trên hình thái và sinh học phân tử, từ đó tổng kết cấu trúc thành phần loài Nghiên cứu cũng xây dựng khóa định loại và lập danh mục các loài giun đất thuộc họ Megascolecidae hiện diện trong khu vực này.
Nội dung nghiên cứu tập trung vào việc xác định mối quan hệ phát sinh của các loài giun đất thuộc họ Megascolecidae ở Đông Nam Bộ Để thực hiện điều này, chúng tôi tiến hành giải trình tự đoạn gen COI và 16S rRNA của ty thể giun đất, từ đó đánh giá mức độ tương đồng của các trình tự thu được với dữ liệu trong ngân hàng gen NCBI Bên cạnh đó, chúng tôi cũng tính toán khoảng cách di truyền K2P và xây dựng cây quan hệ phát sinh giữa các loài trong họ Megascolecidae.
Nội dung 3: Đánh giá đặc điểm phân bố của giun đất ở vùng Đông Nam Bộ dựa trên các chỉ số sinh thái Phân tích sự phân bố giun đất theo địa hình, loại đất và sinh cảnh trong khu vực nghiên cứu.
Đánh giá tiềm năng sử dụng các loài giun đất ở vùng Đông Nam Bộ dựa trên tần số xuất hiện, độ phong phú, hàm lượng đạm tổng số (đo bằng phương pháp Kjeldahl) và hoạt tính kháng oxy hóa (đo bằng 4 phương pháp DPPH, ABTS, phosphomolybdenum và RP) cho thấy giá trị ứng dụng của chúng trong nông nghiệp và y học.
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
Đề tài nghiên cứu cung cấp thông tin đầy đủ và hệ thống về đa dạng loài giun đất ở Đông Nam Bộ, góp phần xây dựng cơ sở dữ liệu cho động vật chí của nhóm loài giun đất tại Việt Nam Sử dụng dữ liệu phân tử từ gen COI và 16S rRNA, nghiên cứu xác định mối quan hệ phát sinh của giun đất trong họ Megascolecidae, tạo nền tảng cho các nghiên cứu phân loại học và tiến hóa trong tương lai Kết quả nghiên cứu cũng có ý nghĩa thực tiễn, làm cơ sở cho việc ứng dụng giun đất trong cung cấp nguồn đạm cho chăn nuôi và trong lĩnh vực y dược.
Những đóng góp mới của đề tài
Luận án đã hoàn thành điều tra đa dạng loài giun đất ở Đông Nam Bộ, phát hiện 44 loài thuộc 12 giống trong 6 họ Nghiên cứu đã bổ sung 26 loài mới cho khu hệ, trong đó có 15 loài giun đất mới được công nhận cho khoa học, bao gồm các loài như A dorsomorrioides, A minhdam, A longiprostaticus, A ocularius, M malayanoides, M haui, M setosa, M grandiverticulata, M bariaensis, M iranomala, và M houlletoides.
M planatoides, M songbeensis, M xuanlocensis và Ph vungtauensis) và 3 taxon đang chờ công bố loài mới cho khoa học Lần đầu tiên ghi nhận giống Pheretima sensu stricto ở Việt Nam Có 2 loài ghi nhận lần đầu ở Nam Bộ (Euk saltensis và Dic. affinis) và 4 loài ghi nhận lần đầu ở Đông Nam Bộ (A exiguus austrinus, M neoexilis,
Po elongata và Dra beddardi).
Bài viết lần đầu tiên cung cấp dữ liệu phân tử với 100 trình tự COI và 76 trình tự 16S rRNA của các loài giun đất ở Đông Nam Bộ, góp phần xây dựng cơ sở dữ liệu sinh học phân tử về giun đất tại Việt Nam Đây là nghiên cứu đầu tiên kết hợp dữ liệu hình thái và sinh học phân tử để khám phá đa dạng loài giun đất, công bố các loài giun đất mới cho khoa học, xác định lại vị trí phân loại học của một số loài nghi vấn như M iranomala, M cf campanulata, M pacseana, và làm sáng tỏ mối quan hệ phát sinh giữa hai giống Amynthas và Metaphire.
