MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Mục tiêu
Tìm được 01-02 chỉ thị SSR có liên quan đến tính trạng sinh trưởng của bạch đàn lai, làm cơ sở cho chọn giống sớm.
Nội dung
- Thu thập các thông tin về các cặp mồi SSR với trình tự xuôi và trình tự ngược
- Sàng lọc các mồi SSR để tìm ra các cặp mồi SSR đa hình
- Xác định 01 – 02 cặp mồi liên quan đến sinh trưởng nhanh và chậm.
Vật liệu nghiên cứu
2.3.1 Vật liệu sử dụng để sàng lọc các cặp mồi SSR đa hình
22 mẫu sử dụng để sàng lọc cặp mồi SSR đa hình được lấy từ hiện trường khảo nghiệm Hòa Bình (trồng năm 2012) và Bắc Giang (trồng năm
2012) (bảng 2.1) Trong đó, hiện trường Bắc Giang là kế thừa của đề tài
“Nghiên cứu lai tại giống một số loài bạch đàn, keo, tràm, thông” giai đoạn 3 (2011-2015) do TS Nguyễn Việt Cường làm chủ nhiệm đề tài
Bảng 2.1 Danh mục 22 mẫu đƣợc sử dụng để sàng lọc cặp mồi đa hình
STT Dòng Địa điểm STT Dòng Địa điểm
1 UE75 LS - Hòa Bình 12 UE189 Yên Lập
2 UE269 LS - Hòa Bình 13 UE163 Yên Lập
3 UE113 LS - Hòa Bình 14 EU204 Yên Lập
4 UE55 LS - Hòa Bình 15 UC33 LS - Hòa Bình
5 UE57 LS - Hòa Bình 16 CU1 LS - Hòa Bình
6 UE63 LS - Hòa Bình 17 UC16 Yên Lập
7 UE89 LS - Hòa Bình 18 UC55 Yên Lập
8 UE69 Yên Lập 19 CU82 Yên Lập
9 EU104 LS - Hòa Bình 20 UC47 Yên Lập
10 EU91 Yên Lập 21 CU28 Yên Lập
11 UE16 Yên Lập 22 UC15 Yên Lập
2.3.2 Vật liệu sử dụng để phân tích sự liên quan của các cặp mồi SSR với tính trạng sinh trưởng của bạch đàn lai Đề tài sử dụng các dòng bạch đàn là con lai giữa Bạch đàn urô với Bạch đàn liễu tại hiện trường Phú Thọ và Hòa Bình để phân tích sự tương quan của các cặp mồi với tính trạng sinh trưởng (bảng 2.3) Trong nghiên cứu này, đề tài phân tích sự tương quan dựa trên cơ sở tính trạng sinh trưởng – cụ thể là năng suất được tính tại tuổi 3 của 60 dòng bạch đàn lai khảo nghiệm năm
2013, thu thập số liệu sinh trưởng năm 2016, các dòng bạch đàn này có năng suất khác nhau, dao động từ 2,5 m 3 /ha/năm đến 43,8 m 3 /ha/năm
Nghiên cứu này sử dụng 9 dòng bạch đàn lai E urophylla x E exserta (UE) để kiểm chứng các chỉ thị liên quan đến sinh trưởng nhanh Dữ liệu sinh trưởng được thu thập từ các giai đoạn nghiên cứu khác nhau, cụ thể là từ đề tài "Nghiên cứu lai tạo một số loài bạch đàn, keo, tràm, thông" giai đoạn 1 (2001–2005) và giai đoạn 2 (2006–2010), với số liệu đo lường vào năm 2006 và 2010.
Bảng 2.2 Các dòng bạch đàn lai sinh trưởng nhanh và chậm ở Bầu Bàng
TT Dòng Năng suất (m 3 /ha/năm) Đánh giá sinh trưởng Năm 2006 Năm 2010
(Ghi chú: Chi tiết chọn dòng nhanh chậm theo khảo nghiệm hậu thế dòng vô tính ở phụ lục 4, 5)
Bảng 2.3 Sinh trưởng của 60 dòng bạch đàn lai được sử dụng trong nghiên cứu (6/2013 – 9/2016)
(m 3 /ha/năm) Địa điểm khảo nghiệm Xtb V% Xtb V% Xtb V%
37 UC16 12,3 5,9 15,2 4,6 90,3 10,2 45,3 Yên Lập - Phú Thọ
38 UC55 10,9 9,1 13,6 7,0 63,4 12,0 30,7 Yên Lập - Phú Thọ
39 CU82 10,7 8,5 14,1 5,9 63,4 11,4 32,9 Yên Lập - Phú Thọ
40 UC47 10,6 5,6 13,4 6,4 59,1 10,7 30,7 Yên Lập - Phú Thọ
41 CU28 10,6 12,6 13,2 14,1 58,2 14,6 29,2 Yên Lập - Phú Thọ
42 UC15 10,2 11,8 12,6 9,6 51,5 12,5 26,7 Yên Lập - Phú Thọ
43 CU122 10,1 7,3 12,3 7,9 49,2 10,7 23,8 Yên Lập - Phú Thọ
44 UE69 9,9 10,9 12,8 11,1 49,2 12,6 22,1 Yên Lập - Phú Thọ
45 EU91 10,0 10,7 12,4 11,5 48,7 12,3 21,0 Yên Lập - Phú Thọ
46 UE20 10,1 9,3 12,1 12,2 48,4 11,7 23,5 Yên Lập - Phú Thọ
47 UC5 9,9 9,1 11,7 10,4 45,0 10,8 21,0 Yên Lập - Phú Thọ
48 UC27 9,7 13,6 11,5 10,2 42,5 13,4 19,8 Yên Lập - Phú Thọ
49 CU98 9,5 11,7 11,1 12,4 39,3 13,2 17,7 Yên Lập - Phú Thọ
50 CU111 9,1 8,0 11,3 9,6 36,7 11,7 16,5 Yên Lập - Phú Thọ
51 CU103 9,0 15,8 10,7 12,0 34,0 15,0 15,9 Yên Lập - Phú Thọ
52 UC64 8,5 13,7 11,2 12,1 31,8 14,4 15,4 Yên Lập - Phú Thọ
53 CU81 8,6 13,5 9,9 15,6 28,7 15,5 12,4 Yên Lập - Phú Thọ
54 UC44 8,5 12,1 9,8 11,9 27,8 13,5 13,5 Yên Lập - Phú Thọ
55 CU61 8,5 14,8 9,3 14,2 26,4 14,3 11,9 Yên Lập - Phú Thọ
56 UE72 11,3 6,3 14,4 5,9 72,2 10,9 33,7 Yên Lập - Phú Thọ
57 UE16 10,6 8,2 13,9 8,0 61,3 11,5 24,4 Yên Lập - Phú Thọ
58 UE189 10,2 4,6 13,5 5,0 55,1 9,3 26,7 Yên Lập - Phú Thọ
59 UE163 10,2 7,0 12,3 9,6 50,2 9,5 25,2 Yên Lập - Phú Thọ
60 EU204 10,1 7,6 12,4 10,2 49,6 11,2 22,9 Yên Lập - Phú Thọ
2.3.3 Các cặp mồi SSR sử dụng trong nghiên cứu
Nghiên cứu này đã tổng hợp 205 cặp mồi từ các bài báo liên quan và lựa chọn thêm một số cặp mồi từ dữ liệu EMBRA trên Gene Bank (Phụ lục 2).
