NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:
- Đối tượng: Các cụm protocom lan Sơn thủy tiên (Dendrobium chrysotoxum) và cây lan Sơn thủy tiên vó chiều cao 2 – 3 cm
Hình 2.1 Các cụm protocom lan
Hình 2.2 Cây lan Sơn thủy tiên chiều cao 2 – 3 cm - Phạm vi nghiên cứu: Cây lan Sơn thủy tiên được thực hiện ở giai đoạn in vitro
Các thí nghiệm được thực hiện tại Trung tâm Nghiên cứu Công nghệ Sinh học thuộc Trường Đại học Hùng Vương, tọa lạc tại thành phố Việt Trì, tỉnh Phú Thọ.
-Đánh giá được ảnh hưởng của môi trường nền đối với sự sinh trưởng chồi của cây in vitro lan Sơn thủy tiên
Nghiên cứu đã đánh giá ảnh hưởng của nồng độ và sự phối hợp các chất điều hòa sinh trưởng đến sự phát sinh thân và lá của cây in vitro lan Sơn thủy tiên Kết quả cho thấy, việc điều chỉnh nồng độ và sự kết hợp hợp lý các chất này là yếu tố quan trọng trong việc tối ưu hóa quá trình phát triển của cây, từ đó nâng cao hiệu suất nhân giống cây lan.
Nghiên cứu này đánh giá ảnh hưởng của nồng độ và sự phối hợp các chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng ra rễ của cây in vitro lan Sơn thủy tiên Kết quả cho thấy rằng việc điều chỉnh nồng độ và phối hợp hợp lý các chất này có thể nâng cao hiệu quả ra rễ, góp phần quan trọng trong việc nhân giống và phát triển cây lan Sơn thủy tiên Việc tối ưu hóa các yếu tố này không chỉ giúp cải thiện tỷ lệ sống sót của cây mà còn tăng cường sự phát triển bền vững trong điều kiện nuôi cấy in vitro.
- Các nhân tố chỉ tiêu nghiên cứu phải chia thành các công thức khác nhau
- Các nhân tố không phải chỉ tiêu nghiên cứu phải đảm bảo tính đồng nhất giữa các công thức thí nghiệm
- Số mẫu của mỗi công thức thí nghiệm phải đủ lớn (≥15)
- Phải tuân thủ nguyên tắc lặp lại (số lần lặp lại ≥3)
2.3.2 Phương pháp bố thí nghiệm
Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nền đến sự sinh trưởng của chồi loài lan Sơn thủy tiên ( Dendrobium chrysotoxum )
+ Vật liệu ban đầu: Các cụm protocom của cây lan Sơn thủy tiên
Môi trường được bổ sung thêm 30g/l đường; 6,5g agar; 150ml nước dừa; 60g/l khoai tây ở mỗi môi trường
+ Chỉ tiêu đánh giá: chiều cao chồi/chồi, số lá/chồi, hình thái
+ Thời gian thu thập: sau 4 tuần nuôi cấy
Thí nghiê ̣m 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ về sự phối hợp của Cytokinin/Auxin đến sự phát triển thân, lá của cây lan Sơn thủy tiên
Công thức: Môi trường phù hợp ở thí nghiệm 1 + Chất điều hòa sinh trưởng ở các nồng độ khác nhau:
Bảng 2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ về sự phối hợp của Cytokinin/Auxin đến sự phát triển thân, lá của cây lan Sơn thủy tiên
Chất điều hòa sinh trưởng
- Chiều dài thân sau 4 tuần
- Chiều dài lá sau 4 tuần
+ Thời gian thu thập: sau 4 tuần nuôi cấy
Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của nồng độ và sự phối hợp của Auxin đến khả năng ra rễ của loài lan Sơn thủy tiên
Công thức: Môi trường phù hợp ở thí nghiệm 1 + Chất điều hòa sinh trưởng ở các nồng độ khác nhau:
Bảng 2.3 Ảnh hưởng của nồng độ và sự phối hợp của Auxin đến khả năng ra rễ của loài lan Sơn thủy tiên
Công thức Chất điều hòa sinh trưởng (mg/l)