Luận án này trình bày thông tin chi tiết về cấu trúc thành phần loài giun đất tại khu vực Đông Nam Bộ, đồng thời phân tích đặc điểm phân bố của các loài giun đất dựa trên các dạng địa hình, nhóm đất và các sinh cảnh đặc trưng của khu vực này.
Khảo sát tiềm năng ứng dụng của giun đất ở Đông Nam Bộ cho thấy M posthuma có hoạt tính kháng oxy hóa tốt qua bốn phương pháp nghiên cứu Ngoài ra, sáu loài giun đất gồm L mauritii, M pacseana, A polychaetiferus, M posthuma, M bahli và M easupana đều có khả năng cung cấp nguồn đạm quý giá cho ngành chăn nuôi.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Phương tiện nghiên cứu
3.1.1 Dụng cụ, thiết bị và hoá chất
Nghiên cứu này được thực hiện bằng các dụng cụ, thiết bị và hóa chất được trình bày theo từng nhóm nội dung công việc như sau:
Thu mẫu và xử lý mẫu: gồm túi vải, leng, giấy etiket ghi nhãn; máy định vị GPS
72H (Garmin – Nhật), máy ảnh kỹ thuật số Nikon D7000 (Nhật).
Hóa chất: ethanol 99,5% (Việt Nam), formol (Trung Quốc).
Bài viết phân tích các đặc điểm hình thái của các thiết bị khoa học, bao gồm cân điện tử AND EK-610i từ Nhật Bản, kính lúp soi nổi Motic DM143-FBGG-C từ Trung Quốc, kính hiển vi Nikon SMZ1000 với ống kính vẽ từ Nhật Bản, tủ sấy EHRET từ Đức, máy cắt microtome Sakura Accu-Cut SRM 200 CW từ Nhật Bản, và kính hiển vi Olympus CX41 từ Philippines.
Hóa chất sử dụng trong công nghiệp bao gồm ethanol 99,5% (Việt Nam), n-Butanol, glycerin, xylene, và paraffin công nghiệp, tất cả đều được cung cấp từ Xilong – Trung Quốc Ngoài ra, sáp ong, hematoxylin và Eosin Y được nhập khẩu từ Merck – Đức, cùng với Baume Canada từ Kanto – Nhật.
Phân tích sinh học phân tử: gồm bộ micropipette, máy ly tâm chân không Mini
Spin Plus from Germany, the PCR C 1000TM Thermal Cycler from the USA, the BIO-RAD UV 2000 gel imaging system from the USA, the Embi-Tec one-dimensional electrophoresis system from the USA, the Akira -20°C refrigerator from Japan, incubators, vortex mixers, and the Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit from Germany are essential laboratory equipment and reagents for molecular biology research.
The article discusses various essential chemicals and reagents used in molecular biology, including ExoSAP-IT from Affymetrix, protein K at 10 mg/ml from Merck, ethanol and TAE 1X from Merck, TBE 1X also from Merck, KOD Fx Neo 2x Buffer from Toyobo, dNTP Mix at 2 mM from Promega, Taq DNA polymerase at 5U from Promega, agarose from Bioline, and specific primers LCO1490 and HCO2198, along with 16SF.
EW và 16SR1-EW, loading bufer (Qiagen – Mỹ).
Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa: gồm máy cô quay chân không Heidolph
The article highlights key laboratory equipment, including the Lab 850 pH meter from Shott Instruments (Germany), the Centrifuge model 0412-1 from China, the Thermo Scientific spectrophotometer from Finland, the Memmert incubator (Germany), and the Mettler Toledo AB104-S analytical balance from Finland.
The article discusses various chemicals used in analysis, including ABTS (2,2-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid), DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl), and Folin-Ciocalteu, sourced from Merck (Germany) and other suppliers from China, Vietnam, and India It also mentions the use of 99.5% ethanol, sodium carbonate (Na2CO3), ascorbic acid, gallic acid, potassium ferricyanide (K3Fe(CN)6), chloroacetic acid (Cl3CCOOH), ammonium molybdate, and ferric chloride (FeCl3) in analytical methods Additionally, the total nitrogen content is analyzed using specific testing kits designed for protein content determination.
