ĐẦU
Đặt vấn đề
Cam (Citrus sinensis) là một trong những loại cây ăn quả phổ biến nhất tại Việt Nam, với diện tích trồng lên tới 120 nghìn ha vào năm 2019 Nhờ giá trị dinh dưỡng cao và giá thành hợp lý, cam và quýt đã trở thành lựa chọn ưa thích của nhiều người tiêu dùng Thị trường Việt Nam hiện nay có sự đa dạng về các giống cam, quýt, được lai tạo để đáp ứng nhu cầu của người tiêu dùng Việt Nam cũng nổi tiếng với nhiều giống cam đặc sản đã được biết đến từ lâu.
Bố Hạ là một trong những đặc sản trái cây nổi tiếng của Bắc Giang Vào tháng 11 -
Cam Bố Hạ chín rộ vào tháng 12 âm lịch, thường được ưa chuộng trong dịp Tết Nguyên Đán Khi chín, cam có màu vàng, cùi dày và da hơi sần Tùy thuộc vào sự chăm sóc và chế độ dinh dưỡng, mỗi cây cam có thể cho từ 100g đến trên 250g trái Cam Bố Hạ nổi bật với mùi thơm đặc trưng, vị ngọt đậm, ruột vàng đỏ, tép to mọng nước và hàm lượng dinh dưỡng cao, nên người dân Nguyên Hòa thường gọi là cam lòng vàng.
Cam Bố Hạ từng là niềm tự hào của người dân Bắc Giang, nhưng hiện nay, giống cam quý này đang đối mặt với nguy cơ bị lãng quên do dịch bệnh tàn phá Việc khôi phục và bảo tồn giống cam này là vô cùng cần thiết Theo điều tra, vẫn còn một số cây cam Bố Hạ tồn tại tại khu vực Bắc Giang, mang lại hy vọng cho việc phục hồi giống cam truyền thống này.
Để khôi phục giống cam Bố Hạ, việc xác định chính xác về mặt di truyền là rất quan trọng Cần thực hiện so sánh và đánh giá di truyền giữa các cây cam để đạt được kết quả tốt nhất trong quá trình phục hồi giống cây này.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã áp dụng kỹ thuật RAPD để đánh giá và so sánh các đặc điểm di truyền của các giống cam hiện có, nhằm hiểu rõ hơn về sự đa dạng di truyền của cây cam Bố Hạ.
Bố Hạ với các giống cam phổ biến hiện nay.
Mục tiêu của đề tài
- Xác định được mối quan hệ di truyền giữa một số giống cam, quýt khác nhau bằng phương pháp chỉ thị phân tử
- Tách chiết được DNA tổng số từ cam, quýt đủ điều kiện để thực hiện phản ứng RAPD, ISSR
- Phân tích được các phân đoạn DNA của các giống cam nghiên cứu bằng kỹ thuật RAPD, ISSR
- Phân tích được mối quan hệ di truyền giữa cam Bố Hạ với các giống cam thu thập dựa trên sơ đồ phả hệ DNA.
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
1.3.1.Ý nghĩa khoa học của đề tài
Nghiên cứu này sẽ cung cấp các dữ liệu khoa học quan trọng về việc ứng dụng chỉ thị phân tử trong việc xây dựng cây phát sinh chủng cam.
- Kết quả sẽ góp phần bổ sung thêm cho chúng ta những tài liệu khoa học, phục vụ cho công tác nghiên cứu trên cây cam ở nước ta
1.3.2.Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
Xác định mối quan hệ di truyền của cam Bố Hạ với các giống cam khác là yếu tố quan trọng trong việc bảo tồn, khai thác và phát triển nguồn gen của cam Bố Hạ.
- Khôi phục lại thương hiệu cam nổi tiếng
- Bảo tồn nguồn gen của giống cam nổi tiếng
QUAN TÀI LIỆU
Nguồn gốc và phân loại cam, quýt
Hầu hết các giống cam quýt được phát triển từ những đột biến lai giống tự nhiên, trong khi chỉ một phần nhỏ được tạo ra từ lai giống nhân tạo Cam có nhiều kích thước và hình dáng khác nhau, thường có 10 múi và tối đa 6 hạt, với lớp vỏ bên trong màu trắng xốp Khi chín, vỏ ngoài của cam chuyển từ màu cam rực rỡ sang màu vàng, tuy nhiên, trong điều kiện khí hậu nhiệt đới, vỏ cam vẫn có thể giữ màu xanh khi chín Một số loại cam tự nhiên cũng không có hạt.
Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng các giống cam, quýt đang được trồng hiện nay đều có nguồn gốc từ vùng cận nhiệt đới Đông Nam Á và nhiệt đới [8]
Nghề trồng cam quýt ở Trung Quốc đã có lịch sử kéo dài từ 3.000-4.000 năm, với nhiều tác giả cho rằng nguồn gốc của quýt King (Citrus nobilis Lour) và quất nằm ở miền Nam Việt Nam thuộc xứ Đông Dương Tại Việt Nam, cam sành được trồng phổ biến từ Bắc vào Nam, với nhiều giống khác nhau và tên gọi địa phương đa dạng như cam sành Bố Hạ, cam sành Hàm Yên, cam Yên Bái, cam sen Yên Bái, cam sen Đình Cả - Bắc Sơn, và cam bừ Hà Tĩnh, tất cả đều là những giống quý của từng địa phương.
Hệ thống phân loại cam, quýt phức tạp do khả năng thích ứng cao với môi trường và sự xuất hiện ngày càng nhiều các dạng lai tự nhiên Các đột biến tự nhiên và sự can thiệp của con người trong quá trình chọn giống nhân tạo đã tạo ra nhiều giống và loài mới Do đó, việc thiếu sót và nhầm lẫn trong phân loại là điều không thể tránh khỏi.
Cam, chanh, bưởi, quýt đều thuộc họ cam (Rutaceae) và họ phụ Aurantoideae, với khoảng 250 loài Hệ thống phân loại đầu tiên của Lines (1753) đã được nhiều tác giả bổ sung và điều chỉnh, thống nhất với hệ thống phân loại của Swingle qua các năm 1915, 1948 và 1967.
+ Họ phụ Aurantoideae đã được chia thành 2 tộc chính là: (1) Clauseneae và
Tộc 2 được chia thành 3 tộc phụ, trong đó tộc phụ thứ 2 - Citrineae, bao gồm hầu hết các loài và giống cam quýt được trồng hiện nay Citrineae được phân thành 3 nhóm nhỏ: A, B, C, với nhóm C lại chia thành 6 chi phụ: Fortunella, Eremocitrus, Poncirus, Clymenia, Microcitrus và Citrus Chi Citrus được chia thành 2 chi phụ là Eucitrus và Papeda, trong đó Papeda có 6 loài, quan trọng nhất là Citrus Ichangensis, được sử dụng để lai tạo giống mới và làm gốc ghép.
Cam, quýt có tới 9 loại quan trọng nhất dược thể hiện trong bảng 2.1
Bảng 2.1: Phân loại cam, quýt [8]
STT Tên loài Tên tiếng việt
3 Citrus sinens Osbeck Cam ngọt
8 Citrus aurantifolia Swingle Chanh ta
9 Citrus latifolia Chanh không hạt
2.1.3 Giá trị cây cam, quýt
Cam và quýt là những loại trái cây giàu dinh dưỡng, được các chuyên gia y tế khuyến cáo nên tiêu thụ Chúng chứa carbohydrate, chất xơ và vitamin, giúp thúc đẩy sức khỏe và bảo vệ cơ thể khỏi một số bệnh tật Việc bổ sung nước trái cây từ cam, quýt vào chế độ ăn hàng ngày mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe.
C, kali, folate, canxi, thiamin, niacin, vitamin B6, phốt pho, magiê, đồng, riboflavin, axit pantothenic và nhiều loại hóa chất thực vật [12] Trong cam tươi có chứa các thành phần như trong bảng 2.2
So với lê, cam có hàm lượng dinh dưỡng vượt trội, với protein cao gấp 10 lần, canxi gấp 6 lần, phốt pho gấp 5,5 lần, vitamin B1 gấp 8 lần, vitamin B2 gấp 3 lần, niacin gấp 1,5 lần và vitamin C gấp 10 lần Điều này cho thấy cam là nguồn dinh dưỡng đa dạng và phong phú.
