Tổng quan vấn đề nghiên cứu
Khái niệm và cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 3 1 Khái niệm
Nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật, hay còn gọi là vi nhân giống, là phương pháp sản xuất hàng loạt cây con từ chồi non của cây Quá trình này diễn ra trong ống nghiệm với điều kiện vô trùng tuyệt đối, sử dụng môi trường thích hợp và được kiểm soát để đảm bảo sự phát triển tối ưu của cây con.
Thuật ngữ "nuôi cấy mô tế bào thực vật" hay "nuôi cấy in vitro" đề cập đến tất cả các phương pháp nuôi cấy mô và tế bào trong điều kiện vô trùng.
Nuôi cấy cây: nuôi cấy thực vật.
Nuôi cấy các bộ phận đã được tách khỏi thực cơ thể thực vật: nuôi cấy cơ quan
Nuôi cấy các phôi thành thục hay chưa thành thục đã được tách khỏi cơ thể thực vật: nuôi cấy phôi.
Nuôi cấy mô bắt nguồn từ cơ quan thực vật: nuôi cấy mô hay nuôi cấy mô sẹo.
Nuôi cấy tế bào đơn lẻ hay các cụm tế bào rất nhỏ trong môi trường lỏng.
Nuôi cấy tế bào thực vật sau khi đã tách bỏ vỏ tế bào, còn gọi là nuôi cấy tế bào trần (protoplast) [14].
1.1.2 Cơ sở khoa học của của nuôi cấy mô tế bào
Vào năm 1902, nhà thực vật học người Đức Haberlandt đã đề xuất rằng mỗi tế bào đã biệt hóa từ một cơ thể thực vật đều có tiềm năng phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh Theo sinh học hiện đại, mỗi tế bào biệt hóa chứa toàn bộ thông tin di truyền (ADN) cần thiết cho sự phát triển của cơ thể đó Khi được cung cấp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào có khả năng trở thành một cơ thể hoàn chỉnh, thể hiện tính toàn năng của tế bào thực vật.
Tính toàn năng của tế bào là lý thuyết nền tảng cho nuôi cấy mô tế bào thực vật Đến nay, con người đã chứng minh khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào đơn lẻ.
* Sự phân hoá và phản phân hoá tế bào
Cơ thể thực vật trưởng thành là một hệ thống thống nhất, bao gồm nhiều cơ quan chức năng và các loại tế bào khác nhau, mỗi loại thực hiện những chức năng cụ thể Tất cả các tế bào này đều phát sinh từ tế bào phôi sinh.
Sự phân hoá tế bào là quá trình chuyển đổi các tế bào phôi sinh thành các tế bào chuyên hoá, mỗi loại đảm nhận những chức năng khác nhau trong cơ thể Quá trình này rất quan trọng cho sự phát triển và hoạt động của các mô.
Sơ đồ 1.1: Quá trình phân hoá và phản phân hoá tế bào
Quá trình này gồm có các giai đoạn
- Sự phân chia tế bào: Quá trình phân chia tế bào xảy ra trong mô phân sinh làm cho số lượng tế bào tăng lên một cách đáng kể.
Tế bào phôi sinh Tế bào dãn Tế bào chuyên hoá
Sự dãn tế bào là quá trình tế bào mở rộng cả chiều ngang và chiều dọc, dẫn đến sự gia tăng kích thước của các cơ quan và toàn bộ cơ thể Qua hai giai đoạn này, tế bào trải qua quá trình biệt hoá, phân hoá thành các mô chức năng với vai trò riêng biệt trong cơ thể sống Dù đã phân hoá, các tế bào này vẫn giữ khả năng phân chia và trong những điều kiện nhất định, chúng có thể trở thành tế bào phôi sinh, tiếp tục phân chia và tạo ra các tế bào mới, góp phần tái sinh thành cây hoàn chỉnh Đây là quá trình phản phân hoá tế bào.
Sự phân hoá và phản phân hoá là quá trình điều hoà hoạt hoá gen, trong đó một số gen bị ức chế có thể được kích hoạt để tạo ra tính trạng mới, trong khi những gen khác lại bị đình chỉ hoạt động Quá trình này được mã hoá trong cấu trúc phân tử ADN của mỗi tế bào Khi tế bào nằm trong khối mô của cơ thể, nó thường bị ức chế bởi các tế bào xung quanh Tuy nhiên, khi tế bào được tách ra và gặp điều kiện thuận lợi, các gen sẽ được kích hoạt theo chương trình đã định sẵn trong bộ gen.
Các giai đoạn chính trong quá trình nhân giống in vitro
Giai đoạn chuẩn bị có mục đích tạo ra nguồn mẫu sạch cho các bước tiếp theo trong quá trình nuôi cấy Đây là bước quan trọng để thuần hoá vật liệu, giúp cây giống thích ứng với môi trường mới và giảm thiểu khả năng nhiễm bệnh Đồng thời, giai đoạn này cũng hỗ trợ trong việc nhân giống chủ động Nếu cần thiết, có thể thực hiện việc trẻ hoá vật liệu giống để nâng cao chất lượng.
1.2.2 Giai đoạn cấy khởi động
Giai đoạn này nhằm tạo ra chồi mới từ mô nuôi cấy, bắt đầu bằng việc lấy mẫu và xử lý trong điều kiện vô trùng Các hóa chất như HgCl2, Ca(OCl)2 và H2O2 thường được sử dụng để khử trùng mẫu cấy, và việc lựa chọn hóa chất, nồng độ cùng thời gian khử trùng phụ thuộc vào loại vật liệu Mô nuôi cấy có thể lấy từ bất kỳ bộ phận nào của cây, nhưng theo Bhatt, mô từ các phần non của cây có khả năng nuôi cấy thành công cao hơn so với các bộ phận trưởng thành Do đó, chồi đỉnh hoặc chồi nách thường được chọn để nuôi cấy in vitro.
Khi lựa chọn mô nuôi cấy, cần chú ý rằng tuổi sinh lý của mô càng thấp thì khả năng trẻ hóa càng cao và tỷ lệ thành công trong nuôi cấy sẽ tốt hơn Mô được lấy trong thời kỳ sinh trưởng mạnh của cây sẽ có khả năng tái sinh tốt hơn (Anolesnon 1980) Đối với những mẫu dễ bị hoá nâu, có thể bổ sung than hoạt tính hoặc Polyvinylpyrroline (PVP) vào môi trường nuôi cấy Trong giai đoạn này, cần đảm bảo tỷ lệ mô nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao và mô tồn tại, sinh trưởng tốt Kết quả của giai đoạn này phụ thuộc vào việc chọn bộ phận nuôi cấy, do đó cần tuân thủ các nguyên tắc đã nêu Giai đoạn này thường kéo dài từ 4 đến 6 tuần.
