Sơ lƣợc về Bacillus subtilis
Bacillus subtilis (B subtilis) là vi khuẩn gram dương, thuộc họ Bacillaceae, chi Bacillus, phân bố rộng rãi trong sinh quyển nhƣng phổ biến nhất là trong đất
Tế bào B subtilis có hình dạng que và khả năng tạo nội bào tử, giúp chúng bảo vệ bản thân trong điều kiện bất lợi, cho phép sinh vật này tồn tại trong những môi trường khắc nghiệt.
Tế bào vi khuẩn B subtilis được bao bọc bởi một thành tế bào vững chắc, bao gồm các lớp peptidoglycan, là polymer của đường và amino acid Thành tế bào này không chỉ tạo ra rào cản giữa môi trường và tế bào vi khuẩn mà còn giúp duy trì hình dạng của tế bào, cho phép tế bào chịu được áp lực cao từ môi trường nội bào.
Bacillus subtilis là một loại vi khuẩn tự nhiên, phổ biến trong đất và thảm thực vật, nhưng ít gặp hơn trong nước và không khí Vi khuẩn này phát triển tốt ở nhiệt độ trung bình, với nhiệt độ tối ưu từ 25-35 độ C Bacillus subtilis là sinh vật hiếu khí, có khả năng sống ký sinh và hình thành bào tử, cho phép chúng tồn tại trong các điều kiện nhiệt độ cao, thường gặp trong quá trình nấu ăn.
Hệ gen B subtilis 168 đã đƣợc giải mã thành công và công bố vào năm
Vào năm 1997, B subtilis được giải mã với một chromosome dạng vòng có kích thước 4,2 Mbp, chứa 4.100 gen mã hóa protein Sự thành công trong việc giải mã hệ gen này đã mở ra cơ hội quan trọng cho các nghiên cứu về proteome và metabolome của vi khuẩn, góp phần thúc đẩy hiểu biết về sinh học vi sinh vật.
B subtilis là vi khuẩn không gây độc và ngày càng trở thành vi sinh vật quan trọng trong nhiều lĩnh vực ứng dụng, từ sản xuất thực phẩm truyền thống đến công nghệ lên men hiện đại, sinh học phân tử, y dược học, và xử lý môi trường Sự gia tăng nghiên cứu về B subtilis cho thấy tiềm năng ứng dụng của chúng trong đời sống con người Vi khuẩn này có khả năng tiết ra nhiều enzyme quan trọng như protease, lipase, xylanase và pectinase kiềm, trong đó pectinase kiềm được ứng dụng rộng rãi trong ngành sản xuất nước ép trái cây, xử lý giấy và đặc biệt là trong xử lý vải bông thô.
Hệ biểu hiện Bacillus subtilis
B subtilis là vi khuẩn đã đƣợc nghiên cứu khá sâu về sinh học phân tử
Bacillus subtilis, chỉ sau E coli, là một loại vi khuẩn không gây bệnh với khả năng sinh trưởng mạnh mẽ Môi trường lên men của chúng đơn giản, rẻ tiền và dễ áp dụng trong công nghiệp Hệ tiết của B subtilis được công nhận là một trong những hệ thống tiết tốt nhất cho sản xuất protein tái tổ hợp Do đó, nhiều tác giả đã lựa chọn hệ biểu hiện B subtilis để sản xuất protein tái tổ hợp hiệu quả.
Promoter đóng vai trò quan trọng trong việc biểu hiện gen ngoại lai trong B subtilis Sử dụng promoter của gen ngoại lai thường không đạt hiệu quả cao khi biểu hiện trong tế bào B subtilis so với việc sử dụng promoter nội sinh của loài này.
RNA-polymerase holoenzyme thường không bám hiệu quả vào promoter ngoại lai, trừ một số trường hợp nhất định Tín hiệu tiết (signal peptide) đóng vai trò quan trọng trong việc biểu hiện hiệu quả của gen ngoại lai Wang và Doi (1989) đã xác định các tín hiệu tiết cần thiết cho sao mã và dịch mã của gen ngoại lai trong B subtilis, cùng với các yếu tố cần thiết để vượt qua rào cản của sự biểu hiện gen Việc lựa chọn giữa vector đa copy và vector tích hợp gen để biểu hiện gen ngoại lai là rất quan trọng, vì mỗi loại vector đều có ưu và nhược điểm riêng Vector đa copy thường cho khả năng biểu hiện mạnh hơn do có nhiều bản sao trong một tế bào chủ, nhưng lại kém bền vững hơn và cần duy trì áp lực chọn lọc (như bổ sung kháng sinh) Ngược lại, vector tích hợp có tính bền cao hơn nhờ vào việc tích hợp gen ngoại lai vào chromosome của tế bào chủ, do đó không cần áp lực chọn lọc khi biểu hiện gen.
Hiện nay, chủng vi khuẩn Bacillus là nguồn chính sản xuất protein tái tổ hợp trong công nghiệp, chiếm tới 60% lượng enzyme tái tổ hợp thương mại Mặc dù hệ biểu hiện B subtilis có những lợi thế, nhưng cũng gặp phải nhược điểm như sự tương tác bất lợi giữa sản phẩm biểu hiện và chủng biểu hiện, dẫn đến hiệu quả biểu hiện thấp hoặc thậm chí không thành công Tuy nhiên, việc sử dụng gen biểu hiện có nguồn gốc từ chính vi khuẩn này có thể loại bỏ hoàn toàn các ảnh hưởng bất lợi, mang lại hiệu quả biểu hiện cao hơn Hướng sản xuất protein tái tổ hợp này đã được chứng minh thành công với gen amylase và xylanase trong B subtilis qua một số nghiên cứu trong nước.
Pectin
Pectin là các đại phân tử polysaccharide phức tạp chủ yếu có trong tế bào thực vật, bao gồm pectin, pectin axit và oligogalacturonate Chúng có khả năng tan trong nước và ít nhất 75% các nhóm carboxyl của galactoronate bị ester hóa với methanol Oligogalacturonate là các chất đa phân tử nhỏ hơn, bao gồm hai hoặc vài đơn phân galacturonate, trong khi oligo methylgalacturonate cũng tương tự nhưng có thể bị methyl hóa một phần hoặc hoàn toàn ở vị trí C-6.
Hợp chất pectin, thuộc nhóm polysaccharide, chủ yếu bao gồm hai thành phần chính là galacturonan và rhamnogalacturonan Trong đó, carbon ở vị trí C-6 của galactose bị oxy hóa tạo thành nhóm carboxyl, bên cạnh đó còn có arabinan, galactan và arabinogalactan Rhamnogalacturonan là thành phần chủ yếu trong pectin, với chuỗi sơ cấp bao gồm các đơn vị α-D-galacturonate liên kết (1-4) và 2-4% L-rhamnose liên kết β-(1-2) và β-(1-4) với D-galacturonate Chuỗi bên của rhamnogalacturonan có thành phần và độ dài đa dạng, thường là các polymer đồng nhất của axit D-galacturonic hoặc L-arabinose.
Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của một đoạn pectin
Cấu trúc hóa học đặc trƣng của pectin đƣợc thể hiện ở Hình 1.1 Các đơn vị D-galactorunate liên kết với nhau bằng các liên kết α-1-4 glycoside Một số
D-galacturonate có thể bị methyl-este hóa tại vị trí O-6 của nhóm carboxyl hoặc acetyl-este hóa tại vị trí O-2 hoặc O-3 của nhóm hydroxyl Ngoài ra, một số dạng khác có thể chuyển đổi thành COO- hoặc –COOH tùy thuộc vào độ pH Mức độ methyl hóa và acetyl hóa của D-galacturonate rất đa dạng và phụ thuộc vào nguồn pectin.
Pectinase
Khái niệm pectinase
Enzyme pectinase, một loại enzyme xúc tác phân cắt pectin, được sản xuất tự nhiên bởi nhiều vi sinh vật như vi khuẩn, nấm, nấm men, côn trùng, giun tròn, nguyên sinh động vật và thực vật Các vi khuẩn đóng vai trò quan trọng trong quá trình này.
B subtilis là một trong nhóm vi khuẩn có khả năng tiết enzyme pectinase
Pectinase được ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành sản xuất như rượu vang, nước ép trái cây, công nghiệp dệt may và xử lý rác thải Trong công nghệ xử lý vải bông, việc sử dụng pectinase kiềm đã phát triển trong khoảng 10 năm qua và thu hút sự quan tâm của nhiều nhà công nghệ nhờ vào lợi ích lớn trong việc nâng cao chất lượng vải bông, rút ngắn thời gian xử lý, tiết kiệm năng lượng và giảm thiểu tác hại đến môi trường Hiện nay, một số loại pectinase thương mại đã được sản xuất và cung cấp trên thị trường để phục vụ cho ngành dệt.
Phân loại và cơ chế hoạt động của pectinase
Pectinase được phân chia thành các enzyme khác nhau dựa trên cơ chế hoạt động và cơ chất mà chúng xúc tác phân cắt Các enzyme này được phân loại thành ba nhóm chính, như được tóm tắt trong Bảng 1.1.