Hóa chất và thiết bị
To extract total DNA, a 4% CTAB buffer is used, which includes 10ml of 1M Tris pH 8, 28ml of 5M NaCl, 4ml of 0.5M EDTA pH 8, 2g of CTAB, 1ml of 14M BME, and 67ml of deionized water Additional necessary chemicals include isopropanol, absolute alcohol, 70% alcohol, a chloroform:isoamyl alcohol mixture (24:1), RNase, deionized water, distilled water, and liquid nitrogen, among others.
For DNA electrophoresis on agarose gel, the required chemicals include a 50X TAE buffer solution, which consists of 121 g of Tris base, 28.6 ml of glacial acetic acid, 50 ml of 0.5M EDTA (pH 8.0), and deionized water to make a total of 500 ml Additionally, a 1% agarose solution is prepared by dissolving 1 g of agarose in 100 ml of 1X TAE buffer Ethidium bromide (EtBr) is used at a concentration of 0.5 µg/ml, along with a loading buffer containing Bromophenol Blue, Xylene Cyanol FF, and glycerol for sample preparation.
- Hóa chất chạy PCR: Taq Polymerase, Buffer, dNTPs
To prepare a 5% polyacrylamide gel for electrophoresis, combine 225.25g of urea, 25ml of 10XTBE buffer, 23.65g of acrylamide, and 1.25g of bis-acrylamide, then add distilled water to a final volume of 500ml Include TEMED and a 10% APS solution (1g APS in 10ml distilled water) for polymerization The 10XTBE buffer consists of 54g of Tris base, 27.5g of boric acid, and 20ml of 0.5M EDTA (pH 8.0), adjusted to 500ml with distilled water and sterilized For sample loading, use a loading dye made from 0.1ml of 5M NaOH, 47.5ml of 95% formamide, 25mg of xylene cyanol FF, and 25mg of bromophenol blue, diluted to 50ml with distilled water Additional chemicals include AgNO3, sodium carbonate, sodium thiosulfate, formaldehyde, formamide, and a DNA ladder standard for size reference.
The article discusses various essential laboratory equipment, including the PCR system 9700 from Applied Biosystems (USA), the PowerPac 300 agarose gel electrophoresis system from Bio-Rad (USA), the Mini-Transilluminator DNA viewer from Bio-Rad (USA), and the Amersham Pharmacia Biotech imaging system from Sweden It also mentions additional devices such as the Bio-Rad ATTA electrophoresis machine, IKA's Minishaker vortex mixer from Germany, magnetic stirrers, centrifuges, and incubators, among other essential laboratory tools.
Phương pháp nghiên cứu
2.5.1 Phương pháp tách chiết ADN tổng số từ mẫu lá
ADN tổng số được tách chiết bằng phương pháp CTAB có cải tiến:
- Cân 200mg mẫu lá và nghiền cẩn thận trong nitơ lỏng thành dạng bột mịn, chuyển ngay vào ống eppendorf 2ml
- Thêm 0,9 ml đệm tách (CTAB 4%), trộn đều, ủ ở 65 0 C trong 60 phút,
- Thêm 0,8ml C:I (24:1), đảo đều trong 10 phút
- Ly tâm 12.000rpm trong 15 phút
- Hút dịch nổi sang ống mới, thêm 0,6ml C:I (24:1), đảo đều trong 10 phút, ly tâm 12.000rpm trong 15 phút
- Hút dịch nổi sang ống mới, thêm 0,8ml isopropanol lạnh, ủ ở -20 0 C trong 2h
- Thêm 0,6ml ethanol 70% lạnh, ly tâm 8000rpm trong 6 phút
- Làm khô tủa, hòa tan trong đệm TE
- Đo độ sạch của ADN bằng phương pháp quang phổ kế
- Bảo quản ADN tổng số trong -20 0 C để phục vụ các nghiên cứu tiếp theo
2.5.2.Phương pháp đo nồng độ bằng quang phổ kế
Sau khi thực hiện quá trình tách chiết, nồng độ DNA tổng số sẽ được đo bằng máy đo quang phổ UV-1601 (UV-Visible Spectrophotometer, Shimadzu).
Nồng độ trong mẫu được tính theo công thức sau:
C(ng/àl) = OD260nm 50 Độ pha loóng
2.5.3 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)
- Đặt các ống vào máy PCR, khởi động, cài đặt chu kì và cho máy chạy
Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR Thành phần phản ứng Nồng độ (àl)
Taq ADN polymerase (5 u/àl) 0,2 dH2O 11,3
Tổng thể tích phản ứng 20
Hình 2.1 Chu trình phản ứng PCR
2.5.4 Phương pháp điện di trên gel agarose 1%
- Cân 1g agarose, đong 100ml TAE 1X cho vào bình Duran
- Đun trong lò vi sóng cho đến khi gel tan hoàn toàn tạo thành một dung dịch đồng nhất
- Để nguội đến khoảng 50 - 60 0 C, thêm 5 l ethidium bromide (10mg/ml) và lắc đều
- Chuẩn bị khay và lược Đổ dung dịch agarose vào khay sao cho không có bọt khí Chờ khoảng 45 - 60 phút gel đông
- Đặt khay gel vào bể điện di, rút lược Đổ 0,5X TBE ngập mặt gel
Sản phẩm PCR được trộn với Loading Dye Buffer theo tỷ lệ 5 ADN:1 Dye trước khi đưa vào giếng điện di Thời gian và điện thế điện di sẽ thay đổi tùy thuộc vào kích thước của cặp mồi SSR cần kiểm tra, với các mẫu được chạy cùng với thang chuẩn 100bp.
