TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y DƢỢC CẦN THƠ KHOA DƢỢC LIÊN BỘ MÔN HÓA PHÂN TÍCH – KIỂM NGHIỆM – ĐỘC CHẤT XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI METHYL PARABEN VÀ PROPYL PARABEN TRONG RƢỢU VANG BẰNG PHƢƠNG PHÁP UPLCUV GVHD ThS Nguyễn Mạnh Quân Học viên thực hiện Lê Văn Bẩy CH CK1 Kiểm nghiệm – Độc chất, Khóa 2020 2022 Cần Thơ 2022 TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y DƢỢC CẦN THƠ KHOA DƢỢC LIÊN BỘ MÔN HÓA PHÂN TÍCH – KIỂM NGHIỆM – ĐỘC CHẤT XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI METHYL PARABEN VÀ P.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tƣợng nghiên cứu
Rượu Vang DALATBECO - Premium, được sản xuất bởi công ty cổ phần rượu bia Đà Lạt, mã số 85/DALATBECO/2018, là mẫu rượu vang được lựa chọn để xây dựng quy trình định lượng methyparaben và propylparaben.
2.1.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu Địa điểm: Liên bộ môn Hóa phân tích – Kiểm nghiệm – Độc chất
2.1.3 Hóa chất, chất chuẩn, thiết bị, dụng cụ
2.1.3.1 Hóa chất, chất chuẩn, dung môi
- Dung môi: Methanol, acetonitril (Merck)
- Hệ thống máy UHPLC THERMO-DIONEX
- Cột sắc ký Thermo C18 (250 x 4,6mm, 5àm)
- Vial, kim tiờm, màng lọc 0,45àm
Nội dung nghiên cứu
2.2.1 Xây dựng quy trình định lượng đồng thời metylparaben và propylparaben trong rượu vang bằng phương pháp UPLC/UV
Để chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc metylparaben 1000ppm, cần cân chính xác 10mg metylparaben bằng cân phân tích 4 số lẻ và ghi lại khối lượng Sau đó, cho vào bình định mức 10ml, hòa tan bằng 5ml MeOH, siêu âm ở nhiệt độ phòng và định mức đến vạch bằng MeOH Cuối cùng, lắc trộn đều và bảo quản dung dịch chuẩn gốc trong tủ mát.
Dung dịch chuẩn làm việc metylparaben 16ppm được tạo ra bằng cách lấy chính xác 800µl dung dịch chuẩn gốc metylparaben, cho vào bình định mức 50ml và định mức đến vạch bằng pha động Sau đó, cần lắc trộn đều và bảo quản dung dịch chuẩn gốc trong tủ mát để đảm bảo tính ổn định.
Để đảm bảo độ chính xác trong quy trình chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc propylparaben 1000ppm, cần cân chính xác 10mg propyl paraben bằng cân phân tích 4 số lẻ và ghi lại khối lượng cân một cách chính xác Sau đó, cho lượng propyl paraben đã cân vào bình định mức 10ml và hòa tan bằng 5ml MeOH Tiếp theo, siêu âm dung dịch ở nhiệt độ phòng để đảm bảo hòa tan hoàn toàn, sau đó định mức đến vạch bằng MeOH và lắc trộn đều Cuối cùng, bảo quản dung dịch tránh ánh sáng trong tủ mát để duy trì chất lượng và độ ổn định.
Dung dịch chuẩn propylparaben 16ppm được pha chế bằng cách cho 800μl dung dịch chuẩn gốc vào bình định mức 50ml, sau đó định mức đến vạch bằng pha động và lắc đều Để đảm bảo độ chính xác, dung dịch chuẩn gốc cần được bảo quản trong tủ mát.
Hút 1ml rượu bằng pipet chính xác vào bình định mức 50ml, sau đó định mức đến vạch bằng pha động và lắc trộn đều Cuối cùng, bảo quản dung dịch chuẩn gốc trong tủ mát để đảm bảo chất lượng.