Bảng 1.1 Phân loại các pectinolytic enzyme [50]
Tên enzyme EC No Cơ chất Sản phẩm Cơ chế xúc tác Esterase
- Endopolymethylgalactu ronate lyase (endopetin lyases)
Protopectin Pectin axit Pectin axit Trigalacto- ronate 4:5 (galacturo- nate)n
Thuỷ phân Thuỷ phân Thuỷ phân Thuỷ phân
Pectinase hoạt động thông qua hai cơ chế phản ứng chính: thủy phân và phân cắt chuyển liên kết Cơ chế thủy phân yêu cầu nước để thực hiện, trong khi cơ chế chuyển liên kết có thể xảy ra trong điều kiện khô ráo, tạo ra sản phẩm với một liên kết đôi.
Pectin methylesterase (EC 3.1.1.11) hoạt động trên pectin để loại bỏ nhóm methoxyl từ nhóm carboxyl C-6 của galacturonate thông qua quá trình thủy phân Kết quả của phản ứng này là pectin axit, methanol và ion H+ từ sự ion hóa các nhóm carboxyl Sự giải phóng H+ từ nhóm carboxyl mới hình thành làm giảm độ pH của môi trường phản ứng, do đó, việc đo pH của dung dịch sau phản ứng có thể được sử dụng để xác định hoạt tính của pectin methylesterase.
Hình 1.2 Thủy phân pectin bởi pectin methylesterases
Pectin acetylesterase hydrolyzes pectin by removing the acetyl group from the hydroxyl groups at C2 and C3 of the galacturonate unit The enzyme was first identified in Aspergillus niger by Searle-van Leeuwen, Vincken, and colleagues in 1996 Additionally, Shevchik and Hugouvieux-Cotte-Pattat discovered two other forms of pectin acetylesterase in Erwinia chrysanthemi 3937 in 1997 However, research on pectin acetylesterase remains limited.
Hình 1.3 Sự thủy phân polygalacturonate bởi endo- và exopolygalacturonase
Endopolygalacturonase (EC 3.2.1.15) và exopolygalacturonase (EC
Thủy phân liên kết glycosid bên trong của polygalacturonate dẫn đến sự hình thành các polygalacturonate mạch ngắn hoặc galacturonate Hoạt động của hai enzyme này có thể được đánh giá thông qua việc xác định mức độ hình thành nhóm khử bằng 3,5-dinitrosalycylate.
Endopolymethylgalacturonase: thủy phân polymethylgalacturonate ngẫu nhiên thành oligomethylgalacturonate [6], [16] Phản ứng đƣợc xúc tác bởi sơ đồ sau:
Hoạt tính của endopolymethylgalacturonase cũng có thể đƣợc đo bằng cách xác định tỷ lệ nhóm khử Hình thành bởi sự thủy phân các liên kết glycosid
Endopolygalacturonate lyase (EC 4.2.2.2), hay còn gọi là pectinase, là một enzyme chỉ có ở vi sinh vật với pH tối ưu từ 8-10, cao hơn so với các enzyme phân giải pectin khác Enzyme này hoạt động cần sự hiện diện của ion Ca2+ và thực hiện quá trình phân cắt liên kết glycosid bằng cơ chế trans, tạo ra liên kết đôi giữa C-4 và C-5 của galacturonate.
Phương pháp hiệu quả nhất để xác định hoạt tính của enzyme này là phát hiện liên kết đôi bằng máy đo quang phổ ở bước sóng 232 nm Ngoài ra, hoạt tính cũng có thể được xác định qua phương pháp đường khử với 3,5-dinitrosalicylate Phản ứng này được xúc tác bởi endopolygalacturonate lyase.
Hình 1.4 Sự phân cắt polygalacturonate bởi pectinase
Exopolygalacturonate lyase (EC 4.2.2.9) chỉ được tìm thấy ở một số loài vi khuẩn như Clostridium multifermentan, Erwinia aroideae và Erwinia disolvens Cơ chất thích hợp cho enzyme này là polygalacturonate, không phải polymethylgalacturonate, và sản phẩm tạo thành là Δ4:5 digalacturonate không no Độ pH tối ưu cho hoạt động của enzyme nằm trong khoảng 8,0 – 9,5 Hoạt tính của exopolygalacturonate lyase có thể được xác định tương tự như phương pháp xác định endopolygalacturonate lyase Phản ứng xúc tác bởi enzyme exopolygalacturonate lyase diễn ra theo một sơ đồ cụ thể.
Endo methylgalacturonate lyase (EC 4.2.2.10) phân cắt pectin bên trong phân tử pectin, tạo thành sản phẩm cuối cùng là các oligomethylgalacturonates
[6], [16] Phản ứng xúc tác bởi Endo methylgalacturonate lyase nhƣ sau:
Hoạt tính của enzyme có thể được xác định thông qua phương pháp đường khử hoặc bằng cách đo trên máy quang phổ, phát hiện các liên kết đôi tại bước sóng 232 nm.
Pectinase của Bacillus subtilis
Pectinase từ vi khuẩn B subtilis đã được Nasser tinh sạch và nghiên cứu từ những năm 90, với khả năng xúc tác phân hủy pectin axit ở pH tối ưu 8,4 và nhiệt độ 42 oC Enzyme này có trọng lượng phân tử khoảng 45,6 kDa, bao gồm 420 amino acid, trong đó có 21 amino acid thuộc peptide tín hiệu tiết Để hoạt động hiệu quả, pectinase của B subtilis cần bổ sung Ca2+ vào phản ứng xúc tác, với ba vị trí bám Ca2+ nằm ở Asp-184, Asp-223 và Asp-.
227 do đó phản ứng xúc tác của chúng không thể thiếu Ca 2+ [32]
Các chủng B subtilis tại Việt Nam thường mang gen pel, và các biến chủng có thể có một số khác biệt trong gen này Dựa vào trình tự nucleotide đã biết, có thể dễ dàng tổng hợp cặp mồi để nhân gen bằng phương pháp PCR.
Ứng dụng của pectinase kiềm
Cấu tạo sợi bông tự nhiên
Trong lớp thứ cấp của sợi bông, cellulose kết nối với các chất không phải cellulose, trong đó có pectin Pectin tồn tại dưới hai dạng chính: pectin axit và pectin esterified.
Sợi bông tự nhiên bao gồm hai lớp: lớp sơ cấp mỏng bên ngoài và lớp thứ cấp dày bên trong Hàm lượng cellulose trong sợi bông chiếm tới 95%, trong khi 5% còn lại là các chất không phải cellulose, chủ yếu là pectin, hemicellulose, protein và chất sáp dính.
Bảng 1.2 Các thành phần cấu tạo sợi bông [9], [39]
Thành phần sợi bông Trọng lƣợng khô (%)
Lớp thứ cấp trong sợi bông chủ yếu chứa các chất không phải cellulose, vì vậy quá trình xử lý sợi bông tập trung vào việc loại bỏ lớp này Pectin, chiếm khoảng 0,4-1,2% trong sợi bông, đóng vai trò như chất kết dính giữa cellulose và các chất không phải cellulose Do đó, việc loại bỏ pectin sẽ giúp dễ dàng hơn trong việc loại bỏ các chất không phải cellulose khác trong sợi bông.
Ứng dụng pectinase kiềm trong công nghiệp xử lý vải bông
Công nghệ xử lý vải bông bằng enzyme pectinase kiềm, được gọi là “BioScouring”, là một giải pháp thay thế xút trong quá trình nấu kiềm, đã được nghiên cứu và triển khai thành công từ năm 1999 với sản phẩm BioPrep 3000L của Novozymes và Baylase EVO của Bayer Nghiên cứu cho thấy enzyme pectinase kiềm có khả năng loại bỏ pectin - chất kết dính giữa cellulose và các thành phần khác trong sợi bông, mà không làm ảnh hưởng đến cấu trúc cellulose, giúp bảo vệ sợi vải Đặc biệt, enzyme pectinase từ Bacillus pumilus BK2 đã chứng minh khả năng loại bỏ 80% pectin trong sợi bông Hơn nữa, việc kết hợp enzyme pectinase kiềm với các enzyme khác như lipase, protease và xylanase sẽ tăng cường hiệu quả loại bỏ các chất không phải cellulose như lignin, sáp và protein, mang lại kết quả tốt hơn so với việc chỉ sử dụng enzyme pectinase đơn lẻ.
Currently available alkaline pectinase products in the market include Bioprep 3000L, Pulpzyme HC, Scourzyme L from Novozymes, Baylase EVO from Bayer, Unizim PEC from Color-Center SA, Sera Zyme C from Singapore, and Prima Green Ecoscour from Genencor These alkaline pectinase formulations have significantly reduced production costs by saving water, energy, and processing time compared to traditional caustic soda cooking methods Additionally, the optimized processing conditions enhance efficiency and effectiveness in various applications.
Sử dụng enzyme pectinase giúp cải thiện chất lượng vải, tăng khả năng thấm hút nước và làm nổi bật độ tươi sáng của màu sắc sau khi nhuộm, theo nghiên cứu của Cavaco-Paulo & Gübitz (2003) [14].
