NGUYÊN T Ắ C VÀ K Ỹ THU Ậ T CHU Ẩ N B Ị TIÊU B Ả N HI Ể N VI
Chọn đối tƣợng và chuẩn bị mẫu cố định
Khi nghiên cứu tế bào, bước đầu tiên là lựa chọn các cơ quan và mô cần thiết, chẳng hạn như mô phân sinh đầu rễ non, rễ chính của hạt nảy mầm, đỉnh sinh trưởng của cây và lá non để nghiên cứu phân chia nguyên nhiễm Các mô ở chóp thường được sử dụng do có vùng tế bào phân chia mạnh mẽ và hình dáng tế bào được định hướng thích hợp Để nghiên cứu hình thái và đếm số lượng nhiễm sắc thể trong phân chia giảm nhiễm, thường dùng tế bào mẹ của tiểu bào tử đã được cố định sau vài ngày nhú bông Đối với đậu và các loại cây khác, các nụ hoa nhỏ chưa có màu đặc trưng cũng là lựa chọn tốt Nhiều trường hợp sử dụng bao phấn non, như ở lúa, sẽ cố định các bông mới nhú khoảng một phần năm bông, trong đó các hoa ở giữa bông có độ thành thục tốt và số tế bào mẹ hạt phấn đang trong giai đoạn giảm phân Để đạt kết quả tốt trong các buổi thực hành, cần chọn đối tượng đáp ứng các tiêu chuẩn nhất định.
Dễ phá vỡ màng tế bào và màng nhân;
Nhiễm sắc thể lớn và dễ phân biệt giúp cải thiện sự đa dạng di truyền Sự phong phú về các dạng nhiễm sắc thể trong bộ nhiễm sắc thể là yếu tố quan trọng, góp phần vào sức khỏe và khả năng thích nghi của các sinh vật.
Dễ trồng, phổ biến trong thời vụ để tiện việc thu lƣợng mẫu lúc cần thiết.
Khi lựa chọn mẫu nghiên cứu, việc tuân thủ quy trình chuẩn bị cố định là rất quan trọng, vì độ chính xác của thí nghiệm phụ thuộc vào điều này Để quan sát sự phân chia tế bào ở chóp rễ non, cần tạo điều kiện tối ưu về nhiệt độ, chế độ nước và ánh sáng cho sự phát triển bình thường của rễ cây Tùy thuộc vào mục đích thí nghiệm, cần kiểm soát nhiệt độ và thời gian sinh trưởng của mẫu trước khi cố định Chẳng hạn, tại nhiệt độ 23 – 25°C, thời gian bắt đầu phân chia nguyên nhiễm đầu tiên ở các loại cây khác nhau là khác nhau: ở Crepis capillaris (L.) là khi rễ dài 2 – 3 mm, trong khi ở Vicia faba (L.) là 12 – 17 mm.
Nigelladamascena (L.) là 2 – 4 mm, ở Triticum aestivum là 8 – 10 mm, ở hành tây (Allium cepa) là 6 – 12 mm
Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng số lượng tế bào phân chia thay đổi theo thời gian trong ngày Do đó, để đạt được kết quả chính xác, cần lưu ý đến chu kỳ phân chia nguyên nhiễm và cố định mẫu vật vào những thời điểm khác nhau, tùy thuộc vào đối tượng và mục đích nghiên cứu.
Trong nghiên cứu phân chia nguyên nhiễm và đếm số lượng nhiễm sắc thể, có thể trồng các đối tượng đạt tiêu chuẩn trong điều kiện đồng ruộng, vườn trường, chậu hoặc trên đĩa petri với khay men có giấy thấm Cần duy trì nhiệt độ ổn định từ 23 – 25°C trong tủ ấm hoặc dưới ánh đèn điện Sau vài ngày, khi rễ mọc dài, cần cố định rễ tại các độ dài khác nhau tùy theo từng đối tượng, như ở đậu Vicia faba là 1 – 1,5 cm, đậu Hà Lan 1,5 – 2 cm, hành tây 1,2 – 1,5 cm và lúa nước 0,8 – 1 cm Đối với hạt nhỏ như hành tây, cà chua, thuốc lá, có thể cố định cả hạt nảy mầm sau khi rửa qua nước lạnh để khử độ chua Trong quá trình cố định, nếu nước vẩn đục, cần thay dung dịch ngay Đối với cây trồng trong chậu, cần đảm bảo độ chiếu sáng, độ ẩm và độ tơi xốp của đất để không ảnh hưởng đến sự phát triển của hệ rễ Sau từ một đến hai tuần, khi rễ đạt kích thước phù hợp, cần cố định trong điều kiện bóng râm để rễ không bị héo.
Để cố định rễ của các thực vật sinh sản bằng thân rễ, thân củ hoặc hom trong phòng thí nghiệm, cần đặt chúng trong cát ẩm ở nhiệt độ 25°C hoặc trồng trong dung dịch dinh dưỡng nhân tạo.
1.1.3 Xử lý mẫu vật trước khi cốđịnh
Việc xử lý mẫu vật trước khi cố định là một bước quan trọng trong quá trình phân tích nhiễm sắc thể Đối với những trường hợp khó khăn trong việc đếm nhiễm sắc thể hoặc khi nhiễm sắc thể quá dài, cần sử dụng các chất đặc hiệu như 8-oxiquinolin, cloral hydrat, colchicine và paradiclorobenzene để đảm bảo kết quả chính xác.
8-oxiquinolin có thể được sử dụng để xử lý sơ bộ mẫu nghiên cứu hoặc như một thành phần trong dung dịch cố định Để xử lý sơ bộ, hòa tan 0,58 g 8-oxiquinolin trong 200 ml nước cất ấm với nồng độ 0,002M ở nhiệt độ 60°C, sau đó hạ nhiệt độ xuống 10-14°C và ngâm mẫu trong dung dịch khoảng 3 giờ, rửa sạch bằng nước cất trước khi chuyển vào dung dịch cố định Phương pháp này làm tăng kích thước nhiễm sắc thể lên 1,5 lần mà không thay đổi chiều dài, đồng thời làm nổi bật các eo sơ cấp và thứ cấp Nếu mẫu được làm lạnh ở 0°C trong 24 giờ trước khi xử lý bằng 8-oxiquinolin, nhiễm sắc thể sẽ co ngắn lại, thuận tiện cho việc đếm Kagava (1929) đã áp dụng dung dịch cloral hydrat nồng độ 0,3-1% để ngâm rễ non trong 1 giờ, rửa qua nước máy và để trong buồng ấm 2-4 giờ trước khi cố định, cũng cho kết quả làm co ngắn nhiễm sắc thể.
Trước khi cố định mẫu, thường sử dụng conchixin ở nồng độ thấp từ 0,01 – 0,05% để ngăn chặn quá trình phân chia nguyên nhiễm và tăng khả năng phát hiện các tế bào trong giai đoạn kì giữa Cụ thể, các rễ và lá non của Crepis capillaris (L.) được ngâm trong dung dịch conchixin với nồng độ nhất định trong khoảng 2 giờ Ngoài ra, có thể sử dụng paradiclorobenzene tinh thể hòa tan để hỗ trợ quá trình này.
Để xử lý mẫu vật nghiên cứu, cần chuẩn bị 500 ml nước cất, đặt trong bình kín và giữ ở nhiệt độ 60°C trong khoảng 10 – 12 giờ Sau đó, hạ nhiệt độ dung dịch xuống 12 – 16°C và tiến hành xử lý các mẫu trong 2 – 3 giờ Ngoài ra, có thể sử dụng conchixin kết hợp với hỗn hợp dung dịch paradiclorobenzene đậm đặc và 8-oxiquinolin 0,02M theo tỉ lệ 1:1 để phân tích kiểu nhân (karyotype) Nghiên cứu từ một số phòng thí nghiệm trên thế giới cho thấy việc làm lạnh đột ngột các tế bào trước khi cố định có thể mang lại kết quả tốt hơn.
Trong 24 giờ ở nhiệt độ -2°C, nhiễm sắc thể sẽ bị ngắn lại một cách rõ rệt Để nghiên cứu hình thái nhiễm sắc thể, trước khi cố định, mẫu vật có thể được xử lý bằng một trong hai phương pháp.