Kjeldahl (như ống Kjeldahl, thiết bị chưng cất đạm, bình tam giác).
Hóa chất: H2SO4, HCl, K2SO4, CuO, NaOH, axit Boric, Phenolphthalein.
3.1.2 Mẫu vật Đánh giá mức đa dạng về thành phần loài giun đất dựa trên kết quả phân tích của 8.114 cá thể giun đất thu trực tiếp ngoài thực địa và sử dụng lại bộ mẫu đã thu trước đây ở tỉnh Đồng Nai và Bình Dương của Dương Chí Trọng, Nguyễn Văn Thẳng, Lê Văn Nhãn và Nguyễn Thị Ngọc Nhi Trong số đó, có 2.575 cá thể được chọn để xây dựng bộ mẫu hình thái (2.037 cá thể) và bộ mẫu phân tử (538 cá thể) (Phụ lục 1).
Khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá được thực hiện trên 652 g mẫu sống (đã loại bỏ hệ tiêu hoá và rửa sạch) của 6 loài là L mauritii (100 g), A polychaetiferus (140 g),
M pacseana (200 g), M bahli (90 g), M posthuma (62 g) và M easupana (60 g) Độ đạm tổng số được đo dựa trên 946 g mẫu sống (đã loại bỏ hệ tiêu hoá và rửa sạch) của
6 loài là L mauritii (168 g), M bahli (86 g), M posthuma (179 g), M easupana (146 g), M pacseana (243 g) và A polychaetiferus (124 g).
Phương pháp nghiên cứu
3.2.1 Phương pháp thu mẫu và xử lý mẫu
Mẫu giun đất ở Đông Nam Bộ được thu thập chủ yếu vào cuối mùa mưa, từ cuối tháng 09 đến giữa tháng 10, khi có nhiều cá thể trưởng thành nhất (Tùng, 2013) Tổng cộng có 263 điểm thu mẫu được phân bố tại 6 tỉnh thành trong khu vực Đông Nam Bộ, không bao gồm các đảo (Hình 3.1).
Giun đất được thu thập theo phương pháp của Górny & Grum (1993), sử dụng leng đào ở những khu vực có độ ẩm cao Mẫu giun được thu trực tiếp bằng tay, và độ sâu hố đào thay đổi tùy theo từng điểm thu mẫu, dừng lại khi không còn giun Phạm vi thu mẫu tại mỗi điểm phụ thuộc vào mức độ đa dạng của các loài giun và độ phức tạp của môi trường xung quanh.
Sau khi thu thập, giun đất được cho vào túi vải kèm theo đất ẩm và nhãn ghi đầy đủ thông tin như địa chỉ, tọa độ, địa hình, loại đất, sinh cảnh, thời gian và người thu mẫu Ngoài ra, cần ghi nhận các yếu tố đặc biệt như chế độ phân bón, thuốc trừ sâu và các hoạt động canh tác của người dân ảnh hưởng đến giun đất Địa hình và loại đất tại mỗi điểm nghiên cứu được xác định bằng cách đối chiếu tọa độ thực địa với tọa độ trên bản đồ địa hình và bản đồ đất từ cơ sở dữ liệu Geographic Information System của Khoa Địa lý, Đại học.
Địa hình khu vực nghiên cứu được xác định qua độ cao so với mực nước biển và mức độ bằng phẳng của bề mặt Vùng đồng bằng có độ cao dưới 40 m và bề mặt tương đối bằng phẳng, trong khi vùng đồi núi có độ cao trên 40 m với bề mặt lượn sóng Các loại đất được phân loại theo màu sắc và đặc điểm: đất đỏ vàng có màu đỏ vàng, thường bị nén chặt và nghèo mùn; đất xám có màu trắng, trắng xám hoặc xám tro, tơi xốp và nghèo mùn; đất phù sa có màu nâu tươi, tơi xốp và giàu mùn.