Cây ăn quả có múi, như cam và quýt, là loại cây lâu năm có giá trị kinh tế cao nhờ vào thời gian thu hoạch nhanh và khả năng cho trái từ 15-30 năm Theo dự báo của FAO, tổng sản lượng quả có múi toàn cầu năm 2019 đạt trên 14 triệu tấn, với mức tiêu thụ hàng năm cao, mang lại lợi ích kinh tế đáng kể cho người nông dân.
Bảng 2.2: Thành phần dinh dưỡng trong cam tươi
Thành phần dinh dưỡng Hàm lượng Thành phần dinh dưỡng
Giá trị năng lượng 48 kcal Magnesium 9 mg
Carotene – một loại vitamin chống oxy hóa 104 microgram Kali 93 mg
Giá trị dược liệu của quả cam rất cao, được sử dụng rộng rãi trong y học tại nhiều quốc gia nhờ vào các thành phần dinh dưỡng phong phú như vitamin C, canxi, phốt pho, kali, beta-carotene và axit citric Tại Việt Nam, cam đã được người dân sử dụng từ lâu để phòng và chữa bệnh, với nhiều nghiên cứu chứng minh tác dụng chống khối u, chống đông máu, chống viêm và chống oxy hóa của nó Cam không chứa chất béo hay cholesterol, nổi bật với hàm lượng vitamin C chiếm từ 15 – 20% tổng số chất kháng oxy hóa, trong khi các hợp chất khác như Hesperidin từ Flavanoid, có khả năng chống oxy hóa cao gấp 6 lần vitamin C, chủ yếu nằm ở lớp vỏ xơ trắng và màng bao múi, giúp giảm cholesterol xấu và tăng cholesterol tốt, đồng thời hỗ trợ điều trị táo bón.
Cam và quýt trồng trên đồi đất không chỉ mang lại quả ngon mà còn góp phần phủ xanh đất trống, giảm nguy cơ xói mòn và rửa trôi đất Tại một số vùng trung dung và miền núi, người dân đã áp dụng rộng rãi các phương thức canh tác kết hợp như vườn-ao-chuồng trong các trang trại nông nghiệp, tạo ra giá trị sinh thái bền vững.
Tình hình sản xuất và tiêu thụ cam quýt trên thế giới và trong nước
2.2.1 Tình hình sản xuất và tiêu thụ cam, quýt trên thế giới
Ngành sản xuất cam và quýt toàn cầu đang phát triển mạnh mẽ, với nhu cầu tiêu thụ trái cây này ngày càng tăng Sản xuất cây có múi đã trở thành một lĩnh vực lớn, chiếm diện tích đáng kể trên toàn thế giới.
Các chỉ tiêu trong việc tiêu thụ và sản xuất được thể hiện trong bảng 2.3
Bảng 2.3 Tình hình sản xuất cam, quýt trên Thế giới từ 05 năm gần đây Năm
Hình 2.1 Biểu đồ thể hiện Tình hình sản xuất cam, quýt trên Thế giới từ 05 năm gần đây
2.2.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ cam, quýt ở Việt Nam
Việt Nam, với khí hậu nhiệt đới gió mùa và điều kiện tự nhiên thuận lợi, rất thích hợp cho sự phát triển của các loại cây có múi như cam và quýt.
Hiện nay, tổng diện tích cây có múi của cả nước đạt 210.000 ha, trong đó diện tích trồng cam chiếm khoảng 100.000 ha Từ năm 2013 đến nay, diện tích trồng cam đã tăng trưởng nhanh chóng, đặc biệt tại nhiều tỉnh miền Bắc như Phú Thọ, Hưng Yên, Hòa Bình và Hà Giang Tuy nhiên, sự phát triển này đã dẫn đến tình trạng dư thừa nguồn cung cam trên thị trường.
- Tình hình sản xuất cam, quýt ở Việt Nam trong vòng 5 năm gần đây được thể hiện trong bảng 2.4 và đồ thị hình 2.2 dưới đây:
Bảng 2.4: Tình hình sản xuất cam, quýt ở Việt Nam trong 5 năm gần đây
Diện tích gieo trồng (nghìn ha) 85,4 101,3 112,6 120,8 120,0 Diện tích cho sản phẩm (nghìn ha) 58,4 65,1 71,7 77,3 88,1 Sản lượng (nghìn tấn) 727,4 806,9 957,9 1.075,0 1.230,1
(Nguồn: Niên giám thống kê) [9]
Hình 2.2 Biểu đồ tình hình sản xuất cam, quýt ở Việt Nam trong 5 năm gần đây
Theo Niên giám thống kê năm 2019, diện tích và sản lượng cam, quýt tại Việt Nam đã có sự tăng trưởng đáng kể trong 5 năm qua Cụ thể, diện tích trồng cam, quýt đã tăng từ 85,4 nghìn ha năm 2015 lên 120 nghìn ha năm 2019, trong khi diện tích cho thu hoạch cũng tăng từ 58,4 nghìn ha lên 88,1 nghìn ha Sản lượng cam, quýt ghi nhận sự tăng trưởng mạnh mẽ, từ 727,4 nghìn tấn năm 2015 lên 1.230,1 nghìn tấn năm 2019.
Các kĩ thuật sinh học phân tử trong đánh giá đa dạng di truyền
2.3.1.1 Giới thiêụ sơ lược về kỹ thuật RAPD
Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) là phương pháp khuếch đại đa hình DNA thông qua việc sử dụng các cặp mồi ngẫu nhiên Kỹ thuật này được phát triển bởi William vào năm 1900 và được cải tiến bởi Welsh cùng các cộng sự vào năm 1991, dựa trên nền tảng của kỹ thuật PCR.
Kỹ thuật này sử dụng các đoạn mồi ngắn có kích thước dao động trong khoảng
Mười nucleotide với trình tự đã biết sẽ bắt cặp và nhân bản ngẫu nhiên các đoạn DNA có trình tự bổ sung, tạo ra các sản phẩm khác nhau tùy thuộc vào trình tự DNA đích Kết quả là, các cá thể giống nhau sẽ cho ra các sản phẩm có kích thước tương tự, trong khi các cá thể khác nhau sẽ tạo ra các sản phẩm khuếch đại khác nhau.
Kỹ thuật RAPD gồm 3 bước như sau:
+ Tách chiết DNA tổng số
+ Nhân bản DNA bằng phương pháp PCR, điện di trên gel agarose
+ Dùng phần mềm thông dụng để xác định tính đa dạng di truyền
2.3.1.2 Những ưu điểm và nhược điểm của kỹ thuật RAPD với các kĩ thuật sinh học phân tử khác Ưu điểm: RAPD là kỹ thuật có thao tác đơn giản, không tốn thời gian thực hiện và có chi phí thấp [19]
Kỹ thuật RAPD có những hạn chế nhất định, bao gồm sản phẩm PCR không đồng nhất, kết quả không ổn định và yêu cầu người thực hiện phải có trình độ chuyên môn cao.
2.3.1.3 Ứng dụng của kỹ thuật RAPD
RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) đang ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong sinh thái học phân tử để xác định phân loại và đánh giá mối quan hệ họ hàng Phương pháp này cho phép phân tích các mẫu bộ gen khác nhau, xác định đa hình của cây tái sinh từ mô sẹo, từ đó phục vụ cho việc phân loại và lai tạo giống hiệu quả.
Nghiên cứu của Serap và cộng sự năm 2020 đã áp dụng kỹ thuật RADP và ISSR để khám phá mối quan hệ di truyền giữa các loài trong chi Salvia thuộc họ Hoa Môi (Lamiaceae) Kết quả cho thấy các điểm đánh dấu này là công cụ hiệu quả để đánh giá sự đa dạng di truyền và mối liên hệ giữa các loài Salvia Cụ thể, 15 loài Salvia ở Iran đã được phân nhóm thành 6 nhóm khác nhau, trong đó nhóm đầu tiên bao gồm các loài S cryptantha, S candidissima, S sclarea, S multicaulis, S limbata, S aethiopis, S virgate, S pachhystachya và S divaricata; nhóm thứ hai có S verticillata; nhóm thứ ba là S nemorosa; nhóm thứ tư gồm S staminea và S verticillata subsp Amasiaca.