(1) Đƣa mẫu vật vào dung dịch cumarin (coumarin) 2% trong 2 giờ đồng hồ ở nhiệt độ 12– 16°C; (2) Dùng hỗn hợp cumarin (coumarin) và 8 – oxiquinolin (theo tỉ lệ1:1) trong 2 giờở nhiệt độ 12 – 16°C.
C ố đị nh m ẫ u v ậ t
1.2.1 Các loại chất cốđịnh và tác dụng của chúng
Mục đích của việc cố định là nhanh chóng giết chết tế bào của mẫu vật sống bằng các chất độc, đồng thời giữ nguyên cấu trúc và tránh biến đổi không mong muốn Thực tế, không có chất cố định nào không làm biến đổi vật sống, vì vậy thường sử dụng chất cố định kép để mỗi chất giữ được một khía cạnh của cấu trúc Chất cố định giúp đẩy không khí ra, làm chắc chắn mô và đông đặc nhanh chóng các thành phần của mẫu vật, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình nhuộm màu Để đạt hiệu quả cao, mẫu vật cần phải tươi và chất cố định phải thẩm thấu nhanh chóng và đều đặn, cố định từng bộ phận riêng biệt của tế bào Tùy thuộc vào đối tượng và mục đích thí nghiệm, các loại chất cố định khác nhau sẽ được sử dụng; ví dụ, trong thí nghiệm tế bào học và phôi thai học thường dùng chất cố định nhân của Navaxin và Carnoy, trong khi để cố định tốt ty thể và lạp thể, chất cố định của G A Levitski là lựa chọn phù hợp Các thành phần trong chất cố định nhân bao gồm axit axetic, formalin, chloroform, axit formic và cồn, do đó, chất cố định kép thường được ưa chuộng hơn chất cố định đơn.
1.2.1.1 Tác d ụ ng c ủ a m ộ t s ố ch ấ t c ố đị nh a Axit axetic
Axit axetic có khả năng xâm nhập nhanh vào các mô và gây kết tủa axit nucleic Theo nghiên cứu của G I Roskin và L B Levinson (1967), axit axetic giữ nguyên hình dạng nhiễm sắc thể nhưng lại làm hỏng thể hạt sợi và tiểu thể gôngi Axit axetic có thể được sử dụng như một thành phần trong quá trình cố định hoặc có thể sử dụng độc lập như một chất cố định.
Axit formic có khả năng thấm vào mẫu vật một cách nhẹ nhàng, nhưng lại có tác dụng làm đông đặc protein, giúp bảo tồn các chi tiết cấu trúc của nhân tế bào, tế bào chất, cũng như các thể hạt sợi và tiểu thể gôngi.
Formalin thấm vào đối tượng một cách chậm rãi và có thể không đều, nhưng ít gây ra biến đổi trong cấu trúc của tế bào chất và nhân Sử dụng axit này có khả năng cố định các thể hạt sợi một cách hiệu quả.
Là một thành phần quan trọng trong các chất cố định nhân, nó duy trì cấu trúc tinh vi của tế bào chất và thể hạt sợi Tuy nhiên, nó có nhược điểm là bắt màu cacmin kém khi được cố định bằng chất này.
Các chất cố định được sử dụng trong nghiên cứu sinh học thường được pha trong cồn hoặc nước, với cồn thẩm thấu nhanh vào mô trong khoảng thời gian từ 30 phút đến 12 giờ Ngược lại, các chất cố định pha trong nước thẩm thấu chậm hơn Lựa chọn chất cố định phù hợp phụ thuộc vào mục đích và đối tượng nghiên cứu: đối với nụ hoa nhỏ và rễ non, nên sử dụng chất cố định pha trong nước, trong khi nụ hoa lớn và rễ dày nên dùng chất cố định pha trong cồn Đối với các mẫu khó thẩm thấu như bao phấn và búp non, thường áp dụng quy trình trước bằng chất cố định pha cồn, sau đó chuyển sang chất cố định pha trong nước để đạt hiệu quả cao hơn.
1.2.1.2 Thành ph ầ n c ủ a m ộ t s ố ch ấ t c ố đị nh a Chất cố định Navaxin (10:4:1) (Уткина, 2001; Барыкина và cs., 2000): Đƣợc dùng để cố định các rễ non và các đối tƣợng nhỏ về phôi thai học Chất cố định Navaxin tác dụng nhẹ, đặc biệt là giữ tốt cấu trúc của nhân và nhiễm sắc thể Chất cố định này thâm nhập chậm vào mô, các mẫu phôi lớn (nụ hoa, hoa, noãn ) nên cần phải tách và cắt thành các phần nhỏ Thời gian cố định 24 giờ trong tối, ở nhiệt độ phòng
Thành phần chấtcố định gồm:
(Formalin ở thị trường là 40%) Axit axetic đậm đặc (98%): 1 phần
Chất cố định cần được chế biến ngay trước khi sử dụng do tính chất dễ hỏng và phân hủy Chất này rất hiệu quả trong việc cố định các vật mềm, nhưng không thích hợp cho các vật lớn và rắn vì khả năng thẩm thấu chậm Một ví dụ điển hình là chất cố định Carnoy (6:3:1), được sử dụng phổ biến trong phân tích tế bào học và phôi thai học Thời gian cố định cho các mẫu cắt lát và mẫu nén dao động từ 2 đến 12 giờ, và có thể để qua đêm trong tủ lạnh Đối với mẫu vật dày từ 1 – 2 mm, thời gian cố định khoảng 2 giờ, trong khi mẫu dày từ 3 – 5 mm cần thời gian lâu hơn.
Thành phần chất cố định:
Cồn etylic tuyệt đối (100%): 6 phần;
Chất cố định ngấm nhanh vào hầu hết các mẫu vật, nhưng do hoạt động mạnh mẽ của nó, chỉ nên sử dụng cho những vật lớn Đối với các mẫu vật nhỏ và mềm, nên hạn chế sử dụng hỗn hợp này Chất cố định Carnoy biến đổi (3:1) hay còn gọi là Carnoy axetic hoặc Clarke (3:1) là một lựa chọn khác cho các mẫu vật nhạy cảm.
Barieskina và cộng sự (2000) đã chỉ ra rằng chất này được sử dụng trong nghiên cứu tế bào học và phôi thai học để tạo ra các tiêu bản nén, với tác dụng tương tự như chất cố định Carnoy Mẫu vật thường được cố định trong khoảng thời gian từ 2 đến 12 giờ, và có thể kéo dài lâu hơn khi được bảo quản ở nhiệt độ từ 0 đến 3°C.
Thành phần chất cố định gồm:
Cồn etytic tuyệt đối: 3 phần;
Cồn etylic 96% và axit axetic đá (1 phần) là thành phần chính trong chất cố định Carnoy và Clarke, trong đó axit axetic có thể được thay thế bằng propionic Dưới đây là một số chất cố định tương tự dành cho đối tượng thực vật.
+ Axit propionic: 1 phần; cồn etylic 95%: 3 phần;
+ Axit propionic: 1 phần; clorofom: 4 phần; cồn etylic tuyệt đối: 3 phần;
+ Formalin: 1 phần; cồn etylic 95%: 15 phần; axit propionic: 2 phần;
Axit propionic 100 ml, cồn etylic 95% 100 ml và sắt hyđroxit 0,4 g được sử dụng trong quy trình cố định mẫu Đối với trường hợp 2 và 3, thêm vài giọt cacmin vào mỗi 10 ml hỗn hợp trước khi đưa mẫu vào chất cố định Chất cố định thứ ba có tác dụng trong 1-2 giờ và phù hợp cho cả động vật và thực vật Chất cố định Flemming, theo Барыкина và cộng sự (2000), được khuyến nghị cho các đối tượng phôi nhỏ với độ dày không quá 2 mm, được coi là chất cố định tối ưu trong công nghệ vi mô Nó đặc biệt hiệu quả trong nghiên cứu cấu trúc nhân và nhiễm sắc thể trong quá trình phân chia tế bào.
Thành phần chất cố định gồm:
Mẫu vật được cố định trong chất cố định Nyukomera (Нъюкомера) trong 1-2 ngày trong bóng tối, sau đó rửa sạch bằng nước máy từ 4 đến 24 giờ trước khi tiến hành nhuộm Chất này được sử dụng rộng rãi để nghiên cứu phân chia giảm nhiễm ở cây ngũ cốc trong quá trình làm tiêu bản nén, cố định bông non và rễ non trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng Sau đó, chất cố định được thay mới và lưu trữ trong tủ lạnh cho đến khi sử dụng Các phần bao phấn của cây ngũ cốc sau khi cố định sẽ được nhuộm bằng axeto cacmin, và chất cố định này cũng có thể dùng để cố định các rễ con.