Phương pháp nhân giống in vitro nổi bật với hệ số nhân cao, dao động từ 5 đến 50 lần tùy thuộc vào loài cây, môi trường và phương pháp áp dụng Đây là giai đoạn then chốt trong toàn bộ quá trình nhân giống, đòi hỏi lựa chọn môi trường và điều kiện ngoại cảnh phù hợp Các chất điều hòa sinh trưởng như Auxin và Cytokinin đóng vai trò quan trọng trong việc sản xuất cây con tối đa, đồng thời duy trì sức sống và bản chất di truyền của cây Môi trường nuôi cấy lý tưởng thường có nhiệt độ từ 25 – 27°C, thời gian chiếu sáng từ 10 – 16 giờ/ngày với cường độ ánh sáng từ 1000 – 3000 lux Mục tiêu của giai đoạn này là tối đa hóa số lượng cây con trong thời gian ngắn mà vẫn đảm bảo chất lượng sống và di truyền.
1.2.4 Tạo cây hoàn chỉnh (cho ra rễ) Đây là giai đoạn chuẩn bị cho cây con chuyển ra ngoài hệ thống vô trùng khi đạt được kích thước nhất định, các chồi được chuyển từ môi trường ở giai đoạn 3 sang môi trường tạo rễ Thường sau 2 – 3 tuần ở các chồi này sẽ xuất hiện rễ và trở thành cây hoàn chỉnh Môi trường tạo rễ được giảm lượng Cytokinin và tăng lượng Auxin để tạo điều kiện thuận lợi cho sự ra rễ của chồi cây Người ta thường dùng các chất NAA (Axit α-naphtyl axetic), IBA (Axit β-indol butyric) và IAA (Axit β-indol axetic) ở nồng độ 1mg/lít đến 5 mg/lít để tạo rễ cho hầu hết các loài cây trồng Giai đoạn này thường kéo dài từ 2 – 4 tuần lễ, sau đó được chuyển sang môi trường không có Auxin để rễ phát triển. ở giai đoạn này cây con rất nhạy cảm với ẩm độ và bệnh tật do hoạt động của lá và rễ mới phát sinh rất yếu, cây chưa chuyển sang giai đoạn tự dưỡng.
1.2.5 Đưa cây ra môi trường tự nhiên Đây là giai đoạn chuyển dần cây con từ ống nghiệm ra nhà kính rồi ra ngoài trời Cây mô được chuyển từ môi trường dị dưỡng sang môi trường tự dưỡng nên phải tập cho cây quen dần với môi trường tự nhiên, tránh sự thay đổi đột ngột làm cây có thể sốc hoặc bị chết Khi cây con đã cứng cáp và đạt những tiêu chuẩn nhất định về chiều cao, số lá và số rễ thì đưa ra ngoài giá thể Giá thể tiếp nhận cây in vitro phải đảm bảo tơi, xốp, thoáng nước và sạch bệnh Phải giữ ẩm cho cây khi mới đưa từ bình nuôi ra, cần duy trì độ ẩm trên50% để cây con không mất nước và làm giàn che để tránh ánh sáng quá mạnh.Sau 2 – 3 tuần đưa ra ngoài cây mô sẽ sinh trưởng ổn định, chăm sóc cây mô tương tự chế độ chăm sóc cây hom hoặc cây từ hạt.
Các nhân tố ảnh hưởng tới quá trình nhân giống in vitro
Trong nuôi cấy in vitro, môi trường nuôi cấy và các điều kiện bên ngoài đóng vai trò quyết định đến thành công của quá trình này Môi trường nuôi cấy cung cấp các chất dinh dưỡng thiết yếu, giúp thúc đẩy sự tăng trưởng và phân hóa mô trong suốt quá trình nuôi cấy.
Cho đến nay, nhiều môi trường dinh dưỡng như MS – 62, WPM, và SH đã được phát hiện, tùy thuộc vào đối tượng và mục đích nuôi cấy Việc lựa chọn môi trường phù hợp cho sự sinh trưởng và phát triển tối ưu của cây trong từng giai đoạn nuôi cấy in vitro là rất quan trọng Môi trường nuôi cấy thường bao gồm các muối khoáng đa lượng và vi lượng, nguồn carbon, axit amin, và các chất điều hòa sinh trưởng, có thể bổ sung thêm các chất phụ gia như than hoạt tính Tùy thuộc vào từng loài, giống, nguồn gốc mẫu cấy, và các cơ quan khác nhau trên cùng một cơ thể, nhu cầu dinh dưỡng cho sự sinh trưởng tối ưu sẽ khác nhau Do đó, việc lựa chọn môi trường thích hợp với số lượng và loại hóa chất chính xác cho từng đối tượng là điều cần thiết.
Trong nuôi cấy mô, các tế bào không thể quang hợp để tự tổng hợp chất hữu cơ, vì vậy cần bổ sung một lượng hợp chất cácbon nhất định vào môi trường để cung cấp năng lượng cho tế bào và mô (Debengh – 1991) Các loại đường như Saccarose và Glucose, với nồng độ khoảng 20 – 30mg/lít, không chỉ giúp tế bào thực vật tổng hợp các hợp chất hữu cơ mà còn hỗ trợ tăng sinh khối và đóng vai trò là chất thẩm thấu chính trong môi trường nuôi cấy.
Nguồn Nitơ trong cây phụ thuộc vào loài và giai đoạn phát triển, thường được cung cấp dưới hai dạng chính: NH4+ (amoni) và NO3- (nitrat) Trong đó, NO3- được hấp thụ hiệu quả hơn NH4+, tuy nhiên, nó có thể gây ra hiện tượng "kiềm hoá" môi trường Do đó, việc kết hợp cả hai nguồn nitơ với tỉ lệ hợp lý là phương pháp phổ biến nhất để tối ưu hóa sự phát triển của cây.
+ Các nguyên tố đa lượng: là những nguyên tố khoáng như: N, P, K, S,
Magie (Mg) và canxi (Ca) là hai nguyên tố thiết yếu trong nuôi cấy thực vật, thường được sử dụng ở nồng độ trên 30ppm Chúng đóng vai trò quan trọng trong việc cung cấp nguyên liệu cho cấu trúc mô và tế bào thực vật, đồng thời hỗ trợ quá trình trao đổi chất giữa tế bào và môi trường Có nhiều loại môi trường nuôi cấy với thành phần và tỉ lệ chất khác nhau; môi trường giàu nitơ thích hợp cho sự hình thành chồi, trong khi môi trường giàu kali thúc đẩy quá trình trao đổi chất Thành phần khoáng của môi trường cấy được xác định bởi sự cân bằng nồng độ của các ion trong dung dịch (đo bằng mg/lít) Việc lựa chọn thành phần và hàm lượng khoáng cho đối tượng nuôi cấy là một thách thức, yêu cầu người thực hiện cần có kiến thức cơ bản về sinh lý thực vật và dinh dưỡng khoáng.