S caespitosa và nhóm 6 có 1 loài S rosifolia [21].
Nghiên cứu năm 2017 của Phạm Thanh Huyền và Đinh Đoàn Long sử dụng kỹ thuật RAPD-PCR để đánh giá đa dạng di truyền của nguồn gen Đảng Sâm tự nhiên và trồng trọt tại các tỉnh vùng Tây Bắc và Tây Nguyên Kết quả cho thấy 15 mẫu quần thể Đảng Sâm, bao gồm các mẫu từ Lào Cai, Hà Giang, Sơn La, Lâm Đồng và Kon Tum, được phân chia thành 2 nhóm lớn, với sự tách biệt rõ rệt giữa mẫu ở Tây Bắc và mẫu ở Tây Nguyên Ngoài ra, nghiên cứu cũng chỉ ra rằng các mẫu thu thập ở vị trí địa lý gần nhau có sự khác biệt di truyền nhỏ hơn.
2.3.2.1 Giới thiệu về kỹ thuật ISSR
Kỹ thuật ISSR sử dụng phản ứng PCR để nhân đoạn gen nằm giữa hai vùng lặp lại giống hệt nhau và ngược chiều, với kích thước khoảng 100 bp.
Kỹ thuật ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) sử dụng các tiểu vệ tinh làm mồi trong phản ứng PCR để nhân bản các chuỗi lặp lại đơn giản với độ dài khác nhau, giúp nghiên cứu đa dạng di truyền và đặc điểm di truyền trong quần thể Các tiểu vệ tinh có thể có độ dài từ 2 đến 5 nucleotide và có thể là mồi neo ở đầu 3’ hoặc 5’ với 1 đến 4 nucleotide thoái hóa Kỹ thuật này được ứng dụng rộng rãi trong việc lấy dấu di truyền, đánh dấu gene, xác định cây trồng, phân tích nguồn gốc, xác định sự thay đổi genome và đánh giá con lai.
Kỹ thuật ISSR không yêu cầu thông tin về trình tự gen và chỉ cần một lượng nhỏ DNA mẫu, nhờ vào việc sử dụng phản ứng khuếch đại PCR để nhân bản DNA đích Trình tự ISSR phân bố ngẫu nhiên trong toàn bộ hệ gen, giúp kỹ thuật này dễ thao tác và tiết kiệm thời gian.
- Khả năng không tương đồng của các đoạn có kích thước tương tự
- Hơn nữa, ISSR, giống như RAPD, có thể có vấn đề về khả năng tái tạo
2.3.3 Một số kỹ thuật khác
Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)
Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) là phương pháp phân tích đa hình chiều dài các đoạn khuếch đại, được sử dụng để phát hiện đa hình DNA AFLP kết hợp giữa PCR và RFLP thông qua việc gắn các chuỗi nhận biết vào mồi, với các cặp mồi thường được tạo từ 50-100 băng trong mỗi phân tích Kỹ thuật này cho phép thu thập dấu DNA từ nhiều nguồn gốc khác nhau.
Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) tạo ra các nhóm đa hình DNA thông qua việc cắt DNA hệ gen bằng enzyme giới hạn Trong ví dụ này, enzyme EcoRI được sử dụng với vị trí giới hạn 5-GAATTC-3’.
Phản ứng phân cắt tạo ra số lượng lớn đoạn giới hạn với hai đầu chứa vị trí cắt của
EcoRI là enzyme quan trọng trong quy trình cắt giới hạn DNA Trong bước tiếp theo, các oligonucleotide mạch kép được gọi là adaptor sẽ được gắn vào sản phẩm cắt giới hạn bằng enzyme DNA ligase Adaptor này có đầu treo mạch đơn bổ sung với đầu treo của đoạn giới hạn Sau khi gắn adaptor, có thể sử dụng PCR để khuếch đại các đoạn DNA thu được Lưu ý rằng việc sử dụng một loại adaptor cho cả hai đầu giúp một trình tự primer đơn có thể gắn với cả hai đầu và thực hiện quá trình khuếch đại hiệu quả.
Kỹ thuật này có ưu điểm là độ tin cậy và lặp lại cao [18].
Kỹ thuật SSLP (Single Sequence Length Polymorphism)
Kỹ thuật chỉ thị tạo các chuỗi lặp lại với độ dài khác nhau nằm giữa hai gen, được gọi là SSLP, giúp đánh giá sự thay đổi di truyền giữa các cá thể trong loài Sự khác biệt về độ dài của các chuỗi này xuất phát từ số lượng trình tự lặp lại khác nhau, do quá trình trao đổi chéo không cân hoặc sự giảm nucleotide trong quá trình sao chép.
Tình hình nghiên cứu về đa dạng di truyền ở trên thế giới và trong nước
2.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Nghiên cứu của Lombardo và cộng sự (2011) về sự biến đổi di truyền của 8 giống cam chua thông qua điểm đánh dấu ISSR cho thấy mức độ biến đổi gen rất thấp giữa các giống cây trồng Đặc biệt, giống 'Canaliculata' đã hình thành một cụm phân tách với màu cam, chỉ ra khả năng lai tạo có thể xảy ra từ sự kết hợp giữa cam chua và cam ngọt.
Nhóm nghiên cứu gồm Fahad Ramzan, Hyoung Tae Kim, Adnan Younis, Yasir Ramzan và Ki-Byung Lim đã tiến hành khảo sát ảnh hưởng của quá trình tự thụ tinh ở cây lai Lilium L bằng kỹ thuật lai huỳnh quang và các phương pháp trình tự đơn giản như FISH và ISSR Trong nghiên cứu, 21 mồi được sử dụng cho kỹ thuật ISSR, trong đó có 7 mồi cho tỷ lệ đa hình cao Kết quả cho thấy có 126 dải ISSR có khả năng tái tạo cao.
Có tới 96,83% là phân đoạn đa hình, chứng tỏ rằng mức độ đa dạng di truyền rất cao giữa các thế hệ con cháu được tạo ra [19]
Nhóm tác giả Ruchi Tyagi và cộng sự đã sử dụng các phương pháp ISSR và ScoT để nghiên cứu tính đa dạng di truyền và cấu trúc quần thể ở mướp hương ScoT áp dụng 80 mồi đã được sàng lọc kỹ lưỡng, trong đó 23 mồi cho kết quả tái tạo tốt, thu được 212 đoạn DNA với 151 phân đoạn đa hình Đối với ISSR, nhóm đã sử dụng 20 đoạn để xác định đặc tính đa dạng di truyền, cho ra 182 dải sáng rõ ràng, trong đó có 137 đoạn cho thấy sự đa dạng.
O Panaud và cộng sự (1996) đã áp dụng kỹ thuật SSLP để nghiên cứu sự phát triển của các dấu hiệu microatellite và xác định đa hình chiều dài trình tự đơn giản ở lúa Họ đã chỉ định 20 dấu hiệu microatellite mới dọc theo nhiễm sắc thể lúa, thể hiện sự đa dạng alen ở lúa trồng và lúa hoang, đồng thời thử nghiệm trên các loài có họ hàng xa Kết quả cho thấy sự phân bố gen ở lúa là ngẫu nhiên, với sự tương đồng giữa các quần thể ở các loài thường và loài đặc biệt.
Tomoji Mashimo và cộng sự (2016) đã tiến hành nghiên cứu về đa hình độ dài trình tự đơn giản (SSLP) ở chuột, tập hợp 357 điểm đánh dấu SSLP và 122 chủng chuột được genotyped Nhóm tác giả nhận thấy rằng các điểm đánh dấu SSLP có sự phân bố đồng đều trong toàn bộ gen chuột, với số lượng dấu hiệu thông tin và mức độ đa hình cao Kết quả từ nghiên cứu này đã giúp nhóm xây dựng sơ đồ cây họ chuột, làm rõ nguồn gốc di truyền của các chủng chuột được khảo sát.