Sinh cảnh tại các điểm thu mẫu được phân loại dựa trên hệ thực vật và mức độ tác động từ môi trường, bao gồm rừng, bãi hoang, đất trồng cây lâu năm và đất trồng cây ngắn ngày (Bái, 1983) Rừng chủ yếu là rừng thứ sinh, tập trung tại các khu bảo tồn thiên nhiên như Bình Châu – Phước Bửu, VQG Bù Gia Mập và VQG Cát Tiên Bãi hoang thường có cây bụi và cỏ dại, chủ yếu xuất hiện ven đường Đất trồng cây lâu năm bao gồm các vườn cây công nghiệp như cao su, điều, cà phê, hồ tiêu và một số cây ăn quả, trong khi đất trồng cây ngắn ngày thường trồng các loại thực vật như khoai mì, mía, bắp và đậu phộng.
3.2.1.2 Phương pháp xử lý mẫu
Mẫu giun đất được xử lý bằng cách rửa sạch và làm chết bằng dung dịch formol 2% Sau đó, giun được xếp thẳng vào hộp và cố định trong 15 phút Tiếp theo, cho dung dịch formol 4% (tỉ lệ 1:9) vào hộp và để định hình trong 8-10 giờ Cuối cùng, thay dung dịch formol 4% mới để bảo quản mẫu, bổ sung định kỳ mỗi 6 tháng khi lượng formol đã bay hơi (Tùng, 2013).
Mẫu giun đất dùng cho phân tích sinh học phân tử cần được rửa sạch với nước trước khi đưa vào lọ chứa ethanol 99,5% Ethanol cần được thay mới định kỳ từ 1 đến 2 tháng một lần (Rümbke et al., 2016).
Mẫu giun đất được sử dụng để khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa và đo độ đạm tổng số, được giữ sống và mang về phòng thí nghiệm Sau đó, giun được mổ, loại bỏ hệ tiêu hóa, rửa sạch và cân trọng lượng Đối với khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa, giun đất được cắt nhuyễn và ngâm trong ethanol 96% trong 5 lần, mỗi lần khoảng 24 giờ Dịch chiết từ các lần ngâm được gom lại và cô quay đuổi dung môi để thu cao chiết giun đất Mẫu đo đạm tổng số được bảo quản trong tủ đông ở nhiệt độ -20°C.
3.2.2 Phương pháp định loại bằng dẫn liệu hình thái Định loại giun đất bằng dẫn liệu hình thái là công việc tương đối phức tạp vì đặc điểm của hệ sinh dục được xem là ổn định với nhiều nhóm động vật nhưng ở giun đất có thể biến đổi trong phạm vi rộng, nhất là các quần thể vượt ra ngoài vùng phân bố gốc (Bái, 1985b) Chính vì thế, số lượng mẫu ở mỗi taxon càng lớn và chất lượng mẫu càng tốt thì độ chính xác trong công tác định loại càng cao Ở mỗi nhóm taxon, ghi nhận các đặc điểm hình thái ngoài (kiểu tơ, kiểu đai sinh dục, hình thái vùng đực, nhú phụ sinh dục, lỗ lưng đầu tiên, kiểu môi…) và cấu tạo trong (túi nhận tinh, manh tràng, đặc điểm hệ sinh dục đực…) (Hình 3.2) Dựa vào các đặc điểm phân tích được, tra cứu theo các khóa định loại của Gates (1972), Sims & Easton (1972), Easton (1979), Bái (1983), Blakemore (2002) hay Tùng (2013) để xác định tên khoa học của loài.
Hình 3.2: Các đặc điểm chẩn loại ở Metaphire posthuma (Vaillant, 1868)
A: Hình thái ngoài; B: Cấu tạo trong
Kết quả định loại hình thái được xác định qua việc phân tích các đặc điểm như màu sắc cơ thể, số đốt, kích thước (chiều dài, đường kính, trọng lượng), vị trí dạ dày cơ, kiểu hậu đơn thận, và các đặc điểm khác như tim bên cuối, tuyến trứng, túi trứng, tuyến tiền liệt, tình trạng vách ngăn đốt Sau khi hoàn tất phân tích, các kết quả sẽ được so sánh với mô tả gốc của từng loài, chú ý đến sự phổ biến dị nhằm tránh nhầm lẫn trong quá trình định loại.