+Chỉ tiêu đánh giá: số rễ, chiều dài rễ
+ Thời gian thu thập: sau 4 tuần nuôi cấy
2.3.3 Phương pha ́ p thu thập số liê ̣u
+ Số lá/chồ i (lá) = tổng số lá/ chồi + Số rễ = tổng số rễ / chồi
+ Chiều cao thân (mm) = Số chiều dài thân sau 4 tuần + Chiều dài lá (mm) = Chiều dài lá sau 4 tuần
+ Chiều dài rễ (mm) = Chiều dài rễ sau 4 tuần
- Thờ i gian thu thâ ̣p: cứ 4 tuần thống kê các chỉ tiêu 1 lần
2.3.4 Phương pha ́ p phân tích và xử lý số liê ̣u
Dữ liệu được phân tích bằng phương pháp thống kê toán học, và quá trình xử lý số liệu được thực hiện thông qua phần mềm Excel trên máy tính.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1 Ảnh hưởng của môi trường nền đến sự sinh trưởng chồi Lan Sơn thủy tiên ( Dendrobium chrysotoxum) Để tìm ra môi trường thích hợp cho nhân nhanh chồi và sự sinh trưởng chồi tương đối là tốt nhất, trong quá trình nghiên cứu tôi tiến hành thí nghiệm cấy cụm chồi vào các môi trường nuôi cấy khác nhau: MS, KC, 1 /2MS Sau đó tiến hành đánh giá để xác định được môi trường nền thích hợp nhất cho giai đoạn nhân nhanh chồi và phát triển thân
Bảng 3.1 Ảnh hưởng của môi trường nền đến sự sinh trưởng chồi Lan
Sơn thủy tiên ( Dendrobium chrysotoxum)
Tỉ lệ ra chồi (%) Đặc điểm
Chồi xanh, thânmập, cân đối
Chối xanh vàng, nhỏ, khôngcân đối ẵ MS
Chồi xanh, nhỏ, cân đối
Hình 3.1 Ảnh hưởng của môi trường nền đến sự sinh trưởng chồi lan
Sơn thủy tiên ( Dendrobium chrysotoxum)
Sau 4 tuần nuôi cấy, có thể nhận thấy, đối với môi trường KC chồi mọc kém hơn tỉ lệ ra chồi thấp nhất là 84,55 %, chồi mọc ra có màu xanh vàng, nhỏ và không cân đốicó chiều cao trung bình là 20,08 mm và chiều dài lá trung bỡnh là 10,28 mm Đối với ẵ MS thỡ chồi xanh hơn đều nhưng vẫn nhỏ tỉ lệ ra chồi là 91,53%, cây đạt chiều cao trung bình là 23.96 mm, có lá dài 14,12 mm Tuy nhiên khi cấy mẫu vào môi trường MS thì nhận thấy rằng tỉ lệ ra chồi là 100%, chồi có màu xanh dài, thân mập, cân đối, chiều cao trung bình của cây đạt 31,46 mm và có chiều dài trung bình của lá đạt 20.25 mm
Qua đó có thể thấy môi trường MS là môi trường thích hợp nhất để nuôi cấy loài lan Sơn thủy tiên(Dendrobium chrysotoxum)
Chiều cao cây chiều dài lá
Hình 3.2 Ảnh hưởng của 3 loại môi trường đến sự sinh trưởng chồi lan Sơn thủy tiên
3.2 Ảnh hưởng của nồng độ và sự phối hợp của cytokinin/auxin đến sự phát triển chiều cao thân, lá cây lan Sơn thủy tiên (Dendrobium chrysotoxum )
Trong thí nghiệm này, tôi đã bổ sung chất điều hòa sinh trưởng BAP, TDZ, NAA với các nồng độ khác nhau vào môi trường nuôi cấy MS, cụ thể là 1mg/l, 1,5mg/l, 2mg/l và 2,5mg/l Đồng thời, tôi cũng phối hợp BAP và NAA với các nồng độ như: 1mg/l BAP + 0,5mg/l NAA (BN1), 1,5mg/l BAP + 0,5mg/l NAA (BN2), 2mg/l BAP + 0,5mg/l NAA (BN3), và 2,5mg/l BAP + 0,5mg/l NAA (BN4) Ngoài ra, tôi thực hiện phối hợp giữa TDZ và NAA với các nồng độ: 1mg/l TDZ + 0,5mg/l NAA (TN1), 1,5mg/l TDZ + 0,5mg/l NAA (TN2), 2mg/l TDZ + 0,5mg/l NAA (TN3), và 2,5mg/l BAP + 0,5mg/l NAA (TN4) Mục tiêu của thí nghiệm là theo dõi mẫu cấy để xác định môi trường tối ưu cho sự phát triển của thân và lá cây lan Sơn thủy tiên.