2.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước
Hoàng Thị Thu Yến và cộng sự (2012) đã tiến hành nghiên cứu đa dạng di truyền của một số dòng chè (Camellia sinensis) trồng tại Tân Cương – Thái Nguyên bằng phương pháp RAPD Sử dụng 8 mồi ngẫu nhiên, nghiên cứu đã ghi nhận 68 phân đoạn DNA với chiều dài dao động từ 0,25kb đến 1,8kb.
Kỹ thuật RAPD đã được áp dụng để nghiên cứu mối quan hệ di truyền giữa một số giống đậu xanh của Chu Hoàng Mậu và các cộng sự Nhóm tác giả đã tiến hành phân tích nhằm làm rõ đặc điểm di truyền của các giống này.
Trong nghiên cứu này, 30 giống đậu xanh đã được đánh giá để phân tích đa dạng di truyền, với 10 mồi ngẫu nhiên được sử dụng Kết quả cho thấy các giống đậu này được chia thành 2 nhóm, có hệ số tương đồng đạt tới 67%/100%.
Vũ Văn Hiếu và cộng sự (2015) đã áp dụng chỉ thị RAPD và ISSR để phân tích sự đa dạng di truyền của các giống cam sành tại Hà Giang Việc kết hợp RAPD và ISSR cùng với xây dựng cây phân loại di truyền đã làm rõ mối quan hệ di truyền giữa các mẫu giống cam Kết quả cho thấy tất cả 25 mồi RAPD và 5 mồi ISSR đều tạo ra đa hình, nhưng số băng đa hình trên từng mẫu có sự khác biệt đáng kể Tổng cộng, nghiên cứu ghi nhận 2.157 băng với hệ số tương đồng di truyền của 39 dòng cam sành dao động từ 0,62 đến 0,98, xác định được 5 nhóm di truyền chính.
Phạm Thị Ngọc và cộng sự (2016) đã tiến hành nghiên cứu đa dạng di truyền của 60 mẫu giống đậu cô ve thông qua chi thị hình thái và chỉ thị phân tử (SSR) Kết quả phân tích dựa trên 16 chỉ thị hình thái cho thấy các mẫu giống được phân chia thành 7 nhóm khác nhau Đồng thời, từ 20 chỉ thị SSR, nghiên cứu đã thực hiện PCR trên các mẫu và phát hiện 15 chỉ thị tạo thành băng DNA đa hình.
Kết quả phân tích 60 mẫu giống đậu cô ve cho thấy có 5 chỉ thị không xuất hiện băng DNA, từ đó làm cơ sở lựa chọn mẫu giống phù hợp cho chương trình chọn giống đậu cô ve với các mục đích khác nhau.
Phạm Quang Tuyến và cộng sự (2018) đã tiến hành đánh giá đa dạng di truyền của một số giống sâm tại Lai Châu Nhóm nghiên cứu áp dụng kỹ thuật RAPD để phân biệt các mẫu P ginseng, góp phần làm rõ sự đa dạng di truyền trong loài này.
(Hàn Quốc) với các taxon Panax khác gồm Nhân sâm SheoAn (Trung Quốc), P notoginseng (Trung Quốc), P japonicus (Nhật Bản) và hai loại Nhân sâm thuộc loài
P quinquefolius từ Mỹ và Canada Ngoài ra, RFLP cũng được sử dụng với các mồi khuếch đại các vùng, cũng như kỹ thuật Random Amplified Microsatellite (RAMS) đã xác định được 4 loài là P ginseng, P quinquefolius, P notoginseng và P vietnamensis Kết quả nghiên cứu đã xác định được trình tự nucleotide vùng ITS- rADN của 24 mẫu sâm Lai Châu Kích thước vùng ITS Với kết quả thu được từ nghiên cứu 24 mẫu sâm Lai Châu có kết quả tương tự như kích thước và tỷ lệ thành phần (G+C) vùng ITS của nhiều loài thực vật hạt kín đã được công bố [10].
ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu và phạm vi nghiên cứu
Các mẫu cây (số lượng mẫu) có múi được sử dụng trong đề tài được trình bày trong bảng 3.1
Bảng 3.1 Các mẫu cam nghiên cứu
STT Tên dòng/giống Ký hiệu Địa điểm thu thập mẫu Ghi chú
1 Cam chanh Bố Hạ 1 CBH 1
Vườn sản xuất tại trường Đại học Nông Lâm
2 Cam chanh Bố Hạ 2 CBH 51 Cam canh
3 Cam sành Bố Hạ 1 CS1 Cam sành
4 Cam sành Bố Hạ 2 CS4 Cam sành
5 Cam sành Bố Hạ 3 CS5 Cam sành
Vườn bảo tồn các dòng cam tại Trường Đại học Nông Lâm
7 Cam Hàm Yên SO16-2 Cam sành
8 Cam Hàm Yên SO19-2 Cam sành
9 Cam Hàm Yên SO1-6 Cam sành
10 Cam Hàm Yên SO32-2 Cam sành
11 Cam Hàm Yên C36 Cam sành
12 Cam Hàm Yên MVL5-2 Cam sành
13 Cam sành Hưng Yên 2 HY Cam sành
14 Cam Xã Đoài Cao Phong XĐCP Cam chanh
15 Cam Xã Đoài Nghệ An XĐNA Cam chanh
16 Cam chanh Chín Sớm 4 CHS Cam chanh
17 Cam chanh Chín Muộn V2-2 CMV Cam chanh
18 Quýt Cam canh 5 CC Quýt
19 Quýt Ôn Châu 2 OC Quýt
3.1.2 Phạm vi nghiên cứu Ứng dụng chỉ thị phân tử, xác định được mối quan hệ di truyền của cam Bố
Hạ với một số giống được trồng phổ biến ở Việt Nam hiện nay.
Vật liệu, thiết bị và hóa chất nghiên cứu
Mồi được sử dụng trong nghiên cứu được thiết kế dựa trên nghiên cứu của tác giả Oliveira E.C và cộng sự (2010) và được sản xuất tại Hàn Quốc Thông tin chi tiết về mồi được trình bày trong bảng 3.2.
Bảng 3.2: Trình tự các mồi được sử dụng trong nghiên cứu
STT Ký hiệu mồi Trình tự (5’ - 3’) Giá trị Tm (ºC)
Các thiết bị được dùng trong quá trình nghiên cứu được liệt kê trong bảng 3.3
Bảng 3.3: Các thiết bị sử dụng trong ngiên cứu
STT Tên thiết bị Nguồn gốc xuất xứ
1 Bộ điện di Scie - Plas Ltd , Anh
2 Máy li tâm lạnh Eppendorf, Đức
3 Bể ủ nhiệt Water bath JSR, Hàn Quốc
4 Cân điện tử Ohaus, Mỹ
5 Máy PCR Master cycler X50s Eppendorf, Đức
6 Máy đồng hoá mẫu Benchmark, Trung Quốc
7 Máy ly tâm Spindown mini Đức
8 Máy Vortex Mixer Trung Quốc
9 Máy soi gel UVP Gel logic 1500 - Kodak -
10 Lò vi sóng Trung Quốc
11 Tủ lạnh Sanyo, Nhật Bản
Các hoá chất cần trong phân tích sinh học phân tử đều năm ở dạng tinh khiết danh sách các hoá chất được trình bày trong bảng 3.4
Bảng 3.4: Danh mục các loại hoá chất sử dụng trong đề tài
STT Tên hoá chất Hãng sản xuất
STT Tên hoá chất Hãng sản xuất
19 Go Taq DNA Polymerase Promerga
Nội dung nghiên cứu
- Nội dung 1: So sánh đặc điểm hình thái của các giống cam nghiên cứu
- Nội dung 2: So sánh giữa cam Bố Hạ với các giống cam, quýt thu thập được bằng chỉ thị phân tử
- Nội dung 3: Xác định được mối quan hệ di truyền của cam Bố Hạ với các giống cam và quýt thu được.
Phương pháp nghiên cứu
3.4.1 Phương pháp đánh giá hình thái
Để đo kích thước của lá cam và quýt, cần thực hiện các bước sau: thu thập 5 lá từ mỗi cây trong vườn, sau đó sử dụng thước để đo chiều dài và chiều rộng của từng lá (đơn vị tính là cm).
