Nghiên cứu ứng dụng thực khuẩn thể phòng trừ bệnh héo xanh do vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên cây hoa Cúc (Chrysanthemum spp.).

Nghiên cứu ứng dụng thực khuẩn thể phòng trừ bệnh héo xanh do vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên cây hoa Cúc (Chrysanthemum spp.).Nghiên cứu ứng dụng thực khuẩn thể phòng trừ bệnh héo xanh do vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên cây hoa Cúc (Chrysanthemum spp.).Nghiên cứu ứng dụng thực khuẩn thể phòng trừ bệnh héo xanh do vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên cây hoa Cúc (Chrysanthemum spp.).Nghiên cứu ứng dụng thực khuẩn thể phòng trừ bệnh héo xanh do vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên cây hoa Cúc (Chrysanthemum spp.).Nghiên cứu ứng dụng thực khuẩn thể phòng trừ bệnh héo xanh do vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên cây hoa Cúc (Chrysanthemum spp.).Nghiên cứu ứng dụng thực khuẩn thể phòng trừ bệnh héo xanh do vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên cây hoa Cúc (Chrysanthemum spp.).Nghiên cứu ứng dụng thực khuẩn thể phòng trừ bệnh héo xanh do vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên cây hoa Cúc (Chrysanthemum spp.).Nghiên cứu ứng dụng thực khuẩn thể phòng trừ bệnh héo xanh do vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên cây hoa Cúc (Chrysanthemum spp.).Nghiên cứu ứng dụng thực khuẩn thể phòng trừ bệnh héo xanh do vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên cây hoa Cúc (Chrysanthemum spp.).Nghiên cứu ứng dụng thực khuẩn thể phòng trừ bệnh héo xanh do vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên cây hoa Cúc (Chrysanthemum spp.).Nghiên cứu ứng dụng thực khuẩn thể phòng trừ bệnh héo xanh do vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên cây hoa Cúc (Chrysanthemum spp.).

Giới thiệu

Mục tiêu luận án

Phân lập các dòng vi khuẩn gây bệnh héo xanh có tính độc cao trên cây hoa Cúc và định danh đến mức độ loài.

Nghiên cứu xác định các dòng TKT và thuốc hóa học hiệu quả, cùng với các phương pháp áp dụng nhằm kiểm soát bệnh héo xanh trên cây hoa Cúc trong điều kiện nhà lưới và ngoài đồng.

Xác định các đặc điểm phân loại của các dòng TKT triển vọng dựa vào hình thái quan sát dưới kính hiển vi điện tử TEM, theo thang phân loại của Ủy ban Quốc tế về phân loại virus, là một bước quan trọng trong nghiên cứu vi sinh vật Việc này giúp phân loại chính xác và hiểu rõ hơn về cấu trúc cũng như tính chất của các virus, từ đó hỗ trợ trong việc phát triển các phương pháp điều trị và vaccine hiệu quả.

Nội dung nghiên cứu

Để đạt được các mục tiêu trên, các nội dung chính sau đây được thực hiện:

Nghiên cứu đã phân lập thành công các dòng vi khuẩn gây bệnh héo xanh trên cây hoa cúc, đồng thời xác định các dòng TKT có khả năng kí sinh vi khuẩn gây bệnh này tại một số tỉnh ở Đồng Bằng Sông Cửu Long và tỉnh Lâm Đồng.

Tuyển chọn các dòng TKT triển vọng trong điều kiện phòng thí nghiệm và nhà lưới nhằm phòng trị vi khuẩn gây bệnh héo xanh trên cây hoa Cúc là một nghiên cứu quan trọng Việc này không chỉ giúp nâng cao chất lượng cây hoa Cúc mà còn góp phần giảm thiểu thiệt hại do bệnh héo xanh gây ra Các phương pháp thử nghiệm hiệu quả sẽ được áp dụng để đánh giá khả năng kháng bệnh của các dòng TKT, từ đó tìm ra giải pháp tối ưu cho việc bảo vệ cây trồng.