- Soi gel trên máy soi cực tím và chụp ảnh bản gel
2.5.5 Phương pháp điện di trên gel polyacrylamide 5%
- Lau kỹ bề mặt hai tấm kính 3 lần bằng nước cất, sau đó lau lại 3 lần
- Lau tấm kính ngắn với giấy lụa tẩm dung dịch chống bám dính Rain-X Để 5 phút cho khô dung dịch
Chú ý Tránh làm dính dung dịch này lên tấm kính dài
- Lau tấm kính dài với dung dịch dính được tạo thành bằng cách thêm
2,5 l Bind Silane vào 1ml chứa 95% ethanol và 5% glacial acetic acid
- Để cho tấm kính khô
- Lắp ghép 2 tấm kính lại với nhau, sử dụng nẹp Sigma 0,4mm
- Đổ 60ml dung dịch gel 5% acrylamide vào 1 cốc đong 100ml Thêm
180 l 10% APS (ammonium persulfate) và 60 l TEMED (N,N,N’,N’- Tetraethyl - ethylendiamine), trộn đều
- Đổ từ từ dung dịch gel vào giữa hai tấm kính sao cho không có bọt khí
- Cài lược vào giữa hai tấm kính (răng lược hướng ra phía ngoài) Dùng kẹp cố định lược
- Để gel polyme hóa trong 1 - 2 giờ Điện di:
- Tháo lược và loại bỏ hết các mảnh gel thừa bám trên mặt tấm kính
- Lắp ráp bộ điện di Cho 1 lít đệm TBE 0,5X vào buồng đệm trên và dưới
- Rút lược, dùng xylanh đuổi hết bọt khí ở bề mặt phía trong giữa 2 tấm kính
- Chạy tiền điện di (prerun) với cường độ dòng điện là 50 - 60A, công suất
92 - 100W cho bản gel nóng lên 50 0 C thì load mẫu
Trộn sản phẩm PCR với 5 l Loading dye SSR, sau đó biến tính các sản phẩm PCR ở 95°C trong 10 phút Ngay lập tức đặt sản phẩm vào trong đá và phủ đá lên trên ít nhất 5 phút để đảm bảo hiệu quả.
- Tra vào mỗi giếng 5 l sản phẩm PCR đã được làm biến tính, các mẫu chạy với ladder 100 bp
Thời gian tra mẫu không quá dài để tránh bản gel bị nguội
- Tiến hành điện di với công suất 60W, thời gian chạy ngắn hay dài tùy kích thước từng mồi sử dụng
+ Chuẩn bị các dung dịch
- Dung dịch cố định/dừng phản ứng (Fix/Stop solution): gồm có 100ml glacial acetic acid và 900ml nước cất
- Dung dịch nhuộm (Staining solution) được tạo thành bằng cách hòa tan 1g bạc nitrat (AgNO3) vào 1 lít nước cất, sau đó bổ sung thêm 1,5ml formaldehyd (H2CO) 37%
- Dung dịch hiện (Developing solution): Hòa tan 30g natri cacbonat (Na2CO3) trong 1 lít nước cất và làm lạnh ở 4 0 C
Chú ý (Trước khi sử dụng thêm 1,5ml formaldehyd (H 2 CO) 37% và 400 l natri thiosulfat 10% (Na2S2O.5H2O)
Sau khi chạy điện đi, tháo gỡ tấm kính bám gel và tiến hành các bước sau:
Để cố định gel, hãy đặt tấm kính vào khay với mặt bám gel hướng lên trên, sau đó đổ dung dịch cố định/dừng phản ứng vào và lắc nhẹ trong khoảng 30 phút Sau khi thời gian đã trôi qua, lấy gel ra khỏi dung dịch, lưu ý giữ lại dung dịch này để sử dụng cho bước tiếp theo.
Rửa gel bằng nước cất hai lần, mỗi lần kéo dài 3 phút Sau đó, cho gel vào dung dịch nhuộm và lắc nhẹ trong 30 phút Tiếp theo, thêm formaldehyd và sodium thiolsulfat vào dung dịch Cuối cùng, lấy gel ra khỏi dung dịch nhuộm và rửa nhanh bằng nước cất trong 5 giây.
Đưa gel vào dung dịch và lắc nhẹ cho đến khi các băng xuất hiện Sau đó, cho gel vào dung dịch cố định trong 3 - 6 phút để dừng phản ứng Rửa gel bằng nước cất và để gel khô tự nhiên trước khi ghi nhận kết quả.
2.5.6 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu
* Phân tích tính đa hình của các chỉ thị SSR nghiên cứu
Trong nghiên cứu sinh học phân tử, việc đánh giá thông tin đa hình của các chỉ thị phân tử thường được thực hiện thông qua công thức tính Polymorphism Information Content (PIC) Công thức này giúp xác định mức độ đa dạng di truyền và tính hiệu quả của các chỉ thị trong các nghiên cứu.
Trong đó: i: allen thứ i của chỉ thị phân tử thứ j n: tổng số allen của chỉ thị phân tử thứ j p i : tần suất của allen
* Xác định vị trí ADN trên bản gel và phân tích các số liệu
Sau khi điện di, bản gel sẽ được xác định vị trí và kích thước từng băng ADN, và dữ liệu sẽ được lập thành bảng so sánh với kích thước băng ADN marker 100bp để dễ dàng theo dõi và phân tích Để lựa chọn các chỉ thị SSR phân biệt giống bạch đàn sinh trưởng nhanh và chậm, cần dựa vào kết quả phân tích bản gel polyacrylamide và xác định mẫu nghiên cứu Phân tích này nhằm tìm ra mối liên hệ giữa các chỉ thị phân tử với tính trạng sinh trưởng, từ đó làm cơ sở cho việc chọn giống sớm.