3.4.1.2 Đánh giá đặc điểm hình thái hoa
- Số cánh: Đếm số cánh hoa/5 hoa/mỗi dòng, giống thí nghiệm
- Chiều dài cánh: Đo chiều dài của mỗi cánh hoa
- Số chỉ nhị: đếm chỉ nhị của hoa/bông
- Chiều dài chỉ nhị: Đo chiều dài chỉ nhị của các bông hoa thu được
- Số nhuỵ: Đếm số nhuỵ/hoa
- Chiều dài nhuỵ: Đo chiều dài nhuỵ/bông
- Số nhị hoa: Đếm số nhị hoa, thu 5 hoa của mỗi dòng/giống, đếm tổng số chỉ nhị và tính trung bình số chỉ nhị
3.4.1.3 Đánh giá các chỉ tiêu của quả
Quả có những đặc điểm hình dáng và kích thước đa dạng, với đường kính và chiều cao quả được đo lường cụ thể Số múi và số hạt của quả cũng là những yếu tố quan trọng Tiến hành thu thập và đo quả, chúng tôi tính toán trung bình chung các chỉ tiêu để có cái nhìn tổng quát về đặc điểm của quả.
+ Đo chiều cao quả (cm): Dùng thước panme đo từ đỉnh quả đến gốc quả theo chiều song song với quả
+ Đường kính quả (cm): Dùng thước panme đo ở chiều ngang của quả
+ Số múi (múi/quả): Đếm số múi của các quả/tổng số quả tách múi
+ Số hạt: Đếm tổng số hạt của quả/tổng số quả tách hạt
- Khối lượng thịt quả ăn được: tách vỏ quả của các dòng/giống, cân khối lượng của phần thịt quả ăn được
3.4.1.4 Đánh giá hạt đa phôi của cam, quýt trong nghiên cứu
Để chế biến quả chín, trước tiên cần bóc tách vỏ, múi, thịt và hạt thành các phần riêng biệt Sau đó, thu hạt và rửa sạch để ráo nước Tiếp theo, tiến hành bóc hạt khỏi vỏ cứng và vỏ lụa, đồng thời đếm số phôi/hạt Hạt đơn phôi chỉ có một phôi, trong khi hạt đa phôi chứa nhiều phôi.
+ Tính tỷ lệ hạt đơn phôi
Tỷ lệ hạt đơn phôi (%) = Số hạt đơn phôi
+ Tính tỷ lệ hạt đa phôi
Tỷ lệ hạt đa phôi (%) = Số hạt đa phôi
Số hạt đạt được ×100 + Tính trung bình số phôi/hạt = Tổng số phôi đạt được
Tổng số hạt đạt được × 100
Trung bình số phôi/hạt = Tổng số phôi đạt được
Tổng số hạt đạt được × 100
- Xác định số hạt đơn phôi của các dòng/giống cam, quýt trong nghiên cứu
- Xác định số hạt đa phôi của các dòng/giống cam, quýt trong nghiên cứu
- Xác định số hạt đơn phôi, đa phôi của các dòng/giống cam quýt
- Xác định được tỷ lệ hạt đơn phôi và đa phôi của cam, quýt
- Xác định số phôi có trong hạt đa phôi của các dòng/giống cam, quýt trong nghiên cứu
3.4.2 Phương pháp tách chiết DNA tổng số
Mẫu lá cam và quýt được thu thập đã trải qua quá trình tách chiết DNA tổng số theo phương pháp của Dolye và Dolye (1987), với một số điều chỉnh nhỏ để phù hợp với điều kiện của phòng thí nghiệm.
Để tiến hành phân tích mẫu lá, đầu tiên, bạn cần cân 0,5g mẫu lá, rửa sạch và cắt nhỏ trước khi cho vào ống effendorf 2ml Tiếp theo, bổ sung 1ml Lysisbuffer và nghiền mẫu trong máy nghiền mẫu Cuối cùng, ủ mẫu trong bể ủ ở nhiệt độ 65 ºC trong 60 phút, nhớ vortex một lần sau mỗi 10 phút.
Bước 4: Ly tâm 10 phút/12000 vòng
Thu 500-600àl dịch nổi vào ống effendorft 2ml
Bước 5: Bổ sung 1ml CIAA (Phenol cloropome isoamin) 1:1 với mẫu
Lắc mạnh tạo thành dạng sữa
Bước 6: Ly tâm 13000 vòng/15 phút
Hỳt 500-600àl dich nổi sang ống effendorft 1,5 ml
Bước 7: Bổ sung 500àl Isopropanol, 50àl Sodium Đảo trộn nhẹ
Bước 8: Ủ (-20 º C) trong 120 phút (hoặc qua đêm)
Bước 9: Ly tâm 12000 vòng/30 phút, loại bỏ dịch nổi
Spindown, hút loại bỏ nốt dịch nổi
Bước 10: Bổ sung 1ml ETOH 70%, Vortex, Ly tâm 12000 vòng/ 2 phút
Loại bỏ cồn, Spindown, hút nốt cồn, để khô tự nhiên
Bước 11: Bổ sung 200àl TE 1x để hoà tan DNA
Bước 12: Hút lấy dung dịch sang ống effendorf khác
Dung dịch DNA tổng số được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1,0%
3.4.3 Phương điện di trên gel
Bước 1: Cân 1g agarose, 100ml TAE 1X, đun sôi đến khi agarose hoà tan hết Bước 2: Bổ sung 10àl ethidium promide vào gel đó đun sụi, lắc đều
Bước 3: Chuẩn bị khuôn đổ gel, bao gồm khuôn, lược và khay, sau đó đổ gel vào khuôn đã chuẩn bị Bước 4: Khi gel đã khô, nhẹ nhàng rút lược ra khỏi gel và lấy khay gel ra ngoài để tiến hành tra mẫu.
Bước 5: Tra mẫu vào gel với tỉ lệ 10àl mẫu: 2àl loading dye
Bước 6: Đưa gel vào bể điện di, chờ kết quả
Bước 7: đưa gel lên máy soi gel và đọc kết quả
Phản ứng RAPD được tiến hành đối với các mồi ngẫu nhiên
Thành phần của mỗi phản ứng PCR bao gồm như sau:
Primer (10àM): 3,0 àl Taq DNA polymerase: 0,2 àl
H2O: 10,3 àl Điều kiện chu trình nhiệt của phản ứng PCR như sau:
- Giai đoạn biến tính ban đầu: 95ºC trong 5 phút
- Giai đoạn khuếch đại gồm 40 chu kỳ gồm 3 bước sau:
+ Biến tính: 95ºC trong 1 phút
+ Gắn mồi: 35ºC trong 1 phút
+ Kéo dài mồi: 72ºC trong 2 phút
- Giai đoạn kéo dài cuối cùng: 72ºC trong 5 phút
- Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 2%
3.4.5 Phương pháp phân tích đa hình
Sản phẩm PCR-RAPD sau khi khuếch đại và điện di trên gel agarose sẽ tạo ra các băng vạch sáng Những băng sáng xuất hiện ở một mẫu nhưng không ở mẫu khác được gọi là phân đoạn đa hình, trong khi băng giống nhau ở tất cả các mẫu được coi là phân đoạn đồng hình.
Các phương pháp xử lý số liệu
Dựa trên kết quả phân đoạn DNA từ điện di sản phẩm PCR-RAPD và PCR-ISSR của các mẫu cam, quýt, các đoạn mồi ngẫu nhiên đã được sử dụng để phân tích Phân tích này được thực hiện bằng phần mềm NTSYSpc 2.0 theo các quy ước đã định.
+ Số 0: Không xuất hiện các đoạn DNA
+ Số 1: Xuất hiện các đoạn DNA
QUẢ NGHIÊN CỨU
Kết quả mô tả hình thái của các dòng cam , quýt
Lá cam có màu xanh đậm, với các gân lá chìm và mép lá có răng cưa không sắc Lá có eo nhỏ và cuống lá hơi có cánh, kích thước của lá có thể thay đổi tùy theo từng loại.
Nghiên cứu này đã tiến hành đánh giá các đặc điểm hình thái, kích thước và màu sắc của hoa, nhị và nhụy từ các dòng/giống cam Bố Hạ Kết quả chi tiết được trình bày trong bảng 4.1 dưới đây.