Thành phần chất cố định gồm:
1.2.2 Nguyên tắc cốđịnh Để việc cố định cho kết quả tốt trước khi thực hiện cố định cần chú ý đến một số nguyên tắc chung nhƣ sau:
– Chọn chất cố định phải phù hợp với mục đích nghiên cứu
Để đảm bảo chất lượng mẫu vật cố định như rễ non và búp hoa, thể tích dung dịch cố định cần gấp 50 đến 100 lần so với lượng mẫu Mẫu vật phải được thu thập tươi và cố định ngay tại nơi gieo trồng để tránh tình trạng rễ non bị tiếp xúc với ánh nắng.
Trước khi cố định các mẫu vật lớn, cần cắt chúng thành từng phần và loại bỏ những bộ phận không cần thiết như lá, lá dài, râu, và gai Việc này giúp tăng cường khả năng thấm chất cố định vào mẫu vật một cách nhanh chóng và hiệu quả.
R ử a và đúc khố i parafin
Sau khi mẫu vật đã được cố định trong thời gian cần thiết, việc rửa sạch mẫu vật là rất quan trọng để loại bỏ hoàn toàn chất cố định còn sót lại Nếu không rửa kỹ, các chất này có thể gây ra hiện tượng phân hóa trong tế bào, dẫn đến những hậu quả nghiêm trọng như làm mẫu vật trở nên rắn, giòn hoặc thậm chí bị rữa nát.
Nếu chất cố định được dùng là nước thì phải rửa mẫu vật trong dòng chảy từ 1 –
Thời gian rửa mẫu vật trong thí nghiệm có thể kéo dài từ 3 đến 24 giờ, tùy thuộc vào kích thước mẫu, tốc độ dòng nước và nhiệt độ môi trường Theo M C Навашин (1936) và La Cour cùng các cộng sự (1958), thời gian rửa tối ưu cho rễ non là từ 3 đến 4 giờ Nếu để lâu hơn, nhiễm sắc thể sẽ bị nhuộm màu kém và có nguy cơ bị rữa nát xung quanh.
Để rửa mẫu vật trong dòng nước chảy, bạn có thể sử dụng vải màu để bọc mẫu vật lại, sau đó buộc chặt bằng dây Một cách khác là cho mẫu vật vào ống nghiệm không đậy, dùng vải màu buộc hai đầu lại và đặt vào bình hoặc chậu để nước chảy liên tục vào.
Sau khi rửa, mẫu vật được chuyển qua các nồng độ cồn khác nhau (20%, 40%, 60%, 80%, 96%, 100%) Quá trình ngâm diễn ra từ nồng độ thấp đến cao, dừng lại ở cồn 80% Thời gian ngâm mẫu vật trong dung dịch cồn khoảng 30 phút đến 1 giờ.
Để bảo quản mẫu vật lâu dài trong cồn 80% khi chưa thể tiến hành nghiên cứu ngay, cần lưu ý thay cồn mới thường xuyên Việc này rất quan trọng vì nếu nồng độ cồn giảm, chất lượng của mẫu vật sẽ bị ảnh hưởng.
Nếu mẫu vật được cắt hay ép bằng tay, quá trình rửa có thể dừng lại Tuy nhiên, nếu mẫu vật cần được cắt bằng microtome, quá trình rửa phải tiếp tục Cụ thể, cần khử hết nước trong mẫu vật bằng cách ngâm trong cồn 96%, sau đó là cồn 100%, và cuối cùng là ngâm trong parafin.
Có hai phương pháp đúc khối parafin:
Sử dụng lưỡi dao cạo để cắt khối parafin thành các khối nhỏ hình lập phương với mẫu vật ở giữa, sau đó gắn lên đế gỗ kích thước 1,5 × 2 × 2,5 cm, đảm bảo mẫu vật được định hướng đúng và xung quanh có lớp parafin dày 1 – 2 mm Áp dụng phương pháp "chôn vùi" của M C Навашин để đúc rễ con và hoa nhỏ, qua các bước thực hiện cụ thể.
Để thực hiện, bạn cần lấy những thỏi parafin đã chuẩn bị sẵn, có hình dạng que nhỏ Tiếp theo, hơ chúng trên ngọn lửa của đèn cồn cho đến khi parafin chảy ra Sau đó, nhỏ giọt parafin lỏng lên mặt đế gỗ đã được hơ nóng trước đó.
Khi thực hiện thí nghiệm, hãy nhỏ parafin vào giữa mặt đế gỗ để đảm bảo rằng đường kính giọt parafin lớn nhất Tiếp tục nhỏ parafin cho đến khi khối lượng parafin đạt chiều cao từ 3 đến 4 mm.
Sử dụng panh để lấy mẫu vật đã được tẩm parafin, sau đó đặt vào giữa khối parafin lỏng trên giá gỗ Tiếp theo, nhỏ thêm vài giọt parafin lỏng để bao kín mẫu vật và để nguội, tạo thành khối parafin Khi khối đã cứng, có thể đưa lên máy cắt lát để tiến hành cắt gọt.
Khi đặt mẫu vật vào khối parafin, cần thực hiện nhanh chóng để tránh parafin đông đặc Sau khi đặt, sử dụng panh hơ nóng để điều chỉnh mẫu vật cho đúng yêu cầu thí nghiệm Paraffin xung quanh mẫu vật phải lỏng, trong suốt và đồng nhất để đảm bảo không bị vỡ khi cắt Sau khi nhỏ giọt parafin, ngâm khối vào nước lạnh cho đến khi nguội hẳn, sau đó dùng dao trích hoặc lưỡi dao lam để gọt xung quanh, chỉ giữ lại khối parafin chứa mẫu vật dưới dạng khối chữ nhật hoặc hình thang cân.
Cắt, ép vật liệu
Tế bào có kích thước rất nhỏ, dao động từ 10 đến 100 µm Để khảo sát tế bào, cần phải tạo những lát cắt mỏng từ 4 đến 10 µm từ cơ thể sinh vật mà bạn muốn nghiên cứu Nếu không có những lát cắt này, sẽ không thể quan sát được cấu trúc của tế bào Để có được những lát cắt mỏng như vậy, người ta thường sử dụng máy cắt microtome, tuy nhiên, mẫu vật cần phải được đúc trong parafin trước khi tiến hành cắt.
Máy cắt được chia thành hai loại chính: kiểu bàn trượt và kiểu quay tay, trong đó máy cắt kiểu bàn trượt là phổ biến nhất Bài viết này sẽ hướng dẫn chi tiết các bước thực hiện khi sử dụng máy cắt lát kiểu bàn trượt.
Để bảo trì máy cắt lát, cần lau sạch bụi và phôi parafin, sau đó bôi vazơlin vào các bộ phận chuyển động để đảm bảo hoạt động trơn tru Trong mùa lạnh, hãy đặt đèn vào buồng cỏ của máy cắt lát để làm nóng lưỡi dao và khối parafin, giúp cải thiện hiệu suất làm việc.
Lưỡi dao được mài sắc theo kiểu mặt bằng với mặt lõm tạo góc nghiêng nhất định, đảm bảo mép dao song song với mặt khối parafin và vuông góc với hướng di chuyển Trong quá trình cắt, cần thường xuyên lau sạch lưỡi dao bằng giẻ tẩm xylen để duy trì hiệu quả cắt.
Kẹp chặt giá gỗ có parafin vào bàn kẹp mẫu vật để thực hiện các lát cắt ngang hoặc dọc Hãy cẩn thận tiếp cận mép lưỡi dao với mặt trên của khối parafin.
Dùng ốc vi cấp để xác định độ dày của lát cắt tùy theo đối tƣợng và mục đích nghiên cứu
Để bắt đầu cắt khối parafin, nâng giá kẹp mẫu vật ở mặt trước dao lên bằng chiều dài lát cắt Tiếp theo, kéo bàn trượt cùng với lưỡi dao về phía mình để cắt một lớp theo yêu cầu Tiếp tục thực hiện các lát cắt còn lại Trong quá trình cắt, nếu lưỡi dao phát ra tiếng kêu, điều này cho thấy góc nghiêng của dao chưa đạt yêu cầu và cần được điều chỉnh lại.
