BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ AN TOÀN VỆ SINH THỰC PHẨM CỦA THỊT HEO TẠI CHỢ BÌNH TÂY Ngành CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn ThS PHẠM MINH NHỰT Sinh viên thực hiện ĐỖ NGUYỄN THỊNH PHÁT MSSV 1611100231 Lớp 16DSHA1 TP Hồ Chí Minh, 2020 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan rằng đồ án tốt nghiệp này là công trình do chính tôi thực hiện Các số liệu thu thập và kết quả phân tích trong báo cáo là trung thực, k.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu
Mẫu thịt heo xay nhuyễn
Môi trường canh Rappaport Vassiliadis Soya broth (RVS)
Môi trường Buffered Peptone Water (BWP)
Môi trường Xylose Lysine Deoxycholate(XLD)
Môi trường Triple Sugar Iron Agae (TSI)
Môi trường Mannitol Phenol Red both
Môi trường Lysine Decacbonxylase (LDC)
2.2.2 Thiết bị và dụng cụ
Bếp từ Cân điện tử
Bể điều nhiệt Bình tam giác
Tủ ấm Cốc thủy tinh
Autoclave Túi nilong vô khuẩn
Bình chứa môi trường Đèn cồn Ống nghiệm có nắp Que cấy vòng Đ a petri vô trùng Que cấy thằng
Bố trí thí nghiệm
2.3 Sơ đồ các quầy thịt heo ở chợ Bình Tây
Hình 2 1 Sơ đồ các quầy thịt heo ở chợ Bình Tây
2.3.2 Tiến hành thí nghiệm Ở mỗi thí nghiệm, tiến hành thu mẫu thịt heo lặp lại là 3 lần.
Phương pháp nghiên cứu
2 4.1 Phương pháp thu và bảo quản mẫu
Các mẫu thu thập được từ các sạp nhỏ lẻ sẽ được cho vào bao nilon sạch, trong khi ở siêu thị, chúng được bọc trong màng thực phẩm Mỗi mẫu sẽ được đánh số và nhanh chóng đưa về phòng thí nghiệm để đảm bảo không bị lây nhiễm lẫn nhau, với khối lượng từ 100-200g Nếu không thể phân tích ngay, các mẫu cần được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ từ 0-4 độ C, và thời gian bảo quản không được vượt quá 36 giờ.
2.4.2 Phương pháp chuẩn bị mẫu
Rã đông mẫu trước khi phân tích là bước quan trọng cần thực hiện trong điều kiện vô trùng Bạn có thể rã đông ở nhiệt độ phòng trong vòng 2 giờ hoặc ở nhiệt độ 45 độ C để đảm bảo mẫu không bị biến đổi và giữ được độ chính xác trong quá trình phân tích.
Mẫu thịt heo xay nhuyễn
Thu mẫu Đánh giá các chỉ tiêu
Chỉ tiêu cảm quan Chỉ tiêu Salmonella Đánh giá kết quả
Hình 2 2 Bố trí thí nghiệm
Cân mẫu là bước đầu tiên trong quy trình phân tích, yêu cầu cân chính xác 25g mẫu với sai số cho phép là ±0.1g Mẫu cần được cho vào bình chứa bằng nhựa hoặc nylon vô trùng Sau khi cân, tiến hành đồng nhất mẫu bằng cách thêm dung dịch pha loãng, nhằm đảm bảo vi sinh vật được phân phối đồng đều trong dung dịch.
2.4.3 Phương pháp phân tích định tính Salmonella Đánh giá sự hiện diện của Salmonella trong mẫu thịt heo xay nhuyễn
2.4.3.1 Nguyên tắc Đây là phương pháp dùng để định tính và kết luận phát hiện hay không phát hiện Salmonella trong một lượng mẫu xác định
Tăng sinh vi sinh vật trong mẫu bằng môi trường BPW, sau đó cấy mẫu đã tăng sinh vào môi trường chọn lọc RVS Tiến hành phân lập trên môi trường XLD và khẳng định kết quả thông qua các thử nghiệm sinh hóa như môi trường TSI, Urea broth, lên men Mannitol, LDC broth, thử nghiệm Indol và thử nghiệm Voges-Proskauer.
25g Thịt heo xay nhuyễn 225ml BPW ở 37 0 C trong 24 giờ
Hút 0,1ml mẫu tăng sinh cho vào ống nghiệm 10ml môi trường RVS ở nhiệt độ 42 0 C ở 24 giờ
Cấy chuyển sang môi trường đ a XLD ở 37 0 C ở 24 giờ huẩn lạc đạc trưng Salmonella: tròn, lòi, trong suốt có tâm đen, xung quanh chuyển sang màu hồng
Các thí nghiệm sinh hóa: TSI; LDC; Urea ; Manitol;
Indole; VP ết luận mẫu
Hình 2 3 Quy trình phân tích định tính Salmonella
Cân 25g mẫu thịt heo xay nhuyễn cho vào túi nylon vô trùng rồi cho vào 225ml môi trường BPW đồng nhất mẫu Đem ủ ở nhiệt độ 37 0 C trong 24 giờ
Cấy 0,1ml dịch mẫu tiền tăng sinh vào ống nghiệm chứa 10ml môi trường RVS Đem ủ ở nhiệt độ 42 0 C trong 24 giờ
Dùng que cấy vòng lấy sinh khối VSV từ môi trường tăng sinh chọn lọc RVS, cấy ria lên môi trường XLD, ủ ở nhiệt độ 37 0 C trong 24 giờ
Khuẩn lạc Salmonella trên môi trường XLD có hình dạng tròn, lồi và trong suốt, có thể có hoặc không có tâm đen Một số dòng vi khuẩn này có tâm đen lớn, bao trùm toàn bộ khuẩn lạc, trong khi môi trường xung quanh chuyển sang màu hồng.