* Nguyên tắc xác định các phân đoạn
Sau khi thực hiện điện di, vị trí và kích thước từng băng ADN trên bản gel sẽ được xác định Dữ liệu sẽ được tổ chức thành bảng, so sánh với kích thước các băng ADN marker 100bp, nhằm thuận tiện cho việc theo dõi và phân tích Cuối cùng, các số liệu thu thập được sẽ được nhập vào phần mềm Excel để tiến hành phân tích.
* Phương pháp phân tích tương quan (Correlation)
Với hàng trăm đến hàng nghìn marker, việc tính toán bằng tay trở nên không khả thi Do đó, nghiên cứu sử dụng phương pháp phân tích tương quan để xác định mối quan hệ giữa các chỉ thị và tính trạng sinh trưởng (năng suất) của bạch đàn lai.
Hệ số tương quan R được tính theo công thức sau:
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
Thu thập thông tin về trình tự từ các mồi SSR có liên quan đến loài bạch đàn
Bạch đàn là cây trồng rừng quan trọng ở nhiều quốc gia, đóng góp lớn vào nguồn nguyên liệu cho sản xuất và chế biến các sản phẩm lâm nghiệp như ván dăm, nguyên liệu giấy và gỗ xây dựng.
Theo thống kê từ NCBI, đã có hơn 1.500 chỉ thị phân tử được áp dụng trong nghiên cứu các loài bạch đàn Trong số đó, có hơn 400 chỉ thị RAPD, khoảng 300 cặp chỉ thị STS và hơn 500 cặp chỉ thị SSR Đặc biệt, nhiều cặp chỉ thị được sử dụng chung cho cả kỹ thuật STS và SSR trong việc lập bản đồ liên kết gen Cụ thể, số lượng chỉ thị áp dụng cho loài Bạch đàn grandis là 486, cho Bạch đàn urô là 260, cho Bạch đàn globulus là 218, và cho Bạch đàn nitens là 165.
16 Các mồi nghiên cứu này có thể được áp dụng cho các loài khác, không nhất thiết là áp dụng với loài riêng biệt theo như các nhóm nghiên cứu nêu ra Chỉ thị SSR mang các đoạn lặp lại (AG)n và (AC)n, trong đó có 300 mồi SSR với tên gọi EMBRA đã được các nhà khoa học thuộc khoa Tế bào sinh học của trường đại học Brasilia (Braxin) xây dựng và phát triển được ký hiệu EMBRA1 EMBRA 395 (Brondani và cộng sự 1998, 2002, 2006) (Phụ lục 1)
Bộ chỉ thị SSR đang được áp dụng rộng rãi trong nghiên cứu các loài bạch đàn, giúp nhóm nghiên cứu của Brondani xây dựng bản đồ liên kết gen cho Bạch đàn grandis và Bạch đàn urô Sau hơn 10 năm nghiên cứu, nhóm đã xác định hơn 300 cặp mồi, cung cấp thông tin quý giá về vị trí và đặc điểm của từng cá thể Giai đoạn đầu, 70 chỉ thị được công bố với ký hiệu EMBRA1 – EMBRA70, và sau đó, nhóm đã phát triển lên tới 300 chỉ thị SSR, trở thành bộ mồi lớn cho nghiên cứu bạch đàn Bộ chỉ thị này có tính đa hình cao, dễ dàng sử dụng để giải thích các kiểu gen và lập bản đồ gen liên kết các tính trạng Tại Việt Nam, bộ mồi này được ưa chuộng nhờ tính khả thi trong nghiên cứu và công nghệ thiết bị Việc so sánh ưu nhược điểm của các phương pháp nghiên cứu cho thấy chỉ thị SSR là lựa chọn tối ưu cho việc chọn dòng bạch đàn lai và nghiên cứu quan hệ di truyền giữa các bố mẹ tham gia lai giống.
Với số lượng lớn các mồi SSR và mẫu ADN bạch đàn từ các dòng lai, nghiên cứu sẽ phân tích và so sánh để sàng lọc các cặp mồi đa hình liên quan đến các tính trạng mong muốn.
Trong nghiên cứu về việc tạo giống mới và ứng dụng chỉ thị phân tử, đề tài tập trung phân tích các chỉ thị liên quan đến tính trạng năng suất của bạch đàn lai Nhiều chỉ thị phân tử đã được sử dụng, nhưng nghiên cứu chú trọng vào các bộ chỉ thị lớn có tính bao phủ rộng trong genome của nhóm loài bạch đàn Cụ thể, đề tài đã lựa chọn nghiên cứu các chỉ thị trong bộ chỉ thị EMBRA, và từ 300 chỉ thị SSR thu thập được, đã chọn ra những chỉ thị phù hợp nhất.
Nghiên cứu này đã xác định 205 chỉ thị làm đối tượng nghiên cứu, với kích thước của 205 SSR dao động từ 58-356bp Tần số lặp lại của các đoạn nucleotid trong nghiên cứu nằm trong khoảng từ 11 đến 34 lần.
- 14 chỉ thị dùng chung cho loài Bạch đàn
- 159 chỉ thị phát triển trên loài Bạch đàn grandis
- 9 chỉ thị phát triển trên loài bạch đàn lai giữa Bạch đàn grandis và Bạch đàn urô
- 19 chỉ thị phát triển trên loài Bạch đàn urô
Theo tài liệu công bố của tác giả, tiêu chí lựa chọn các chỉ thị trong nghiên cứu là chúng phải được phân bố đồng đều trên 11 nhiễm sắc thể, với tổng cộng 205 chỉ thị được chọn.
- 17 trên 24 chỉ thị phân tử nằm trên NST số 1
- 8 trên 28 chỉ thị phân tử nằm trên NST số 2
- 8 trên 15 chỉ thị phân tử nằm trên NST số 3
- 15 trên 19 chỉ thị phân tử nằm trên NST số 4
- 23 trên 25 chỉ thị phân tử nằm trên NST số 5
- 18 trên 21 chỉ thị phân tử nằm trên NST số 6
- 6 trên 23 chỉ thị phân tử nằm trên NST số 7
- 21 trên 28 chỉ thị phân tử nằm trên NST số 8
- 8 trên 20 chỉ thị phân tử nằm trên NST số 9
- 14 trên 17 chỉ thị phân tử nằm trên NST số 10
- 10 trên 15 chỉ thị phân tử nằm trên NST số 11
- 57 trên 69 chỉ thị phân tử chưa được xác định thuộc NST nào.