Sử dụng chổi lông mềm để lấy các lát cắt từ dao và đặt chúng lên đáy hộp dài có mặt đen mà không để sâu Đảm bảo ghi nhãn để tránh nhầm lẫn Tiếp theo, dán các tiêu bản lên lam kính Sau khi sử dụng, nhớ lau sạch máy cắt lát và bảo quản dao cắt cẩn thận.
Hiện nay, ngoài hai loại máy cắt truyền thống, còn có máy cắt lát đông lạnh sử dụng khí CO2 để cắt vật tươi trực tiếp Nếu không có máy cắt, người dùng có thể sử dụng dao cắt tay, với khả năng đạt độ dày dưới 10 mm Đối với những vật liệu mềm như rễ hành, tỏi hay túi phấn, có thể ép chúng bằng hai miếng kính lam hoặc một lamen, giúp thu được những tiêu bản chất lượng cao.
Nhuộm tiêu bản
1.5.1 Phương pháp pha chế một số loại thuốc nhuộm
Các thuốc nhuộm dùng để nhuộm tiêu bản không có sẵn mà cần được pha chế theo quy trình cụ thể trước khi sử dụng Dưới đây là một số loại thuốc nhuộm phổ biến.
1.5.1.1 Pha dung d ị ch axeto cacmin
Axeto cacmin là thuốc nhuộm chủ yếu dùng để nhuộm cấu trúc nhân tế bào Để chuẩn bị dung dịch nhuộm, hòa tan 1 g axeto cacmin (có thể dùng 2 g hoặc hơn tùy nhu cầu) vào 45 ml axit axetic đậm đặc và 55 ml nước cất Sau đó, cho hỗn hợp vào bình cầu có thiết bị làm nguội và đun cách thủy trong 30 – 60 phút Nếu không có thiết bị làm nguội, có thể sử dụng ống thông để thoát khí Sau khi đun, để dung dịch nguội và lọc qua phễu giấy lọc Dung dịch đã lọc được cho vào chai nâu, đậy nắp và bảo quản trong tủ lạnh Cặn axeto cacmin còn lại trên giấy lọc có thể tái sử dụng.
Để chuẩn bị thuốc nhuộm cacmin, hòa tan 4 g cacmin trong 15 ml nước nóng, thêm 1 ml HCl Sau khi để nguội, đổ hỗn hợp vào 95 ml cồn 85% và tiến hành lọc.
1.5.1.2 Pha dung d ị ch axeto ocxein (Orcein)
Axeto ocxein là một loại thuốc nhuộm hiệu quả cho các cấu trúc nhân của nấm và thực vật bậc cao Để pha chế, hòa tan 1 g orcein vào 45 ml axit axetic, sau đó làm lạnh hỗn hợp Tiếp theo, thêm 55 ml nước cất, lắc nhẹ và lọc trước khi bảo quản trong lọ nâu có nút nhám.
Cân 2 g lacmoit, hòa vào 100 ml axit axetic 45% đem đun sôi 2 giờ trong bình cầu có thiết bị ngƣng lạnh Sau khi bốc hơi cho thêm axit axetic cho đến khối lƣợng ban đầu rồi lọc và bảo quản trong lọ nâu có nút nhám
Xanh metylen hòa tan tốt trong nước, rượu và glycerin Phương pháp pha chế: Lấy 100 – 500 mg xanh metylen hòa vào 100 ml nước cất
Lưu ý: Khi dùng các loại thuốc nhuộm trên thì mẫu vật được cố định trong cồn axetic theo tỉ lệ 3:1
1.5.2 Kỹ thuật nhuộm tiêu bản
Nếu tiêu bản không chứa parafin, như tiêu bản ép tay hoặc cắt bằng dao tay, có thể tiến hành nhuộm ngay Ngược lại, với tiêu bản cắt bằng microtome và đúc trong parafin, cần phải khử parafin bằng xylen hoặc toluen trước Sau đó, rửa sạch xylen hoặc toluen bằng cồn, và cuối cùng rửa sạch cồn bằng nước cất trước khi thực hiện nhuộm.
1.5.2.2 Các phương pháp nhuộm tiêu bản
Các loại thuốc nhuộm tế bào có tính chất, màu sắc và khả năng hoạt động khác nhau, do đó việc chọn thuốc nhuộm phù hợp với mục đích nghiên cứu là rất quan trọng để có tiêu bản chất lượng Sau khi nhuộm, cần rửa tiêu bản bằng nước cất và nếu muốn bảo quản lâu dài, nên cố định tiêu bản trong keo Canada Một trong những phương pháp nhuộm tiêu bản phổ biến là sử dụng thuốc nhuộm tím gentian theo phương pháp của Newton.
Phương pháp nhuộm tiêu bản bằng tím genxian là kỹ thuật nhuộm nhanh, phổ biến trong nghiên cứu tế bào học, phôi học và di truyền học Phương pháp này giúp nhuộm màu tím cho nhiễm sắc thể, trong khi các thành phần khác vẫn giữ nguyên trạng thái trong suốt Quy trình thực hiện được tiến hành theo các bước cụ thể.
Nhúng lam kính vào xylen I (Dimetylbenzen) trong khoảng 10 – 30 phút, sau đó chuyển sang xylen II (o–Xylen hay 1,2–Dimetylbenzen) trong 5 – 6 phút Tiếp theo, sử dụng cồn 96% để rửa tiêu bản bằng ống nhỏ giọt, rồi ngâm tiêu bản trong cồn 96% khoảng 10 – 15 phút.
– Rửa tiêu bản bằng nước cất trong 3 – 5 phút
–Nhúng vào dung dịch tím gentian 1% (1 g tím geatian nguyên chất pha trong l00 ml nước cất) trong 5 – 15 phút tùy theo đối tượng
Rửa sạch trong nước cất từ 3 đến 5 giây, sau đó ngâm vào dung dịch gồm 1g iốt và 1g kali iôđua hòa trong 100ml cồn 80% (nếu không có cồn, có thể sử dụng nước cất).
– Rửa tiêu bản bằng cồn 96% và ngâm trong khoảng 2 – 3 giây
– Rửa lại bằng cồn 100%, rồi ngâm trong khoảng 2 – 3 giây Nếu tiêu bản nhiều nước thì có thể để lâu hơn
– Tiến hành phân hóa bằng dầu cẩm chướng hoặc cũng có thể phân hóa trong hỗn hợp dầu cẩm chướng và xylen theo tỉ lệ 1:1).
– Nhúng lam kính có tiêu bản vào xylen III (m–Xylen hay 1,3–Dimetylbenzen) khoảng từ 3 – 5 giây rồi cho vào xylen IV (p–Xylen hay 1,4–Dimetylbenzen) khoảng
Phương pháp trên rất thích hợp đối với việc đếm các nhiễm sắc thể dài xếp chồng lên nhau b Nhuộm tiêu bản bằng axeto cacmin
Theo N.V Favorski có 2 phương pháp chính:
–Phương pháp 1 gồm những bước như sau:
Nhỏ 1 – 2 giọt axeto cacmin 3% lên tiêu bản cắt lát đã khử parafin bằng xylen và rửa sạch bằng nước cất trong 3 – 5 phút, kết hợp với việc hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn vài lần
Rửa tiêu bản đã nhuộm bằng nước để loại bỏ axeto cacmin còn lại, rồi phân hóa trong dung dịch amiac thị trường 0,5% dưới kính hiển vi
Rửa lại tiêu bản trong nước cất 5 phút rồi khử nước trong cồn 90% và 100% Chuyển tiêu bản qua xylen rồi dán bằng keo Canada
– Phương pháp 2 gồm những bước sau:
Sau khi khử parafin bằng xylen và rửa sạch bằng nước cất, các lát cắt mẫu vật được nhuộm bằng axeto cacmin trong thời gian 5 phút.
Rửa mẫu vật đã nhuộm bằng nước cất, rồi chuyển vào dung dịch phèn sắt – amoni
3 – 5% và hơ nóng trên ngọn lửa đèn cồn cho đến lúc bốc hơi.