Ứng dụng trong công nghiệp sản xuất bột giấy
Trong quy trình sản xuất bột giấy hiện đại, bước tẩy trắng bằng peroxide kiềm là thiết yếu để đạt được giấy trắng tinh khiết Việc không loại bỏ pectin axit trong bột giấy có thể dẫn đến sự hình thành phức hợp cationic polymer khi tẩy trắng, ảnh hưởng tiêu cực đến độ trắng của sản phẩm Sử dụng enzyme pectinase kiềm để loại bỏ pectin axit không chỉ nâng cao hiệu quả tẩy trắng mà còn bảo vệ môi trường.
Ứng dụng pectinase kiềm trong chiết xuất dầu thực vật, trong chế biến cà phê và trà 13 1.7 Tình Hình nghiên cứu pectinase tái tổ hợp trên thế giới và Việt Nam
Pectinase kiềm có khả năng phá vỡ vách tế bào thực vật, cho phép ứng dụng hiệu quả trong công nghệ chiết xuất dầu thực vật từ các loại hạt như hạt cải, dầu dừa, hạt hướng dương và hạt nho Việc sử dụng pectinase kiềm trong quá trình xử lý hạt giúp nâng cao hiệu suất chiết xuất dầu so với phương pháp dùng dung môi hexane, vốn có nguy cơ gây ung thư Hơn nữa, khi bổ sung pectinase kiềm cùng với hemicellulase và protease trong chế biến cà phê và trà lên men, năng suất và chất lượng sản phẩm được cải thiện đáng kể.
1.7 Tình Hình nghiên cứu pectinase tái tổ hợp trên thế giới và Việt Nam
Pectinase là một enzyme quan trọng trong ngành công nghiệp, thu hút sự chú ý của nhiều nhà khoa học Nhiều nghiên cứu đã thành công trong việc biểu hiện pectinase dạng tái tổ hợp trong tế bào E coli và tế bào Bacillus.
Mặc dù có nhiều nghiên cứu về enzyme pectinase tái tổ hợp từ tế bào nấm men Pichia pastoris, thông tin về sản xuất enzyme này trong công nghiệp và năng suất của các chủng tái tổ hợp vẫn còn hạn chế Nhiều chế phẩm enzyme pectinase thương mại thực chất là enzyme tái tổ hợp, nhưng các công bố về quy trình sản xuất trong ngành công nghiệp rất ít Nguyên nhân chính là các công ty thường giữ bí mật công nghệ để bảo vệ lợi ích kinh doanh Gần đây, Liu và cộng sự đã công bố kết quả biểu hiện gen pectinase từ B subtilis trong chính B subtilis.
WB600 là một sản phẩm hiệu suất cao, được thiết kế đặc biệt cho ứng dụng trong sản xuất công nghiệp Các tác giả đã thành công trong việc biểu hiện enzyme tái tổ hợp với hoạt tính riêng đạt 445 U/mg.
Không có thông tin cụ thể về hoạt tính pectinase, tức là số lượng enzyme ngoại bào (unit/ml) sau quá trình lên men Một nghiên cứu gần đây của Zhang và cộng sự đã thành công trong việc biểu hiện pectate lyase từ B subtilis 168 trong tế bào P pastoris GS115, nhằm mục đích ứng dụng loại pectin trong ngành công nghiệp xử lý sợi gai Nhóm nghiên cứu đã phát triển một chủng P pastoris tái tổ hợp có khả năng sản xuất pectinase hiệu quả trong môi trường lên men.
Hiện nay, enzyme pectinase đang được nghiên cứu rộng rãi tại Việt Nam, với nhiều đề tài tập trung vào việc cảm ứng, thu nhận và khảo sát các đặc tính của enzyme này Các nghiên cứu chủ yếu hướng đến việc tinh sạch, cố định và ứng dụng enzyme pectinase từ các chủng vi nấm, đặc biệt là từ Aspergillus.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Vật liệu
Các chủng vi khuẩn
Chủng B subtilis được sử dụng trong thí nghiệm sàng lọc enzyme pectinase, với 20 chủng B subtilis có nguồn gốc từ Việt Nam, được lấy từ bộ sưu tập giống của ngân hàng chủng giống VTCC thuộc Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học, Đại học Quốc gia.
Hà Nội và Trung tâm Công nghệ sinh học phục vụ đời sống và sản xuất (Biolab) đƣợc sử dụng để sàng lọc enzyme pectinase
Chủng vi khuẩn E coli chủng DH5α, DH10b (Invitrogen) đƣợc sử dụng cho mục đích tách dòng gen
Chủng B subtilis 168 M đƣợc sử dụng cho mục đích biểu hiện gen.
Hóa chất thí nghiệm
Các hóa chất trong sinh học phân tử:
Enzyme cắt giới hạn EcoRI, HindIII, XbaI, XhoI, ScaI, Dream Taq DNA polymerase, T4 ligase, DNA marker, protein marker đƣợc mua từ hãng
Kit tách DNA plasmid, kit tinh sạch DNA genome từ agarose, dung dịch Bradford đƣợc mua từ hãng Qiagen (CHLB Đức)
Common chemicals such as peptone, yeast extract, NaCl, agarose, glucose, tryptone, KCl, Tris HCl, EDTA, NaOH, MgSO4, MgCl2, glycerol, and CaCl2 are sourced from Merck (Germany) Additionally, Tris-HCl, hexadecyl trimethyl ammonium bromide (HTAB), citrus pectin, and acid pectin are obtained from Sigma.
Các vector sử dụng
Vector cloning: pJET1.2 đƣợc mua từ hãng Fermentas
Vector biểu hiện trong B subtilis dạng đa copy pMSE3 đƣợc nhận từ viện Công nghệ sinh vật Biển Greifswald.
Trình tự mồi
Tên và trình tự mồi Gen đƣợc nhân lên
Enzyme treo Mục đích BSpelF: atcg aag ctt atg aaa aaa gtg atg tta gc
BSpelR: atcg aag ctt tac tgc tga ctg tt pel HindIII
Nhân gen pel từ chủng tự nhiên pel-BaP-pMSE-XhoIf acttctcgagtcttgtaaatgagttgctag
Môi trường nuôi cấy
- Môi trường LB (g/l): Pepton 10, cao nấm men 5, NaCl 5
- Môi trường khoáng chất Belitsky (BMM):
Dung dịch Nồng độ (M) Lƣợng dịch cần (ml) PP khử trùng
KH 2 PO 4 0,2 0,2 khử trùng ƣớt
Glutamic axit 0,5 0,9 khử trùng ƣớt
Nước cất vô trùng Đến 100 khử trùng ướt
+ Thành phần chính (g/l): (NH4)2SO4 4; MgSO4.7H2O 4; KCl 4; Na3- citrat 2H 2 O 4; Tris-HCl 6,06; pH 7,5
- Môi trường lên men FM (g/l): Tinh bô ̣t ga ̣o 3; pepton đâ ̣u tương 3,5;
K2HPO4 0,7; KH2PO4 0,3; NaCl 0,5; pH 7,4
Dung dịch Nồng độ Lƣợng dịch cần
+ T-base (g/l): (NH4)2SO4 2; K2HPO4.3H2O 18,3; KH2PO4 6; Na3-citrate 1 Tất cả thành phần môi trường đều được khử trùng ướt trước khi sử dụng
- Môi trường SOC (g/l): Tryptone 20; yeast extract 5; NaCl 0,58; KCl
Phương pháp nghiên cứu
Sàng lọc các chủng B subtilis có hoạt tính pectinase trên môi trường thạch đĩa
Các chủng B subtilis trong bộ sưu tập được trẻ hóa trên môi trường LB thạch đĩa qua đêm, sau đó được cấy vạch sang môi trường LB thạch đĩa có bổ sung 0,2% pectin và nuôi qua đêm ở 37 ºC Sau khi nuôi cấy, các đĩa được nhuộm bằng dung dịch 0,5% hecxadecyl trimethyl trimethyl ammonium bromide (HTAB) để phát hiện vòng thủy phân pectin Những chủng sinh pectinase sẽ tạo ra vòng thủy phân xung quanh khuẩn lạc.
Thu nhận pectinase ngoại bào từ các chủng B subtilis tự nhiên
Các chủng B subtilis được nuôi cấy trong môi trường LB lỏng ở nhiệt độ 37 ºC với tốc độ 200 vòng/phút qua đêm Sau đó, chúng được cấy chuyển 1% sang môi trường LB lỏng có bổ sung pectin để kích thích sự sản sinh enzyme pectinase Sau 24 giờ nuôi cấy trong cùng điều kiện, dịch enzyme ngoại bào được thu thập bằng cách ly tâm ở tốc độ 10.000 vòng/phút.
10 phút ở 4 ºC để loại tế bào, dịch nổi chứa enzyme ngoại bào đƣợc thu nhận và bảo quản ở -20 ºC cho các thí nghiệm tiếp theo.
