(LUẬN văn THẠC sĩ) nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh vật đối kháng với vi khuẩn xanthomonas oryzae pv oryzae

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Vật liệu và hóa chất

- Các mẫu đất thu thập tại vùng trồng lúa của huyện Đông Anh - Hà Nội; Kim Bảng - Hà Nam (6 mẫu)

- Các vi khuẩn kiểm định: Xanthomonas oryzae pv oryzae gây bệnh bạc lá (của trung tâm Coste)

1.2 Hóa chất và dụng cụ

- Các loại muối: K2HPO4, KH2PO4, KI, MgSO4 7H2O, KNO3, NaCl, FeSO4.7H2O, (NH4)2SO4, NaHPO4.12H2O, Ca(NO3)2.4H2O

- Cao thịt, cao nấm men, peptone

- Các loại hóa chất khác như thạch, tinh bột tan, casein, đường saccarose

- Bình tam giác và ống đong 100 ml, 250 ml, 500 ml

- Nồi khử trùng ướt (ALP) (Đài Loan)

- Tủ sấy khô (Sellab – Mỹ)

- Tủ ấm ổn nhiệt (Sellab – Mỹ)

- Máy đo pH (Nhật Bản)

- Máy lắc ổn nhiệt (Sellab – Mỹ)

- Tủ cấy vô trùng (Singapo)

- Cân phân tích (Nhật Bản)

- Máy li tâm lạnh (Mikro – Đức)

- Kính hiển vi quang học (Hàn Quốc)

Các dụng cụ vi sinh: ống nghiệm, đĩa petri, que cấy, que trang, đèn cồn, giấy lọc, giá đỡ ống nghiệm, phễu lọc

- Môi trường Wakimoto (Wakimoto Medium, 1995) (1 lít):

Dung dịch muối vi lượng 1 ml

Phương pháp nghiên cứu

2.1 Phương pháp phân lập Bacillus

Pha loãng mẫu đến nồng độ thích hợp (10^-3, 10^-4, 10^-5, ) Tiến hành xử lý sốc nhiệt cho các ống mẫu đã pha loãng bằng cách nhúng chúng vào bình ổn nhiệt ở 80°C trong 10 phút, sau đó nhanh chóng chuyển vào khay nước đá trong vòng 5 phút Cuối cùng, phân lập mẫu trên môi trường MPA.

2.2 Phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật

Trang đều dịch nuôi vi khuẩn Xanthomonas trên bề mặt đĩa thạch chứa môi trường Wakimoto Sau đó, tạo 3-4 giếng trên đĩa thạch bằng cách khoan đục lỗ và cho 100 µl dịch nuôi vi khuẩn vào mỗi giếng Ủ đĩa thạch trong tủ lạnh ở 4-6 °C trong 2 giờ để dịch khuếch tán đều Tiếp theo, chuyển các đĩa thạch sang tủ ấm ở 30 °C trong 24 giờ cho vi khuẩn hoặc 120 giờ cho xạ khuẩn Khả năng ức chế được đánh giá qua vòng kháng xung quanh giếng thạch.

DKK = D - d Trong đó: DKK: Đường kính vòng kháng Xoo (mm)

D: đường kính vòng kháng (mm) d: đường kính khoanh thạch chứa VSV đối kháng (mm)

2.3 Phương pháp đánh giá khả năng đồng sinh trưởng của các chủng vi sinh vật được tuyển chọn

Mục đích của thí nghiệm này là đánh giá sự tương thích của các chủng vi sinh vật (VSV) để xác định những VSV không đối kháng lẫn nhau Chỉ những VSV tương thích mới có thể kết hợp trong cùng một hỗn hợp để đảm bảo hiệu quả tối ưu trong ứng dụng.