Bảng 3.1: Quy trình thực hiện tiêu bản cố định lát cắt ngang cơ thể giun đất (Lý và ctv., 2010)
STT Giai đoạn Hóa chất Thời gian Ghi chú
Cắt lấy một đoạn mẫu của vùng đực giun đất, từ đốt xvii - xix.
Rửa mẫu Nước máy 2,5 - 4,5 giờ Tùy theo kích thước và thời gian cố định mẫu.
Ethanol 70 o I* 2 giờ Ethanol 70 o II 2 giờ
Ethanol 90 o II 2 giờ Ethanol tuyệt đối I 2 giờ Ethanol tuyệt đối II 2 giờ n – Butanol I 2 giờ n – Butanol II 2 giờ
Tùy thuộc vào kích thước mẫu, thời gian ngâm trong ethanol tuyệt đối II cần được điều chỉnh cho phù hợp; mẫu lớn nên tăng thêm 1 giờ, trong khi mẫu nhỏ thì giảm 1 giờ.
Thực hiện trong tủ sấy ở
Khử xylene Sáp ong : paraffin công nghiệp (1 : 4) 14 giờ 60 o C.
4 Đúc khuôn Sáp ong : paraffin công nghiệp (1 : 4) Trữ mẫu ít nhất
5 Cắt mẫu Sử dụng nguồn lạnh
6 Tải mảnh cắt lên lame
7 Tách paraffin ra khỏi mảnh cắt
Dung dịch albumin Nước nóng khoảng 80 o C
Ethanol 90 o 20 giây - 1,5 phút Ethanol tuyệt đối 1 - 4 phút n – butanol I 3 phút n – butanol II 5 phút trước khi sử dụng ít nhất 3 tháng
Thay đổi tùy theo mẫu, thời gian cố định mẫu và vị trí lát cắt mẫu
9 Xylene II Đến lúc trong mẫu
Dán mẫu Baume Canada Cẩn thận tránh để bọt khí.
Các loại hóa chất được đánh số phía sau thể hiện số lượng lọ chứa cùng loại hóa chất ở từng bước Đối với các taxon đã xác định tên khoa học đến loài, chỉ cần chụp hình các đặc điểm chẩn loại chính Trong trường hợp taxon chưa xác định được tên khoa học đến loài hoặc còn nghi vấn về vị trí phân loại học, cần chụp hình, vẽ thêm các hình đặc tả các đặc điểm chẩn loại, và thực hiện tiêu bản hiển vi cố định cắt ngang qua vùng đực để khảo sát kiểu nhú đực, bao gồm việc xác định có hay không có buồng giao phối và kiểu tuyến phụ sinh dục.
Hình mẫu được chụp bằng phần mềm Motic Images Plus 2.0 kết nối với kính lúp Motic DM143 – FBGG – C, sử dụng camera 3.0 Megapixel Mẫu vật được cố định trên khay mổ với nền đen để tạo sự tương phản và ngập trong nước nhằm tránh chói Các đặc điểm hình thái bên ngoài được chụp trước, sau đó là các đặc điểm cấu tạo bên trong sau khi mẫu đã được giải phẫu và làm sạch Ảnh chụp được lưu dưới định dạng *.jpg.
Hình ảnh được tạo ra bằng kính lúp gắn ống kính vẽ Nikon SMZ1000 cho phép thể hiện chính xác các đặc điểm, kích thước và vị trí của các cơ quan.
Tiêu bản hiển vi của vùng đực giun đất được cố định và cắt ngang theo quy trình của Lý và cộng sự (2010) Sau khi hoàn tất, các tiêu bản này được chụp dưới kính hiển vi Olympus CX41 với máy ảnh 5.0 Megapixels.