Để chuẩn bị mẫu thử, sử dụng pipet chính xác để thêm 1ml rượu vào bình định mức 50ml Tiếp theo, thêm 800µl dung dịch chuẩn gốc metylparaben và 800µl dung dịch chuẩn gốc propylparaben Định mức đến vạch bằng pha động, lắc trộn đều và bảo quản dung dịch chuẩn gốc trong tủ mát.
2.2.1.2 Khảo sát điều kiện sắc ký
- Khảo sát thành phần dung môi pha động: Acetonitrile – nước
- Khảo sát t lệ dung môi pha động: khảo sát chương trình đ ng dòng ACN-nước (40:60), (50:50), (60:40)
- Khảo sát bước sóng phát hiện: 280nm, 254nm, 225nm, 210nm
2.2.1.3 Khảo sát xử lý mẫu
Xử lý mẫu bằng phương pháp pha loãng đơn giản
2.2.2 Thẩm định quy trình định lượng đồng thời methyl paraben và propyl paraben trong rượu vang bằng phương pháp UPLC/UV
2.2.2.1 Tính tương thích hệ thống:
- Nhằm xác định độ phân giải và độ lặp lại của hệ thống phân tích sắc ký thích hợp với phương pháp phân tích đang thực hiện
Tiến hành tiêm 6 lần liên tiếp cho mẫu h n hợp chuẩn và mẫu thử giả lập
Để xác định các thông số sắc ký, ta cần xem xét các yếu tố như thời gian lưu (tR), diện tích đỉnh (S), độ phân giải (Rs), hệ số bất đối (As), hệ số dung lượng (k') và số đĩa lý thuyết (N) Những thông số này đóng vai trò quan trọng trong việc đánh giá hiệu suất và độ chính xác của quá trình phân tích sắc ký.
Độ lệch chuẩn tương đối: RSD = ̅ x 100%
+ Độ lệch chuẩn tương đối RSD của thời gian lưu và diện tích đỉnh phải
+ Hệ số bất đối: 0,8 ≤ As ≤ 1,5
Mục đích của quy trình phân tích là đảm bảo tính đặc hiệu, cho phép xác định chính xác chất cần phân tích mà không bị ảnh hưởng bởi sự có mặt của các chất khác trong mẫu thử Quy trình này giúp phân biệt chất phân tích với nền mẫu và các chất không liên quan, đảm bảo độ tin cậy trong kết quả phân tích.
Cách tiến hành: Tiến hành sắc ký các loại mẫu sau đây theo các điều kiện sắc ký tối ƣu đã xác định:
- Mẫu trắng: Dung môi pha động/dung môi hòa tan mẫu hay pha loãng mẫu
- Mẫu chuẩn: dung dịch chuẩn methylparaben và propylparaben
- Mẫu thử: mẫu rượu vang được xử lý theo phương pháp đã chọn
- Mẫu thử thêm chuẩn: mẫu rƣợu vang đã đƣợc cho thêm chuẩn methylparaben và propylparaben nồng độ xác định, đƣợc xử lý theo theo phương pháp đã chọn
Ghi lại các sắc ký đồ, xác định thời gian lưu của pic methylparaben và propylparaben
Tính tuyến tính trong quy trình phân tích giúp xác định mối quan hệ giữa độ đáp ứng của đại lượng đo được và nồng độ trong một khoảng nhất định, từ đó rút ra kết quả phân tích chính xác.
+ Tiến hành sắc ký với đã xác định với h n hợp dung dịch chuẩn với nồng độ từ 10 – 200ppm
+ Xây dựng đường th ng biểu diễn tương quan giữa diện tích đỉnh theo nồng độ chất phân tích
+ Dùng phần mềm Microsoft Excel xác định hệ số a độ dốc , b tung độ gốc , R 2 bình phương của hệ số tương quan của phương trình hồi quy (y ax + b)
+ Tính tuyến tính thường được chấp nhận khi 0,995 ≤ R 2 ≤ 1
+Sử dụng trắc nghiệm t để kiểm tra ý nghĩa của các hệ số trong phương trình hồi quy và trắc nghiệm F để kiểm tra tính tương thích của phương trình
2.2.2.4 Độ chính xác trong ngày:
Để đảm bảo độ chính xác của quy trình phân tích, cần chứng minh rằng kết quả phân tích các mẫu riêng lẻ có thể lặp lại khi áp dụng quy trình cho cùng một mẫu thử đồng nhất trong điều kiện xác định.