Thu nhận pectinase ngoại bào từ các chủng tái tổ hợp
Các chủng B subtilis tái tổ hợp được nuôi cấy trong môi trường LB lỏng có bổ sung 20 µg/ml Kan ở 37 ºC với tốc độ lắc 200 vòng/phút Sau khi cấy chuyển 1% sang các môi trường lỏng như LB, BMM hoặc FM cũng có bổ sung 20 µg/ml Kan, quá trình nuôi cấy diễn ra trong 26 giờ Sau đó, dịch enzyme ngoại bào được thu thập bằng cách ly tâm ở tốc độ 10.000 vòng/phút trong 10 phút tại 4 ºC để loại bỏ tế bào, và dịch nổi chứa enzyme ngoại bào được bảo quản ở -20 ºC cho các thí nghiệm tiếp theo.
Định lượng protein theo phương pháp Bradford [11]
Thuốc nhuộm Coomassie Blue G trong dung dịch có trạng thái cân bằng bền, và ở điều kiện axit mạnh, nó tạo ra phức hợp màu đỏ Khi protein có mặt, thuốc nhuộm kết hợp với protein, khiến dung dịch chuyển sang màu xanh Mức độ đậm nhạt của màu sắc phụ thuộc vào nồng độ protein trong dung dịch, cho phép định lượng nồng độ protein thông qua việc đo độ hấp phụ của dịch màu trên máy quang phổ ở bước sóng 595 nm.
Chuẩn bị đường chuẩn protein: pha BSA nồng độ 0, 10, 20, 40, 75, 100,
150 àg/ml trong nước cất
Pha loãng dung dịch Bradford 5x thành 1x, hút 0,98 ml dịch 1x vào các ống eppendorf Bổ sung 20 àl dịch protein BSA, ủ 5 phỳt ở nhiệt độ phũng Đo
OD ở 595 nm trên máy đo quang phổ Thiết lập đường chuẩn bằng chương trình Exel
Để đo nồng độ protein, cần pha loãng mẫu ở các tỷ lệ khác nhau như 1/10, 1/20 và 1/100 Thêm 20 µl mẫu protein vào 0,98 ml dung dịch Bradford 1x, sau đó đo độ hấp thụ quang (OD) tại 595 nm bằng máy quang phổ.
Chuyển đổi giá trị OD 595 sang nồng độ protein (mg/ml) theo công thức chuyển đổi Đồ thị đường chuẩn protein có dạng như sau: Đường chuẩn protein y = 1.247x + 0.3831
Hình 2.1 Đồ thị đường chuẩn protein Công thức chuyển đổi từ giá trị OD595 sang nồng độ protein:
(y - 0,3831) a x= - 1,247 Trong đó x là nồng độ protein (mg/ml), y là giá trị OD 595, a là số lần pha loãng mẫu.
Xác định hoạt tính pectinase bằng phương pháp đường khử (Bernfeld 1955)[10]
Phương pháp này dựa vào phản ứng của đầu đường khử của các oligogalacturonate, được tạo ra từ việc cắt liên kết glycoside của pectin bởi enzyme pectinase với 3,5 dinitrosalicylic axit (DNSA) Trong quá trình này, DNSA (màu vàng) được khử thành 3 amino, 5-nitrosalicylic axit (màu đỏ cam) Giá trị OD đo ở bước sóng 530 nm của dung dịch phản ứng phản ánh hoạt tính của enzyme pectinase.
Hình 2.2 Sơ đồ phản ứng khử 3,5 dinitrosalicylic axit thành 3 amino,
Chuẩn bị cơ chất: 0,2% pectin trong đệm phản ứng: Tris 50 mM, NaCl 20 mM, CaCl2 0,1 mM pH 10
Hỳt 50 àl dịch enzyme vào 350 àl dung dịch phản ứng 0,2% pectin, ủ
42 o C trong 1 giờ Mẫu đối chứng được thay dịch enzyme bằng 50àl nước cất
Bổ sung 400àl DNSA, đun sụi trong 5 phỳt, làm nguội ở nhiệt độ phũng Đo OD ở bước sóng 530 nm
Pha dung dịch DNSA: DNSA: 5 g; K-Na-tartarate: 150 g; NaOH 2M:
100 ml; nước cất: đến 500 ml
Đường chuẩn glucose được thiết lập để chuyển đổi giá trị OD 530nm của dịch phản ứng enzyme sang đơn vị unit Glucose được cân chính xác với độ sai số từ 0,0001 đến 0,0005 mg và được pha loãng với các nồng độ từ 0,2 đến 20 mM trong nước cất Sau đó, 0,5 ml dung dịch glucose ở các nồng độ khác nhau được bổ sung 0,5 ml DNSA, đun sôi trong 5 phút, làm nguội đến nhiệt độ phòng và đo OD trên máy quang phổ ở bước sóng 530 nm Đồ thị glucose chuẩn được thiết lập dựa trên phương trình hồi quy y = 0.7267x - 0.0654 bằng chương trình Excel.
Lượng đường khử sau phản ứng enzyme với cơ chất được tính theo công thức: y+ 0,654 x = -
0,7267 Trong đó: x là số mM đường khử được sinh ra sau phản ứng, y là giá trị
OD của phản ứng so màu ở 530 nm Định nghĩa đơn vị hoạt tính enzyme :
Một đơn vị hoạt tính enzyme (unit) đƣợc định nghĩa là lƣợng enzyme pectinase phõn cắt cơ chất pectin tạo ra 1 àM glucose trong 1 phỳt
Qui đổi từ giá trị OD 530 sang Unit đƣợc tính theo công thức sau:
E = - t, trong đó X đại diện cho số milimol (mM) đường khử được sinh ra sau phản ứng, t là thời gian phản ứng enzyme (phút), và 1000 là hệ số chuyển đổi từ mM sang micromol (µM) đường khử.
Xác định hoạt tính pectinase bằng phương pháp phát hiện liên kết đôi
Hình 2.4 Sơ đồ phản ứng cắt pectin axit của pectinase
Enzyme pectinase hoạt động bằng cách phân cắt các liên kết glycosid của pectin axit, tạo ra liên kết đôi giữa C-4 và C-5 của galacturonate ở đầu không khử Liên kết đôi này có thể được phát hiện qua máy quang phổ tại bước sóng 232 nm.
Các bước tiến hành: Đệm phản ứng: Tris 50 mM, NaCl 20 mM, CaCl 2 0,1 mM (pH tùy thuộc vào từng thí nghiệm)
Cơ chất pectin: 0,2% pectin axit trong đệm phản ứng
Hỳt 50 àl dịch enzyme vào 350 àl dung dịch cơ chất pectin, ủ 42 o C trong
1 giờ Bổ sung 400 àl dung dịch HCl 50 mM để kết thỳc phản ứng, ly tõm
10000 vòng/phút trong 5 phút sau đó đo trực tiếp trên máy quang phổ ở bước sóng 232 nm Đối chứng õm: thay dịch enzyme bằng 50 àl dH 2 O
Tách chiết DNA tổng số của vi khuẩn B subtilis
Để tách chiết DNA tổng số, cần phá vỡ cấu trúc tế bào và các liên kết giữa protein và DNA Trong quá trình tách chiết, việc làm bất hoạt các enzyme phân hủy DNA là rất quan trọng.
Nuôi 1 khuẩn lạc B subtilis trong LB lỏng, lắc 200 vòng/phút ở 37˚C qua đêm Hút 1ml dịch nuôi vào ống eppendorf, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 2 phỳt ở 4 o C Loại dịch trờn, hũa tan tế bào vào trong 100àl TE pH 8.0 Bổ sung
10 àl lysozyme nồng độ 100 àg/ml, lắc nhẹ, ủ hỗn hợp ở 37 ˚C trong 1 giờ, sau đú bổ sung thờm 10 àl SDS 1%
Để tách DNA bằng bộ kit của Bioneer, đầu tiên trộn 100 µl mẫu với 500 µl dung dịch 1 (dung dịch ly giải) để phá vỡ tế bào Sau đó, ủ hỗn hợp ở 70˚C trong 5 phút và để mẫu nguội đến nhiệt độ phòng.
600 àl chloroform, trộn đều hỗn hợp cho tới khi chuyển màu trắng sữa và ly tõm 10.000 vòng/phút trong 5 phút ở 4 o C
Để chuẩn bị dung dịch kết tủa DNA, cần pha loãng dung dịch 2 với nước cất theo tỉ lệ 1/10 Cụ thể, pha 80 µl dung dịch 2 với 720 µl nước cất Sau đó, sử dụng pipet để trộn nhẹ nhàng.
Pha 200 µl dung dịch DNA vào ống chứa 800 µl dung dịch kết tủa DNA, trộn đều và để ở nhiệt độ phòng trong 1-2 phút Sau đó, ly tâm với tốc độ 10.000 vòng/phút trong 5 phút ở 4°C Bỏ dịch nổi và hòa tủa trong 150 µl dung dịch hòa tan, trộn đều trong 10 giây cho đến khi tủa hoàn toàn hòa tan Tiếp theo, thêm 450 µl cồn tuyệt đối, trộn đều và để hỗn hợp ở -20°C trong 30 phút trước khi ly tâm.
Tiến hành ly tâm ở 10.000 vòng/phút trong 5 phút tại 4 độ C với 10.000 vũng/phỳt Sau đó, loại bỏ dịch nổi và thêm 500 µl cồn 75%, trộn đều để rửa tủa DNA Tiếp theo, loại bỏ hoàn toàn cồn và hòa tan DNA trong 100 µl dung dịch TE, bảo quản ở nhiệt độ -20 ºC.