Nội dung 3: Xác định loại thuốc hóa học có hiệu lực ức chế vi khuẩn

Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh trên cây hoa Cúc trong phòng thí nghiệm và hiệu quả phòng trừ bệnh ở điều kiện nhà lưới.

Đánh giá hiệu quả của TKT trong việc phòng trị bệnh héo xanh do vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên cây hoa Cúc được thực hiện trong điều kiện ngoài đồng Nghiên cứu này nhằm xác định khả năng kiểm soát bệnh lý và bảo vệ cây trồng, từ đó góp phần nâng cao năng suất và chất lượng hoa Cúc Kết quả cho thấy TKT có tác dụng tích cực trong việc giảm thiểu sự phát triển của vi khuẩn gây hại, giúp cây hoa Cúc phát triển khỏe mạnh hơn.

Tính mới của luận án

Nghiên cứu đã xác định được tác nhân vi khuẩn gây bệnh héo xanh trên cây hoa Cúc tại một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long và Lâm Đồng, nhằm phục vụ cho việc phát triển các biện pháp phòng trừ hiệu quả bằng phương pháp sinh học và hóa học.

Phân lập và tuyển chọn các dòng TKT cùng với thuốc hoá học có hiệu quả cao là bước quan trọng trong việc kiểm soát bệnh héo xanh trên cây hoa Cúc Những kết quả này sẽ tạo nền tảng vững chắc để xây dựng quy trình kiểm soát bệnh héo xanh, nhằm nâng cao hiệu quả chăm sóc và bảo vệ cây hoa Cúc.

Phạm vi và đối tượng nghiên cứu

Giống hoa Cúc được sử dụng trong thí nghiệm là Cúc Tiger.

Nguồn vi khuẩn gây bệnh và nguồn tác nhân gây bệnh (TKT) đã được phân lập từ các mẫu bệnh của các giống hoa Cúc khác nhau, được thu thập từ các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) và tỉnh Lâm Đồng.

Một số loại thuốc hóa học hiện có trên thị trường có hoạt chất ức chế vi khuẩn gây bệnh.

Nghiên cứu được tiến hành trong môi trường phòng thí nghiệm nhằm phân lập vi khuẩn và tế bào khối u (TKT), đồng thời tuyển chọn các loại thuốc hóa học có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn.

Nghiên cứu này đánh giá khả năng gây hại của các dòng vi khuẩn R solanacearum và hiệu quả phòng trị của biện pháp sinh học TKT, thuốc hóa học, cũng như sự kết hợp giữa hai phương pháp này Thí nghiệm được tiến hành trong cả điều kiện nhà lưới và ngoài đồng, nhằm cung cấp thông tin hữu ích cho việc quản lý dịch hại hiệu quả.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Nghiên cứu đã xác định được tác nhân vi khuẩn gây bệnh héo xanh trên Cúc là loài Ralstonia solanacearum.

Nghiên cứu đã chỉ ra hiệu quả của TKT, một tác nhân phòng trừ sinh học mới tại Việt Nam, trong việc kiểm soát bệnh héo xanh do vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên cây hoa Cúc Kết quả này mang lại thông tin khoa học quý giá cho lĩnh vực nghiên cứu phòng trừ sinh học bệnh hại cây trồng do vi khuẩn tại Việt Nam.

Nghiên cứu này cung cấp cơ sở khoa học cho việc ứng dụng TKT trong việc kiểm soát bệnh héo xanh do R solanacearum trên cây hoa Cúc Việc áp dụng này không chỉ mang lại hiệu quả cao trong điều kiện sản xuất thực tế mà còn góp phần vào quản lý dịch hại tổng hợp Điều này hỗ trợ sự phát triển bền vững của ngành sản xuất hoa kiểng tại vùng ĐBSCL cũng như trên toàn quốc.

Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp

3.2.1 Nội dung 1: Phân lập các dòng vi khuẩn gây bệnh héo xanh trên cây hoa Cúc và các dòng thực khuẩn thể có khả năng kí sinh vi khuẩn gây bệnh ở một số tỉnh ĐBSCL và tỉnh Lâm Đồng

3.2.1.1 Phân lập các dòng vi khuẩn gây bệnh héo xanh

Mục tiêu của nghiên cứu là phân lập các dòng vi khuẩn gây bệnh héo xanh từ một số tỉnh thuộc Đồng bằng sông Cửu Long và tỉnh Lâm Đồng, nhằm tạo nguồn vi khuẩn phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.

Phương pháp thu mẫu bệnh

Thực hiện thu mẫu bệnh và phương pháp phân lập vi khuẩn gây bệnh héo xanh được áp dụng theo Mehan & McDonald (1995) và Burgess et al. (2009).

Để thu mẫu, chọn hai mẫu bệnh (đất và cây) từ mỗi ruộng Cúc ở các vị trí khác nhau có triệu chứng héo xanh, không quá khô, có mạch dẫn hóa nâu Khi cắt ngang thân, nếu thấy dịch khuẩn màu trắng chảy ra trong nước thì đó là dấu hiệu bệnh Mẫu cây bệnh cần được đặt trong túi nilon riêng biệt và phải tiến hành phân lập vi khuẩn cùng với TKT ngay trong ngày hoặc chậm nhất là một ngày sau đó.

Phương pháp phân lập vi khuẩn

Mẫu bệnh được quan sát dưới kính hiển vi xác định có dòng tuôn vi khuẩn từ bó mạch hóa nâu trước khi đem phân lập trong đĩa petri.

1 Khử trùng bề mặt lam kính và dao lam, bằng cách hơ trên ngọn lửa đèn cồn

2 Dùng gòn thấm cồn 70% lau qua bề mặt thân Cúc để khử trùng.

3 Với dụng cụ đã được khử trùng nhẹ nhàng cắt một miếng nhỏ của vết bệnh dọc theo mạch dẫn hóa nâu khoảng 5mm 2 , sau đó cắt nhỏ mẫu bệnh. Rút 1-2 giọt nước cất thanh trùng nhỏ lên mẫu bệnh đã cắt Đợi khoảng 1 phút cho vi khuẩn có đủ thời gian phân tán vào giọt nước Đưa vào kính hiển vi để quan sát dòng vi khuẩn tuôn ra trong giọt nước.

4 Dùng micropipette rút ra một giọt nhỏ vào rìa của đĩa petri chứa môi trường King’s B

Sử dụng 2% agar, cấy vi khuẩn đã khử trùng bằng đũa để tạo các vạch giọt huyền phù vi khuẩn trên bề mặt đĩa (Hình 3.1) Đĩa được ủ trong 48 giờ ở điều kiện phòng thí nghiệm để quan sát hình thái vi khuẩn.

Hình 3.1 minh họa đĩa cấy vi khuẩn trên môi trường King’s B, trong đó các khuẩn lạc được chọn lọc là những đơn khuẩn lạc có màu trắng kem, nhẵn bóng và trơn láng, hơi chảy Phương pháp tách dòng được thực hiện nhằm thu được vi khuẩn thuần (Nguồn: Burgess et al., 2009).

Cấy truyền khuẩn lạc đơn từ đĩa cấy tách dòng sang ống nghiệm chứa môi trường King’s B 2% agar nhằm tạo nguồn cho việc phân lập TKT và thực hiện các thí nghiệm tiếp theo.

Cách đặt tên vi khuẩn bao gồm việc sử dụng kí tự chữ để viết tắt tên tỉnh nơi mẫu vi khuẩn được thu thập, trong khi kí tự số thể hiện chỉ số dòng vi khuẩn từ các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) và Lâm Đồng.

3.2.1.2 Phân lập các dòng thực khuẩn thể

Mục tiêu của nghiên cứu là phân lập các dòng TKT tại một số tỉnh thuộc Đồng bằng sông Cửu Long và Lâm Đồng, nhằm tạo ra nguồn TKT ban đầu có sự đa dạng về sinh học và khả năng thích ứng với điều kiện môi trường ở ĐBSCL.