Chuẩn bị 6 mẫu thử giả lập và thực hiện phân tích trong ngày Độ chính xác intra-day được xác định thông qua giá trị độ lệch chuẩn tương đối của diện tích pic và thời gian lưu.
* Đánh giá: Phương pháp có độ chính xác khi độ lệch chuẩn tương đối
RSD của diện tích các pic methylparaben và propylparaben có giá trị không vƣợt quá quy định trong bảng 2.1
Bảng 2.1 Độ lặp lại tối đa chấp nhận tại các hàm lƣợng khác nhau theo phụ lục
TT Hàm lƣợng % Tỷ lệ chất Đơn vị RSD (%)
2.2.2.5 Độ đúng (tỷ lệ thu hồi %)
Mục đích của quy trình phân tích là xác định độ chính xác của giá trị tìm thấy so với giá trị thực khi áp dụng trên cùng một mẫu thử trong điều kiện nhất định Độ chính xác được thể hiện qua tỷ lệ thu hồi giá trị tìm thấy so với giá trị thực của chất chuẩn, đồng thời đánh giá hiệu suất của quá trình chiết mẫu phân tích.
Để tiến hành phân tích mẫu thử với chuẩn metylparaben và propylparaben, cần thực hiện ở ba nồng độ 80, 100 và 120, nằm trong khoảng tuyến tính Mỗi nồng độ sẽ được phân tích lặp lại ba lần Dựa vào diện tích đỉnh thu được, hàm lượng mẫu thử chuẩn sẽ được xác định thông qua phương trình hồi quy tuyến tính, từ đó tính toán tỷ lệ thu hồi của phương pháp định lượng.
: Lƣợng chuẩn tìm thấy thực tế ̅ : Lƣợng chuẩn thêm vào
* Đánh giá kết quả: Phương pháp có độ đ ng khi độ thu hồi của methylparaben và propylparaben có giá trị không vƣợt quá quy định trong bảng 2.2
Bảng 2.2 Độ thu hồi chấp nhận ở các hàm lƣợng khác nhau theo AOAC
TT Hàm lƣợng (%) Tỷ lệ chất Đơn vị Độ thu hồi (%)
2.2.2.6 Xác định giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ):
Xác định giới hạn phát hiện trong quy trình phân tích là bước quan trọng để xác định lượng nhỏ nhất của chất phân tích có thể được phát hiện trong mẫu thử Điều này giúp đảm bảo tính chính xác và độ nhạy của quy trình phân tích, từ đó nâng cao hiệu quả trong việc phát hiện các chất cần thiết.
Xác định giới hạn định lượng trong quy trình phân tích là bước quan trọng để xác định lượng nhỏ nhất của chất phân tích có thể được đo với độ chính xác và độ tin cậy phù hợp.
Trong nghiên cứu này, giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lƣợng
KẾT QUẢ
Kết quả thẩm định quy trình định lƣợng đồng thời methylparaben và
Sử dụng phương pháp pha loãng đơn giản, hãy lấy 1ml mẫu rượu vang bằng pipet chính xác và cho vào bình định mức 50ml Tiếp theo, thêm dung môi cho đến vạch định mức, lắc đều và lọc qua màng lọc 0.45μm trước khi tiêm vào hệ thống HPLC.
Hình 3.5 Sắc ký đồ mẫu thử pha loãng 50 lần
Nhận xét từ sắc ký đồ của mẫu thử pha loãng 50 lần cho thấy thời gian lưu của các pic parapen, với metylparapen là 4.17 và propylparapen.
