PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26
Sơ đồ các bước nghiên cứu thể hiện như trong Hình 2 1
Nghiên cứu phân lập vi khuẩn từ nền đáy vùng nuôi tôm hùm (Panulirus sp ) và đánh giá chuyển hóa nitơ trong nuôi trồng thủy sản
Phân lập và định danh các nhóm vi khuẩn từ nền đáy vùng nuôi tôm hùm (Panulirus sp) là một nghiên cứu quan trọng nhằm đánh giá hiệu quả chuyển hóa nitơ trong nuôi trồng thủy sản Việc tuyển chọn các vi khuẩn có khả năng chuyển hóa nitơ giúp cải thiện chất lượng môi trường nuôi, từ đó nâng cao năng suất và sức khỏe của tôm hùm Nghiên cứu này không chỉ cung cấp thông tin về sự đa dạng vi sinh vật trong hệ thống nuôi mà còn góp phần vào việc phát triển các biện pháp quản lý bền vững trong ngành thủy sản.
Bacillus sp chuyển hóa ammonia ở nền đáy vùng nuôi tôm hùm
Nhóm vi khuẩn chuyển hóaAOB ammonia ở nền đáy vùng nuôi tôm hùm
Nhóm vi khuẩn chuyển hóaNOB nitrite ở nền đáy vùng nuôi tôm hùm
Tối ưu hóa thành phần môi trường nhân sinh khối lỏng các chủng vi khuẩn
Tạo chế phẩm vi sinh dạng bột
Thử nghiệm sử dụng chế
Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng chuyển hóa ammonia, nitrite và nitrate hiệu quả nhất là bước quan trọng trong việc cải thiện phẩm vi sinh chuyển hóa nitơ trong bể ương nuôi tôm thẻ chân trắng ở giai đoạn post 5 Việc tối ưu hóa quy trình này không chỉ giúp nâng cao chất lượng nước mà còn đảm bảo sự phát triển khỏe mạnh của tôm.
Hình 2 1 Sơ đồ tiến trình nghiên cứu
2 2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Luận án được thực hiện từ tháng 8/2016 đến tháng 07/2017 tại Vịnh Xuân Đài, Huyện Sông Cầu, Tỉnh Phú Yên, và tiếp tục từ tháng 08/2016 đến tháng 08/2020 tại phòng thí nghiệm Công Nghệ Vi Sinh thuộc Viện Nghiên cứu Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường, cùng với Trại thực nghiệm Khoa Thủy Sản, Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM.
2 3 Phương pháp thu mẫu bùn đáy
Từ tháng 8/2016 đến tháng 7/2017, mẫu bùn được thu định kỳ hàng tháng (12 lần) tại 11 lồng treo và lồng chìm, tổng cộng thu được 132 mẫu Mẫu bùn được lấy bằng hệ thống ống PVC đã được tiệt trùng bằng dung dịch cồn 70% Tại mỗi khu vực nuôi tôm, mẫu bùn được thu tại đáy ở 3 vị trí (M1, M2, M3) như được mô tả trong hình.
2 2 (M1 cách M2: 1 – 2 mét, M2 cách M3: 1-2 mét) (TCVN 6663-13:2000)
(M1, M2, M3: Các điểm lấy mẫu bùn)
Hình 2 2 Mô tả sự thải phân và thức ăn thừa (Price và Morris, 2013)
Mẫu nước và bùn cần được giữ lạnh bằng nước đá và chuyển về phòng thí nghiệm trong vòng 12 - 24 giờ Sau đó, mẫu được bảo quản ở 4°C và xử lý trong vòng 2 giờ Tất cả thông tin như địa chỉ lồng, thứ tự lồng, ngày tháng và thời gian thu mẫu phải được ghi rõ ràng trên nhãn và dán trên chai thu mẫu, tuân thủ theo tiêu chuẩn TCVN 6663-3:2016 và TCVN 6663-15:2004.
2 3 2 Phương pháp phân tích hóa lý của mẫu bùn:
Chỉ tiêu phân tích trên đo định kỳ: 1 tháng/1 lần, trong 12 tháng
Độ mặn: đo bằng khúc xạ kế có thang đo 100 Đo pH bằng máy đo pH
Ammonia: Sử dụng phương pháp trắc quang 4500 NH 3 – F (APHA, 2012)
Nitrite: Sử dụng phương pháp trắc quang 4500 NO 2 - B (APHA, 2012)
Nitrate: Sử dụng phương pháp trắc quang 4500 NO 3 – D (APHA, 2012) để phân tích nitrate
Nitơ tổng số: sử dụng phương pháp Kjeldahl theo TCVN 6638:2000
2 4 Nội dung 1: Phân lập và định danh vi khuẩn chuyển hóa Nitơ từ nền đáy vùng nuôi tôm hùm
2 4 1 Phân lập và định danh vi khuẩn Bacillus sp chuyển hóa ammonia
2 4 1 1 Phân lập vi khuẩn Bacillus sp
Môi trường phân lập vi khuẩn Bacillus sp
Phân lập vi khuẩn Bacillus được thực hiện trên môi trường Tripticase soya agar (TSA) với NaCl ở các nồng độ từ 1,5% đến 3,5% Bacillus có khả năng chịu nhiệt cao và sinh bào tử trong điều kiện bất lợi, do đó, quy trình phân lập sử dụng nhiệt độ trên 80°C để tiêu diệt các vi khuẩn không tạo bào tử, giữ lại các chủng Bacillus có khả năng sinh bào tử (Nguyễn Lân Dũng và ctv, 2002; Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2006).