3.2.1 Ảnh hưởng của nồng độ Auxin đến sự phát triển chiều cao thân, lá cây lan Sơn thủy tiên (Dendrobium chrysotoxum)
Trong thí nghiệm này, tôi đã bổ sung các nồng độ khác nhau của chất điều hòa sinh trưởng BAP vào môi trường nuôi cấy MS, cụ thể là BAP 1mg/l (B10), BAP 1,5mg/l (B15), BAP 2mg/l (B20) và BAP 2,5mg/l (B25) Kết quả thu được cho thấy sự ảnh hưởng của từng nồng độ BAP đến quá trình phát triển của cây.
Bảng 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ Auxin đến sự phát triển của thân, lá cây lan Sơn thủy tiên ( Dendrobium chrysotoxum )
Hình 3.3 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng BAP đến sự phát triển chiều cao thân và chiều dài lá loài lan Sơn thủy tiên
( Công thức) chiều cao cây chiều dài lá
Công thức Chiều dài thân (mm)
(mm) Số lá ĐC(CT0) 24,22± 0,36 13,12± 0,15 3,15± 1,15 B10(CT1) 30,39± 0,25 21,52± 0,18 5,65± 1,17
Hình 3.4 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng BAP đến sự phát triển số lá loài lan Sơn thủy tiên ( Dendrobium chrysotoxum)
Kết quả từ bảng 3.2 và hình 3.2, 3.3 cho thấy khi nồng độ BAP tăng từ 1 mg/l lên 2,5 mg/l, chiều dài thân có sự thay đổi Cụ thể, ở nồng độ BAP 1 mg/l, chiều dài thân trung bình đạt 30,39 mm Tuy nhiên, khi nồng độ BAP tăng lên 1,5 mg/l, 2 mg/l và 2,5 mg/l, giá trị chiều dài thân lần lượt giảm còn 29,25 mm, 29,15 mm và 29,12 mm Mặc dù vậy, tất cả các công thức này đều có giá trị chiều dài thân cao hơn so với công thức đối chứng.
Khi tăng nồng độ BAP từ 1 mg/l đến 2,5 mg/l, chiều dài lá có sự biến đổi rõ rệt Ở nồng độ BAP 1 mg/l, chiều dài lá trung bình đạt 21,52 mm Tuy nhiên, khi nồng độ BAP tăng lên 1,5 mg/l, 2 mg/l, và 2,5 mg/l, chiều dài lá lần lượt giảm xuống còn 19,33 mm, 19,31 mm, 19,15 mm và 14,95 mm Mặc dù có sự giảm, các công thức này vẫn có giá trị cao hơn so với công thức đối chứng.
Khi nồng độ BAP tăng từ 1 mg/l lên 2,5 mg/l, số lá trung bình ở nồng độ 1 mg/l đạt 5,65 lá Tuy nhiên, khi nồng độ BAP tiếp tục tăng lên 1 mg/l, 1,5 mg/l, 2 mg/l và 2,5 mg/l, giá trị số lá giảm xuống còn 4,75 lá, 4,61 lá và 4,58 lá Mặc dù vậy, các công thức này vẫn có giá trị cao hơn so với công thức đối chứng.
3.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ Cytokinin đến sự phát triển chiều cao thân, lá cây lan Sơn thủy tiên (Dendrobium chrysotoxum)
Trong thí nghiệm này, tôi đã bổ sung các nồng độ chất điều hòa sinh trưởng TDZ vào môi trường nuôi cấy MS với các mức 1mg/l (T10), 1,5mg/l (T15), 2mg/l (T20) và 2,5mg/l (T25) Kết quả đạt được từ các nồng độ này sẽ được trình bày trong phần sau.