Tách chiết DNA plasmid từ E coli
DNA plasmid từ E coli đƣợc tách bằng kit tách plasmid của Qiagen, các bước tách chiết được tiến hành theo hướng dẫn của hãng.
Tách chiết DNA plasmid từ B subtilis
Cấy 1 khuẩn lạc vi khuẩn trong 3 ml môi trường LB + 20 g/ml kanamycine, lắc qua đêm Hút 1,5 ml dịch nuôi cấy vào ống eppendoft, li tâm 10.000 vòng/phút trong 2 phút, bỏ dịch nổi, hòa tế bào lại trong 300 l dung dịch 1 (50 mM Tris-HCl; 5 mM EDTA; pH 7,5), bổ sung 5 l dung dịch RNase nồng độ 10 mg/ml và 5 l dung dịch lysozyme nồng độ 20 mg/ml (pha mới trong ngày), trộn đều, ủ 37º C trong 30 phút Bổ sung 200 l dung dịch 2 (200 mM NaOH; 1% SDS), đảo ngƣợc ống 3-4 lần Bổ sung 200 l dung dịch 3 (0,5
M kali acetate; pH 4,2), đảo ngƣợc ống 3-4 lần Chiết với 0,5 ml chloroform ( lặp lại 2 lần) Tủa plasmid bằng việc bổ sung 1 ml cồn ở - 20 o C qua đêm
Sau khi tủa bằng cồn, li tâm, làm khô và hòa lại plasmid trong 50 ul TE, bảo quản trong -20 o C.
Các phương pháp thao tác trong sinh học phân tử
2.3.10.1 Khuếch đại gen bằng PCR
Bảng 2.1 Thành phần phản ứng nhân gen
Thành phần Thể tớch (àl) dH2O vô trùng 35
DNA khuôn mẫu: từ dịch phản ứng gắn ở mục 3 2
Bảng 2.2 Chương trình nhân gen bằng PCR
Bước Phản ứng Nhiệt độ ( o C) Thời gian Chu kỳ
4 Kéo dài chuỗi 72 o C 1 phút 30 giây
2.3.10.2 Phản ứng cắt bằng enzyme hạn chế
Bảng 2.3 Thành phần phản ứng cắt pKTH/pUC bằng Hin dIII
Thành phần Thể tớch (àl) dH2O vô trùng 60
Buffer 10X 10 pKTH/pUC (100 ng/àl) 30
Tổng 100 Ủ 37 o C trong thời gian 1 - 16 giờ
Bảng 2.4 Thành phần phản ứng cắt pJET/pel bằng Hin dIII
Thành phần Thể tớch (àl) dH 2 O vô trùng 60
Buffer 10X 10 pJET/pel (100 ng/àl) 30
Tổng thể tích 100 Ủ 37 o C trong thời gian 1 - 16 giờ
2.3.10.3 Thiết kế gen dung hợp
Bảng 2.5 Thành phần phản ứng gắn gen pel với promoter
Thành phần Thể tớch (àl) dH2O vô trùng 10
Tổng thể tích 20 Ủ 22 o C trong thời gian 15 - 60 phút
Bảng 2.6 Thành phần phản ứng nhân gen dung hợp BaP-pel
Thành phần Thể tớch (àl) dH2O vô trùng 35
Dream Taq pol (5 u/àl) 0.5 DNA khuôn mẫu: từ dịch phản ứng gắn ở Bảng 2.5 2
Biến nạp plasmid vào E coli bằng phương pháp xung điện
Nuôi cấy khuẩn lạc vi khuẩn E coli DH 5α trong môi trường LB lỏng trên máy lắc 200 vòng/phút ở nhiệt độ 37°C qua đêm Sau đó, cấy chuyển 1% dịch tế bào vào 100 ml môi trường LB lỏng và lắc tiếp 220 vòng/phút ở 37°C cho đến khi mật độ quang học (OD 600) đạt 0,5 - 0,7 Cuối cùng, ủ lạnh trong 1 giờ, thu dịch và ly tâm ở 4000 vòng/phút trong 10 phút.
Bổ sung nước cất để rửa và thực hiện ly tâm hai lần ở 4 độ C Hòa tan cặn trong 0,5 ml nước khử ion lạnh Chuyển tế bào khả biến vào các ống Eppendorf, mỗi ống chứa 100 µl.
Hỳt 1 àl sản phẩm gắn gen vào ống eppendoft chứa tế bào khả biến, trộn nhẹ, đƣa vào cuvet xung điện Xung điện ở điều kiện 2,5 KV, 250 F
Bổ sung 0,5 ml môi trường SOC, (công thức môi trường xem trong phụ lục, phần môi trường) Hút dịch từ cuvert ra ống eppendoft Lắc 220 vòng/phút,
Trải 100 µl dịch nuôi trên môi trường thạch LB có bổ sung kháng sinh ampicillin 100 µg/ml, sau đó giữ trong tủ ấm ở 37°C trước khi kiểm tra sự phát triển của khuẩn lạc.
Biến nạp pMSE3/BaP-pel vào B subtilis 168
Plasmid pMSE3/BaP-pel được biến nạp vào B subtilis 168 theo phương pháp tế bào tương hợp Các bước tiến hành cụ thể:
Nuôi 1 khuẩn lạc BS168 trên môi trường SPII hoặc LB (2 ml), lắc 200 vòng/phút, 37 o C, qua đêm Cấy chuyển sang môi trường SPII mới (OD khởi đầu:
OD 600=0,1) (0,5 ml dịch nuôi cấy qua đêm cho vào 10 ml SPII), lắc tiếp 37 o C, 3 – 4 giờ OD 600 đạt khoảng 0,6 – 0,8
Thu tế bào: 1 ml dịch nuôi cấy vào ống eppendorf, li tâm 5000 vòng/phút,
Sau khi loại bỏ 0,9 ml dịch nổi trên bề mặt, bổ sung 15 µl dịch DNA (hoặc plasmid) với nồng độ 2 µg/µl, lắc tiếp trong 30 phút ở 37 độ C Tiếp theo, bổ sung 500 µl LB, lắc trong 1 giờ, và cấy trải 50-200 µl lên đĩa môi trường chọn lọc LB có 20 µg/ml kanamycin, sau đó ủ ở điều kiện thích hợp.
Thể biến nạp thu được trên môi trường chọn lọc mang pMSE3/BaP-pel là chủng B subtilis tái tổ hợp sinh pectinase sản lƣợng cao.
Phương pháp điện di protein SDS-PAGE (Laemmli, 2009)
Hỗn hợp enzyme được bổ sung với 15 µl đệm mẫu 2x và biến tính nhiệt ở 95 °C trong 5 phút Sau đó, hỗn hợp được làm lạnh trong đá tan và tiến hành điện di trên gel polyacrylamide 12% Sau khi điện di hoàn tất, gel được nhuộm trong dung dịch coomassie brilliant blue 0,1% trong 1 giờ và rửa bằng đệm rửa 5% ethanol, 10% axit acetic để phát hiện băng protein.
Thành phần Nồng độ các thành phần trong gel 10ml dH2O vô trùng 3,3
Thành phần Nồng độ các thành phần trong gel 3ml dH2O vô trùng 2,1
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Sàng lọc các chủng B subtilis phân lập từ trong nước có hoạt tính pectinase cao
Sàng lọc chủng B subtilis có hoạt tính pectinase trên đĩa thạch
Để tạo ra chủng biểu hiện gen pel từ B subtilis phục vụ cho ngành công nghiệp xử lý vải bông, các chủng B subtilis đã được lựa chọn để sàng lọc enzyme pel Vi khuẩn B subtilis được mua từ bộ sưu tập của VTCC - Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội, và Trung tâm Công nghệ sinh học phục vụ đời sống và sản xuất (Biolab) đã được sử dụng trong quá trình này Kết quả sàng lọc được trình bày trong Bảng 3.1.
Bảng 3.1 Kết quả sàng lọc các chủng B subtilis có khả năng phân hủy pectin trên đĩa thạch
Tên chủng gốc Nguồn gốc Vòng thủy phân pectin
Chú thích: (-) Không tạo vòng, (+) tạo vòng yếu, (++) tạo vòng mạnh với cơ chất pectin
Sau khi làm trẻ hóa các chủng vi khuẩn trên môi trường LB ở 37 o C, chúng được cấy chuyển sang môi trường LB thạch đĩa chứa 0,2% pectin và nuôi qua đêm để kiểm tra khả năng sản sinh pectinase Hoạt tính pectinase được phát hiện thông qua việc nhuộm đĩa thạch bằng dung dịch 0,5% hecxadecyl trimethyl ammonium bromide (HTAB) Kết quả cho thấy có 17 trên tổng số 20 chủng vi khuẩn dương tính với pectin, chứng tỏ hầu hết các chủng trong nghiên cứu đều có khả năng biểu hiện pectinase ra môi trường Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu trước đây về enzyme pectinase trong B subtilis.