5.69 ph t không xuất hiện các pic tạp
Kết luận: Có thể xử lý mẫu bằng phương pháp pha loãng đơn giản
3.2 Kết quả thẩm ịnh quy trình ịnh lƣợng ồng thời methylparaben và propylparaben trong rượu vang bằng phương pháp UPLC/UV
3.2.1 Tình tương thích hệ thống
Tiêm 6 lần liên tiếp mẫu thử giả lập vào hệ thống sắc ký, ghi lại sắc ký đồ, kết quả đƣợc thể hiện ở hình 3.6 và bảng 3.1
Hình 3.6 Sắc ký tương thích hệ thống trên mẫu thử thêm chuẩn
Bảng 3.1 Kết quả tính tương thích hệ thống trên mẫu thử thêm chuẩn
Th ng số sắc ký Methylparaben Propylparaben
TB SD RSD% TB SD RSD%
Hệ số bất đối As 1.39 1.29 Độ phân giải Rs 6.32 5.86
Kết quả cho thấy rằng RSD của thông số thời gian lưu và diện tích đỉnh của methylparaben là dưới 2, cụ thể là 0.47 cho thời gian lưu và 1.31 cho diện tích đỉnh Tương tự, RSD của propylparaben cũng dưới 2, với 0.47 cho thời gian lưu và 1.21 cho diện tích đỉnh.
Bên cạnh đó, giá trị A s của các pic trên sắc ký đồ trong khoảng 0,8 đến 1,5; giá trị Rs > 1,5; N > 2000
Kết luận: Quy trình phân tích đạt tính tương thích hệ thống trên mẫu thử thêm chuẩn
Kết quả tính đặc hiệu của quy trình phân tích đƣợc trình bày ở hình 3.7
Hình 3.7 Sắc ký đồ tính đặc hiệu của quy trình phân tích: (a) Dung môi pha động; (b) Dung môi pha mẫu; c Mẫu thử; (d) Mẫu thử thêm chuẩn; (e) H n hợp chuẩn
Trên sắc ký đồ dung môi pha mẫu, không xuất hiện pic có thời gian lưu tương ứng với pic của các paraben trên sắc ký đồ mẫu chuẩn, cho thấy dung môi pha động không chứa các paraben.
- Trên sắc ký đồ mẫu thử, không xuất hiện pic có thời gian lưu tương ứng với pic của các paraben trên sắc ký đồ mẫu chuẩn
Trên sắc ký đồ, mẫu thử xuất hiện các đỉnh pic của methylparaben và propylparaben, với thời gian lưu tương ứng như trong mẫu chuẩn đơn và mẫu hỗn hợp chuẩn.
Kết luận: Quy trình phân tích có tính đặc hiệu
3.2.3 Tính tuyến tính Đường chuẩn được xây dựng với 5 nồng độ các chuẩn methylparaben và propylparaben lần lƣợt là 0.5ppm, 1ppm, 2ppm, 4ppm, 8ppm, 16ppm, 32ppm và 50ppm Kết quả tính tuyến tính đƣợc trình bày ở bảng 3.2, hình 3.10 và bảng 3.3, hình 3.12
Hình 3.8 Sắc ký đồ tính tuyến tính của metylparapen và propylparapen
Hình 3.9 Sắc ký đồ tính tuyến tính của metylparapen
Hình 3.10 Đồ thị tính tuyến tính của metylparapen Bảng 3.2 Bảng phân tích tuyến tính của metylparapen
Phân tích bằng test F và T cho thấy phương trình tuyến tính của Metylparaben có mối tương quan chặt chẽ, với cả hệ số a và b đều có ý nghĩa thống kê.
Hình 3.11 Sắc ký đồ tính tuyến tính của propylparapen
Hình 3.12 Đồ thị tính tuyến tính của propylparapen
Bảng 3.3 Bảng phân tích tuyến tính của propylparapen
Kết quả kiểm tra bằng test F và T cho thấy phương trình tuyến tính của propylparaben có mối tương quan chặt chẽ Hệ số a của phương trình có ý nghĩa thống kê, trong khi hệ số b không có ý nghĩa.
Trong khoảng nồng độ từ 0.5 đến 50ppm, diện tích pic và nồng độ của metylparaben và propylparaben có sự tương quan chặt chẽ, với hệ số tương quan R² lần lượt là 0.9999 cho metylparaben và 0.9995 cho propylparaben.