Nhóm các nguyên tố vi lượng như Fe, Cu, Zn, Mg, Mo, B, Co, I đóng vai trò thiết yếu trong sự phát triển của mô và tế bào, nhờ vào vai trò quan trọng của chúng trong hoạt động của enzym Những nguyên tố này được sử dụng với nồng độ thấp hơn so với các nguyên tố đa lượng, nhưng vẫn cần thiết để đảm bảo sự sinh trưởng và phát triển bình thường của cây.
Mặc dù cây in vitro có khả năng tự tổng hợp vitamin, nhưng lượng vitamin này không đủ để đáp ứng nhu cầu sinh trưởng tối ưu Do đó, cần bổ sung một số vitamin nhóm B vào môi trường nuôi cấy với liều lượng phù hợp cho từng hệ mô và giai đoạn phát triển Các vitamin B1 (Thiamin) và B6 là những vitamin quan trọng cần được cung cấp.
(pyrodoxal) là những vitamin cơ bản nhất thường dùng trong môi trường nuôi cấy với nồng độ thấp khoảng 0.1 – 1mg/lít [13].
Dung dịch hữu cơ như nước dừa và dịch chiết nấm men được bổ sung vào môi trường nuôi cấy để kích thích sinh trưởng mô sẹo và các cơ quan Nước dừa, đã được sử dụng từ năm 1941, có vai trò quan trọng trong các môi trường nhân nhanh in vitro nhờ chứa nhiều axit amin, axit hữu cơ, đường, ARN và ADN Đặc biệt, nước dừa còn cung cấp Myo-inositol, các hợp chất có hoạt tính Auxin và Gluxit của Cytokinin, những yếu tố cần thiết cho nuôi cấy mô.
Agar là một polysaccharid từ tảo, có khả năng ngậm nước cao từ 6-12g/lít, được sử dụng làm chất làm đông cứng môi trường nuôi cấy Độ thoáng khí của môi trường thạch ảnh hưởng rõ rệt đến sự sinh trưởng của mô nuôi cấy, với nồng độ thạch dao động từ 6 – 10mg/lít tùy thuộc vào mục tiêu nuôi cấy.
1.3.2 Các chất điều hoà sinh trưởng
Phytohormon là những chất quan trọng trong việc điều hòa sinh trưởng và phát triển của thực vật, ảnh hưởng đến quá trình phân chia và biệt hóa tế bào Chúng cũng tác động đến quá trình lão hóa mô và nhiều quá trình sinh lý khác Các phytohormon được chia thành 5 nhóm chính: Auxin, Cytokinin, Giberillin, Ethylen và Abscisic Axit, và đóng vai trò quyết định trong môi trường nuôi cấy thực vật, góp phần vào sự thành công của quá trình này.
Auxin là nhóm chất quan trọng trong nuôi cấy mô thực vật, bao gồm IBA (3-Indol butyric axit), IAA (Indol acetic axit) và NAA (Napthyl acetic axit) Chúng thường được sử dụng để kích thích sự phân chia tế bào, biệt hoá rễ, hình thành mô sẹo, kìm hãm sự phát triển chồi và tạo ra các rễ phụ.
Cytokinin là chất được bổ sung vào môi trường nuôi cấy nhằm kích thích sự phân chia tế bào và quyết định quá trình phân hóa chồi bất định từ mô sẹo và cơ quan Một trong những hợp chất thường được sử dụng là Kinetin (6-Furfuryl aminopurine).
Cytokinin như Kinetin và BAP (6-Benzyl amino purine) là những chất được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy mô nhờ vào hoạt tính cao và giá thành hợp lý Tùy thuộc vào từng hệ mô và mục đích nuôi cấy, nồng độ của Cytokinin sẽ được điều chỉnh khác nhau, thường ở mức thấp từ 10^-7 đến 10^-6 M.
Cytokinin có tác dụng kích thích sự phân bào và phân hóa chồi trong nuôi cấy mô Ở nồng độ từ 10^-6 đến 10^-5 M, cytokinin thúc đẩy quá trình này, trong khi nồng độ từ 10^-6 đến 10^-4 M thường được sử dụng để kích thích nhân nhanh.
Gibberellin là một nhóm hormone thực vật với khoảng 50 loại khác nhau, trong đó GA3 (Gibberellic Axit 3) là loại quan trọng nhất GA3 kích thích quá trình nảy mầm của hạt, kéo dài các lóng đốt của thân cây, đồng thời có tác dụng phá ngủ phôi, ức chế sự hình thành rễ phụ và tạo chồi phụ Ngoài ra, GA3 còn ảnh hưởng đến sự ra hoa của một số loài thực vật và rút ngắn thời gian sinh trưởng sinh dưỡng của cây.
ứng dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật trong công tác giống cây rừng
Nuôi cấy in vitro hiện đang được áp dụng rộng rãi trong sản xuất thương mại trên toàn thế giới, với hàng trăm loài cây lá rộng và nhiều loài cây lá kim được nhân giống thành công Tính đến năm 1991, Thái Lan đã thành công trong việc nhân giống in vitro 55 trong tổng số 67 loài tre trúc thử nghiệm Công nghệ này cho phép nhân nhanh loài Dendrocalamus asper với số lượng khoảng 1 triệu cây mỗi năm, đáp ứng nhu cầu cây con cho trồng rừng.
Số lượng loài Bạch đàn được nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy in vitro ngày càng gia tăng, với hơn 20 loài thành công tính đến năm 1987 Các nhà khoa học Ấn Độ đã tạo ra cây mô từ các giống Bạch đàn ưu việt như Eucalyptus camandulensis, E globulus, E tereticornis, và E torelliana Cây mô từ những cây này có tốc độ sinh trưởng nhanh gấp 3 lần và đồng đều hơn so với cây mọc từ hạt cùng nguồn gốc Tại Australia, phương pháp nhân giống in vitro đã được áp dụng để phát triển nhanh các giống Bạch đàn chịu mặn, đặc biệt là E camandulensis, và đang được đưa vào sản xuất quy mô lớn.
Trung Quốc đã đạt được nhiều thành công trong việc nhân giống cây in vitro cho các loài cây thân gỗ, với hơn 100 loài như Dương, Bạch đàn, Tếch và Bao đồng Là một trong những quốc gia tiên phong trong ứng dụng nuôi cấy mô vào trồng rừng, đến năm 1991, khu vực Nam Trung Quốc đã sản xuất hơn 1 triệu cây mô từ các giống cây và dòng lai được chọn lọc Những cây mô này không chỉ được sử dụng làm cây đầu dòng tại các vườn ươm địa phương mà còn được trồng trực tiếp trong các dự án rừng.