Bảng 4.1: Hình thái lá ở cam
Dòng/Giống Chiều dài phiến lá (cm)
Chiều rộng phiến lá (cm)
Kết quả CV%, LSD được thể hiện ở bảng phụ lục 2
Kết quả nghiên cứu cho thấy lá của các dòng/giống cam đều có màu xanh đậm, phiến lá dài và mọc so le, với gân lá chìm Hầu hết các mẫu lá có viền răng cưa nhẹ, ngoại trừ một số giống như Cam sành CS1, CS7, quýt Chín sớm và quýt Ôn Châu Tất cả các mẫu lá đều có độ cong nhẹ, với một số dòng/giống như cam chanh CBH và cam sành có eo lá nhỏ và cánh lá nhỏ Chiều dài lá dao động từ 8 đến 12 cm và chiều rộng trung bình từ 3 đến 6 cm, với hình dáng lá chủ yếu là bầu dục ở nhiều giống như Cam sành và quýt Đặc biệt, dòng cam chanh Bố Hạ, cam Hàm Yên và quýt Chín Sớm có kích thước lá lớn hơn so với các dòng cam và quýt khác.
Hình 4.1 Hình thái của lá mặt trên (A) và mặt dưới
(B) của các dòng/giống cam, quýt
Ghi chú: a: Cam chanh CBH e: Cam sành CS5 i: Cam XĐCP n: Cam chanh
Chín muộn bao gồm các loại trái cây như quýt Ôn Châu, cam sành CS1, cam sành CS7, cam XĐNA và cam chanh Trong khi đó, chín sớm có các loại như cam sành CS2, cam Hàm Yên C36, cam sành Hưng Yên và cam Hàm Yên.
SO d: Cam sành CS4 h: Cam Hàm Yên MVL m: Quýt ngọt q: Quýt Cam canh
Hoa đóng vai trò quan trọng trong phân loại thực vật Nghiên cứu này đã phân tích các đặc điểm hình thái, kích thước và màu sắc của hoa, nhị và nhụy của các dòng/giống cam Bố Hạ Kết quả chi tiết được trình bày trong bảng 4.2.
Bảng 4.2 Hình thái hoa ở cam
Kết quả CV%, LSD được thể hiện ở phụ lục 2
Kết quả nghiên cứu cho thấy hoa của các dòng cam đều có 5 cánh, màu trắng ngà với nhiều đốm vàng nâu, nhụy và bầu trên Chiều dài cánh hoa dao động từ 1,2 đến 2,03 cm, trong khi số chỉ nhị trung bình mỗi hoa từ 19 đến 27, với chỉ nhị màu trắng và bao phấn màu vàng tươi.
Số chỉ nhị trung bình của các dòng/giống cam khác nhau cho thấy sự đa dạng trong đặc điểm di truyền Cụ thể, cam chanh có chỉ số 22,82, trong khi cam sành có các chỉ số lần lượt là CS1: 19,3; CS2: 20; CS4: 19,16; và CS5: 19,31 Ngoài ra, cam Hàm Yên đạt chỉ số 23,5, còn cam Xã Đoài có chỉ số cao nhất là 27,1.
Hoa trên cây có thể xuất hiện dưới hai dạng là hoa đơn và hoa chùm, và điều này được ghi nhận ở tất cả các dòng, giống nghiên cứu Hoa thường mọc ở đỉnh ngọn cành hoặc tại nách lá trên cành.
Hình 4.2 Hình thái và vị trí của hoa cam nghiên cứu
A Hình thái và kích thước hoa cam chanh CBH, B Hình thái và kích thước cam sành CS1, C Hình thái và kích thước hoa cam sành CS5, D Vị trí của hoa trên cành
Các đặc điểm hình thái của quả và hạt được đánh giá ở bảng 4.3
Bảng 4.3 Hình thái của quả và hạt
Khối lượng quả (g) Đường kính quả (cm)
Hình 4.3 Hình thái và vị trí của quả cam nghiên cứu
A Hình thái quả cam chanh CBH, B Hình thái quả cam sành CS5, C Hình thái quả cam sành CS1, D Hình thái quả cam Hàm Yên SO
E Hình ảnh vị trí quả trên cành (đỉnh và nách); quả chùm, quả đơn
Nghiên cứu cho thấy cam sành Bố Hạ có hình dáng quả cầu dẹt, với túi tinh dầu rõ ràng, đỉnh và đáy quả bằng nhau, vỏ màu vàng thẫm khi chín Thịt quả màu vàng đậm, vách múi dai và dễ tách, lõi quả đặc với nhiều hạt Trong khi đó, cam sành Hàm Yên cũng có hình dáng tương tự nhưng túi tinh dầu chìm hơn, đỉnh quả lõm, vỏ màu vàng đậm và ruột màu vàng sậm Kích thước và khối lượng của cam Hàm Yên lớn hơn, trung bình đạt 220,65g so với 123,0g của cam Bố Hạ Số múi quả tương đương giữa hai giống, nhưng cam sành Hàm Yên có ít hạt hơn (trung bình 15 hạt/quả), chủ yếu là hạt mảy lớn, với số lượng hạt lép trung bình là 1 hạt/quả.
Cam chanh Bố Hạ có hình cầu hơi tròn, với vỏ nhẵn và túi tinh dầu chìm hơn so với cam sành Bố Hạ và cam sành Hàm Yên Khi chín, vỏ quả có màu vàng thẫm sáng và giòn Thịt quả màu vàng sáng, vách múi dai, dễ tách, với lõi quả đặc và nhiều hạt Trung bình, mỗi quả chứa khoảng 26 hạt, bao gồm 20 hạt mảy và 6 hạt lép, có kích thước lớn và hình thái gần giống hạt bưởi Quả cam chanh Bố Hạ còn nổi bật với mùi thơm đặc trưng.
Cam sành Bố Hạ có những đặc điểm hình thái quả khác biệt so với cam sành Hàm Yên, bao gồm hình thái đỉnh quả, khối lượng, màu sắc ruột quả, và số lượng hạt lép trên mỗi quả Đặc biệt, cam chanh Bố Hạ cũng sở hữu những đặc điểm quả và hạt khác biệt so với cả cam sành Bố Hạ và cam sành Hàm Yên.
Nghiên cứu này tiếp tục đánh giá tỷ lệ hạt đơn phôi và đa phôi của các dòng/giống cam Kết quả cho thấy số lượng hạt đơn phôi và đa phôi được tổng hợp trong bảng 4.4, trong khi số phôi trung bình trên mỗi hạt đa phôi được trình bày trong bảng 4.5.
Bảng 4.4 Bảng đánh giá số hạt của quả
Nghiên cứu về số lượng hạt đơn phôi và đa phôi của các dòng/giống cam cho thấy tất cả các giống đều có cả hai loại hạt Giống cam chanh Bố Hạ có số hạt đa phôi cao nhất với 17,5 hạt/quả, tiếp theo là giống cam sành Hàm Yên với 13,6 hạt/quả Trong khi đó, giống cam sành Bố Hạ lại có tỷ lệ hạt đơn phôi thấp hơn, với 7,0 hạt/quả ở giống CS1 và 10,5 hạt/quả ở giống CS5.
Bảng 4.5 Đánh giá số phôi trong cam
Số phôi trung bình/hạt đa phôi
Tên dòng/giống Số hạt đơn phôi Số hạt đa phôi
Kết quả nghiên cứu cho thấy, cam chanh Bố Hạ CBH có số phôi trung bình cao nhất với 3,7 phôi/hạt đa phôi, theo sau là cam sành Hàm Yên cũng với 3,7 phôi/hạt Trong khi đó, cam sành bố Hạ CS5 có số phôi trung bình thấp nhất, chỉ đạt 2,9 phôi/hạt Đặc biệt, ở cam sành Hàm Yên và cam sành CS5, hạt chủ yếu có từ 2 đến 5 phôi, trong đó hạt có 2 phôi là phổ biến nhất Cam sành CS1 chủ yếu là hạt có 2 phôi (38 hạt), còn cam chanh Bố Hạ CBH lại có tỷ lệ cao nhất là các hạt có 3-4 phôi.