Sàng lọc các cặp mồi SSR để tìm ra các cặp mồi SSR đa hình
3.2.1 Tách chiết ADN tổng số và điện di kiểm tra Đề tài sử dụng 60 dòng bạch đàn là con lai giữa bạch đàn urô với Bạch đàn liễu và Bạch đàn urô với Bạch đàn caman tại hiện trường Phú Thọ và Hòa Bình để phân tích sự tương quan của các cặp mồi với tính trạng sinh trưởng Bảng 3.1 là số liệu tổng hợp các dòng bạch đàn lai sẽ được sử dụng trong nghiên cứu để phân tích mối liên quan giữa chỉ thị phân tử với tính trạng sinh trưởng Trong đó 22 dòng bạch đàn lai đại diện cho các tổ hợp lai UC và UE được sử dụng để sàng lọc cặp mồi đa hình
Sau khi tách chiết ADN tổng số, sản phẩm được điện đi kiểm tra trên gel agarose 0,8%, kết quả được thể hiện ở hình 3.1
Hình 3.1: Kết quả điện di ADN tổng số các mẫu lá bạch đàn lai
Kết quả điện di trong ảnh 3.1 cho thấy ADN tổng số tách từ các mẫu lá bạch đàn lai có băng vạch rõ ràng, không có vệt smear, chứng tỏ ADN nguyên vẹn, không bị nhiễm tạp chất RNA và protein đã được loại bỏ hoàn toàn, đảm bảo chất lượng ADN đủ điều kiện cho các nghiên cứu tiếp theo.
Bảng 3.1 Kết quả đo OD các mẫu ADN tổng số
TT Mẫu đo OD 260nm OD 280nm OD 260 /OD 280 TT Mẫu đo OD 260nm OD 280nm OD 260 /OD 280
Sau khi tách ADN tổng số, việc đo nồng độ ADN được thực hiện để xác định độ tinh sạch và nồng độ thông qua phương pháp quang phổ Kết quả đo quang phổ cho thấy tỷ số OD260nm/OD280nm của các mẫu ADN tổng số nằm trong khoảng (1,8 – 2), chứng tỏ ADN đã đạt chất lượng tinh sạch, không còn RNA và protein, sẵn sàng cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.2.2 Xác định điều kiện PCR tối ưu cho việc nhân đoạn SSR
Chu trình nhiệt trong phản ứng PCR đóng vai trò quan trọng, không chỉ giúp tháo xoắn phân tử ADN mà còn hỗ trợ quá trình gắn mồi và kéo dài chuỗi ADN mới Nghiên cứu đã xác định rằng nhiệt độ gắn mồi tối ưu để nhân đoạn SSR cho hầu hết các cặp mồi là 56°C, trong khi một số cặp mồi khác yêu cầu nhiệt độ 58°C.
Sau khi tối ưu hóa các điều kiện phản ứng PCR, nghiên cứu đã thiết lập thành công phản ứng PCR với các thành phần được trình bày trong bảng 2.4 và hình 2.1.
Hình 3.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR với các cặp mồi SSR ở 56°C M: Marker 1kb, 1 - 20: sản phẩm PCR với các cặp mồi SSR
Hình 3.3 Kết quả điện di sản phẩm PCR với các cặp mồi SSR ở 58°C; M: Marker 1kb, 1 - 16: sản phẩm PCR với các cặp mồi SSR
Bảng 3.2 Nhiệt độ bắt cặp của 205 cặp mồi EMBRA sau khi tối ƣu sử dụng trong nghiên cứu (chi tiết ở phụ lục 1)
TT Mồi Trình tự lặp lại Trình tự mồi (5' đến 3')
Nhiệt độ gắn mồi (ºC)
205 EMBRA386 (TC)24AAA (TC)24 CCAAACACTCTTCCCATAT 58 212 n.s
3.2.3 Kết quả phân tích sự đa hình bằng điện di trên gel polyacrylamide Đa hình của các dòng bạch đàn lai có thể được xác định bởi chiều dài khác nhau của các đoạn lặp lại ở mỗi giống khi chúng được nhân lên bởi cùng một chỉ thị nhờ phản ứng PCR Việc sàng lọc các chỉ thị SSR đa hình là điều kiện tiên quyết cho việc tìm ra các chỉ thị SSR có liên kết với tính trạng sinh trưởng Chỉ thị phân tử SSR đã được chứng minh có hiệu quả trong xác định các vùng gen chịu trách nhiệm cho sự biểu hiện của các tính trạng nông học và quá trình sinh lý quan trọng Ngoài ra, chúng cũng được sử dụng trong phân tích các lôcut tính trạng số lượng (quantitative trait loci - QTL), mà qua đó có thể xác định được các gen quy định các tính trạng mong muốn a Mức độ đa hình mồi EMBRA232 b Mức độ đa hình mồi EMBRA47 c Mức độ đa hình mồi EMBRA229 d Mức độ đa hình mồi EMBRA58 e Mức độ đa hình mồi EMBRA5 f Mức độ đa hình mồi EMBRA37 g Mức độ đa hình mồi EMBRA242 h Mức độ đa hình mồi EMBRA168
Để phân tích mối tương quan giữa chỉ thị phân tử và các tính trạng quan tâm, việc ghi nhận sự đa hình của các băng chỉ thị trong quần thể mẫu nghiên cứu là rất quan trọng Sự đa hình của một cặp mồi SSR được thể hiện qua sự hiện diện hoặc vắng mặt của băng điện di ở từng cá thể trong quần thể Hình 3.4 minh họa mức độ đa hình của một số cặp mồi EMBRA.
Dữ liệu đa hình của các cặp mồi SSR được thu thập để tính toán hàm lượng thông tin đa hình (PIC) theo phương pháp của Weir (1996), và kết quả được trình bày trong bảng 3.3.