- Phương trình hồi quy của metylparapen được biểu diễn là : y = 1.3087x + 0.3195
- Phương trình hồi quy của propylparapen được biểu diễn là : y = 1.0802x - 0.0341
3.2.4 Độ chính xác trong ngày
Kết quả phân tích 6 mẫu thử thêm chuẩn đƣợc tiến hành trong ngày đƣợc thể hiện ở hình 3.13, hình 3.14 và bảng 3.8
Hình 3.13 Sắc ký đồ độ chính xác của metylparapen
Hình 3.14 Sắc ký đồ độ chính xác của propylparapen
Bảng 3.4 Kết quả độ chính xác trong ngày của quy trình phân tích
Phương pháp phân tích theo tiêu chuẩn AOAC cho phép xác định hàm lượng metylparaben và propylparaben trong khoảng 10 – 100 PPM với độ chính xác cao Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của thời gian lưu và diện tích pic cho metylparaben không vượt quá 7.3%, cụ thể là 0.14%/0.89, và cho propylparaben là 0.002%/0.85.
Kết luận: Phương pháp đạt độ chính xác theo AOAC
Hình 3.15 Sắc ký đồ độ đ ng của metylparapen (80%)
Hình 3.16 Sắc ký đồ độ đ ng của metylparapen (100%)
Hình 3.17 Sắc ký đồ độ đ ng của metylparapen (120%)
Bảng 3.5 Kết quả thẩm định độ đ ng của quy trình phân tích metyl parapen
Nhận xét: Phương pháp có đạt độ đ ng theo AOAC- mức nồng độ 10 –
100ppm , độ lệch chuẩn tương đối RSD% của lượng metylparapen tìm thấy n 9 có giá trị không quá 7.3% (2.64 Lƣợng chất phân tích tìm thấy nằm trong khoảng 80% – 110% ( 81.65% - 88.53%)
Hình 3.18 Sắc ký đồ độ đ ng của propylparapen (80%)
Hình 3.19 Sắc ký đồ độ đ ng của propylparapen (100%)
Hình 3.20 Sắc ký đồ độ đ ng của propyl parapen (120%)
Bảng 3.6 Kết quả thẩm định độ đ ng của quy trình phân tích propyl parapen
Nhận xét: Phương pháp có đạt độ đ ng theo AOAC- mức nồng độ 10 –
100ppm , độ lệch chuẩn tương đối RSD của lượng propylparapen tìm thấy n 9 có giá trị không quá 7.3% (1.39 Lƣợng chất phân tích tìm thấy nằm trong khoảng 80% – 110% ( 86.00% - 89.44%)
Kết luận: Phương pháp có đạt độ đ ng theo AOAC- mức nồng độ 10 –
100ppm) với độ lệch chuẩn tương đối RSD của diện tich pic metylparapen và propylparapen có giá trị không quá 7.3 Lƣợng chất phân tích tìm thấy nằm trong khoảng 80 – 110%
3.3.6 iới h n phát hiện và giới h n định lượng
- Giới hạn phát hiện (LOD):
Hình 3.21 Sắc ký đồ giới hạn phát hiện LOD của metylparapen
Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn nồng độ 0.008ppm cho thấy pic của metylparaben cao hơn nhiễu nền trên 3 lần, nhưng hình dạng pic không cân đối và các thông số sắc ký As, Rs không đạt yêu cầu Vì vậy, giới hạn phát hiện của phương pháp được chọn là LOD 0.016ppm.
- Giới hạn định lượng (LOQ):
- Tính LOD, LOQ d a vào đư ng chuẩn:
Trong đó: σ là độ lệch chuẩn của đáp ứng (Standard Error)
S là độ dốc của đường chuẩn
Nhƣ vậy giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng metylparapen của phương pháp phù hợp là : LOD = 0.015ppm; LOD = 0.045ppm
- Giới hạn phát hiện (LOD):
Hình 3.22 Sắc ký đồ giới hạn phát hiện LOD của propylparapen
Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn nồng độ 0.016ppm cho thấy pic của propylparaben cao hơn nhiễu nền hơn 3 lần, nhưng hình dạng pic răng cưa không cân đối và các thông số sắc ký As, Rs nằm ngoài ngưỡng xác định của thiết bị với giá trị n.a Vì vậy, giới hạn phát hiện của phương pháp được xác định là LOD = 0.03125ppm.