Hình 3.1 Hình ảnh một số chủng B subtilis tạo vòng thủy phân pectin trên đĩa thạch LB 0,2% pectin Thứ tự các chủng từ 1-10: VBS6 đến VBS15.
Nghiên cứu khả năng phân cắt pectin ở pH kiềm bởi dịch enzyme ngoại bào của các chủng nghiên cứu
Mục đích của nghiên cứu này là chọn lọc các chủng B subtilis sản sinh enzyme pectinase, đặc biệt là những chủng hoạt động tối ưu ở pH kiềm từ 8 đến 10 Chúng tôi đã chọn 9 trong số 17 chủng vi khuẩn dương tính mạnh với pectin trên đĩa thạch để nuôi cấy trong môi trường lỏng, bổ sung 0,2% pectin nhằm kích thích tiết pectinase Sau 24 giờ nuôi cấy ở 37°C, enzyme ngoại bào được thu nhận và định lượng hoạt tính pectinase thông qua phản ứng với pectin Giá trị OD 530 nm từ phản ứng này được chuyển đổi sang đơn vị Unit dựa vào đồ thị chuẩn glucose với phương trình hồi quy y = 0,7267x – 0,0654, r = 0,9981 Kết quả cho thấy có 7 chủng có hoạt tính pectinase tối ưu ở pH 10, trong đó 2 chủng VBS7 và VBS10 có hoạt tính tối ưu ở pH 9,5-10 và pH 8,5-10 Tất cả 9 chủng B subtilis đều thuộc loại enzyme pectinase kiềm.
Bảng 3.2 Hoạt tính pectinase ở điều kiện pH phản ứng tối ƣu của các chủng nghiên cứu
STT Tên chủng pH tối ƣu Hoạt tính pectinae
So sánh hoạt tính pectinase của các chủng nghiên cứu cho thấy chủng VBS15 có hoạt tính thấp nhất (17,5 U/ml), trong khi chủng VBS11 đạt hoạt tính cao nhất (38,9 U/ml) Sự khác biệt này có thể do các chủng B subtilis được phân lập từ các nguồn khác nhau, dẫn đến sự khác biệt về gen và ái lực với pectin của enzyme Do đó, việc sàng lọc các chủng để chọn ra những chủng có hoạt tính pectinase cao là cần thiết để loại bỏ những enzyme có hoạt tính yếu.
Hình 3.2 Ảnh hưởng của pH đến khả năng phân hủy pectin của các pectinase từ các chủng nghiên cứu
Xác định hoạt tính pectinase bằng phương pháp phát hiện liên kết đôi
Bảng 3.3 Hoạt tính pectinase của các enzyme thu đƣợc
STT Tên chủng OD 232 nm
Pectinase có khả năng phân cắt pectin axit thông qua cơ chế chuyển liên kết, tạo ra một liên kết đôi trong phân tử galacturonate Các chủng có hoạt tính cao được in đậm trong nghiên cứu Sản phẩm phân cắt này có thể được phát hiện dễ dàng bằng máy đo quang phổ ở bước sóng 232 nm, với nước cất được sử dụng làm đối chứng âm.
Để xác định khả năng sinh enzyme pectinase của các chủng Bacillus, dịch enzyme ngoại bào từ B subtilis được nuôi cấy trên môi trường khoáng đã được thử nghiệm với cơ chất pectin axit (90% demethylation) Kết quả đo trên máy quang phổ tại bước sóng 232 nm cho thấy tất cả các chủng nghiên cứu đều có giá trị OD 232 nm cao hơn so với mẫu đối chứng âm Điều này chứng tỏ enzyme pectinase của các chủng này có khả năng phân cắt pectin axit, tạo ra liên kết đôi trong sản phẩm phản ứng, xác nhận rằng các enzyme pectinase thuộc nhóm pectinase.
So sánh hoạt tính enzyme giữa phương pháp phát hiện liên kết đôi và phương pháp đường khử cho thấy các mẫu có hoạt tính enzyme tỉ lệ thuận với nhau, do cơ chất pectin có khoảng 70% methyl hóa và 30% là pectin axit Enzyme pectinase xúc tác phản ứng tại các vị trí không bị methyl hóa, dẫn đến bản chất phản ứng tương tự mặc dù hai cơ chất khác nhau Bốn chủng VBS6, VBS8, VBS11 và VBS13 đạt giá trị OD 232 nm cao, được sử dụng trong thí nghiệm nhân dòng và giải trình tự gen.
Tách dòng gen pectinase trong E coli
Tách chiết DNA tổng số của các chủng B subtilis
Để nhân gen pectinase từ B subtilis, bước đầu tiên là tách chiết DNA tổng số từ tế bào Độ tinh sạch và hàm lượng DNA tách chiết sẽ ảnh hưởng trực tiếp đến thành công của các thí nghiệm tiếp theo.
Trong thí nghiệm này, chúng tôi đã sử dụng 4 chủng B subtilis đã được sàng lọc và đánh giá ban đầu về khả năng sinh enzyme pectinase Chúng tôi tiến hành tách chiết DNA tổng số của các chủng VBS6 và VBS8 để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.
VBS11 và VBS13 đã được thực hiện theo phương pháp đã mô tả, và DNA tổng số sau khi tách chiết được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% trong đệm TAE Kết quả cho thấy băng DNA có kích thước lớn và đậm, cho phép sử dụng cho phân tích PCR hoặc các nghiên cứu khác trong tương lai (Hình 3.3).
Hình 3.3 Điện di DNA tổng số của các chủng B subtilis 1-4: DNA genome của VBS6, VBS8, VBS11 và VBS13 M: DNA marker (Fermentas);
Thang DNA chuẩn đƣợc đặt ở bên.
Nhân gen pectinase bằng PCR
Mồi nhân gen được thiết kế dựa trên trình tự gen pectinase ưa kiềm của chủng B subtilis, đã được Nasser và cộng sự tách dòng và nghiên cứu Trình tự cặp mồi được sử dụng trong nghiên cứu này là BspelF và BSpelR, như đã mô tả trong phần vật liệu.
DNA tổng số của vi khuẩn B subtilis được tách chiết và sử dụng làm khuôn mẫu cho phản ứng PCR, nhằm khuếch đại đoạn gen bằng cặp mồi đã chỉ định Các thành phần của phản ứng PCR và chương trình nhân gen được mô tả chi tiết trong phần phương pháp.
Sau khi hoàn tất phản ứng PCR, sản phẩm được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 0,8% trong đệm TAE 1X Kết quả điện di cho thấy cả 4 mẫu DNA sử dụng làm khuôn đều khuếch đại thành công một đoạn gen khoảng 1,5 kb, đúng với kích thước dự kiến của gen pectinase.
Hình 3.4 Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân gen pectinase
1 - 4: sản phẩm PCR của VBS6, VBS8, VBS11 và VBS13: DNA marker Băng
DNA 1,5 kb đƣợc chỉ bằng mũi tên Thang DNA chuẩn đƣợc đặt ở bên.
Tách dòng các gen pel vào E coli
Gắn pel vào pJET1.2 và biến nạp vào E coli
Băng DNA 1,5 kb trong mục 3.2.2 được cắt ra và làm sạch bằng bộ kit gel-extraction của Qiagen Sau đó, DNA được làm tù đầu và gắn vào vector pJET1.2/blunt, tiếp theo là biến nạp vào E coli DH5α Các thể biến nạp được chọn lọc trên môi trường thạch đĩa LB chứa 100 µg/ml ampicillin ở 37 °C.
Hình 3.5 Khuẩn lạc các thể biến nạp E coli DH5 α mang pJET/pel trờn mụi trường chọn lọc LB, 100 àg/ml ampicillin
Các tế bào chứa vector nhưng không mang đoạn gen chèn sẽ không thể sinh trưởng do gen gây chết có trong vùng đa điểm nối của vector Ngược lại, những tế bào mang vector có đoạn gen chèn sẽ làm hỏng gen gây chết trong vector, dẫn đến việc gen này không biểu hiện, cho phép tế bào phát triển thành khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc.
Kết quả biến nạp cho thấy sự xuất hiện các thể biến nạp trên môi trường chọn lọc, điều này chứng tỏ rằng phản ứng gắn và thí nghiệm biến nạp đã đạt được thành công (Hình 3.5).
Phân tích plasmid bằng enzyme giới hạn
Hình 3.6 Điện di sản phẩm cắt pJET/pel bằng Hin dIII
1,2,: pJET1.2 mang gen pel của VBS6; 3,5: pJET1.2/pel; 4, 6: pJET1.2 mang gen pel của VBS8, M: Marker 12 kb (Fermentas) Băng 1,5 kb đƣợc chỉ bằng mũi tên Thang
DNA chuẩn đƣợc đặt ở bên.
Hình 3.7 Điện di sản phẩm cắt pJET/pel bằng Hind III
1 - 2,: pJET1.2 mang gen pel của VBS11; 3 - 4: pJET1.2 mang gen pel của VBS13, M: Marker 10 kb (Fermentas) Băng 1,5 kb đƣợc chỉ bằng mũi tên Thang DNA chuẩn đƣợc đặt ở bên.