Bảng 3.3 Số alen và hệ số PIC của 106 cặp mồi có đa hình
STT Chỉ thị SSR Số alen Tổng số alen PIC STT Chỉ thị SSR Số alen
Sau khi tối ưu hóa và thực hiện PCR với 205 cặp mồi SSR, đã thu được 106 chỉ thị SSR có đa hình, thể hiện qua giá trị PIC trong bảng 3.3 Kết quả cho thấy có tổng cộng 2.893 alen, trong đó có 478 alen đa hình, với số lượng alen mỗi chỉ thị dao động từ 2 đến 10 Giá trị PIC của 106 chỉ thị nằm trong khoảng từ 0,16 đến 0,87, với giá trị trung bình đạt 0,58 Những chỉ thị có hệ số PIC lớn hơn 0,5 cho thấy khả năng phân biệt cao về tỷ lệ đa hình Dựa trên kết quả này, 53 chỉ thị có độ đa hình cao và hoạt động tốt đã được chọn để tiếp tục phân tích và sàng lọc cặp mồi liên quan đến sinh trưởng nhanh của bạch đàn lai.
Bảng 3.4 53 cặp mồi SSR có độ đa hình cao đƣợc sử dụng để sàng lọc chỉ thị SSR liên kết với sinh trưởng nhanh
NST Trình tự xuôi Trình tự ngƣợc
Trong số 53 chỉ thị SSR có đa hình cao, chỉ thị EMBRA39 đã được chọn để phân tích các kiểu gen của cây bố mẹ và cây lai trong tổ hợp thuận nghịch U29E1, cũng như các cây F1 là hậu thế của cây mẹ Nghiên cứu này có thể mở ra hướng đi mới trong việc tìm hiểu sự khác biệt về các kiểu gen giữa các cây sinh trưởng khác nhau trong tổ hợp lai thuận nghịch giữa U29 và E1, cùng với hậu thế của U29 và E1.
Bảng 3.5 Các kiểu gen của 104 cây đƣợc phân tích bởi chỉ thị EMBRA39
Alen U29 E1 UE27 UE24 UE4 EU67 UE31 U29E1* E1U29*
F1 của U29 thụ phấn tự do
F1 của E1 thụ phấn tự do
Để xác định các chỉ thị liên quan đến tính trạng sinh trưởng của bạch đàn lai, nghiên cứu đã sử dụng các mẫu sinh trưởng đối lập từ các dòng vô tính thuộc tổ hợp lai U29E1, bao gồm U29, E1, UE27, UE24, UE4, EU67, UE31 Cụ thể, tổ hợp lai U29E1* chứa 24 cây F1, trong khi E1U29* có 23 cây Đối với các cây thụ phấn tự do, có 16 cây F1 từ U29 và 34 cây từ E1 Thí nghiệm đã tiến hành với 104 mẫu nhằm tìm ra sự khác biệt về kiểu gen giữa các cây sinh trưởng nhanh và chậm.
+ Hạt thụ phấn tự do của cây mẹ U29 và E1
Cây UE27 và UE24, con lai của tổ hợp U29E1, có tốc độ sinh trưởng nhanh và đã được trồng khảo nghiệm tại nhiều địa phương như Bình Dương, Bình Phước, Phú Thọ, và Cà Mau Giống cây này đã được công nhận là giống quốc gia vào năm 2008.
+ Cây UE4, UE67, UE31 có sinh trưởng chậm là con lai của tổ hợp
U29E1 đã được trồng khảo nghiệm tại nhiều hiện trường cùng với dòng lai UE24, UE27
Trong nghiên cứu này, chúng tôi khảo nghiệm 24 cây thuộc tổ hợp lai thuận U29E1, 23 cây thuộc tổ hợp lai nghịch E1U29, cùng với 16 cây F1 tự thụ phấn từ cây mẹ U29 tại Bắc Giang và 34 cây F1 tự thụ phấn từ cây mẹ E1 tại Yên Bái Các phép lai đã được thực hiện để đánh giá sự phát triển và đặc tính di truyền của các tổ hợp này.
Trong giai đoạn 2010-2011, dự án nghiên cứu công nghệ sinh học đã tiến hành chuẩn bị đấu thầu cho đề tài liên quan đến việc trồng cây lai Địa điểm thực hiện thuộc về nghiên cứu lai tạo một số loài cây như bạch đàn, keo, tràm và thông.
Chỉ thị EMBRA39 cho thấy sự khác biệt về kiểu gen giữa cây bạch đàn lai sinh trưởng nhanh và sinh trưởng chậm, với 4 kiểu gen được xác định qua các thử nghiệm Các kết quả này được trình bày chi tiết trong bảng 3.7 và hình 3.5.
- 2 kiểu đồng hợp tử mang 1 alen là : + 150bp
- 2 kiểu dị hợp tử mang 2 alen là : + 150bp và 140 bp
- Kiểu gen của cây mẹ U29 là đồng hợp tử mang alen : 140bp
- Kiểu gen của cây mẹ E1 là đồng hợp tử mang alen : 150bp
- Kiểu gen của cây UE27 và UE24 (có sinh trưởng nhanh) là dị hợp tử:
- Kiểu gen của cây UE4, UE67, UE31 (có sinh trưởng chậm) là đồng hợp tử giống mẹ U29: 140bp
- Theo dõi bảng 3.5 cho thấy đối với các cây tự thụ phấn (F1) của cây mẹ U29 và cây mẹ E1 có sự khác nhau về sự xuất hiện kiểu gen :
Xác định các cặp mồi SSR liên quan đến sinh trưởng nhanh
Sinh trưởng của bạch đàn lai chủ yếu được đánh giá qua đường kính và chiều cao cây, từ đó xác định năng suất Năng suất là yếu tố quan trọng để phân tích mối tương quan với các cặp mồi EMBRA, thể hiện sự liên quan giữa chúng và tính trạng sinh trưởng Đề tài đã sử dụng 53 chỉ thị SSR cho đa hình ở 60 dòng bạch đàn lai UE và UC, là kết quả của sự lai giữa Bạch đàn urô với Bạch đàn liễu và Bạch đàn urô với Bạch đàn caman tại Phú Thọ và Hòa Bình trong giai đoạn khảo nghiệm 2013-2016 Năng suất của các dòng này dao động từ 2,5 m³/ha/năm đến 43,8 m³/ha/năm, nhằm sàng lọc các mồi SSR liên quan đến sinh trưởng nhanh Kết quả chi tiết được trình bày trong bảng 3.6.