3.2.3 Phương pháp định loại bằng dẫn liệu sinh học phân tử
Phương pháp phân tích và xử lý số liệu
3.3.1 Phân tích số liệu sinh học phân tử
Sau khi căn chỉnh và loại bỏ các phần dư của 121 trình tự gen COI, bao gồm 100 trình tự mẫu phân tích và 21 trình tự từ ngân hàng gen NCBI, nghiên cứu đã tập trung vào 33 taxon giun đất thuộc 5 giống trong họ Megascolecidae Cụ thể, giống Amynthas có 20 trình tự từ 7 taxon, giống Metaphire có 86 trình tự từ 20 taxon, giống Polypheretima với 10 trình tự từ 4 taxon, giống Pheretima có 2 trình tự từ 1 taxon, và giống Lampito với 3 trình tự từ 1 taxon Các trình tự phân tích có chiều dài 595 bp, trong đó phần chứa thông tin bảo thủ là 312 bp, thông tin ít biến đổi là 252 bp, và thông tin thay đổi là 283 bp Tần suất các nucleotide T, C, A và G lần lượt là 29,3%, 18%, 29,3% và 23,4%.
Phân tích khoảng cách di truyền được thực hiện theo mô hình K2P trong phần mềm MEGA X với giá trị bootstrap 1.000 lần lặp lại (Kumar et al., 2018).
Trong việc xây dựng cây quan hệ phát sinh chủng loại, việc chọn nhóm đối chứng (outgroup) có quan hệ gần với nhóm phân tích là rất quan trọng để tăng độ tin cậy của cây Nghiên cứu này đã chọn L mauritii làm nhóm đối chứng Dữ liệu từ đoạn gen COI và COI-16S rRNA được sử dụng để xây dựng cây quan hệ, áp dụng hai thuật toán Maximum Likelihood (ML) và Bayesian Inference (BI) nhằm nâng cao độ tin cậy của kết quả Cây phát sinh chủng loại theo ML được thực hiện với 121 trình tự của 33 taxon bằng phần mềm IQTREE, với chỉ số bootstrap 1.000 lần lấy lại mẫu và mô hình tiến hóa TIM3+F+I+G4 Độ tin cậy của các nhánh cây ML được đánh giá qua giá trị bootstrap, phân loại thành cao (> 85%), trung bình (65 – 85%) và thấp (< 65%) Cây phát sinh chủng loại theo BI được xây dựng bằng phần mềm MrBayes với các tham số cụ thể, đảm bảo tính chính xác của phân tích.
Giá trị xác suất hậu nghiệm (Bayesian posterior probability - BPP) được sử dụng để đánh giá mức độ tin cậy của các phân tích gen, với các mức độ như sau: độ tin cậy cao (BPP > 0,85), độ tin cậy trung bình (BPP từ 0,65 đến 0,86) và độ tin cậy thấp (BPP < 0,65) (Anh & Sơn, 2016) Trong nghiên cứu về đoạn gen COI-16S rRNA, đã phân tích 66 trình tự gen từ 28 taxon giun đất thuộc 4 giống: giống Lampito (1 trình tự), giống Amynthas (17 trình tự thuộc 6 taxon), và giống Metaphire (40 trình tự thuộc 17 taxon).
Polypheretima có 8 trình tự thuộc 4 taxon Trình tự gen 16S rRNA của L mauritii (mã số JX157596) được lấy từ NCBI để thiết lập COI-16S rRNA Các trình tự này có tổng chiều dài 1007 bp, bao gồm 599 bp thông tin bảo thủ, 351 bp thông tin ít biến đổi và 408 bp thông tin thay đổi Cây phát sinh chủng loại được xây dựng bằng phần mềm IQTREE trên web server CIBIV, Austria, với chỉ số bootstrap 1.000 lần lấy lại mẫu (Nguyen et al., 2015c) Mô hình tiến hóa phù hợp là TIM3+F+I+G4 với các thông số LogL -12932,7761 và AIC.
Cây phát sinh chủng loại được xây dựng theo phương pháp BI sử dụng phần mềm MrBayes 3.2.7a với các tham số nst = 6, rates = invgamma, mcmc nruns = 2, ngen = 1.000.000, nchains = 4 và samplefreq Kết quả phân tích cho thấy AIC là 26135,5522 với w-AIC là +0,0704, AICc là 26177,7106 với w-AICc là +0,1297, BIC đạt 26799,0409 và w-BIC là +0,9117 (Kalyaanamoorthy et al., 2017).