Kết quả đánh giá đa dạng di truyền của các dòng/giống cam nghiên cứu bằng chỉ thị phân tử RAPD và ISSR
4.2.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số từ lá cam, quýt Để đánh giá đa dạng di truyền của các dòng/giống cam nghiên cứu bằng chỉ thị phân tử, các mẫu lá cam, quýt thu thập được tách chiết DNA tổng số bằng phương pháp hóa chất Mẫu tách chiết được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1,0% Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết DNA tổng số được thể hiện trong hình 4.4
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết DNA tổng số từ các mẫu cam và quýt được trình bày trong Hình 4.4 Đường chạy M thể hiện thang chuẩn DNA 100 bp, trong khi các đường chạy từ 1 đến 20 đại diện cho các mẫu DNA tổng số.
Kết quả điện di cho thấy, các đường chạy đều cho một số băng DNA sáng, gọn
Các mẫu cam, quýt đã được tách chiết DNA tổng số với các chỉ số (XĐCP, CBH1, C36, SO1, CHS, MVL, SO16, SO19, SO6, SO32, CBH5, CS1, CS4, QN, XĐNA) và một số băng mờ (CMV, CC, OC, HY, CS5) Sản phẩm DNA thu được không bị đứt gãy, có hàm lượng cao, đáp ứng đủ điều kiện cho các bước nghiên cứu tiếp theo Các dung dịch DNA tổng số được bảo quản ở nhiệt độ -20 oC để phục vụ cho các nghiên cứu sau này.
4.2.2 Kết quả phân tích đa hình các dòng/giống cam sử dụng các chỉ thị mồi ISSR và RAPD
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR sử dụng mồi OPT-01 được thể hiện trong hình 4.5 dưới đây:
Hình 4.5: Kết quả điện di kiểm tra PCR- mồi OPT – 01
Giếng M bao gồm các marker như Giếng 1: XĐCP, Giếng 2: CMV, Giếng 3: CC, Giếng 4: OC, Giếng 6: CBH1, Giếng 7: C36, Giếng 8: SO1, Giếng 9: CHS, Giếng 10: MVL, Giếng 12: SO19, Giếng 13: SO6, Giếng 14: SO32, Giếng 15: CBH5, Giếng 17: CS5, Giếng 18: CS4, Giếng 19: QN và Giếng 20: XĐNA.
Giếng 5: HY Giếng11: SO16 Giếng 16: CS1
Kết quả nghiên cứu cho thấy mồi OPT-01 chỉ tạo ra sản phẩm PCR ở hai mẫu C36 và CS4 Mẫu C36 xuất hiện 4 băng DNA kích thước 200bp, trong khi mẫu CS4 có 2 băng DNA kích thước 350bp Các mẫu còn lại không có băng DNA, chứng tỏ mồi OPT-01 không thể hiện tính đa hình với các mẫu này.
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR sử dụng mồi OPA-04 được thể hiện trong hình 4.6 dưới đây:
Hình 4.6: Kết quả điện di kiểm tra PCR với mồi OPA – 04
Giếng M bao gồm các marker như Giếng 1: XĐCP, Giếng 2: CMV, Giếng 3: CC, Giếng 4: OC, Giếng 6: CBH1, Giếng 7: C36, Giếng 8: SO1, Giếng 9: CHS, Giếng 10: MVL, Giếng 12: SO19, Giếng 13: SO6, Giếng 14: SO32, Giếng 15: CBH5, Giếng 17: CS5, Giếng 18: CS4, và Giếng 19: QN, Giếng 20: XĐNA.
Giếng 5: HY Giếng11: SO16 Giếng 16: CS1
Kết quả nghiên cứu cho thấy, mồi OPA-04 đã cho ra 16 mẫu sản phẩm PCR, bao gồm các mẫu XĐCP, CMV, OC, HY, CBH1, C36, SO1, CHS, MVL, SO16, SO19, SO32, CS1, CS5, CS4, và XĐNA Trong đó, các mẫu C36, SO32, CS4, MVL tạo ra 2 băng DNA kích thước 200bp; các mẫu XĐCP, CMV, OC, HY, CHB1, CHS, CS1, SO19, CS5 tạo ra 3 băng DNA kích thước 200bp; mẫu SO1 và SO16 tạo ra 1 băng DNA kích thước 600bp; và mẫu XĐNA tạo ra 1 băng kích thước 750bp Tuy nhiên, các mẫu còn lại không hình thành băng DNA, cho thấy mồi OPA-04 không thể hiện tính đa hình với các mẫu nghiên cứu này.
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR sử dụng mồi OPA-08 được thể hiện trong hình 4.7 dưới đây:
Hình 4.7: Kết quả điện di PCR với mồi OPA – 08
Giếng 1: XĐCP Giếng 7: C36 Giếng 12: SO19 Giếng 18: CS4 Giếng 2: CMV Giếng 8: SO1 Giếng 13: SO6 Giếng 19: QN Giếng 3: CC Giếng 9: CHS Giếng 14: SO32 Giếng 20: XĐNA Giếng 4: OC Giếng10: MVL Giếng 15: CBH5 Giếng M: Marker Giếng 5: HY Giếng 11: SO16 Giếng 16: CS1
Giếng 6: CBH1 Giếng M: Marker Giếng 17: CS5
Kết quả nghiên cứu cho thấy mồi OPA-08 đã tạo ra sản phẩm PCR ở 12 mẫu, bao gồm các mẫu XĐCP, CMV, CC, OC, HY, CH1, C36, SO16, SO19, SO6, CBH5 Trong đó, mẫu CC và CBH5 hình thành 2 băng DNA kích thước 300bp, mẫu XĐCP có 4 băng kích thước 100bp, mẫu CMV, CBH1, C36 tạo ra 3 băng kích thước 300bp, và mẫu HY có 3 băng kích thước 400bp Các mẫu OC, SO16, SO19, SO6 lần lượt hình thành 1 băng DNA kích thước 500bp và 300bp Mẫu SO32 tạo ra 3 băng kích thước 150bp Đặc biệt, các mẫu SO1, CHS, MVL, CS1, CS5, CS4, QN, XĐNA không xuất hiện băng DNA, cho thấy mồi OPA-08 không có tính đa hình với các mẫu nghiên cứu này.
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR sử dụng mồi OPT-01 được thể hiện trong hình 4.8 dưới đây
Hình 4.8: Kết quả điện di PCR- mồi OPG – 17
Danh sách các giếng bao gồm: Giếng M, Giếng 1 (XĐCP), Giếng 2 (CMV), Giếng 3 (CC), Giếng 4 (OC), Giếng 6 (CBH1), Giếng 7 (C36), Giếng 8 (SO1), Giếng 9 (CHS), Giếng 10 (MVL), Giếng 12 (SO19), Giếng 13 (SO6), Giếng 14 (SO32), Giếng 15 (CBH5), Giếng 17 (CS5), Giếng 18 (CS4), và Giếng 19 (QN), Giếng 20 (XĐNA).
Giếng 5: HY Giếng11: SO16 Giếng 16: CS1
Kết quả nghiên cứu cho thấy, mồi OPG-17 đã tạo ra sản phẩm PCR ở 19 mẫu, bao gồm các mẫu XĐCP, CMV, CC, OC, HY, CBH1, C36, SO1, CHS, MVL, SO16, SO19, SO6, SO32, CBH5, CS1, CS5, CS4, và QN Cụ thể, mẫu CMV và CC tạo ra 3 băng DNA kích thước 400bp; mẫu CS1 có 2 băng DNA kích thước 350bp; các mẫu CBH1, C36, CHS, MVL hình thành 7 băng DNA kích thước 300bp; mẫu HY, SO1, SO16 có 8 băng DNA kích thước 320bp; mẫu SO32 và CS4 tạo ra 4 băng DNA kích thước 500bp; mẫu SO19, CBH5 và QN có 2 băng DNA kích thước 800bp; mẫu SO6 có 1 băng DNA kích thước 1000bp; mẫu CS5 tạo ra 5 băng DNA kích thước 550bp; mẫu OC có 3 băng DNA kích thước 300bp; và mẫu XĐCP tạo ra 6 băng kích thước 300bp Đặc biệt, mẫu XĐNA không xuất hiện băng DNA, cho thấy mồi OPG-17 không thể hiện tính đa hình với các mẫu nghiên cứu.