Bảng 3.6 Kết quả điện di của 8 cặp mồi liên quan đến sinh trưởng với 60 dòng bạch đàn lai
Trong nghiên cứu này, các kiểu gen được ký hiệu từ 1 đến 5 cho mỗi chỉ thị khi thực hiện trên 60 dòng bạch đàn lai Cụ thể, EMBRA208-1 có kích thước 100bp và 90bp, EMBRA208-2 có kích thước 110bp và 100bp, trong khi EMBRA208-3 đạt 120bp Đối với EMBRA229, EMBRA229-1 ghi nhận kích thước 190bp và 160bp, EMBRA229-2 có kích thước 180bp và 160bp, còn EMBRA229-3 có kích thước 190bp và 180bp.
EMBRA124-1: 145bp, EMBRA124-2: 145bp và 140bp, EMBRA124-3: 140bp, EMBRA124-4: 125bp, EMBRA124-5: 135bp và 125bp
EMBRA78-1: 140bp, EMBRA78-2: 170bp và 140bp, EMBRA78-3: 170bp
The EMBRA series features various measurements across different models, including EMBRA168 with sizes of 85bp and 80bp for the first variant, 90bp for the second, and 80bp and 70bp for the third The EMBRA39 series includes measurements of 150bp and 140bp for the first variant, 142bp and 140bp for the second, and 140bp for the third Lastly, the EMBRA209 series shows sizes of 125bp and 120bp for the first variant, 125bp for the second, and 135bp and 130bp for the third.
EMBRA196-1: 125bp và 120bp, EMBRA196-2: 130bp và 120bp, EMBRA196-3: 130bp và 125bp
Bảng 3.7 Tương quan của các cặp mồi EMBRA với năng suất bạch đàn lai
STT Chỉ thị SSR Thông tin mồi R
Bảng số liệu 3.7 chỉ ra rằng mức tương quan R giữa các cặp mồi SSR và tính trạng sinh trưởng của 60 dòng bạch đàn lai dao động từ 0,02 đến 0,57 Đặc biệt, có 06 chỉ thị có mức tương quan tương đối lớn, với R > 0,4.
- Chỉ thị EMBRA39 có mức độ tương quan với tính trạng năng suất là
Các dòng UC16, CU113, CU123, CU98, CU110, UE72, CU82, CU182, và UC47 có năng suất cao, dao động từ 30,7 đến 45,3 m³/ha/năm, đều mang alen EMBRA39-1 Ngược lại, các dòng có năng suất thấp như UC224, UC33, CU1, CU112, CU99, UC76, và UC227 chỉ đạt năng suất từ 2,5 đến 9,7 m³/ha/năm và đều mang alen EMBRA39-3 Bên cạnh đó, các dòng UC78 và UE113 có năng suất từ 4,7 đến 9,7 m³/ha/năm, mang alen EMBRA39-2.
Chỉ thị EMBRA229 cho thấy mối tương quan với năng suất với hệ số R=0,51 Các dòng như UC16, UC51, CU113, CU123, CU98, CU110, UE72, CU82, CU182, CU55, và UC47 đạt năng suất cao từ 30,7 đến 45,3 m³/ha/năm, tất cả đều mang kiểu gen EMBRA229-1 Ngược lại, các dòng UC224, UC33, CU1, UE113, CU203, CU112, CU99, UC76, UC78, UC11, và UC227 có năng suất thấp từ 2,5 đến 9,7 m³/ha/năm và đều mang alen EMBRA229-2.
- Chỉ thị EMBRA78 có mức độ tương quan với tính trạng năng suất là
Các dòng cây có năng suất cao như UC16, UC51, CU113, CU123, UC52, CU98, và UE72 với năng suất từ 30,7 đến 45,3 m³/ha/năm đều mang alen EMBRA78-1 Ngược lại, các dòng có năng suất thấp như CU112, UE113, CU1, và UC33 chỉ đạt năng suất từ 3,8 đến 7,7 m³/ha/năm và đều mang alen EMBRA78-2.
Chỉ thị EMBRA208 cho thấy mối tương quan rõ rệt với năng suất, với hệ số R=0,5 Các dòng như UC16, UC51, CU113, CU123, UC52, CU98, CU110, CU82, CU182, và CU55 đạt năng suất cao, dao động từ 30,7 đến 43,5 m³/ha/năm, và đều mang kiểu gen EMBRA208-1 Ngược lại, các dòng có năng suất thấp như UC227, UC78, UC76, và CU99 chỉ đạt từ 8,7 đến 9,7 m³/ha/năm, mang alen EMBRA208-3 Bên cạnh đó, các dòng CU112, CU203, UE113, CU1, UC33, và UC244 có năng suất rất thấp, dao động từ 2,5 đến 7,7 m³/ha/năm, và đều mang alen EMBRA208-2.
Chỉ thị EMBRA196 có mối tương quan đáng kể với năng suất, với hệ số R=0,47 Các dòng giống có năng suất cao như UC16, UC51, CU113, UC52, CU98, CU82, CU182 và UC55 đạt năng suất từ 30,7 đến 45,3 m³/ha/năm đều mang alen EMBRA196.
Các dòng cây có năng suất cao như UC224, UE113, CU203, CU99 và UC76 (năng suất từ 2,5 đến 8,8 m³/ha/năm) đều mang alen EMBRA196-1, trong khi đó, các dòng UC33, CU1, CU112, UC78, UC227, UC11 (năng suất từ 3,8 đến 10,2 m³/ha/năm) mang alen EMBRA196-2.
Chỉ thị EMBRA209 cho thấy mối tương quan với năng suất cây trồng, với hệ số R=0,4 Các dòng có năng suất cao như UC16, UC51, CU113, UC52, CU98, CU110, UE72, CU82, và CU182 đều mang alen EMBRA209-1 Ngược lại, các dòng có năng suất thấp như UC224, CU1, UE113, CU112, UC76, và UC227 (chỉ đạt 2,5 đến 9,7 m³/ha/năm) mang alen EMBRA209-2 Thêm vào đó, các dòng UC33, CU203, và CU99 có năng suất từ 3,8 đến 9,7 m³/ha/năm đều mang alen EMBRA209-3.