Nhiều loài cây lá rộng ở Châu Âu như Acer, Beluta, Fagus, Quercus và Carpinus đã được nhân giống thành công qua phương pháp nuôi cấy mô Các cây mô này đã được trồng thực địa để so sánh, cho thấy kiểu hình tương đối giống nhau Tỷ lệ sống sót của chúng trong rừng trồng sau khi được huấn luyện có thể đạt từ 90% đến 100% cho một số loài.
Hiện nay, nuôi cấy in vitro là phương pháp nhân giống phổ biến cho các loài cây lá kim, phục vụ cho chương trình trồng rừng vô tính Nhiều loài Thông đã được nuôi cấy thành công, góp phần vào việc bảo tồn và phát triển rừng.
Trong số 30 loài cây lá kim được nghiên cứu nuôi cấy mô, các loài như Pinus nigra, P caribaea, và P pinaster đã đạt được những thành công đáng kể Đặc biệt, các loài Bách tán (Araucaria), Liễu sam (Cryptomeria japonica) và Bách xanh cũng được ghi nhận Trong số này, bốn loài đã được đưa vào sản xuất rộng rãi, bao gồm Cù tùng (Sequoia sempervirens) tại Pháp, Thông P radiata tại Viện nghiên cứu Lâm nghiệp New Zealand, và Thông P taeda cùng Pseudotsuga menziesii tại Mỹ.
Tác giả Darus H Ahmas thuộc Viện nghiên cứu Lâm nghiệp Malaysia đã nuôi cấy in vitro cây Keo tai tượng (Accasia mangium) bằng môi trường
Môi trường MS được bổ sung 3% sucrose, 0.6% agar và 0.5mg/l BAP cho giai đoạn nhân chồi Chồi có chiều cao trên 0.5 cm được cấy vào môi trường tạo rễ, trong đó IBA 1000ppm là chất điều hòa sinh trưởng tốt nhất, đạt tỷ lệ ra rễ 40%.
Kỹ thuật nuôi cấy mô đã được áp dụng thành công để nhân giống Phi lao, cho phép trồng cây trong nhà kính và so sánh với cây hạt Phương pháp này giúp tạo ra cây mô Phi lao có khả năng sinh trưởng nhanh, kháng bệnh tốt và có khả năng cố định đạm cao, phù hợp cho việc trồng rừng.
Biện pháp nuôi cấy mô đã được áp dụng thành công cho cây Tếch (Tectona grandis) Gupta và các cộng sự (1979) đã mô tả quá trình hình thành chồi từ cành cắt của cây non và cây 100 tuổi, cho phép tạo ra 500 cây in vitro từ một chồi cây trưởng thành và 3000 cây từ cây non trong một năm Năm 1986, Thái Lan cũng phát triển kỹ thuật nuôi cấy mô cho cây Tếch, đạt được khả năng tạo ra 500.000 chồi từ một chồi trong một năm (Kaosaard, 1990) Ngoài ra, Perhutani tại Indonesia (1991) đã thử nghiệm và thành công trong nuôi cấy mô cho loài Tếch, với một số cây được đem trồng thử.
Hiện nay, nhiều cơ sở ở Việt Nam đang thực hiện nhân giống cây rừng bằng phương pháp nuôi cấy mô quy mô lớn, bao gồm Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng, Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy Phù Ninh, và Công ty giống Lâm nghiệp trung ương Ngoài ra, các đơn vị như Trung tâm khoa học sản xuất Lâm nghiệp Quảng Ninh, Xí nghiệp giống Thành phố Hồ Chí Minh, và Trường đại học Lâm nghiệp cũng tham gia vào lĩnh vực này Một số tỉnh và địa phương đã thành lập phòng nuôi cấy mô để hỗ trợ công tác giống cây trồng và đã đạt được những thành công bước đầu.
Nuôi cấy mô đã trở thành phương pháp phổ biến trong nhân giống các giống Bạch đàn nhập nội và các dòng vô tính Bạch đàn lai, Keo lai với năng suất cao tại Việt Nam Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng đã thành công trong việc phát triển kỹ thuật nuôi cấy in vitro cho Keo lai, Bạch đàn và nhiều giống cây rừng khác, góp phần cải thiện chất lượng giống cây trồng.
Dương Mộng Hùng (1993) đã tiến hành nghiên cứu nuôi cấy mô cho hai loài Bạch đàn E camaldulensis và E urophylla từ cây trội, đạt được một số cây mô Bạch đàn với hệ số nhân chồi từ 1 đến 2 lần.
Năm 1995, nghiên cứu của Nguyễn Ngọc Tân và cộng sự về nhân nhanh Keo lai bằng phương pháp nuôi cấy mô cho thấy việc sử dụng môi trường MS bổ sung BAP 2mg/l giúp tăng hệ số nhân chồi lên 3-4 lần so với các nồng độ khác Cây mô có thể ra rễ trực tiếp trên nền cát phun sương trong nhà kính với tỷ lệ ra rễ trên 70% khi ngâm trong IBA hoặc ABT, đồng thời rút ngắn thời gian tạo rễ Đoàn Thị Mai và cộng sự (2000) cũng đã thành công trong việc nuôi cấy mô giống Bạch đàn lai U 29 C 3, với tỷ lệ bật chồi cao nhất từ tháng 5 đến tháng 8 và môi trường MS bổ sung 0,5mg/l BAP cho số chồi trung bình đạt 16,6 chồi/cụm, trong khi môi trường ra rễ với 1,0mg/l IBA đạt tỷ lệ ra rễ tới 83,8%.
Vũ Ngọc Phượng và cộng sự (Viện sinh học nhiệt đới) đã thành công trong việc nhân giống in-vitro cây Tre tàu (Sinocalamus latiflorus) và Tre mạnh tông (Dendrocalamus asper) vào năm 2002, sử dụng mẫu hạt được khử trùng bằng Ca(OCl)2 và HgCl2 Kết quả cho thấy môi trường MS bổ sung BAP 3mg/l và Kinetin 1mg/l hiệu quả trong việc tạo chồi, trong khi môi trường MS bổ sung BAP 2mg/l và Kinetin 1mg/l là tốt nhất cho nhân chồi Đoàn Thị Mai và cộng sự (2005) đã xác định môi trường MS cải tiến với 1.0mg/l BAP và 0.5mg/l Kinetin là thích hợp cho cây trầm, và môi trường MS/2 cải tiến bổ sung 2.0mg/l IBA là tốt nhất cho ra rễ Cũng trong năm 2005, Đoàn Thị ái Thuyền và cộng sự đã nhân giống thành công cây Hông từ chồi đỉnh và chồi bên, với môi trường MS cải tiến bổ sung 30g/l đường, 8g/l Agar và 5mg/l BAP cho việc tạo chồi và nhân nhanh chồi.