Rửa lại mẫu vật trong nước cất, rồi khử nước trong cồn 90% và 100%
Chuyển tiêu bản vào xylen
Nhiễm sắc thểnhuộm theo phương pháp này thì có màu đen c Nhuộm tiêu bản bằng axeto fucxin (fuchsine)
Lấy 1 g fucxin basic hòa vào 50 ml axit axetic 40% Đun nóng dung dịch đến
Để fucxin tan hoàn toàn, nhiệt độ cần đạt 50 độ C, sau đó làm lạnh xuống 25 – 30 độ C và lọc bằng giấy lọc Các mẫu được cố định trong axit axetic 45% trong khoảng 10 – 30 phút ở nhiệt độ 15 độ C, tiếp theo là quá trình làm mủn trong HCl (1N) trong khoảng 10 – 30 giây ở nhiệt độ 60 độ C.
Nhuộm mẫu vật bằng axeto fucxin trong các lọ nhỏ kín trong thời gian 1 – 3 giờ, trong khi tiêu bản nén được chuẩn bị với axit axetic 30% giúp làm sáng tế bào chất Trong trường hợp này, nhiễm sắc thể sẽ có màu tím đậm Ngoài ra, có thể nhuộm tiêu bản bằng lacmoit propionic.
Thuốc nhuộm lacmoit propionic được sử dụng để nhuộm các tiêu bản tạm thời của rễ non và bao phấn thực vật Công thức pha chế gồm 5 g lacmoit hòa vào 50 ml axit propionic 50%, để trong chỗ tối khoảng 3 – 5 ngày và lắc đều thường xuyên Sau khi lọc, dung dịch này được dùng làm dung dịch chuẩn Để nhuộm, cho các đầu rễ dài 2 – 4 mm vào ống nghiệm chứa 5 – 10 giọt dung dịch chuẩn, ngâm trong 2 giờ Tiếp theo, chuyển đầu rễ vào 0,5 ml axit propionic 40% và đun sôi từ 5 – 30 giây để làm mủn Sau đó, chuyển rễ lên lam kính sạch, nhỏ thêm một giọt axit propionic 40%, đậy lamen lại và ép nát tiêu bản Để nâng cao độ tương phản của nhiễm sắc thể, cần nghiên cứu trên các tiêu bản đã chuẩn bị khoảng 30 phút; nhiễm sắc thể sẽ có màu nâu khi nhuộm bằng phương pháp này.
Nguyên t ắc và phương pháp chuẩ n b ị tiêu b ả n nén
1.6.1 Cốđịnh và làm mủn tiêu bản
Tiêu bản nén đang trở thành công cụ phổ biến trong nghiên cứu hiển vi, giúp đơn giản hóa quy trình so với phương pháp cắt lát truyền thống Chúng được sử dụng để nghiên cứu phân bào nguyên nhiễm, giảm nhiễm, cũng như cấu trúc và hình thái của nhiễm sắc thể ở cả thực vật và động vật.
Chất cố định phổ biến nhất trong việc chuẩn bị tiêu bản nén bao gồm Carnoy, cồn etylic và Nyukomera Đối với những nhiễm sắc thể quá dài, cần áp dụng phương pháp đặc hiệu để co ngắn chúng Chẳng hạn, để phân tích nhiễm sắc thể của cây crepis capillaris, rễ non cần được xử lý trong dung dịch conchixin với nồng độ thích hợp trước khi cố định.
Trong quá trình xử lý conchixin, nồng độ từ 0,01 – 0,05% được áp dụng trong khoảng thời gian 2 giờ Nhiều trường hợp còn bổ sung thêm dung dịch hỗn hợp paradiclorobenzene và 8-oxiquinolin 0,002M (1:1) cũng trong 2 giờ, được pha chế trong tủ ấm ở nhiệt độ 60°C Hiện nay, dung dịch monobrom naptalin bão hòa trong nước cũng được sử dụng để xử lý các rễ non Sau khi cố định mẫu vật trong các dung dịch này, chúng được bảo quản trong cồn 70% hoặc 80% ở điều kiện lạnh (4°C).
Các phương pháp làm mủn mô đóng vai trò quan trọng trong việc chuẩn bị tiêu bản nén Thông thường, axit axetic 45%, axit propionic 40-50%, cloral hydrat, axit clohydric 1N và các enzym như xitaza được sử dụng để làm mủn Rozen đã áp dụng các phương pháp này để xử lý đối tượng nghiên cứu một cách hiệu quả.
Chuẩn bị hỗn hợp axit clohydric đậm đặc và cồn etylic 95% theo tỷ lệ 1:4:1:2:1, tùy thuộc vào đối tượng nghiên cứu Đối với các đối tượng mềm và dễ làm mủn, sử dụng tỷ lệ 1:4 Sau đó, làm lạnh chất làm mủn đến 10 – 15°C và ngâm đối tượng nghiên cứu trong hỗn hợp này khoảng 5–20 phút.
– Sau đó rửa mẫu vật qua nước lạnh từ 30 phút đến 2 giờrồi chuyển đối tượng lên kính để tiêu bản, nhỏ 1 giọt nigrozin 4% ở nhiệt độ 18 – 20°C trong 2 – 3 phút
– Sau khi làm mủn, các tiêu bản được nhuộm bằng các thuốc nhuộm thông thường nhƣ axeto cacmin 3 – 5% axeto ocxein, axeto lacmoit, thuốc thử Schiff, v.v…
1.6.2 Phương pháp chuẩn bị tiêu bản nén
Phương pháp chuẩn bị tiêu bản nén có thể thực hiện qua các bước cụ thể như sau: – Cố định mẫu vật trong Carnoy biến đổi vài giờ
– Rửa mẫu vật trong cồn 70% – 80% cho đến khi hết mùi của axetic
–Cất giữ mẫu vật trong cồn 70% (nếu chƣa dùng hết)
– Làm mủn mẫu vật trong HCl (1N) ở nhiệt độ 60°C vài giây hoặc vài phút tùy theo từng đối tƣợng nghiên cứu
– Rửa mẫu vật lại trong nước để loại trừ HCl còn thừa các cặn bẩn
Nhuộm tiêu bản trong các thuốc nhuộm thường mất khoảng 3 – 5 phút, nhưng đối với những rễ cây khó làm mủn, thời gian nhuộm có thể kéo dài hơn, như trường hợp của các rễ cây họ hòa thảo Khi sử dụng axeto ocxein, axeto cacmin hoặc axeto lacmoit, cần hơ nóng tiêu bản trên đèn cồn để làm mủn mẫu vật và giúp hóa chất thấm nhanh vào nhân tế bào, đặc biệt quan trọng khi không sử dụng HCl để làm mủn Sau khi nhuộm, đặt mẫu vật lên lam kính, nhỏ một giọt axit axetic 45% hoặc cloral hydrat (5 g cloral hydrat hòa trong 2 ml nước cất), gạt bỏ mô thừa, đậy lamen để tránh bọt khí, và dùng đầu que diêm không có thuốc dằm nhẹ từ trong ra ngoài để tiêu bản được dàn mỏng.
Ngoài các phương pháp đã nêu, có thể thực hiện một số thay đổi trong quá trình cất giữ và nhuộm mẫu vật Cụ thể, mẫu vật đã cố định có thể được lưu trữ trong thuốc cố định mới ở nhiệt độ 0–3°C, sau đó nhuộm và làm mủn bằng hỗn hợp axeto ocxein 2% và HCl (1N) với tỷ lệ 9:1 kết hợp với đun nóng Ngoài ra, axeto lacmoit 4% và HCl (1N) theo tỷ lệ 9:1 cũng có thể được sử dụng để làm mủn mẫu vật trước khi nhuộm Một số tác giả như Mac Klintoc và Benling đã chỉ ra rằng việc cất giữ mẫu vật trong cồn 70% ở nhiệt độ 0–3°C và nhuộm bằng axeto cacmin có thêm sắt cũng mang lại hiệu quả tốt.
Có thể thay thế chất làm mủn mẫu vật HCl bằng axeto cacmin hoặc axeto ocxein, với thời gian ngâm mẫu trong các dung dịch này khoảng một đêm Đối với axeto lacmoit, để làm mủn mẫu vật cần phải ngâm ít nhất 2 ngày.