Kiểm chứng các chỉ thị có liên quan đến tính trạng sinh trưởng
Nghiên cứu này sử dụng 9 dòng bạch đàn lai E urophylla x E exserta (UE) để kiểm chứng các chỉ thị liên quan đến sinh trưởng nhanh Dữ liệu sinh trưởng được thu thập từ năm 2006 và 2010, kế thừa từ đề tài “Nghiên cứu lai tạo một số loài bạch đàn, keo, tràm, thông” giai đoạn 1 (2001–2005).
2 (2006–2010) mẫu lá thu năm 2012- 2013 được bảo quản ở tủ lạnh sâu (-
85 O C) Các mẫu với năng suất được thể hiện trong bảng 3.8:
Bảng 3.8 Các dòng bạch đàn lai thể hiện năng suất cao và thấp tại các hiện trường khảo nghiệm Bầu Bàng Bình Dương (2002-2010)
TT Dòng Năng suất (m 3 /ha/năm) Đánh giá sinh trưởng Năm 2006 Năm 2010
(Ghi chú: chi tiết chọn dòng nhanh chậm theo khảo nghiệm hậu thế dòng vô tính ở phụ lục 5, 6)
Sự liên kết của chỉ thị SSR với sinh trưởng nhanh của bạch đàn lai được thể hiện trong bảng 3.9
Bảng 3.9 Sự liên kết giữa các chỉ thị SSR với tính trạng (NS - năng suất)
Sinh trưởng nhanh Sinh trưởng chậm
UE24 UE27 UE3 UE33 UC1 CU90 UE31 UE5 UE25
Hình 3.6: Kết quả điện di 9 dòng bạch đàn lai với EMBRA229 trên gel polyacrylamide
Chỉ thị EMBRA229 cho thấy rằng các dòng UE sinh trưởng nhanh đều mang kiểu gen dị hợp tử với hai alen kích thước 190 và 180 bp Trong khi đó, các dòng sinh trưởng chậm không hoàn toàn có kiểu gen khác biệt, như dòng UE31, mặc dù sinh trưởng chậm nhưng lại có kiểu gen giống với các dòng sinh trưởng nhanh Đặc biệt, dòng UE5 và UE25 sinh trưởng chậm có kiểu gen dị hợp tử với hai alen 180 bp và 160 bp.
Hình 3.7: Kết quả điện di 9 dòng bạch đàn lai với EMBRA78 trên gel polyacrylamide 5% Thứ tự điện di nhƣ ở hình 3.6
Chỉ thị EMBRA78 cho thấy các dòng sinh trưởng nhanh đều mang kiểu gen đồng hợp tử với alen 140bp, trong khi dòng UE31 và UE5 có kiểu gen đồng hợp tử với alen 170bp Đặc biệt, dòng UE25, mặc dù sinh trưởng chậm, lại có kiểu gen tương tự như các dòng sinh trưởng nhanh.
Hình 3.8: Kết quả điện di 9 dòng bạch đàn lai với EMBRA209 trên gel polyacrylamide 5% Thứ tự điện di nhƣ ở hình 3.6
Chỉ thị EMBRA209 phân biệt rõ ràng giữa các dòng sinh trưởng nhanh và chậm Các dòng sinh trưởng nhanh có kiểu gen dị hợp tử với hai alen 125bp và 120bp, trong khi các dòng sinh trưởng chậm có hai kiểu gen: dị hợp tử với hai alen 135bp và 130bp, và đồng hợp tử với một alen 125bp.
Chỉ thị EMBRA196 cho thấy rằng các dòng có sinh trưởng nhanh đều mang kiểu gen dị hợp tử với hai alen 130bp và 125bp Trong khi đó, các dòng có sinh trưởng chậm không cùng kiểu gen, nhưng đều khác với kiểu gen của các dòng sinh trưởng nhanh Cụ thể, dòng UE31 và UE5 có kiểu gen dị hợp tử với hai alen 125bp và 120bp, trong khi dòng UE25 có kiểu gen dị hợp tử với hai alen 130bp và 120bp.
Chỉ thị EMBRA208 cho thấy rằng các dòng có sinh trưởng nhanh đều mang kiểu gen dị hợp tử với hai alen 100bp và 90bp Ngược lại, các dòng sinh trưởng chậm không có cùng kiểu gen, nhưng đều khác với kiểu gen của các dòng sinh trưởng nhanh Cụ thể, dòng UE31 và UE5 có kiểu gen dị hợp tử với hai alen 110bp và 100bp, trong khi dòng UE25 có kiểu gen đồng hợp tử với alen 120bp.
Chỉ thị EMBRA39 phân biệt rõ ràng giữa các dòng sinh trưởng nhanh và chậm Các dòng sinh trưởng nhanh mang kiểu gen dị hợp tử với hai alen 150bp và 140bp, trong khi các dòng sinh trưởng chậm có thể có kiểu gen dị hợp tử với hai alen 142bp và 140bp hoặc kiểu gen đồng hợp tử với một alen 140bp.
Tóm lại, trong 06 chỉ thị được phân tích, 03 chỉ thị EMBRA39, EMBRA78 và EMBRA229 cho thấy có mối tương quan mạnh nhất với các dòng bạch đàn lai sinh trưởng nhanh Mặc dù chưa thể khẳng định chắc chắn rằng đây là 03 chỉ thị liên quan đến tính trạng sinh trưởng của bạch đàn lai, nhưng khi kiểm chứng với các dòng bạch đàn lai có sinh trưởng nhanh, kết quả về kiểu gen phần lớn tương đồng với các dòng bạch đàn lai nhanh trưởng như UC16, UC51, CU113, CU123, UC52.
Bảng 3.8 đã chỉ ra rằng các chỉ thị SSR (CU98, CU82, CU182, UE72, UC55) có khả năng phân biệt giữa các dòng bạch đàn lai sinh trưởng nhanh và chậm Tuy nhiên, có thể xảy ra tình huống dòng bạch đàn sinh trưởng chậm lại mang kiểu gen tương tự như dòng sinh trưởng nhanh Điều này cho thấy rằng tính trạng sinh trưởng của mỗi dòng bạch đàn lai bị ảnh hưởng bởi cả yếu tố di truyền và môi trường, chẳng hạn như điều kiện lập địa.