Các khuẩn lạc được nhân lên riêng rẽ trong môi trường LB lỏng để tách plasmid Sau khi tách plasmid sạch bằng kit, chúng được cắt bằng enzyme giới hạn HindIII để kiểm tra sự hiện diện của đoạn gen đã được chèn vào.
Cả hai mồi dùng để nhân gen đã được thiết kế với điểm cắt HindIII ở đầu 5', do đó, khi cắt plasmid mang gen chèn bằng HindIII, sẽ xuất hiện một băng DNA 1,5 kb và một băng vector 3 kb.
Kết quả điện di trên gel agarose cho thấy hầu hết các mẫu cắt plasmid đều có một băng vector 3 kb và một băng 1,5 kb, tương ứng với kích thước đoạn gen được nhân lên bằng PCR Điều này xác nhận rằng đoạn gen 1,5 kb từ 4 chủng VBS6, VBS8, VBS11 và VBS13 đã được chèn vào vector pJET1.2 và nhân lên trong tế bào E coli Do đó, 4 gen pectinase từ B subtilis nguồn gốc Việt Nam đã được tách dòng thành công vào E coli trong vector pJET1.2.
Giải trình tự các gen pectinase
3.2.4.1 Trình tự 4 gen pectinase phân lập từ Việt Nam
Bốn dòng plasmid kích thước 1,5 kb chứa 4 gen pel đã được tách dòng và sử dụng để giải trình tự gen trên máy giải trình tự tự động Kết quả thu được là 4 trình tự nucleotide có độ dài tương đương, mã hóa cho một loại protein.
420 amino acid Toàn bộ trình tự nucleotide của 4 gen pel đƣợc chi tiết trong phụ lục Trình tự nucleotide của 4 gen pel từ chủng VBS6, VBS8, VBS11 và
VBS13 đã đƣợc đăng trên Genbank với mã số theo thứ tự là JX083068, JX083069, JX083070, JX083071 So sánh trình tự amino acid (aa) suy diễn của
4 gen trên bằng phần mền so sánh BLAST trên NCBI cho thấy chúng có độ tương đồng với các trình tự aa của Pel từ B subtilis168 lần lượt là 98,8; 99,7;
99,0 và 99,5% Điều này chứng tỏ rằng 4 gen pel đƣợc nhân dòng từ 4 chủng vi khuẩn VBS6, VBS8, VBS11 và VBS13 đều là gen mã hóa cho pectinase
3.2.4.2 Tính đa dạng của các pectinase phân lập từ B subtilis nguồn gốc Việt Nam
Mục đích của nghiên cứu là đánh giá sự đa dạng của các pectinase phân lập từ Việt Nam Trình tự amino acid (aa) của PL từ B subtilis 168 được sử dụng để so sánh với 4 Pel khác Phần mềm ClustalW đã được áp dụng để thực hiện việc so sánh này Kết quả cho thấy có 9 vị trí aa khác nhau khi so sánh giữa 5 trình tự aa.
Hình 3.8 trình bày sự so sánh trình tự amino acid của Pel từ bốn chủng B subtilis được phân lập ở Việt Nam với Pel từ B subtilis 168 Các amino acid không tương đồng đã được đánh dấu bằng bôi đen để dễ nhận diện.
So sánh trình tự aa của 4 Pel phân lập với Pel từ B subtilis 168 cho thấy sự khác biệt rõ rệt Cụ thể, Pel của VBS6 có 5 aa (L-162, H-181, A-248, M-249, Q-294), VBS8 có 1 aa (Q-294), VBS11 có 4 aa (K-118, T-140, Q-294, P-356) và VBS13 có 2 aa (D-69, A-376) khác biệt so với Pel của B subtilis 168 Điều thú vị là Pel từ VBS6 và VBS11, phân lập từ đất, có số lượng aa khác biệt nhiều hơn so với Pel từ VBS8 (1 aa) và VBS13 (2 aa), cho thấy các chủng phân lập từ thực vật có trình tự aa ít thay đổi hơn B subtilis 168 có nguồn gốc từ B subtilis ATCC 6051, được phân lập từ thực vật bởi Cohn vào năm 1875 và đã được gây đột biến dị dưỡng tryptophan từ chủng này.
Tạo chủng B subtilis tái tổ hợp sản sinh pectinase
Thiết kế vector biểu hiện gen pectinase trong B subtilis
3.3.1.1 Sơ đồ thiết kế vector biểu hiện gen pel trong B subtilis
The gene expression structure in B subtilis consists of the BaP promoter derived from the amylase gene of B amyloliquefaciens, a gene encoding pectinase, and a terminator (Ter) from the VBS11 strain The design of the expression vector for the pel gene includes two main components.
Trong phần 1, chúng tôi tiến hành tạo gen dung hợp BaP-pel bằng cách kết nối promoter của gen amylase từ Bacillus amyloliquefaciens (BaP) có trong plasmid pKTH với gen pel của Bacillus subtilis được phân lập từ Việt Nam Plasmid pKTH/pUC được tạo ra bằng cách kết hợp hai plasmid pKTH và pUC18, mang theo promoter BaP thông qua điểm cắt HindIII.
Trong phần 2, chúng tôi tiến hành gắn gen dung hợp BaP-pel vào vector biểu hiện đa copy pMSE3 nhằm tạo ra một vector biểu hiện hoàn chỉnh Sơ đồ thiết kế của vector này được trình bày rõ ràng trong Hình 3.9.
Hình 3.9 Sơ đồ thiết kế vector biểu hiện pel trong B subtilis
3.3.1.2 Dung hợp promoter BaP vào gen pel
Để đạt hiệu quả biểu hiện gen, việc lựa chọn một promoter mạnh là rất cần thiết Promoter BaP đã được xác nhận là có khả năng biểu hiện mạnh các protein trong tế bào B subtilis qua nhiều nghiên cứu trước đây Do đó, chúng tôi đã quyết định sử dụng promoter này để điều khiển sự biểu hiện của gen pel trong tế bào B subtilis.
Hình 3.10 Điện di sản phẩm cắt pKTH/pUC bằng Hin dIII 1: pKTH/pUC cắt bằng HindIII, 2: DNA marker Thang DNA chuẩn đƣợc đặt ở bên.
Để thu nhận plasmid pKTH-BaP (pKTH mang promoter BaP), plasmid pKHT/pUC đã được cắt bằng enzyme HindIII nhằm loại bỏ pUC18 (2,7 kb) Kết quả thu được là băng DNA 3,7 kb, tương ứng với pKTH-BaP, được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo (Hình 3.10) Thành phần của phản ứng cắt được trình bày chi tiết trong Bảng 2.1 ở phần phương pháp.
Thu nhận pel từ pJET/pel
Gen pel từ plasmid pJET/pel tách dòng từ chủng VBS11 được sử dụng để thiết kế vector biểu hiện Sau khi cắt plasmid pJET/pel bằng HindIII, DNA được phân tách trên gel agarose 0,8% Băng DNA 1,5 kb thu nhận được đã được làm sạch bằng bộ kit chiết gel (Qiagen) và kiểm tra lại trên điện di agarose Kết quả cho thấy gen pel có độ tinh sạch cao, đảm bảo chất lượng cho các thí nghiệm tiếp theo.
Hình 3.11 Thu nhận pel từ pJET/pel Gen pel 1,5 kb đƣợc chỉ bằng mũi tên
Để tạo gen dung hợp BaP-pel, trước tiên cần nối pKTH-BaP và pel bằng T4 ligase, tạo thành sợi khuôn cho phản ứng PCR Thành phần phản ứng nối được thực hiện theo Bảng 2.3 trong phần phương pháp, với điều kiện phản ứng ở 16 °C trong suốt một đêm Sau khi hoàn tất, sản phẩm gắn gen sẽ được sử dụng làm khuôn mẫu cho phản ứng nhân gen dung hợp BaP-pel.
Nhân gen dung hợp BaP-pel bằng PCR
Phản ứng gắn BaP với pel có hai khả năng: thứ nhất, BaP nối thuận chiều với pel, tức là kết nối trực tiếp với đầu 5’ của gen pel; thứ hai, BaP nối ngược chiều, kết nối với đầu 3’ của gen pel Mồi xuôi (mồi F) được thiết kế để bám vào vị trí đầu 5’ của promoter BaP, trong khi mồi ngược (mồi R) bám vào vị trí đầu 3’ của pel Do đó, trong phản ứng PCR, chỉ có BaP-pel nối thuận chiều mới được nhân lên Gen dung hợp BaP-pel sẽ bao gồm promoter BaP và terminator của pel.
Hình 3.12 Sơ đồ nhân gen dung hợp BaP-pel bằng PCR Vị trí bám của mồi đƣợc chỉ bằng mũi tên ngang
Chúng tôi đã thiết kế một cặp mồi nhân gen dung hợp BaP-pel nhằm mục đích tạo ra vector biểu hiện đa copy, và tiến hành tích hợp vào plasmid pMSE3.