1.6.3 Chuẩn bị tiêu bản lấy từmô phân sinh đầu ngọn, lá non a Chuẩn bị tiêu bản lấy từ môphân sinh đầu ngọn Đối với các cây thuộc họ hòa thảo có rễ cứng nên khó ép mỏng, tế bào chất lại bắt màu axeto cacmin rất mau Vì vậy rất khó phân biệt giữa nhân và tế bào chất Trong trường hợp này có thể nghiên cứu phân bào nguyên nhiễmvà hình thái nhiễm sắc thể ở mô phân sinh đầu ngọn bằng cách lấy chóp lá mầm của các hạt mới nảy mầm xử lí dung dịch conchixin với nồng độ 0,3% và dung dịch paradiclorobenzene trong 3 giờ Cố định mầm trong Carnoy biến đổi Sau đó cho mẫu vật qua các dung dịch cồn 80%, 50%, 30%, rửa qua nước và nhuộm bằng thuốc thử Schiff b Chuẩn bị tiêu bản lấy từ lá non
Thuốc cố định cồn axetic thường được sử dụng để cố định các lá non đang sinh trưởng mạnh Sau khi cố định, mẫu vật được rửa và bảo quản trong cồn 70% Để nhuộm, các lá non đã cố định được ngâm trong axeto cacmin hoặc axeto ocxein và đun sôi nhiều lần Tiếp theo, chuyển các lá non đã nhuộm lên lam kính, nhỏ vài giọt axit axetic 45% vào tiêu bản Sử dụng kim tiêu bản để tách lấy phần gốc lá, nơi có phân bào mạnh nhất, và loại bỏ các phần còn lại Sau đó, đậy lamen lại, ép nhẹ tiêu bản để dàn mỏng các tế bào, rồi quan sát trên kính hiển vi Phương pháp này có thể được áp dụng để đếm số lượng nhiễm sắc thể trên các cây trồng.
Để quan sát nhiều tế bào ở kỳ giữa, cần xử lý mẫu bằng dung dịch conchixin 0,2% trong 1-2 giờ trước khi cố định Đối với nghiên cứu nhiễm sắc thể, các lá tươi nên được ngâm trong dung dịch esculin đặc 15-24 giờ ở nhiệt độ 10-12°C trước khi cố định trong cồn axetic từ 3-24 giờ Sau khi cố định, mẫu vật được ngâm trong hỗn hợp axeto ocxein 2% và HCl 1N theo tỷ lệ 9:1 để làm mủn và nhuộm tiêu bản Tiếp theo, mẫu được hơ nóng trên ngọn lửa đèn cồn vài giây, rồi cho vào dung dịch ở 30°C trong 30 phút Cuối cùng, chuyển mẫu lên lam kính, nhuộm bằng axeto ocxein 1%, đậy lamen và ép tiêu bản.
1.6.4 Phương pháp chuẩn bị nhanh tiêu bản nén
Dyer (1963) đã nêu ra phương pháp để chuẩn bị nhanh tiêu bản nén theo các bước nhƣ sau:
– Chuẩn bị một hỗn hợp dung dịch cố định: cồn etylic, axit axetic, clorofom và formalin theo tỉ lệ 10:2:2:1
– Cố định mẫu vật trong dung dịch trên trong 5 phút
– Làm mủn mẫu vật bằng HCl (1N) ở nhiệt độ 50°C từ 3 – 5 phút tùy theo từng đối tƣợng.
Để nhuộm mẫu vật, hãy ngâm chúng trong hỗn hợp ocxein, axit lactic và axit propionic trong thời gian 2-5 phút Hỗn hợp này được chuẩn bị bằng cách hòa tan 2 g orcein vào 100 ml hỗn hợp axit lactic và axit propionic 45% với tỉ lệ thể tích bằng nhau.
–Nhuộm mẫu vật trong hỗn hợp orcein, axit lactic và axit propionic 45% với tỉ lệ thể tích bằng nhau.
Chuy ể n tiêu b ả n t ạ m th ờ i thành tiêu b ả n c ố đị nh
Tùy thuộc vào điều kiện của phòng thí nghiệm, có thể áp dụng ba phương pháp để chuyển tiêu bản tạm thời thành tiêu bản cố định Phương pháp 1 sử dụng đá khô, trong đó axit cacbonic rắn được dùng để làm bất động lam kính trong 1-1,5 phút, sau đó tiêu bản được khử nước bằng cồn etylic 96% và 100%, tiếp theo là xylen I và II Phương pháp 2 sử dụng nitơ lỏng, trong đó tiêu bản được đặt lên bàn lạnh bằng nhôm và sau đó tách ra để xử lý tương tự như phương pháp 1 Phương pháp 3 là giải pháp đơn giản hơn khi không có đá khô hay nitơ lỏng, sử dụng axit axetic 10% để tách lamen khỏi lam kính bằng cách đặt lam kính vào dung dịch axit trong đĩa petri.
Trong quá trình tách lam kính, hãy đảm bảo thực hiện trong khoảng thời gian từ 10 đến 15 phút Sau đó, nhanh chóng đưa lam kính vào dung dịch cố định cồn axetic Tiếp theo, chuyển lam kính vào các dung dịch khác theo đúng thứ tự và thời gian đã quy định trong phương pháp 1.
Để chuyển tiêu bản thành công, lam kính cần phải sạch; nếu không, mẫu vật sẽ bị rửa trôi Trong những trường hợp cần thiết, nếu công việc chuẩn bị lam kính và lamen chưa đạt tiêu chuẩn, có thể cố định cả lamen và lam kính sau khi tách ra, nhằm phát hiện và giữ lại tiêu bản.
PHƯƠNG PHÁP LÀM TIÊU BẢN NÉN TẠM THỜI, NGHIÊN CỨU CÁC PHA CỦA NGUYÊN PHÂN VÀ BỘ NHIỄM SẮC THỂ CỦA LOÀI
Nguyên phân (phân chia nguyên nhi ễ m)
Cơ thể của hầu hết các loài sinh vật là đa bào, được hình thành từ nhiều tế bào có đặc điểm cơ bản giống nhau như màng sinh chất, tế bào chất, bào quan, ty thể, lưới nội chất và trung thể Khi mới hình thành, cơ thể chỉ là một tế bào, và sự phát triển chủ yếu đến từ việc tăng số lượng tế bào thông qua quá trình nguyên phân sau mỗi chu kỳ tế bào.
Chu kỳ tế bào là khoảng thời gian giữa hai lần phân bào liên tiếp, bắt đầu từ cuối lần phân bào trước đến cuối lần phân bào kế tiếp Chu kỳ này gồm hai giai đoạn chính: giai đoạn chuẩn bị (kỳ trung gian hay tĩnh kỳ - Interphase) và giai đoạn phân chia (Mitosis - M).
2.1.1 Giai đoạn chuẩn bị (kỳ trung gian)
Trong kỳ trung gian của chu kỳ tế bào, tế bào trải qua quá trình tăng trưởng và chuẩn bị cho sự phân bào, với sự tổng hợp ADN diễn ra quan trọng Trong giai đoạn này, nhiễm sắc thể không thể quan sát được vì chúng ở dạng duỗi xoắn Kỳ trung gian được chia thành ba giai đoạn nhỏ, trong đó giai đoạn trước tổng hợp ADN được gọi là G1.
Giai đoạn này bắt đầu sau khi kết thúc lần phân chia trước, trong đó tế bào tăng trưởng về kích thước và tích tụ các enzym cùng cơ chất cần thiết cho sự tổng hợp ADN Nhiễm sắc thể ở trạng thái đơn với dạng sợi mảnh, các gen thực hiện chức năng sao mã, tổng hợp protein và hình thành các loại ARN Tốc độ chuyển hóa của tế bào trong giai đoạn này rất cao, chuẩn bị cơ sở vật chất cho quá trình tổng hợp ADN.
Tế bào tiến hành tổng hợp ADN tự nhân đôi và sản xuất các protein histon cùng phi histon, đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành sợi nhiễm sắc Khi quá trình này diễn ra, các nhiễm sắc thể bắt đầu tự nhân đôi để chuẩn bị cho kỳ phân chia.
Trong giai đoạn sau tổng hợp ADN (G2), diễn ra nhiều quá trình quan trọng như tổng hợp các hợp chất cao phân tử như protein và ARN, cùng với việc sản xuất các hợp chất giàu năng lượng như ATP Đặc biệt, sự tự nhân đôi của trung tử (trung thể) là yếu tố then chốt trong việc hình thành thoi vô sắc sau này Vào cuối giai đoạn này, mỗi nhiễm sắc thể tồn tại ở trạng thái kép, với hai nhiễm sắc tử gắn liền nhau tại tâm động.