0.1mg/l NAA Môi trường tạo rễ và cây con hoàn chỉnh tối ưu là MS/2 + 20g/l đường + 0.1mg/l NAA + 1.0g/l than hoạt tính [23]
Hồ Văn Giảng và cộng sự (2006) đã phát triển qui trình nhân giống cây Dó trầm thông qua kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào Họ xác định rằng môi trường tối ưu cho nhân chồi là MS cải tiến với 0,3mg/l BAP, 20g/l sucrose và 6g/l agar, đạt hệ số nhân chồi 4,2 chồi/cụm Đối với quá trình ra rễ, môi trường WMP kết hợp với 0,3mg/l NAA, 20g/l sucrose và 6g/l agar cho tỷ lệ ra rễ đạt 88,7%, trong khi tỷ lệ cây mô sống khi đưa ra vườn ươm đạt 98%.
Loài Tếch ( Tectona grandis Linn)
1.5.1 Đặc điểm sinh vật học và sinh thái học
* Đặc điểm sinh vật học
Tếch (Tectona grandis Linn) là một loại cây gỗ lớn, có thể cao đến 40m và đường kính lên tới 100cm Thân cây có múi và gốc bạnh vè, với vỏ màu xám vàng Cành non của cây có hình vuông và phủ một lớp lông hình sao màu nâu vàng nhạt Lá cây mọc đối, có hình trái xoan hoặc hình trứng với đầu nhọn, dài từ 20 đến 60cm và rộng từ 20 đến 40cm Mặt trên của lá nhẵn, trong khi mặt dưới có lớp lông hình sao màu vàng nhạt, với cuống lá dài gần 5cm và không có lá kèm.
Hoa tự hình viên chuỳ lớn, với chiều dài 40cm và đường kính trên 35cm Lá bắc nhỏ, có hình lưỡi mác Hoa nhỏ, đài hình chuông với 5 răng đều, bề mặt phủ đầy lông Tràng hoa màu trắng, dài 5 – 6mm, có 5 – 6 cánh gần tròn, bên ngoài cánh phủ lông và các tuyến nhỏ Hoa có 5 – 6 nhị hơi lộ ra ngoài, bầu hình nón, vòi ngắn và đầu nhuỵ xẻ đôi.
Quả hạch hình cầu, đường kính quả gần 2cm, phủ lông hình sao Đài phát triển bao kín quả Mỗi quả có từ 1- 2, đôi khi 3 – 4 hạt [1]
* Đặc điểm sinh học và sinh thái học
Cây Tếch ưa sáng, cần độ chiếu sáng từ 70-100% và phát triển tốt trong khí hậu nhiệt đới mưa mùa với hai mùa rõ rệt Nhiệt độ trung bình hàng năm dao động từ 20-27°C và lượng mưa hàng năm khoảng 1200-3800mm, không có sương muối Dưới điều kiện sống lý tưởng, cây Tếch có thể cao tới 18m và đường kính đạt 22cm Cây sẽ rụng lá vào mùa khô, ra hoa từ tháng 6 đến tháng 8 và quả chín từ tháng 11 đến tháng 2 năm sau.
Cây Tếch có khả năng thích nghi với nhiều loại đất khác nhau, bao gồm granit, sa thạch và phiến thạch Cây phát triển mạnh mẽ trên đất sâu, ẩm, thoáng khí và thoát nước tốt Đặc biệt, cây có khả năng tái sinh chồi và hạt rất hiệu quả.
1.5.2 Giá trị kinh tế của Tếch
Tếch là một loại cây gỗ lớn, phát triển nhanh chóng và có gỗ với kết cấu mịn, vân thớ đẹp cùng mùi thơm đặc trưng Gỗ Tếch có khả năng chống mối mọt, làm cho nó trở thành nguyên liệu lý tưởng cho đồ mộc cao cấp và có giá trị xuất khẩu cao.
1.5.3 Các nghiên cứu về Tếch
Tếch (Tectona grandis) là loài cây thuộc họ Cỏ roi ngựa (Verbenaceae), thường phân bố trong các khu rừng nhiệt đới tại Miến Điện, Ấn Độ, Thái Lan, Lào Loài cây này cũng đã được trồng rộng rãi ở nhiều quốc gia khác như Indonesia, Malaysia, Philippines, Campuchia, cùng một số nước ở Châu Phi và Châu Mỹ.
Cây Tếch là loài cây thích hợp với khí hậu nhiệt đới mưa mùa, yêu cầu lượng mưa trung bình từ 1200-2500mm và có hai mùa rõ rệt Loại cây này có khả năng chịu lửa tốt và ít bị sâu bệnh tấn công Gỗ Tếch có trọng lượng trung bình, thớ gỗ to và mịn, không bị cong vênh hay nứt nẻ, đồng thời không bị mối mọt và nấm mốc phá hoại Đặc biệt, gỗ Tếch còn có khả năng chịu nước mặn và không bị hà ăn.
Tếch là loại cây có giá trị kinh tế cao, được trồng trên diện tích lớn, đặc biệt ở Java (Indonesia) với khoảng 1 triệu hecta, chiếm 45% diện tích rừng trồng tại đây Tính đến năm 2004, diện tích rừng Tếch ở khu vực Châu Á - Thái Bình Dương đã đạt tới 25 triệu hecta.
Năm 1989, Indonesia xuất khẩu 46.000 m³ gỗ Tếch, mang về doanh thu 29,4 triệu USD Thái Lan đạt xuất khẩu gỗ Tếch 97.000 m³ vào năm 1980 Năm 1992, Sabah (Malaysia) xuất khẩu chỉ 12 m³ gỗ Tếch nhưng thu được 4.600 USD, trung bình 383 USD/m³ Tại Myanmar, năm 2000 có 470.356 m³ gỗ Tếch được khai thác, chiếm 25% tổng sản phẩm gỗ của nước này (Saw Eh Dah, 2004).
Giá gỗ Tếch phụ thuộc vào chất lượng, đường kính, tuổi thọ và xuất xứ của gỗ Gỗ có nguồn gốc từ Myanmar, thường được dùng để sản xuất bàn ghế, có giá cao nhất khoảng 2000USD/m3 Ngược lại, gỗ tỉa thưa và gỗ nhỏ từ các rừng trồng ở Trung Mỹ có giá thấp nhất, chỉ khoảng 200USD/m3 Gỗ có đường kính lớn hơn 40cm có giá bán khoảng 300USD/m3, trong khi gỗ 25 năm đã chọn lựa có giá khoảng 600USD/m3, có thể lên tới 900USD/m3 trong một số trường hợp Tại Brazil, giá gỗ lớn như cây dái ngựa có đường kính trên 80cm chỉ dao động từ 25-60USD/m3.