Tuyển chọn các chủng vi khuẩn Bacillus sp có khả năng xử lý ammonia
Sau khi phân lập các chủng vi khuẩn Bacillus sp, các mẫu vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường ammonium-calcium-carbonate agar trong 48 giờ Sau đó, khả năng xử lý ammonia của các chủng vi khuẩn này được kiểm tra bằng bộ test kit.
Sera NH4/NH3 sử dụng thang màu của bộ kit Sera NH3/NH4 để lựa chọn các chủng vi khuẩn Bacillus sp có khả năng chuyển màu môi trường sang màu vàng hoặc xanh nhạt.
2 4 1 2 Phương pháp định danh sinh hóa vi khuẩn Bacillus sp
Tiến hành nhuộm Gram và nhuộm bào tử để xác định các chỉ tiêu sinh lý và sinh hóa theo khóa phân loại Bergey's, bao gồm tính di động, khả năng sản sinh catalase, sự khử nitrate, thủy phân gelatin, thủy phân tinh bột, và phản ứng Voges-Proskauer.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi khảo sát các phản ứng lên men đường ở các nồng độ muối khác nhau và phát triển tại các nhiệt độ khác nhau Phương pháp methyl red được thực hiện theo quy trình của Sharmin và Rahman để đánh giá hiệu quả của quá trình lên men.
2 4 1 3 Phương pháp định danh sinh học phân tử vi khuẩn Bacillus sp
Ly trích ADN: Mẫu vi khuẩn được tăng sinh trong môi trường LB đạt mật độ
10 6 CFU/mL được tiến hành tách chiết ADN bằng bộ kit AccuPrep Genomic ADN extraction (theo hướng dẫn của nhà sản xuất Bioneer, Hàn Quốc) (Boon và ctv,
Kiểm tra chất lượng ADN sau khi trích (Schuurman và ctv, 2004)
Khuếch đại vùng gen mục tiêu bằng phản ứng PCR là phương pháp hiệu quả để xác định các chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus sp Quá trình này sử dụng cặp mồi ITS chung cho vùng 16S-RNA, cụ thể là 27F (5' AGATTTGATCCTGGCTCAG 3'), nhằm tăng cường sự phát hiện và phân loại vi khuẩn.
Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose 1,5% trong TBE buffer 0,5 X với điện thế 100 V trong 35 phút Sau khi nhuộm bằng Gel Red, kết quả được quan sát dưới đèn UV Những mẫu PCR đạt yêu cầu sẽ được giải trình tự, xử lý trình tự bằng fastPCR và so sánh trình tự.
NCBI/BLAST (Schuurman và ctv, 2004)
Giải trình tự đoạn gen đã khuếch đại: Gửi sản phẩm PCR cho công ty Nam
Khoa, tọa lạc tại 793/58 Trần Xuân Soạn, phường Tân Hưng, quận 7, thành phố Hồ Chí Minh, thực hiện giải trình tự gen theo phương pháp Sanger từ năm 1977 Sau đó, kết quả trình tự được so sánh với ngân hàng gen để xác định tên loài vi khuẩn được khảo sát.
Để xây dựng cây phả hệ, cần thu thập các trình tự tham chiếu từ GenBank cùng với số Assession Number làm cơ sở Việc sử dụng công cụ phù hợp sẽ hỗ trợ trong quá trình này.
Phần mềm MEGA X thực hiện việc căn chỉnh các trình tự bằng phương pháp ClustalW, và kết quả của quá trình căn chỉnh này được sử dụng làm nền tảng để xây dựng cây phả hệ Cây phả hệ sau đó được tạo ra bằng cách sử dụng phần mềm MEGA X theo phương pháp đã xác định.
Neighbor Joining với hệ số bootrap là 1000 (Kurma và ctv, 2018)
2 4 2 Phân lập và định danh vi khuẩn chuyển hóa ammonia (AOB)
2 4 2 1 Môi trường phân lập vi khuẩn chuyển hóa ammonia (phụ lục 1 3 1)
Môi trường phân lập vi khuẩn: môi trường ammonium-calcium-carbonate được sử dụng để phân lập vi khuẩn dựa theo phương pháp của Ehrlich (1975)
Môi trường nuôi tăng sinh vi khuẩn được chuẩn bị theo công thức môi trường của Lewis và Pramer (1958) và MacDonad và Spokes (1980)
Thuốc thử Griess – Ilosway (Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2006)
2 4 2 2 Các bước phân lập nhóm vi khuẩn chuyển hóa ammonia