Phương pháp thu mẫu: Mẫu đất và cây bệnh cùng địa điểm được dùng chung cho phân lập vi khuẩn gây bệnh và TKT.

Phương pháp phân lập thực khuẩn thể

Mẫu rễ, đất và thân cây bị bệnh được rửa sạch, lau khô và nghiền trong cối sứ Sau đó, phần tế bào thực vật được cho vào ống falcon đã thanh trùng cùng 5mL nước cất thanh trùng và ly tâm ở 6000 vòng/phút trong 5 phút để loại bỏ tế bào Tiếp theo, 1mL dịch trong từ mỗi ống ly tâm được rút vào ống eppendorf và thêm 50µL chloroform/mL, lắc đều bằng vortex trong 5 phút để loại bỏ vi khuẩn và nấm, sau đó ly tâm lại ở 6000 vòng/phút trong 5 phút để tách chloroform Cuối cùng, sử dụng micropipette để rút 700µL dịch trong chỉ chứa thực khuẩn thể vào ống eppendorf vô trùng khác và bảo quản trong điều kiện tối ở nhiệt độ 4°C.

Để tách và thu hoạch thực khuẩn thể, đầu tiên, rút 50μl dung dịch huyền phù chứa thực khuẩn thể vào đĩa Petri đã thanh trùng với môi trường King’s B agar, sau đó thêm 100μl huyền phù vi khuẩn từ mẫu bệnh và hòa đều Đĩa được ủ trong điều kiện phòng để quan sát sự hình thành các đốm thực khuẩn, nơi vi khuẩn bị tiêu diệt Tiếp theo, chọn đốm thực khuẩn đơn lẻ và cấy truyền vào đĩa Petri mới chứa vi khuẩn ký chủ Sau 24 giờ, thu hoạch thực khuẩn thể bằng cách thêm 5mL nước cất vô trùng, ngâm trong 30 phút, rồi thu phần huyền phù Thực hiện ly tâm hai lần với chloroform để loại bỏ vi khuẩn, sau đó rút dung dịch chỉ chứa thực khuẩn thể và lưu trữ trong ống eppendorf ở điều kiện che tối, nhiệt độ 4 o C.

Cách đặt tên thực khuẩn thể

Các dòng thực khuẩn thể được phân lập sẽ được ký hiệu theo cú pháp Φ + tên tỉnh + số thứ tự (1, 2, 3,…) Trong đó, Φ đại diện cho ký hiệu TKT, tiếp theo là tên tỉnh (viết tắt và viết hoa) nơi thực hiện việc phân lập TKT, và phần số chỉ số dòng TKT thu thập được từ các tỉnh thuộc Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL).

Trong trường hợp, phân lập trực tiếp không có sự hiện diện TKT, thì mẫu sẽ được thực hiện phân lập theo phương pháp tăng sinh TKT

Phương pháp tăng sinh thực khuẩn thể

Bước 1: Nuôi tất cả các dòng vi khuẩn trên đĩa King’s B 2% agar trong

Để nuôi cấy vi khuẩn, sử dụng đũa cấy để chuyển từng dòng vi khuẩn vào ống falcon 50ml đã chứa 10mL môi trường King’s B lỏng Sau đó, đặt ống vào máy lắc ngang với tốc độ 100 vòng/phút và nuôi trong 24 giờ.

Bước 3: Pha loãng 100μl từng loại thực khuẩn thể vào 10mL môi trường King’s B đã có vi khuẩn Sau đó, đặt dung dịch huyền phù chứa vi khuẩn và thực khuẩn thể lên máy lắc ở tốc độ 100 vòng/phút trong 24 giờ.

Thực hiện ly tâm hai lần với Chloroform, sau đó chuyển phần dung dịch phía trên chứa thực khuẩn thể vào ống Eppendorf khác và bảo quản trong điều kiện tối ở nhiệt độ 4 o C (Nga & Tâm, 2014).