Trong giai đoạn này, nhiễm sắc thể ở trạng thái sợi kép, tế bào tích lũy năng lượng và chuẩn bị các yếu tố cần thiết cho quá trình phân chia Trạng thái chuyển hóa của tế bào cũng gia tăng, với giai đoạn G1 và G2 chiếm thời gian dài hơn do đây là giai đoạn tích lũy Trong chu kỳ tế bào, có hai ngưỡng mà tế bào nhạy cảm với nhiều tác động khác nhau.
– Ngƣỡng chuyển từ G 1 –S – nhiều tác động kích thích ngƣỡng này nhƣ tác động của các hoocmon sinh trưởng, điều kiện dinh dưỡng…
– Ngƣỡng chuyển từ G 2 –M – ngƣỡng này khá mẫn cảm với tác động kích thích của dạng phytohoocmon nhƣ xitokinin (Cytokinin)
2.1.2 Diễn biếncủa phân chia nguyên nhiễm
Phân chia nguyên nhiễm hay nguyên phân được Walter Flemming quan sát lần đầu vào năm 1789, và sau đó, vào năm 1884, Strasburger đã mô tả chi tiết cũng như đặt tên cho các giai đoạn của quá trình phân chia này.
Nguyên phân là quá trình phân chia tế bào đặc biệt, trong đó một tế bào mẹ tạo ra hai tế bào con giống hệt nhau về mặt di truyền Quá trình này chủ yếu xảy ra ở các tế bào nhân chuẩn, nhưng có sự khác biệt ở một số loài Đối với động vật nhân sơ, tế bào không có nhân hoặc có nhân không hoàn chỉnh thực hiện phân chia theo cách trực phân, dẫn đến việc tạo ra các nhân con với bộ nhiễm sắc thể không đồng nhất Hiện tượng này thường xuất hiện trong các tế bào của mô chuyên hóa cao, tế bào tạm thời như noãn tâm, nội nhũ, ngoại nhũ, cũng như trong các tế bào bị biến đổi do bệnh lý.
Nguyên phân xảy ra ở các tế bào sinh dƣỡng, nhất là các tế bào ở vùng mô phân sinh nhƣ:
– Mô phân sinh đỉnh (chồi ngọn, chóp rễ…)
– Mô phân sinh bên (ở thân cây, giúp cây phát triển bề ngang)
– Mô lóng (ở cây họ lúa: Lúa, ngô, mía,…)
– Mô sẹo (giúp cây làm lành các vết thương)
Quá trình nguyên phân gồm 4 kỳ: Kỳ đầu, kỳ giữa, kỳ sau và kỳ cuối (Hình 2.2 và Hình 2.3) Đầu kỳ đầu Cuối kỳ đầu
Kỳ giữa Kỳ sau Kỳ cuối
Kỳ đầu (Prophase) là pha dài nhất trong quá trình nguyên phân, khi các nhiễm sắc thể bắt đầu co xoắn và trở nên rõ ràng hơn Vào đầu kỳ đầu, nhiễm sắc thể ở dạng sợi mảnh trong nhân có thể tăng kích thước, trong khi màng nhân và nhân con vẫn còn quan sát được Cuối kỳ đầu, nhiễm sắc thể tiếp tục co xoắn và lớn hơn, đồng thời màng nhân và nhân con biến mất Trung tử tách ra và di chuyển về hai cực của tế bào, tạo thành sợi tơ vô sắc từ các protein có cấu trúc giống sợi cơ, kéo dài về hai cực tế bào.
Các nhiễm sắc thể đính với sợi tơ vô sắc ở tâm động và bắt đầu dịch chuyển về mặt phẳng xích đạo của tế bào
Hình 2.3 Quá trình phân chia nguyên nhiễm ở tế bào rễ hành
A – Kỳ trung gian; B – Kỳ đầu; C – Kỳ giữa; D – Kỳ sau; E, F – Kỳ cuối b Kỳ giữa (Metaphase)
Trong kỳ sau (Anaphase), các nhiễm sắc thể co ngắn và xoắn lại tối đa, tạo thành hình dạng và kích thước đặc trưng Các nhiễm sắc thể kép được sắp xếp thành một hàng trên mặt phẳng xích đạo của thoi vô sắc.
Tâm động của nhiễm sắc thể tách đôi giúp tạo ra hai nhiễm sắc thể đơn di chuyển về hai cực của tế bào nhờ sự co giãn của sợi tơ vô sắc Nếu nhiễm sắc thể mất tâm động, chúng sẽ không di chuyển đến hai cực mà bị giữ lại ở giữa tế bào Trong kỳ cuối, các nhiễm sắc thể tập trung ở hai cực và bắt đầu duỗi xoắn trở về dạng sợi mảnh như ban đầu, khiến chúng không còn rõ ràng Màng nhân và nhân con được hình thành, đưa nhân trở lại trạng thái như ở kỳ trung gian.
Hình 2.4 Sự hình thành vách ngăn chia tế bào mẹ thành hai tế bào con
A – Tế bào động vật; B – Tế bào thực vật
Trong quá trình phân chia tế bào, tế bào chất cũng phân chia, kéo theo sự phân chia của các bào quan như ty thể và lưới nội chất Hiện tượng này gọi là cytokinese, trong đó vách ngăn xuất hiện để chia tế bào mẹ thành hai tế bào con Ở tế bào động vật, vách ngăn hình thành theo kiểu eo thắt từ ngoài vào, trong khi ở tế bào thực vật, vách ngăn được hình thành từ phía trong ra do có màng xenlulô bao bọc Mặc dù lý thuyết cho rằng hai tế bào con có kích thước bằng nhau, nhưng do sự phân chia tế bào chất mang tính ngẫu nhiên, kích thước của hai tế bào con có thể không giống nhau.
Hình 2.5 Các kỳ phâ n chia nguyên nhiễm ở tế bào rễ hành a – Kỳ trung gian; b – Kỳ đầu; c – Kỳ giữa; d – Kỳ sau; e – Kỳ cuối
Thời gian phân chia nguyên nhiễm ở các tế bào dao động từ 30 phút đến 5 giờ, với kỳ đầu chiếm thời gian lâu nhất, tiếp theo là kỳ cuối, và kỳ sau có thời gian ngắn nhất Nhiệt độ tối ưu cho quá trình này là từ 20 đến 30 độ C; nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp sẽ ảnh hưởng tiêu cực đến quá trình phân bào.
Chỉ số phân bào, hay chỉ số nguyên phân, là một chỉ số quan trọng phản ánh hoạt tính nguyên phân của tế bào Chỉ số này được tính bằng tỷ lệ số lượng tế bào đang trong quá trình nguyên phân so với tổng số tế bào được khảo sát Đặc biệt, chỉ số nguyên phân được biểu diễn dưới dạng số phần nghìn (‰), tương ứng với số lượng tế bào nguyên phân trên 1000 tế bào Cách xác định chỉ số phân bào được trình bày bởi Пухальский và các cộng sự vào năm 2007.
Trong đó, MI – chỉ số phân bào; P, M, A, T, I – tương ứng là số lượng tế bào trong kỳ đầu, kỳ giữa, kỳ sau, kỳ cuối, kỳ trung gian
Các bước làm tiêu bản nén tạm thời, quan sát các pha của nguyên phân và đếm số lƣợng nhiễm sắc thể
CỦA NGUYÊN PHÂN VÀ ĐẾM SỐLƢỢNG NHIỄM SẮC THỂ
2.2.1 Các bước làm tiêu bản nén tạm thời và quan sát các pha của quá trình nguyên phân
2.2.1.1 V ậ t li ệ u và thi ế t b ị , hóa ch ấ t
– Rễ hành (Allium cepa, 2n = 16) và một số cây trồng khác
– Kính hiển vi quang học với vật kính ở độ phóng đại 10X và 40X
– Lam kính (kính mang vật), lamen (kính đậy vật), kim mũi mác (kim tiêu bản), panh, dao lam, giấy thấm, đèn cồn…
Hóa chất: Dung dịch Carnoy biến đổi, cồn 70 o , dung dịch thuốc nhuộm axeto cacmin (3%), nước cất, axit axetic (45%)
Quá trình phân bào nguyên nhiễm diễn ra trong các tế bào vùng mô phân sinh như chóp rễ non và đỉnh sinh trưởng của cây Để quan sát quá trình này, cần thực hiện phương pháp cố định mẫu rễ hành một cách chính xác.