Sản phẩm ligationnối thuận chiều
Gen dung hợp được nhân lên bằng cặp mồi
Ter mồi được chi tiết trong phần phương pháp Thành phần phản ứng PCR của thí nghiệm đƣợc thể hiện trong Bảng 2.6
Sau khi thực hiện phản ứng nhân gen với cặp mồi và khuôn mẫu sản phẩm gắn gen, sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di agarose 0,8% Kết quả cho thấy một đoạn gen khoảng 1,8 kb đã được nhân lên, tương ứng với tổng chiều dài của promoter BaP (0,384 kb) và gen pel (1,438 kb) Điều này chứng minh rằng promoter BaP đã được nối thuận chiều với gen pel, và gen dung hợp BaP-pel đã được nhân lên thành công bằng PCR.
Hình 3.13 minh họa quá trình nhân gen dung hợp BaP-pel bằng phương pháp PCR Sử dụng hai cặp mồi 1 và 2 để khuếch đại BaP-pel, với DNA marker 1 kb (EUR) được hiển thị ở bên cạnh Băng DNA có kích thước 1,8 kb được chỉ rõ bằng mũi tên.
3.3.1.3 Tạo vector đa copy pMSE/BaP-pel
Hình 3.14 Kiểm tra gen dung hợp BaP-pel trong pMSE/BaP-pel
1 - 2: pMSE/BaP-pel đƣợc cắt bằng XhoI và XbaI., M : DNA marker 1 kb (EUR)
Băng DNA 5,6 kb và 1,8 kb được chỉ bằng mũi tên, với thang DNA chuẩn ở bên Để đưa gen BaP-pel vào pMSE3, pMSE3 và BaP-pel được nhân lên bằng PCR và làm sạch bằng kit QIAGEN từ agarose, sau đó xử lý với XhoI và XbaI trước khi nối bằng T4 ligase ở 16 ºC qua đêm Sản phẩm nối được biến nạp vào DH10b bằng phương pháp xung điện và chọn lọc trên môi trường LB thạch đĩa bổ sung 50 µg/ml kanamycin và 20 µg/ml streptomycin Các thể biến nạp sinh trưởng được nuôi cấy trong môi trường lỏng để tách chiết plasmid và kiểm tra bằng enzyme giới hạn Kết quả điện di agarose cho thấy plasmid sau khi cắt bằng XhoI và XbaI cho 1 băng vector kích thước khoảng 5,6 kb và một băng kích thước 1,8 kb, chứng tỏ gen BaP-pel đã được đưa thành công vào vector pMSE3, và plasmid mang gen BaP-pel được đặt tên là pMSE/Bap-pel.
Nghiên cứu chuyển gen pectinase vào B subtilis
3.3.2.1 Chuẩn bị plasmid đa copy pMSE/BaP-pel
Biến nạp gen vào B subtilis yêu cầu lượng plasmid lớn (30-50 µg) và nồng độ plasmid cao (khoảng 2 µg/µl) để đạt hiệu quả Trong thí nghiệm này, plasmid pMSE/Ba-pel được tách sạch từ E coli bằng kit tách plasmid của Qiagen theo hướng dẫn Kết quả tách plasmid được xác nhận qua điện di agarose, cho thấy băng vector (5,6 kb) và băng gen dung hợp BaP-pel (1,8 kb) (Hình 3.14) Điều này chứng tỏ plasmid pMSE/BaP-pel đã được tách sạch và đạt chất lượng cần thiết cho thí nghiệm biến nạp gen.
3.3.2.2 Biến nạp gen pectinase vào B Subtilis 168
Plasmid pMSE3/BaP-pel đã được biến nạp vào tế bào B subtilis 168 thông qua phương pháp tế bào tương hợp tự nhiên Sử dụng 5 µg plasmid trong tổng thể tích 15 µl để thực hiện quá trình biến nạp Sau khi hoàn tất, các thể biến nạp được chọn lọc trên môi trường thạch đĩa bổ sung.
Môi trường nuôi cấy LB lỏng bổ sung 20 µg/ml kanamycin được sử dụng để kiểm tra sự hiện diện của plasmid trong các thể biến nạp sinh trưởng Sau khi tách plasmid, chúng được phân tích để xác định sự có mặt và tính chất của chúng trong tế bào.
XhoI và XbaI được kiểm tra bằng phương pháp điện di agarose, cho thấy các plasmid tách từ các thể biến nạp khác nhau đều xuất hiện băng vector (5,6 kb) và băng gen dung hợp BaP-pel (1,8 kb) Kết quả này khẳng định plasmid pMSE3/BaP-pel đã được biến nạp thành công vào B subtilis 168, và chủng tái tổ hợp này được đặt tên là BSM.
Hình 3.15 Kiểm tra pMSE/BaP-pel trong tế bào B subtilis 168 tái tổ hợp
1 và 2: pMSE/BaP-pel đƣợc cắt bằng XhoI và XbaI., 3 : DNA marker 1 kb Băng vector (5,6 kb) và BaP-pel (1,8 kb) đƣợc chỉ bằng mũi tên.
Biểu hiện chủng tái tổ hợp BSM sản sinh pectinase trên môi trường lỏng
Để đánh giá sự biểu hiện pectinase trên môi trường lỏng của chủng BSM,
Bốn thể biến nạp khác nhau được trẻ hóa trên môi trường LB lỏng 20 µg/ml kanamycin, sau đó cấy chuyển sang môi trường BMM với tỉ lệ 1% để kiểm tra sự biểu hiện của gen tái tổ hợp Sau 24 giờ nuôi cấy lắc ở 200 vòng/phút và 37°C, enzyme ngoại bào được thu nhận bằng cách ly tâm để loại bỏ sinh khối, và sau đó protein được kiểm tra thông qua điện di SDS-PAGE cùng với khả năng phân hủy cơ chất pectin.
Hình 3.16 trình bày kết quả điện di SDS-PAGE của dịch enzyme ngoại bào từ chủng B subtilis tỏi tổ hợp đa copy trong môi trường LB+Kan Các mẫu 1-4 là 15 µl dịch enzyme ngoại bào từ các thể biến nạp khác nhau, trong khi mẫu 5 là dịch lên men từ chủng B subtilis 168.
Kết quả điện di SDS-PAGE cho thấy dịch enzyme từ 4 thể biến nạp đều có một băng protein rõ nét kích thước 42 kDa, phù hợp với kích thước của pectinase Trong khi đó, mẫu đối chứng từ chủng BS168 chỉ cho thấy băng mờ, chứng tỏ băng protein 42 kDa là pectinase tái tổ hợp đã được biểu hiện, đặc biệt là mẫu 5 từ dịch enzyme của chủng B subtilis.
168 do pectinase đƣợc sinh ra tự nhiên nên nồng độ enzyme quá thấp cho nên không thể phát hiện đƣợc trên điện di protein (Hình 3.16)
Kết quả kiểm tra hoạt tính pectinase cho thấy chủng đối chứng B subtilis 168 chỉ có hoạt tính đạt 15 U/ml, trong khi các mẫu từ chủng tái tổ hợp có hoạt tính pectinase cao hơn, dao động từ 66 đến 72 U/ml, gấp 4,6-4,8 lần so với chủng B subtilis 168.
BSM1 BSM2 BSM3 BSM4 BS168
Các thể biến nạp khác nhau
Hoạt tính pectate lyase của B subtilis tái tổ hợp đa copy
Hình 3.17 trình bày kết quả kiểm tra sự biểu hiện của enzyme pectinase trong các thể biến nạp đa copy của tế bào B subtilis 168 sau 24 giờ nuôi cấy Các mẫu BSM 1-5 đại diện cho các thể biến nạp đa copy, trong khi BS168 là chủng B subtilis 168 không được biến nạp gen.
Hoạt tính pectinase của thể biến nạp được kiểm tra trên đĩa thạch chứa 0,2% pectin axit bằng phương pháp đục lỗ Sau khi nhỏ 30 µl dịch enzyme ngoại bào vào lỗ thạch và ủ ở 42 ºC qua đêm, mẫu được nhuộm với ruthenium red 0,05% Kết quả cho thấy đường kính vòng hoạt tính của mẫu tái tổ hợp BSM đạt 3 cm, vượt trội so với mẫu đối chứng B subtilis 168 không mang gen chỉ có đường kính 1,8 cm.
Hình 3.18 trình bày việc kiểm tra hoạt tính của enzyme pectinase trong thể biến nạp đa copy BSM và chủng B subtilis 168 trên cơ chất pectin axit BSM là thể biến nạp đa copy, trong khi chủng BS168 là B subtilis 168 không được biến nạp gen.
Nasser và cộng sự (1993) đã thành công trong việc biểu hiện gen pel của B subtilis trong tế bào E coli với hệ thống T7 promoter, tạo ra một protein nguyên vẹn 42 kDa và một protein không nguyên vẹn 33 kDa Tuy nhiên, trong nghiên cứu của chúng tôi, gen pel chỉ cho một băng protein 42 kDa khi biểu hiện trong B subtilis, cho thấy hiệu quả biểu hiện tốt hơn so với E coli Liu và cộng sự (2011) cũng đã biểu hiện thành công gen pectinase kiềm (Apel) từ B subtilis TCCC11286 trong tế bào B subtilis WB600, cho kết quả là một băng protein duy nhất 45 kDa, tương tự như kết quả của chúng tôi.