Thí nghiệm khẳng định: huẩn lạc nghi ngờ Salmonell a được kiểm tra sinh hóa:
Thử nghiệm này được thiết kế để đánh giá khả năng của vi sinh vật trong việc sử dụng các nguồn carbohydrate có sẵn trong môi trường, cũng như khả năng sinh ra H2S và khí gas.
Cơ sở sinh hóa Môi trường TSI là môi trường rắn sử dụng trong thử nghiệm sinh hóa Môi trường TSI có các nguồn carbohydrate: lactose 1%, glucose 0,1% và sucrose 1%
Có 3 trường hợp xảy ra khi nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường TSI: chỉ lên men glucose, lên men cả glucose lẫn lactose và không lên men được cả
Khi vi sinh vật lên men glucose trong khoảng thời gian 18-24 giờ, môi trường nuôi cấy sẽ có sự thay đổi pH rõ rệt: phần nghiêng có pH kiềm và phần sâu có pH acid Hiện tượng này được phát hiện khi sử dụng chất chỉ thị pH như phenol red Cụ thể, ở phần nghiêng, glucose được tiêu thụ hoàn toàn và sau đó vi sinh vật chuyển sang sử dụng pepton, dẫn đến sự giải phóng NH3 và tạo ra pH kiềm, làm cho phần nghiêng có màu đỏ Ngược lại, ở phần sâu, quá trình lên men kỵ khí glucose diễn ra, tạo ra các acid hữu cơ và làm giảm pH, khiến phần sâu có màu vàng.
Vi sinh vật có khả năng sử dụng cả hai nguồn carbohydrate, dẫn đến việc cả phần sâu lẫn phần nghiêng đều có tính acid sau 18-24 giờ nuôi cấy Kết quả là, cả hai phần này đều chuyển sang màu vàng do lượng đường lactose đủ để vi sinh vật tiêu thụ trong khoảng thời gian này.
Khi vi sinh vật không thể sử dụng cả hai nguồn carbohydrate, peptone sẽ trở thành nguồn năng lượng chính cho sự sinh trưởng và phát triển của chúng, dẫn đến việc môi trường chuyển sang màu đỏ.
Trong môi trường nếu có tạo thành H 2 S sẽ làm đen môi trường
44 nuôi cấy Còn trường hợp có sinh gas thì sẽ tích tụ trong môi trường và có thể làm v thạch hay tạo thành các bọt khí bên trong
Môi trường TSI được chuẩn bị trong ống nghiệm với phần nghiêng cách nắp khoảng 2,5 cm và phần sâu có chiều cao khoảng 2,5 cm Sử dụng que cấy thẳng để đưa vi sinh vật vào phần sâu mà không chạm đáy ống, sau đó cấy ria lên phần nghiêng Các ống nghiệm được ủ ở 30°C trong 18-24 giờ Ghi nhận các biểu hiện ở phần sâu, phần nghiêng, sinh H2S và sinh gas.
Hình 2 5 Môi trường TSI Thử nghiệm LDC
Nguyên tắc: Nhằm xem VSV có tiết enzyme Lysine decacboxylase hay không
Trong quá trình nuôi cấy vi sinh vật (VSV) lên men đường dextrose vào môi trường LDC, axit được sinh ra khiến màu sắc môi trường chuyển sang tím vàng nhờ chỉ thị Bromocresol purple Sau khi nuôi cấy Salmonella, môi trường sẽ chuyển sang kiềm và giữ nguyên màu tím ban đầu.
Thử nghiệm ( ): môi trường giữ nguyên màu tím ban đầu canh khuẩn đục, môi trường bị kiềm hóa
Thử nghiệm (-): môi trường có màu vàng
Thử nghiệm Urea Broth nhằm xác định vi sinh vật có khả năng phân hủy urea thành ammonia và CO2, nhờ vào enzyme urease mà chúng tiết ra.
Cơ sở sinh hóa: Urea là một hợp chất carbamide rất dễ bị thủy giải
Quá trình thủy giải urea dưới sự xúc tác của urease sẽ tạo ra hai phân tử ammonia Trong dung dịch, các thành phần sau phản ứng sẽ diễn ra theo cơ chế chuyển hóa thuận nghịch, và sản phẩm cuối cùng sẽ được thể hiện qua phản ứng tương ứng.
Urea + H 2 O CO 2 + H 2 O + NH 3 ammonia carbonat
Enzyme urease đóng vai trò quan trọng trong tế bào vi sinh vật (VSV) Khi có sự hiện diện của ure trong môi trường, enzyme này được tổng hợp và giải phóng ra ngoài tế bào, xúc tác cho phản ứng thủy giải urea Sản phẩm của phản ứng này làm tăng độ kiềm của môi trường và thay đổi màu sắc của chất chỉ thị pH.