Bảng 3.3 Ảnh hưởng của nồng độ Cytokinin đến sự phát triển của chiều cao thân, lá cây lan Sơn thủy tiên (Dendrobium chrysotoxum)
Số lá (lá) ĐC(CT0) 24,22± 0,21 13,12± 0,16 3,15± 1,12
Hình 3.5 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng TDZ đến sự phát triển chiều cao thân và chiều dài lá loài lan Sơn thủy tiên ( Dendrobium chrysotoxum)
Hình 3.6 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng TDZ đến sự phát triển số lá loài lan Sơn thủy tiên ( Dendrobium chrysotoxum)
Khi tăng nồng độ TDZ từ 1 mg/l lên 2,5 mg/l, chiều dài thân cây có sự thay đổi rõ rệt, như thể hiện qua bảng 3.3 và hình 3.4, hình 3.5.
(Công thức) chiều cao cây chiều dài lá
Nồng độ TDZ từ 1mg/l đến 1,5mg/l làm tăng chiều dài thân trung bình từ 29,15mm lên 31,43mm Tuy nhiên, khi nồng độ TDZ tăng lên 2mg/l và 2,5mg/l, chiều dài thân giảm xuống còn 29,17mm và 27,26mm Tất cả các công thức này đều có giá trị cao hơn so với công thức đối chứng.
Kết quả nghiên cứu cho thấy, khi nồng độ TDZ tăng từ 1 mg/l lên 1,5 mg/l, chiều dài lá trung bình tăng từ 19,10 mm lên 20,14 mm Tuy nhiên, khi nồng độ TDZ tiếp tục tăng lên 2 mg/l và 2,5 mg/l, chiều dài lá lại giảm xuống còn 18,75 mm và 15,67 mm Tất cả các công thức này đều cho giá trị cao hơn so với công thức đối chứng.
Khi tăng nồng độ TDZ từ 1 mg/l lên 2,5 mg/l, số lượng lá có sự thay đổi đáng kể ở nồng độ BAP là 1 mg/l, với giá trị trung bình của số lá tăng lên.
Khi nồng độ TDZ tăng lên 1,5mg/l, 2mg/l và 2,5mg/l, số lượng lá giảm xuống lần lượt còn 4,75 lá, 4,34 lá và 4,12 lá Tuy nhiên, các công thức này vẫn có giá trị cao hơn so với công thức đối chứng.
3.2.3 Ảnh hưởng sự phối hợp của Auxin/auxin đến sự phát triển của thân, lá cây lan Sơn thủy tiên (Dendrobium chrysotoxum )
Trong thí nghiệm này, tôi đã phối hợp sử dụng BAP và NAA với các nồng độ khác nhau, cụ thể là: 1mg/l BAP kết hợp với 0,5mg/l NAA (BN1); 1,5mg/l BAP và 0,5mg/l NAA (BN2); 2mg/l BAP cùng 0,5mg/l NAA (BN3); và 2,5mg/l BAP kết hợp với 0,5mg/l NAA (BN4) Kết quả thu được sẽ được trình bày trong phần tiếp theo.
Bảng 3.4 Ảnh hưởng sự phối hợp của Auxin/auxin đến sự phát triển của thân, lá cây lan Sơn thủy tiên ( Dendrobium chrysotoxum )
Công thức Chiều dài thân
(mm) Số lá ĐC(CT0) 24,22± 0,18 13,12± 0,13 3,15± 0,72
Sự phối hợp của chất điều hòa sinh trưởng BAP và NAA có ảnh hưởng đáng kể đến sự phát triển chiều dài thân và chiều dài lá của loài lan Sơn thủy tiên (Dendrobium chrysotoxum) Nghiên cứu cho thấy rằng tỷ lệ hợp lý giữa BAP và NAA có thể tối ưu hóa sự phát triển của cây, từ đó nâng cao chất lượng và năng suất của loài lan này Việc điều chỉnh các loại hormone này không chỉ giúp tăng trưởng chiều dài thân mà còn cải thiện chiều dài lá, góp phần vào sự phát triển toàn diện của cây lan.
Hình 3.8 Ảnh hưởng của sự phối hợp chất điều hòa sinh trưởng BAP/NAA đến sự phát triển số lá loài lan Sơn thủy tiên (Dendrobium chrysotoxum)
Qua bảng 3.4 và 2 hình 3.6, hình 3.7, ta thu được kết quả như sau:
45 ĐC BN1 BN2 BN3 BN4
15.56 chiều cao cây chiều dài lá
0 1 2 3 4 5 6 7 ĐC BN1 BN2 BN3 BN4