3.3.2 Xử lý các số liệu về sinh thái học Đặc điểm phân bố của giun đất theo các dạng địa hình, nhóm đất và sinh cảnh ở khu hệ giun đất Đông Nam Bộ được đánh giá dựa trên phân tích các chỉ số sinh thái bằng phần mềm Primer 5 như:
Chỉ số ưu thế Simpson (Simpson, 1949): λ = ∑(pi)2
Chỉ số đa dạng loài Shannon-Weiner (Shannon & Weiner, 1949):
Chỉ số phong phú loài Margalef (Margalef, 1958): d = (S-1)/log(N)
Chỉ số đồng đều Pielou (Pielou, 1966) được tính bằng công thức J’ = H ’ /log(S), trong đó pi là tần số xuất hiện của mỗi loài, được xác định bởi pi = ni/N, với ni là số lượng cá thể của loài thứ i và N là tổng số lượng cá thể của tất cả các loài, S là tổng số loài Độ phong phú về số lượng cá thể (Krebs, 1989) được thể hiện qua công thức n% = ni.
N x 100 Độ phong phú về tổng khối lượng cá thể của loài (Krebs, 1989): p% = pi
Trong nghiên cứu, pi đại diện cho tổng khối lượng cá thể của loài thứ i, trong khi P là tổng khối lượng cá thể của tất cả các loài được thu thập Độ thường gặp hay tần số xuất hiện của loài được tính theo công thức C = ai (Sharma, 2003).
A x 100 là công thức tính tỷ lệ phần trăm của loài nghiên cứu trong tổng số ô thu mẫu Trong đó, A là tổng số ô đã thu mẫu và số ô thu mẫu có loài nghiên cứu xuất hiện được tính là ai Giá trị C được phân loại thành ba nhóm: loài thường gặp khi C > 50%, loài ít gặp khi 50% > C > 25%, và loài ngẫu nhiên khi C < 25%.
3.3.3 Xử lý số liệu kháng oxy hoá và độ đạm tổng số
Hoạt tính kháng oxy hóa tổng của cao chiết giun đất được xác định thông qua giá trị Abs 0,5, sử dụng phương trình hồi quy y = ax + b Để tìm nồng độ x, ta thay thế giá trị 0,5 vào y và giải phương trình, từ đó xác định nồng độ tương ứng với giá trị Abs đo được.
Hiệu quả làm sạch gốc tự do DPPH hay ABTS được tính bằng công thức: EC50
EC50, hay hiệu quả kháng oxy hóa 50%, được tính bằng công thức (Absc – Absm)/Absc x 100, trong đó Absc là giá trị hấp thu quang phổ của mẫu đối chứng âm và Absm là giá trị hấp thu quang phổ của mẫu thử Công thức này giúp xác định khả năng trung hòa gốc tự do DPPH hoặc ABTS của các mẫu.
Năng lực khử sắt được xác định bằng công thức EC50 (%) = (Absm – Absc)/Absm x 100, trong đó EC50 (%) đại diện cho hiệu quả kháng oxy hóa, Absc là giá trị hấp thu quang phổ của mẫu đối chứng âm, và Absm là giá trị hấp thu quang phổ của mẫu thử Để phân tích, cần vẽ phương trình hồi quy y = ax + b cho mỗi loại cao chiết, sau đó thay thế giá trị 50 vào y để tìm x, với x là nồng độ mà tại đó cao chiết có khả năng trung hòa 50% gốc tự do.
Hàm lượng nitơ tổng được tính bằng công thức: (%) = [(Vs – Vb) * 0,014*C/m] * 100, trong đó Vb là thể tích HCl sử dụng trong mẫu trắng (mL) và Vs là thể tích HCl sử dụng trong mẫu (mL) Hàm lượng protein (%) được tính bằng cách nhân hàm lượng nitơ tổng với 6,25 C là nồng độ HCl chuẩn độ (0,1N), 0,014 là hệ số tính ra nitơ, và m là khối lượng mẫu (g).
Số liệu được xử lí bằng phần mềm Excel và Minitab 16.