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR sử dụng mồi OPM- 13 được thể hiện trong hình 4.9 dưới đây
Hình 4.9: Kết quả điện di PCR- mồi OPM – 13
Giếng M bao gồm nhiều mốc quan trọng như Giếng 1 với mã XĐCP, Giếng 2 mã CMV, Giếng 3 mã CC, Giếng 4 mã OC, Giếng 5 mã chưa được đề cập, Giếng 6 mã CBH1, Giếng 7 mã C36, Giếng 8 mã SO1, Giếng 9 mã CHS, Giếng 10 mã MVL, Giếng 11 mã chưa được đề cập, Giếng 12 mã SO19, Giếng 13 mã SO6, Giếng 14 mã SO32, Giếng 15 mã CBH5, Giếng 16 mã chưa được đề cập, Giếng 17 mã CS5, Giếng 18 mã CS4, Giếng 19 mã QN và Giếng 20 mã XĐNA.
Giếng 5: HY Giếng 11: SO16 Giếng 16: CS1
Kết quả điện di PCR từ 20 mẫu cam, quýt sử dụng mồi OPM-13 cho thấy không có phân đoạn DNA nào được khuếch đại Điều này chỉ ra rằng mồi OPM-13 không thể hiện tính đa hình đối với các mẫu nghiên cứu này.
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR sử dụng mồi OPC-08 được thể hiện trong hình 4.10 dưới đây:
Kết quả nghiên cứu cho thấy, với mồi OPC-08, có 8 mẫu hình thành sản phẩm PCR, bao gồm XĐCP, CMV, HY, CBH1, C36, MVL, CS4, và QN Cụ thể, mẫu XĐCP tạo ra 3 băng DNA kích thước 750bp; mẫu CMV tạo 1 băng kích thước 750bp; mẫu HY tạo 5 băng kích thước 150bp; mẫu CBH1 tạo 2 băng kích thước 300bp; mẫu C36 tạo 1 vạch kích thước 500bp; mẫu MVL tạo 4 vạch kích thước 200bp; mẫu CS4 tạo 3 băng kích thước 200bp; và mẫu QN tạo 1 băng kích thước 400bp Các mẫu còn lại không xuất hiện băng vạch, trong khi mồi OPC-18 không thể hiện tính đa hình với các mẫu nghiên cứu.
Hình 4.10: Kết quả điện di PCR- mồi OPC–08
Giếng M: Marker Giếng 6: CBH1 Giếng M: Marker Giếng 17: CS5
Giếng 1: XĐCP Giếng 7: C36 Giếng12: SO19 Giếng 18: CS4
Giếng 2: CMV Giếng 8: SO1 Giếng 13: SO6 Giếng 19: QN
Giếng 3: CC Giếng 9: CHS Giếng 14: SO32 Giếng 20: XĐNA
Giếng 4: OC Giếng 10: MVL Giếng 15: CBH5
Giếng 5: HY Giếng 11: SO16 Giếng 16: CS1
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR sử dụng mồi OPG- 16 được thể hiện trong hình 4.11 dưới đây
Hình 4.11: Kết quả điện di PCR- mồi OPG – 16
Giếng M: Marker Giếng 6: CBH1 Giếng M: Marker Giếng 17: CS5
Giếng 1: XĐCP Giếng 7: C36 Giếng12: SO19 Giếng 18: CS4
Giếng 2: CMV Giếng 8: SO1 Giếng 13: SO6 Giếng 19: QN
Giếng 3: CC Giếng 9: CHS Giếng 14: SO32 Giếng 20: XĐNA
Giếng 4: OC Giếng 10: MVL Giếng 15: CBH5
Giếng 5: HY Giếng 11: SO16 Giếng 16: CS1
Kết quả nghiên cứu cho thấy, với mồi OPG-16, có 12 mẫu hình thành sản phẩm PCR, bao gồm các mẫu XĐCP, OC, HY, C36, SO1, MVL, SO16, SO19, SO6, CS1, CS5, và CS4 Cụ thể, mẫu XĐCP tạo ra 2 băng DNA kích thước 300bp; các mẫu OC, HY, C36 tạo 4 băng DNA kích thước 300bp; mẫu SO1 có 4 băng kích thước 270bp; mẫu MVL tạo 3 băng kích thước 270bp; mẫu SO16 có 2 băng kích thước 300bp; mẫu SO19 và SO6 mỗi mẫu có 1 băng kích thước 300bp; mẫu CS1 và CS5 tạo 2 băng kích thước 300bp; mẫu CS4 có 3 băng kích thước 600bp Tuy nhiên, các mồi còn lại không tạo ra băng DNA, cho thấy mồi OPG-16 không thể hiện tính đa hình với các mẫu nghiên cứu này.
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR sử dụng mồi OPO- 04 được thể hiện trong hình 4.12 dưới đây
Hình 4.12: Kết quả điện di PCR- mồi OPO – 04
Giếng M: Marker Giếng 6: CBH1 Giếng 12: SO19 Giếng 18: CS4
Giếng 1: XĐCP Giếng 7: C36 Giếng 13: SO6 Giếng 19: QN
Giếng 2: CMV Giếng 8: SO1 Giếng 14: SO32 Giếng 20: XĐNA Giếng 3: CC Giếng 9: CHS Giếng 15: CBH5 Giếng M: Marker Giếng 4: OC Giếng 10: MVL Giếng 16: CS1
Giếng 5: HY Giếng 11: SO16 Giếng 17: CS5
Xác định mối quan hệ di truyền giữa các giống cam, quýt dựa trên giản đồ phả hệ DNA
Dựa trên chỉ thị RAPD và ISSR, chúng tôi đã thực hiện phân tích đa hình và tổng hợp các đoạn PCR của các mẫu cam, quýt, như được trình bày trong bảng phụ lục 1.
Từ bảng tổng hợp trên, chúng tôi xây dựng được hệ sơ đồ cây phát sinh chủng loài của các mẫu cam, quýt phân tích sau:
Hình 4.18 Sơ đồ hình cây mô tả quan hệ di truyền của 20 mẫu cam, quýt nghiên cứu
Cây phân loại hình 5.8 cho thấy 20 mẫu cam được chia làm 2 nhóm chính (Nhóm
Nhóm I: Gồm 9 mẫu, được chia thành 2 nhóm phụ (nhóm phụ I và nhóm phụ II)
- Nhóm phụ I chia thành 2 cụm (cụm 1, cụm 2): cụm 1 bao gồm 3 mẫu (XĐCP, CBH1, CBH5) và cụm 2 với 1 mẫu (XĐNA)
- Nhóm phụ II chia thành 2 cụm (cụm3, cụm 4): Cụm 3 với 1 mẫu (CMV) và cụm 4 gồm 4 mẫu (CC, OC, CHS, QN)
Nhóm II: Gồm 11 mẫu, được chia thành 2 nhóm phụ (nhóm phụ 3, nhóm phụ 4)
- Nhóm phụ 3 với 1 mẫu (HY)
- Nhóm phụ 4 chia ra 2 cụm (cụm 5, cụm 6) trong đó:
+ Cụm 5 được chia ra 2 cụm (cụm 5a, cụm 5b)
++/ Cụm 5a được chia ra 2 cụm nhỏ (5a-1 và 5a-2) với cụm 5a-1 gồm 7 mẫu (C36, SO1, SO16, SO19, CS1, CS5, CS4) và cụm 5a-2 gồm 1 mẫu (SO6)
Kết quả từ sơ đồ cây cho thấy cam chanh Bố Hạ (CBH1 và CBH5) thuộc cùng một nhánh và có mối quan hệ gần gũi với cam Xã Đoài Cao Phong (XDCP) và cam Xã Đoài Nghệ An (XDNA) Các dòng cam sành Bố Hạ (CS1, CS4 và CS5) cũng thuộc một nhánh phát sinh chung, không có sự khác biệt về mặt di truyền, và có quan hệ gần với các dòng/giống cam sành Hàm Yên, tuy nhiên lại nằm ở hai nhánh khác nhau.