Phương pháp đường vuông góc:

Môi trường dinh dưỡng được khử trùng và đổ vào đĩa petri, sau đó sử dụng que cấy đã khử trùng để cấy các chủng vi sinh thành các đường vuông góc giống như bàn cờ Mẫu được ủ ở 30°C trong 24 giờ đối với vi khuẩn và 120 giờ đối với xạ khuẩn Sau thời gian ủ, quan sát và đánh giá tính kháng tại các điểm giao nhau; nếu các chủng vi sinh có tính kháng nhau, tại điểm giao cắt sẽ không có sự sinh trưởng của vi sinh vật.

Phương pháp nuôi trong môi trường dịch thể:

Các vi sinh vật được chọn lọc đã được nuôi trong môi trường Gauze lỏng với sự bổ sung cao thịt 5g/l Sau 3 ngày, kết quả kiểm tra cho thấy dịch nuôi vi sinh đã được phân lập trên hai loại môi trường dinh dưỡng chuyên biệt cho vi khuẩn và xạ khuẩn, cụ thể là ISP4 và MPA.

2.4 Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy các chủng vi sinh vật tuyển chọn

2.4.1 Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng đến sinh trưởng của các chủng vi sinh vật tuyển chọn

Bằng cách điều chỉnh các môi trường dinh dưỡng cơ bản và bổ sung thêm các yếu tố dinh dưỡng như nguồn cacbon (cám gạo, rỉ đường, bột giấy), nguồn nitơ (cao nấm men, bột đậu tương, cao thịt) và nguồn khoáng (muối, CaCl2, KH2PO4, MgSO4), chúng tôi đã xác định được điều kiện tối ưu với mật độ/sinh khối tế bào VSV cao nhất và hoạt tính sinh học ổn định Sau khi ly tâm, dịch nuôi cấy được thử nghiệm hoạt tính kháng Xoo bằng phương pháp giếng thạch.

2.4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng của các chủng vi sinh vật tuyển chọn

Môi trường nuôi cấy tối ưu được xác định từ phương pháp nghiên cứu, với tỷ lệ cấp giống 10%, pH trung tính Thời gian lên men là 24 giờ cho vi khuẩn và 120 giờ cho xạ khuẩn, kèm theo quá trình lắc đều.

150 vòng/phút Nhiệt độ trong quá trình lên men được điều chỉnh ở các mức

Nhiệt độ lên men sinh khối tối ưu dao động từ 15°C đến 55°C, trong đó nhiệt độ lý tưởng là khi mật độ và sinh khối tế bào vi sinh vật (VSV) đạt mức cao nhất và hoạt tính sinh học ổn định Để đánh giá hiệu quả, dịch nuôi cấy sau khi ly tâm sẽ được thử nghiệm hoạt tính kháng Xoo theo phương pháp giếng thạch.

2.4.3 Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng của các chủng vi sinh vật tuyển chọn

Môi trường lên men được điều chỉnh pH ở các mức từ 4,0 đến 9,0, trong đó pH tối ưu cần thiết để đạt được mật độ sinh khối tế bào VSV cao nhất và đảm bảo hoạt tính sinh học ổn định Điều kiện nuôi cấy lý tưởng là 30 độ C với tốc độ lắc 150 vòng/phút Sau khi ly tâm, dịch nuôi cấy sẽ được kiểm tra hoạt tính kháng Xoo bằng phương pháp giếng thạch.

2.5.1 Đánh giá khả năng đối kháng của chế phẩm với các chủng vi khuẩn Xoo Để xác định liều lượng sử dụng chế phẩm trong các thí nghiệm đánh giá hiệu quả phòng trừ bệnh bạc lá do vi khuẩn Xoo gây ra các thí nghiệm được bố trí như sau:

Bước 1: Chuẩn bị dịch huyền phù Xoo (có mật độ khoảng 10 8 CFU/ml)

Bước 2: Chuẩn bị chế phẩm dạng dịch thể (mật độ 10 8 CFU/ml)

Bước 3: Chuẩn bị các bình thí nghiệm có chứa 100 ml môi trường Wakimoto Bước 4: Tiến hành thí nghiệm