Tếch, với giá trị kinh tế cao, đang được phát triển mạnh mẽ trên toàn thế giới Tại Thái Lan, chương trình cải thiện giống Tếch đã được triển khai từ năm 1982, bao gồm các khâu khảo nghiệm, bảo quản hạt, nhân giống bằng giâm hom, kỹ thuật lâm sinh và khảo nghiệm hậu thế (Verapong Suangtho, Sunanta Kajornsrichon, Tawin Kusolkul) Indonesia cũng đã bắt đầu nghiên cứu về nhân giống sinh dưỡng (S.N Widiyanto) Bên cạnh đó, nhiều công trình cải thiện giống Tếch cũng đã được công bố ở các quốc gia khác như Miến Điện (Htun Kaufmanm 1980, Gyi 1993) và Trung Quốc (Bingchao & Shuzhen 1993).
Theo nghiên cứu của Erik D Kjaer và G Sam Foster (1999), việc cải thiện giống và cung cấp giống Tếch cho trồng rừng có thể nâng cao năng suất rừng trồng lên 10% và gia tăng giá trị rừng trồng từ 15-20% so với phương pháp trồng từ hạt.
Kjaer Lauridsen và Wellendorf (1995) đã tiến hành khảo nghiệm loài và xuất xứ quốc tế cho Tếch, nhưng kết quả không rõ ràng Tại mỗi khảo nghiệm, xuất xứ có sinh trưởng tốt lại không đạt chất lượng thân cây cao, trong khi xuất xứ khác có chất lượng tốt nhưng sinh trưởng không nổi bật Các xuất xứ từ Thái Lan và Lào có chất lượng thân cây tương đối tốt, nhưng năng suất chưa cao, trong khi xuất xứ Indonesia có năng suất cao nhưng chất lượng thân cây lại kém.
Cây Tếch được nhập và trồng thăm dò ở nước ta vào khoảng những năm
Vào những năm 30 của thế kỷ 20, cây Tếch được thử nghiệm trồng tại các công viên và đường phố ở nhiều tỉnh như Hà Giang, Tuyên Quang, Sơn La, và Sài Gòn Đặc biệt, tại Lộc Ninh, tỉnh Bình Phước, cây Tếch đã được trồng thành các khu rừng nhỏ Đến những năm 60, nguồn giống từ Lộc Ninh đã được sử dụng để trồng thành công một khu rừng Tếch 200 ha tại Định Quán, tỉnh Đồng Nai và một khu rừng 5 ha tại Eak – Mat, tỉnh Đắc Lắc Sau năm 1975, cây Tếch tiếp tục được mở rộng trồng tại nhiều lâm trường ở miền Đông Nam Bộ và Tây Nguyên như Đồng Nai, Bình Phước, Tây Ninh, Đắc Lắc, Gia Lai, và Kom Tum.
Năm 1980 Lê Đình Khả đã tiến hành chọn cây trội và xây dựng phương án khoanh nuôi rừng giống cho vùng Định Quán.
Từ năm 1990 đến 1995, tại rừng trồng Tếch ở Là Ngà, Đồng Nai, Hoàng Chương cùng các cộng sự đã tiến hành chọn lọc 36 cây trội và xây dựng vườn giống thông qua phương pháp ghép Tuy nhiên, kết quả đạt được chưa như mong đợi.
Mục tiêu, nội dung và phương pháp nghiên cứu
Mục tiêu nghiên cứu
- Xác định được phương thức và các loại môi trường thích hợp cho việc nhân giống Tếch bằng nuôi cấy mô tế bào.
- Xác định khả năng nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào cho một số dòng Tếch.
Đối tượng nghiên cứu
Cây ghép 4 tháng tuổi thuộc dòng Tếch, có nguồn gốc từ Malaysia, Indonesia, Thái Lan và Việt Nam, đang được trồng tại vườn ươm của Trung tâm Nghiên cứu Giống cây rừng thuộc Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam, xã Đông Ngạc, huyện Từ Liêm, Hà Nội.
Nội dụng nghiên cứu
Để thực hiện được mục tiêu thì nội dung nghiên cứu của đề tài là:
1 Nghiên cứu ảnh hưởng của các loại hoá chất khử trùng và mùa vụ đến mÉu cÊy.
2 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số Cytokinin (BAP, Kinetin) và tổ hợp Cytokinin và Auxin đến khả năng nhân chồi của Tếch.
3 Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ của các Auxin (IBA, NAA) và thời vụ đến khả năng ra rễ trong ống nghiệm và ở vườn ươm.
4 So sánh khả năng vào mẫu, nhân chồi và ra rễ của 10 dòng Tếch có nguồn gốc khác nhau.
Phương pháp nghiên cứu
Mẫu nuôi cấy được lấy từ chồi bên của cây ghép 4 tháng tuổi, với chồi 20 ngày tuổi có sinh trưởng tốt và không bị sâu bệnh Chồi được cắt bỏ một phần cuống lá và toàn bộ phiến lá, có chiều dài từ 3-6cm, mang từ 1-2 nách lá.
2.4.2 Địa điểm, điều kiện bố trí thí nghiệm
Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng nuôi cấy mô của Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng thuộc Viện khoa học Lâm nghiệp, Đông Ngạc, Từ Liêm, Hà Nội Điều kiện thí nghiệm được tuân thủ theo các tiêu chuẩn và quy định kỹ thuật của phòng nuôi cấy mô.
+ Số giờ chiếu sáng trong ngày là 10h/ngày.
+ Cường độ ánh sáng khoảng 2000-3000 Lux.
+ Các dụng cụ sử dụng được hấp trong nồi tuyệt trùng có áp suất là 1.2- 1.5atm, nhiệt độ là 120-130 O C.
+ PH của môi trường nuôi cấy 5,6-5,8.
Cũng tương tự các loài cây Lâm nghiệp khác như Keo, Bạch đàn, Thông
…việc nhân giống in vitro cho Tếch cũng được tiến hành bằng phương pháp tạo cụm chồi với sơ đồ tổng quát sau:
Sơ đồ 3.1: Các bước nhân giống in vitro
* Cấy khởi động:Là giai đoạn khử trùng đưa mẫu vào nuôi cấyin vitro.