Để chuẩn bị củ hành, trước tiên bạn cần rửa sạch và cắt bỏ rễ Tiếp theo, hãy giâm củ hành trong môi trường ẩm như cát ẩm, đất trộn tro trấu hoặc nước trong khoảng 2 – 3 ngày cho đến khi rễ phát triển dài từ 0,5 – 1,5 cm Sau khi rễ đã đạt độ dài mong muốn, hãy cắt và rửa sạch chúng bằng nước cất Thời điểm lý tưởng để thu hoạch rễ là từ 7 đến 8 giờ sáng, khi tế bào phân chia diễn ra mạnh mẽ nhất.
Ngay sau khi thu rễ, cần cố định mẫu ngay lập tức, tốt nhất là ở nhiệt độ thấp bằng cách đặt cốc chứa mẫu lên khay đá lạnh mà không cần dung dịch Có thể sử dụng đĩa petri để đựng mẫu Sau đó, cho một ít nước cất vào cốc và để trong ngăn đá tủ lạnh khoảng 2–5 phút cho đến khi xuất hiện váng Cuối cùng, chuyển cốc chứa mẫu vào ngăn mát tủ lạnh và giữ ở đó khoảng 24 giờ.
Sau 24 giờ để mẫu ở nhiệt độ phòng, rễ được rửa sạch bằng nước cất và ngâm trong dung dịch Carnoy trong 12 – 24 giờ Quy trình này giúp tiêu diệt tế bào, ngăn chặn quá trình phân chia tế bào và làm cứng vách tế bào, từ đó cố định hình dạng để dễ dàng quan sát.
Sau khi rửa rễ bằng cồn 70-80% cho đến khi hết mùi chua của axit, mẫu rễ hành cần được bảo quản ở nhiệt độ tủ lạnh khoảng 10-15°C Phương pháp cố định này giúp bảo quản mẫu rễ trong thời gian dài, lên đến 1-2 năm, để phục vụ cho việc quan sát các giai đoạn của quá trình nguyên phân.
Để tạo tiêu bản quan sát, cần nhuộm màu bằng dung dịch axeto cacmin (3%) với thể tích thuốc nhuộm ít nhất gấp ba lần thể tích rễ hành Hỗn hợp thuốc nhuộm và rễ hành được đun trên ngọn lửa đèn cồn trong khoảng 2 đến 3 phút.
Hình 2.9 Hành củ ngâm trong nước và giâm trong cát ẩ m để thu rễ
Hình 2.10 Rễ hành đƣợc cố định trong dung dị ch Carnoy biến đổi và rửa bằng cồn 70 o
2.2.1.3 Phương pháp thự c hi ệ n tiêu b ả n t ạ m th ờ i Để quan sát quá trình phân bào nguyên nhiễmở tế bào chóp rễ hành (Hình 2.11.), các bước thực hiện một tiêu bản tạm thời như sau (Hình 2.12):
Hình 2.11 Cấu tạo rễ hành
Nguồn: http://bio.sci.ubu.ac.th/facilities/docs/Biology–Anatomy–Root–Leaf–stem.pdf
1 – Gắp 1 rễ hành cho lên lam kính
2 – Cắt phần chóp rễ (phần bắt màu đậm hơn)
4 – Đậy mẫu bằng lamen và tán đều mẫu
Hình 2.12 Phương pháp thực hiện tiêu bản nén tạm thời ở chó p rễ hành
Sử dụng panh nhọn để gắp 1-2 rễ hành đã cố định và đặt lên lam kính Tiếp theo, dùng kim mũi mác hoặc dao lam cắt phần chóp rễ với chiều dài khoảng 0,5-1 mm Nhỏ 1-2 giọt axit axetic (45%) lên các chóp rễ, đảm bảo che phủ toàn bộ chóp rễ và ngâm trong 1-2 phút Thao tác này giúp làm nhạt màu tế bào chất và làm mủn mẫu vật.
– Dùng kim mũi mác ấn nhẹ chóp rễ cho rễ dập ra để các tế bào dàn mỏng và tách rời nhau
Nhỏ 1-2 giọt thuốc nhuộm axeto cacmin vào mẫu rễ và để nhuộm trong 1-2 phút Sau đó, đậy mẫu bằng lamen, đảm bảo góc giữa lam kính và lamen là 45 độ Sử dụng cán kim mũi mác để tán mẫu, giúp các tế bào phân tán đều ra.
Sau khi tán mẫu, tiêu bản thu đƣợc có thể sử dụng để quan sát ngay
2.2.1.4 Yêu c ầu đố i v ớ i sinh viên
–Hãy cho biết tại sao nói nguyên phân là cơ sở của sự sinh sản vô tính? Ý nghĩa di truyền học của sự phân bào nguyên phân?
– Thực hiện một vài tiêu bản nén tạm thời để quan sát các giai đoạn của quá trình nguyên phân ở tế bào chóp rễ hành
Quan sát tế bào tiêu bản chóp rễ hành dưới kính hiển vi giúp nhận biết và phân biệt các kỳ trong quá trình nguyên phân Qua sự thay đổi trạng thái và vị trí của nhiễm sắc thể, chúng ta có thể chú ý đến các biểu hiện khác nhau của tế bào ở từng giai đoạn phân bào.
–Vẽ và chú thích các kỳcủa quá trình nguyên phân ở tế bào chóp rễ hành.
–Đếm số lƣợng tế bào ở các kỳcủa nguyên phân và viếtvào bảng sau:
Số lần đếm Số lượng tế bào
Kỳ trung gian (I) Kỳ đầu (P) Kỳ giữa (M) Kỳ sau (A) Kỳ cuối (T)
Từ đó xác định chỉ số phân bào?
2.2.2 Quan sát hình thái và đếm sốlƣợng nhiễm sắc thể
2.2.2.1 Vật liệu và thiết bị Để quan sát hình thái và đếm số lƣợng nhiễm cần chuẩn bị các vật liệu và thiết bị nhƣ sau:
– Các bao phấn non, rễ non, lá non của hành tây, dƣa chuột, đậu Hà Lan đã đƣợc cố định (Carnoy và giữ trong cồn 70% đến 80% (xem mục 6 bài 1)
Kính hiển vi với độ phóng đại từ 600 đến 1000 lần, như kính hiển vi ba mắt B-353PLi có gắn camera, hoặc sử dụng gương vẽ và mạng lưới thị kính, là những thiết bị quan trọng trong nghiên cứu và quan sát chi tiết.
– Dao lam, giấy thấm, kim tiêu bản, đèn cồn, lam kính và lamen sạch.
– Hóa chất: Axeto cacmin 3% (hoặc lacmoit), axit axetic 45%
2.2.2.2 Phương pháp tiến hành a Trên bao phấn non của hành tây
– Các bước làm tiêu bản:
Sử dụng kim tiêu bản để tách 2-3 bao phấn từ các vị trí khác nhau trên hoa Sau đó, loại bỏ các cơ quan phụ của hoa và giữ lại các bao phấn trên lam kính.
Giầm nát các bao phấn bằng kim tiêu bản và thêm 1 – 2 giọt axeto cacmin 3% (hoặc lacmoit) trước khi tiếp tục giầm nát Đun sôi nhỏ lửa trên ngọn đèn cồn vài lần và thực hiện quá trình nhuộm trong khoảng 7 – 10 phút.
Để chuẩn bị tiêu bản, trước tiên, bạn cần dùng giấy thấm để hút hết axeto cacmin còn thừa Sau đó, nhỏ một giọt axit axetic 45% hoặc glycerin lên mẫu và đậy lamen, chú ý tránh tạo bọt khí Tiếp theo, đặt một tờ giấy thấm lên lam kính và dùng đầu que diêm không thuốc để gõ nhẹ, giúp dàn mỏng tế bào trên tiêu bản thành một lớp mỏng đồng nhất.
+ Mỗi sinh viên cần chuẩn bị 10 tiêu bản có các đĩa kỳgiữa.
+ Lần lƣợt quan sát các tiêu bản đã chuẩn bị trên kính hiển vi có độ phóng đại từ
600 – 1000 lần Phát hiện các tiêu bản có các đĩa kỳ giữa rõ
Sử dụng máy ảnh hoặc gương vẽ trên kính hiển vi để chụp lại chi tiết bộ nhiễm sắc thể trong các tế bào, và dùng bút chì để vẽ lại các chi tiết này Đồng thời, xác định mức độ phóng đại của bộ nhiễm sắc thể thông qua trắc vi vật kính và trắc vi thị kính.