- Giới hạn định lượng (LOQ):
- Tính LOD, LOQ d a vào đư ng chuẩn:
Trong đó: σ là độ lệch chuẩn của đáp ứng (Standard Error)
S là độ dốc của đường chuẩn
Nhƣ vậy giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng propylparapen của phương pháp phù hợp là : LOD = 0.03ppm; LOD = 0.1ppm
Kết luận: Dựa trên kết quả thực nghiệm và khảo sát bằng đường chuẩn, chúng tôi đã xác định được giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng cho phương pháp phù hợp.
- Metylparapen: LOD = 0.015ppm; LOD = 0.045ppm
- Propylparapen: LOD = 0.03ppm; LOD = 0.1ppm
3.3 Kết quả ứng dụng quy trình ịnh lƣợng ã thẩm ịnh trên một số mẫu rƣợu vang
Quy trình định lượng sau khi thẩm định đạt yêu cầu theo quy định đã được áp dụng để phân tích 3 mẫu rượu vang thu thập từ thị trường TP Cần Thơ Kết quả kiểm tra chi tiết được trình bày trong bảng 3.7.
Bảng 3.7 Kết quả phân tích methylparaben và propylparaben trong một số mẫu rượu vang thu thập trên thị trường TP.Cần Thơ
Chất bảo quản tìm thấy
Giới hạn chất bảo quản
Hình 3.23 Chồng phổ sắc ký đồ của 03 mẫu thử và h n hợp chuẩn
Nhận xét: Trong 03 mẫu rượu vang lấy trên thị trường không có chứa chất bảo quản methylparaben và propylparaben.
Kết quả ứng dụng quy trình định lƣợng đã thẩm định trên một số mẫu rƣợu
Kết quả khảo sát iều kiện sắc ký
Qua nghiên cứu tài liệu từ những nghiện cứu trước, thấy rằng hệ pha động
ACN - H2O có thể tách đồng thời nhiều paraben trên cột pha đảo C18 bằng rửa giải đ ng dòng
Khảo sát cho thấy hệ dung môi ACN - H2O với tỷ lệ 67:33 tách biệt tốt hơn các tỷ lệ khác, đặc biệt là đối với pic của các parapen cân xứng, mặc dù vẫn còn hơi kéo đuôi Thời gian rửa giải ngắn cho methyl parapen là 3.7 phút và propyl parapen là 5.1 phút.
Khi giảm tốc độ dòng từ 1ml/ph xuống 0.9ml/ph, thời gian rửa giải cho metyl parapen là 4.17 phút, trong khi propyl parapen là 5.69 phút Các pic của parapen cân xứng và khoảng cách giữa các pic cũng phù hợp, với tổng thời gian phân tích khoảng 8 phút.
Từ kết quả khảo sát lựa chọn hệ dung môi pha động ACN - H 2 O (67 : 33) và tốc độ dòng 0.9ml/ph t để phân tích các parapen trên nền mẫu
Khảo sát tại các bước sóng 210nm, 225nm, 254nm và 280nm cho thấy rằng ở bước sóng 254nm, sắc ký đồ của mẫu chuẩn ghi nhận tín hiệu diện tích đỉnh của các parapen đạt giá trị cao nhất Do đó, bước sóng 254nm được chọn làm bước sóng phân tích mẫu.
Khảo sát nền mẫu thử giả lập pha loãng 50 lần cho thấy thời gian lưu của pic metylparaben là 4.17 và pic propylparaben là 5.69, không xuất hiện các pic tạp tại pH t Kết quả cho thấy có thể xử lý mẫu bằng phương pháp pha loãng đơn giản.
Hình 4.1 sắc ký đồ của mẫu thử và h n hợp mẫu chuẩn