Trong giai đoạn này, cần đảm bảo các yêu cầu quan trọng như tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao và mô tồn tại, tái sinh tốt Để đạt được điều này, quá trình khử trùng mẫu bằng chất hóa học có hoạt tính diệt nấm khuẩn cần được thực hiện theo các bước cụ thể.
- Rửa dưới vòi nước chảy.
- Ngâm trong dung dịch khử trùng khoảng 5-15 phút.
- Đổ bỏ dung dịch khử trùng, rửa lại bằng nước cất vô trùng từ 3-5 lần.
- Cấy mẫu vào môi trường tái sinh chồi ban đầu, các thao tác được thực hiện trong buồng cấy vô trùng.
Giai đoạn tạo và nhân nhanh chồi là quá trình kích thích mô cấy để hình thành nhiều chồi mới Để đạt hiệu quả cao nhất, việc xác định môi trường và điều kiện nuôi cấy phù hợp là rất quan trọng.
Để tái sinh chồi ban đầu từ mẫu nuôi cấy, cần tiến hành cấy trên các môi trường khác nhau như WPM, MS, B5 Các môi trường này được bổ sung 7g/l agar và 30g/l đường, đồng thời điều chỉnh độ pH đến 5,8.
Nhân chồi là quá trình quan trọng trong thí nghiệm tái sinh chồi, nhằm tối ưu hóa môi trường cho việc nhân nhanh chồi Điều này được thực hiện bằng cách điều chỉnh thành phần chất khoáng và thử nghiệm sự kết hợp hoặc riêng lẻ của các Cytokinin như BAP và Kinetin.
Giai đoạn tạo rễ và huấn luyện là quá trình chuyển chồi từ môi trường nhân nhanh sang môi trường tạo rễ, nhằm tạo ra cây con hoàn chỉnh hoặc phát triển rễ trực tiếp trên nền cát trong nhà kính Việc chọn chồi đạt tiêu chuẩn về chiều cao và chất lượng nuôi cấy là rất quan trọng để xác định môi trường thích hợp cho sự phát triển của cây con Sau khi hoàn thành, cây con sẽ được huấn luyện để thích nghi với các điều kiện bên ngoài.
Đưa cây in vitro ra điều kiện bên ngoài đòi hỏi tìm kiếm giá thể phù hợp nhằm nâng cao tỷ lệ sống sót của cây con Các thí nghiệm về thành phần ruột bầu sẽ được tiến hành để xác định điều kiện tối ưu cho sự phát triển của cây khi chuyển ra môi trường tự nhiên.
2.4.4 Phương pháp bố trí thí nghiệm
Trong nuôi cấy mô tế bào, việc lựa chọn môi trường, loại hoá chất và nồng độ chất điều hoà sinh trưởng rất đa dạng và phong phú Sự kết hợp giữa các yếu tố này cần dựa trên kinh nghiệm và kết quả nuôi cấy mô của một số loài cây lâm nghiệp như Keo và Bạch đàn.
Các thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp khối ngẫu nhiên đầy đủ với 3 lần lặp lại Thí nghiệm 1-3 tiến hành song song với 4 dòng cây trội Tếch ngẫu nhiên, quan sát trên 45 mẫu cấy Thí nghiệm 4-8 tập trung vào 1 dòng cây trội Tếch với 50 mẫu quan sát Thí nghiệm 9-11 khảo sát 10 dòng trội Tếch từ Thái Lan, Việt Nam, Inđônêsia và Malaysia Các mẫu thí nghiệm được kiểm tra hàng tuần để loại bỏ mẫu nhiễm và theo dõi diễn biến của mẫu cấy.
Thí nghiệm 1 nghiên cứu ảnh hưởng của các loại hóa chất đến quá trình khử trùng mẫu, sử dụng ba loại hóa chất: HgCl2 với nồng độ 0.05% và 0.1%, Ca(OCl)2, và H2O2 (ôxi già) Quá trình khử trùng được thực hiện trong các khoảng thời gian 5, 10 và 15 phút để đánh giá hiệu quả của từng hóa chất.
Do chưa xác định được môi trường tối ưu cho giai đoạn cấy khởi động, mẫu đã được khử trùng và cấy vào môi trường MS cải tiến với 0.5mg/l BAP Các chỉ tiêu quan sát bao gồm số mẫu nhiễm, số mẫu bật chồi và số mẫu chết sau 30 ngày nuôi cấy.
Thí nghiệm 2 Xác định thời điểm lẫy mẫu thích hợp
Các thí nghiệm được tiến hành theo 4 mùa trong năm.
- Hạ: tháng 6-2007 Chỉ tiêu quan sát là số mẫu nhiễm, số mẫu bật chồi và số mẫu chết sau
Thí nghiệm 3 Xác định môi trường tái sinh chồi ban đầu
Thí nghiệm được tiến hành trên ba loại môi trường MS, WPM và B5 có bổ sung thêm một số chất khoáng và Vitamin (Môi trường cải tiến)
Công thức 1: Môi trường MS* (Murashige và Skoog Medium).
Công thức 2: Môi trường WPM* (McCown Woody Plant Medium). Công thức 3: Môi trường B5* (Micro-Macro Gamborg’s B5 medium).
Chỉ tiêu quan sát là hệ số nhân chồi, chiều dài chồi và số lá/chồi.
Thí nghiệm 4:ảnh hưởng của các Cytokinin (BAP và Kinetin) riêng rẽ đến khả năng nhân nhanh và kéo dài chồi
Chất điều hoà sinh trưởng Công thức Thành phần môi trường §C MS*
K3 MS* + 1,0 mg/l kinetin K4 MS* + 1,5 mg/l kinetin Kinetin
Chỉ tiêu quan sát là hệ số nhân chồi, chiều dài chồi và số lá/chồi.
Thí nghiệm 5: ảnh hưởng của tổ hợp BAP và NAA đến khả năng nhân nhanh và kéo dài chồi
Chất điều hoà sinh trưởng Công thức Thành phần môi trường
BAP NAA Đối chứng ĐC MS*
0.1 BA1 MS*+0,3mg/l BAP +0,1mg/l NAA
0.5 BA2 MS*+0,3mg/l BAP +0,5mg/l NAA
1.0 BA3 MS*+0,3mg/l BAP +1,0mg/l NAA
1.5 BA4 MS*+0,3mg/l BAP +1,5mg/l NAA
0.1 BA5 MS*+0,5mg/l BAP +0,1mg/l NAA
0.5 BA6 MS*+0,5mg/l BAP +0,5mg/l NAA
1.0 BA7 MS*+0,5mg/l BAP +1,0mg/l NAA
1.5 BA8 MS*+0,5mg/l BAP +1,5mg/l NAA
0.1 BA9 MS*+0,7mg/l BAP +0,1mg/l NAA
0.5 BA10 MS*+0,7mg/l BAP +0,5mg/l NAA 1.0 BA11 MS*+0,7mg/l BAP +1,0mg/l NAA 1.5 BA12 MS*+0,7mg/l BAP +1,5mg/l NAA Chỉ tiêu quan sát là hệ số nhân chồi, chiều dài chồi và số lá/chồi.