TN1: 2 ml chế phẩm + 1 ml dịch huyền phù Xoo

TN2: 1 ml chế phẩm + 1 ml dịch huyền phù Xoo

TN3: 1 ml chế phẩm + 3 ml dịch huyền phù Xoo

TN4: 1 ml chế phẩm + 5 ml dịch huyền phù Xoo

TN5: 1 ml chế phẩm + 10 ml dịch huyền phù Xoo

TN6: 1 ml chế phẩm + 15 ml dịch huyền phù Xoo

TN7: 1 ml chế phẩm + 20 ml dịch huyền phù Xoo

Các bình thí nghiệm được nuôi trong máy lắc ổn nhiệt ở nhiệt độ 30°C trong 48 giờ, với việc lấy mẫu sau mỗi 12 giờ Mục tiêu là phân lập và xác định các chủng vi sinh vật có mặt trong các bình thí nghiệm.

2.5.2 Đánh giá khả năng phòng trừ bệnh bạc lá trên lúa

Theo Quy phạm khảo nghiệm trên đồng ruộng "hiệu lực của các loại phân bón đối với năng suất cây trồng, phẩm chất nông sản 10 TCN 216 – 2003", được ban hành kèm theo Quyết định số 59/2003/QĐ-BNN ngày 05 tháng 5 năm 2003, việc áp dụng các loại phân bón có vai trò quan trọng trong việc nâng cao năng suất và chất lượng nông sản.

2003 Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn

+ Lô thí nghiệm 1: Sử dụng chế phẩm xử lý hạt giống

Bước 1 Chuẩn bị dịch ngâm hạt giống: Pha chế phẩm với nước sạch tỷ lệ 1% (mật độ vi sinh trong nước nước khoảng 10 6 CFU/ml)

Ngâm hạt giống trong dung dịch đã pha chế trong 48 giờ, trong quá trình này, cứ 10-12 giờ cần rửa và đãi hạt lép để đảm bảo hạt không có mùi hôi hay chua Khi hạt đã no nước, tức là căng đều và có phôi trắng ở đầu, cần đãi sạch và loại bỏ hạt lép Sau đó, để ráo nước và ủ hạt trong bao vải hoặc thúng, dùng bao vải để che miệng thúng ủ.

Bước 3 Ủ hạt giống: nhiệt độ ủ thóc nên duy trì ở 25 – 30 0 C, chú ý ko để đọng nước trong thúng ủ hạt giống

Trong quá trình ủ hạt thóc từ 8-10 giờ, cần kiểm tra định kỳ để đảm bảo chất lượng Nếu hạt thóc khô, hãy tưới thêm nước để duy trì độ ẩm Nếu phát hiện mùi chua, cần đãi sạch để tránh hiện tượng bốc nóng, điều này có thể làm hỏng giống hạt.

- Khi hạt thóc nứt nanh phải nhanh chóng đảo nhẹ, rải mỏng, hạ nhiệt độ chỉ còn khoảng 25 o C, đậy nhẹ cho thóc khỏi khô

- Sau thời gian ủ 36-48h hạt thóc ra mầm đều, mầm bằng 1/3 rễ đem gieo là tốt nhất

Sau khi mạ đủ tuổi tiến hành canh tác như bình thường

+ Lô thí nghiệm 2: Sử dụng chế phẩm xử lý hạt giống, kết hợp xử lý đất (1 kg chế phẩm/20m 2 )

Bước 1 Xử lý hạt giống như thí nghiệm 1

Bước 2 trong quy trình canh tác lúa là làm đất, bao gồm cày và bừa như phương pháp thông thường Sau đó, phun chế phẩm lên toàn bộ diện tích cấy lúa với liều lượng 1 kg cho 20 m² Khi mạ đủ tuổi, tiến hành canh tác tách như bình thường.

+ Lô thí nghiệm 3: Không xử lý hạt giống, chỉ xử lý đất trồng lúa: 1 kg chế phẩm/20 m 2 (tiến hành xử lý đất trồng giống thí nghiệm 2)