Thí nghiệm 6: ảnh hưởng của các Auxin (IBA và NAA) riêng rẽ đến tỷ lệ ra rễ trong ống nghiệm
Các chồi đạt tiêu chuẩn cao trên 2.0 cm, cứng cáp và khỏe mạnh, sẽ được cấy vào môi trường ra rễ 1/2MS*, được bổ sung thêm một số chất kích thích sinh trưởng với nồng độ khác nhau.
Hoá chất Công thức Nồng độ
(mg/l) Thành phần Đối chứng ĐC 0 MS*/2
Chỉ tiêu quan sát là tỷ lệ ra rễ, số rễ trung bình/chồi và chiều dài trung b×nh/rÔ.
Thí nghiệm 7 nghiên cứu ảnh hưởng của IBA và NAA đến tỷ lệ ra rễ ở vườn ươm Các chồi đạt tiêu chuẩn cao trên 2.0 cm, khỏe mạnh được xử lý bằng thuốc TTG chứa Auxin với các nồng độ khác nhau để kích thích ra rễ Sau đó, chồi được cấy vào nền cát hoặc bầu đất đã được khử trùng bằng thuốc tím và Benlat.
Hoá chất Công thức Nồng độ Đối chứng ĐC 0
Chỉ tiêu quan sát là tỷ lệ ra rễ, số rễ trung bình/chồi và chiều dài trung b×nh/rÔ.
Thí nghiệm 8:ảnh hưởng của nhân tố mùa vụ đến tỷ lệ ra rễ
Phương pháp thống kê và sử lí số liệu
Các chỉ tiêu theo dõi và thu thập
1, Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) = Tổng số mẫu nhiễm x 100 Tổng số mẫu ban đầu
2, Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%) = Tổng số mẫu nảy chồi x 100 Tổng số mẫu cấy vào
3, Chiều cao trung bình (Cm) = Tổng chiều cao chồi x 100 Tổng số mẫu ban đầu
4, Hệ số nhân (Lần) = Tổng số chồi mới hình thành x 100 Tổng số chồi ban đầu
5, Tỷ lệ ra rễ (%) = Tổng số chồi ra rễ x 100 Tổng số chồi nuôi cấy
6, Chiều dài rễ trung bình (cm) = Tổng chiều dài rễ
Số liệu thu được nghi chép trong bảng biểu và xử lý trên máy tính bằng phần mềm thống kê Excel và SPSS.
Một số công thức tính toán như sau:
Nếu nhân tố A tác động đồng đều lên kết quả thí nghiệm thì giả thuyết
Ho đặt ra là: Ho: 1=2=…a=
Nhân tố A có ảnh hưởng không đồng đều đến kết quả thí nghiệm, cho thấy ít nhất một số trung bình tổng thể i khác biệt so với các số trung bình tổng thể khác.
Nếu giả thuyết Ho được xác nhận, biến ngẫu nhiên Vn sẽ có phân bố chi bình phương với k = n - a bậc tự do, trong khi Va cũng sẽ có phân bố chi bình phương với k.
= a-1 bậc tự do vì vậy biến ngẫu nhiên:
(a-1)V n Với V a là tổng biến động do nhân tố A và V n là tổng biến động ngẫu nhiên
Phân bố F với k 1 =a-1 và k 2 = n-a bậc tự do.
Nếu F A tính theo (1) F 0.5 tra bảng với k 1 =a-1 và k 2 = n-a bậc tự do thì giả thuyết Ho đợc chấp nhận, ngược lại nếu F A tính theo (1)> F 0.5 thì giả thuyết
Ho bị bác bỏ chỉ ra rằng nhân tố A ảnh hưởng không đồng đều đến kết quả thí nghiệm, điều này cho thấy việc phân cấp các công thức thí nghiệm là rất quan trọng.
Phương pháp phân tích phương sai trên dựa vào phần mềm máy tính SPSS11.5.
Kiểm tra thống kê nhằm đánh giá ảnh hưởng của các nhân tố đến các chỉ tiêu nghiên cứu được thực hiện thông qua các thủ tục phân tích phương sai một nhân tố và hai nhân tố, với mức ý nghĩa α = 0.05.
*Phân tích phương sai một nhân tố
Giả thiết Ho là 1 = 2 = 3=…… i=…….= k trong đó i là trung bình tổng thể thứ i mà từ đó mẫu thứ i được rút ra.
Trong phân tích phương sai thì kết quả được trình bày dưới dạng 1 bảng tính gọi là bảng phân tích phương sai:
(MS) F Xác suất của F (sig) Nh©n tè A V A a-1 S 2 a = V A /a-1 S 2 a / S 2 N
Trong phân tích phương sai, nếu giá trị thống kê F có mức ý nghĩa (sig) ≤ 0.05, giả thuyết Ho bị bác bỏ, cho thấy các công thức thí nghiệm khác nhau có ảnh hưởng khác nhau đến kết quả Ngược lại, nếu sig > 0.05, giả thuyết Ho được chấp nhận, nghĩa là các công thức thí nghiệm không ảnh hưởng đến kết quả Để so sánh các công thức và xác định công thức có ảnh hưởng nổi bật nhất, tiêu chuẩn Duncan được áp dụng, phân chia các giá trị trung bình thành các tập con với các số trung bình thuần nhất Kết quả cho thấy công thức có ảnh hưởng trội nhất.
* Phân tích phương sai hai nhân tố
Giả thuyết thường được cho là:
H 0A : i = 0 với mọi i (và đối thuyết H 1A ít nhất có một i 0)
H 0B : j = 0 với mọi j (và đối thuyết H 1B ít nhất có một j0)
Bảng phân tích phương sai có dạng:
BËc tù do (df) Phương sai (MS) F
Trong phân tích phương sai, nếu giá trị thống kê F có mức ý nghĩa (sig) ≤ 0.05, giả thuyết H0A bị bác bỏ, cho thấy nhân tố A ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm; ngược lại, nếu sig > 0.05, H0A được chấp nhận, nghĩa là nhân tố A không có ảnh hưởng Tương tự, nhân tố B cũng được đánh giá theo cách này Để so sánh nhiều cặp công thức và xác định công thức có ảnh hưởng nổi bật nhất, tiêu chuẩn Duncan được áp dụng, phân chia các giá trị trung bình thành các tập con đồng nhất Kết quả từ bảng phân tích cho thấy công thức có ảnh hưởng trội nhất.