TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
Giới thiệu về Trà hoa vàng Tam Đảo
1.1.1 Hệ thống phân loại và phân bố
Hình 1.1 Cây Trà hoa vàng Tam Đảo
Hệ thống phân loại Giới : Plantae
Tên khoa học: Camellia tamdaoensis Ninh et Hakoda
(http://caytrahoavang.com/tra-hoa-vang-tam-dao-camellia-tamdaoensis-ninh-et-hakoda/)
Trà hoa vàng Tam Đảo, có tên khoa học là C tamdaoesis Ninh et Hakoda, là một loài thực vật hạt kín thuộc họ Chè (Theaceae) và là loài đặc hữu của Vườn Quốc gia Tam Đảo Loài này phân bố ở sườn dốc phía Tây Nam dãy núi Tam Đảo, ở độ cao từ 200 đến 600m Họ Chè hiện chưa thống nhất về số lượng chi loài, với khoảng 18 chi và 500 loài được ghi nhận bởi L Watson và M.J Dallwitz Phần lớn các chi có nguồn gốc từ miền Đông Châu Á, trải dài từ Malaysia đến Nhật Bản, trong khi một số chi khác xuất hiện ở Nam và Trung Mỹ, cùng với hai chi Franklinia và Gordonia có nguồn gốc từ Đông Nam Hoa Kỳ.
1.1.2 Đặc điểm sinh học Trà hoa vàng Tam Đảo
Cây Trà hoa vàng Tam Đảo là thân gỗ nhỏ hay cây bụi, nhánh, không lông, cao 2
Cây có chiều cao khoảng 4 mét, mọc rải rác trong rừng, với thân tròn, thẳng và màu trắng nhạt Cành non và ngọn cây có màu nâu đỏ Lá cây có cuống, hình trái xoan dài, đầu nhọn, kích thước lá dài từ 9,5 đến 14,5 cm và rộng.
Lá cây có kích thước từ 3,5 đến 5,0 cm, mọc đơn lẻ và không có lá kèm Lá non có màu nâu đỏ và thường mọc chúc xuống, tạo nên đặc điểm dễ nhận diện Hệ gân lá nổi rõ cả hai mặt, với 8 đến 9 đôi gân, gân phụ chạy hợp mép Phiến lá dày, cứng, dài, và mép lá có răng cưa.
Hoa trà có cuống dài từ 7 đến 10 mm, với 5 lá bắc, 5 lá đài và 8 đến 10 cánh hoa Nhị hoa rất nhiều, bầu nhụy không có lông và vòi nhụy dính nhau một phần, có từ 3 đến 4 nhụy Hoa trà nở lâu tàn, có thể duy trì từ 8 đến 10 ngày, thường nở vào mùa từ tháng 10 đến tháng 12 Quả trà thuộc loại quả nang, có từ 1 đến 4 hạt, với hình dạng có thể là tròn, tam giác hoặc vuông tùy theo số hạt, đường kính khoảng 3 cm Khi quả chín, vỏ sẽ nứt ra, gồm 6 đến 7 lớp tế bào tạo thành lớp vỏ cứng, bên trong là lớp lụa mỏng màu nâu có nhiều gân, giúp vận chuyển nước và dinh dưỡng Nhân trà có 2 lá mầm, trong đó lá mầm chiếm 3/4 khối lượng hạt trà, là nơi dự trữ dinh dưỡng.
Trà hoa vàng Tam Đảo là loài cây có hệ rễ đa dạng, bao gồm rễ trụ sâu vào đất, rễ bên và rễ hấp thụ phân bố từ tầng canh tác Cây trà rụng lá hàng năm vào mùa khô và có nhịp sinh trưởng rõ rệt Mùa hoa nở diễn ra từ tháng 10 đến 12, với thời gian hoa nở kéo dài từ 8 đến 10 ngày Loài trà này phát triển tốt trong điều kiện khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, với nhiệt độ lý tưởng trên 20°C, độ ẩm không khí từ 85% - 90%, lượng mưa từ 1000 - 2000 mm, và độ cao từ 300 - 500 m so với mặt nước biển.
Trà hoa vàng Tam Đảo yêu cầu đất tơi xốp, giàu mùn, thoát nước tốt và giữ ẩm, với độ pH từ 4,5 đến 5,5 Cây trà này ưa sáng, nên cần trồng ở những khu vực đồi gò, với khoảng cách thưa và tán cây rộng để phát triển hoa và lá lớn Ngược lại, ở những nơi thiếu ánh sáng như khe núi hay chân núi, hoa sẽ nhỏ hơn và quả kém phát triển, mặc dù cây vẫn có thể sinh trưởng tốt.
1.1.3 Giá trị sử dụng cây trà hoa vàng
Các loài thuộc chi chè và họ trà đã được con người sử dụng cho nhiều mục đích khác nhau Dựa trên các công bố, chúng ta có thể phân loại chúng thành những nhóm chính.
Trà hoa vàng, cùng với các loài thuộc chi Camellia, đã được sử dụng làm đồ uống từ những năm trước Công nguyên, đặc biệt phổ biến tại Trung Quốc và nhiều nước châu Á Ở Nhật Bản và Trung Quốc, trà trở thành một phần quan trọng trong văn hóa ẩm thực Tại Việt Nam, cây trà cũng được trồng rộng rãi, tuy nhiên trà xanh vẫn được biết đến nhiều hơn so với trà hoa vàng Một điểm nổi bật của trà hoa vàng là chiết xuất từ lá trà này không chứa caffeine, khác với trà xanh, giúp nó trở thành lựa chọn lý tưởng cho những ai nhạy cảm với chất này.
Hạt trà không chỉ được sử dụng để chưng cất dầu mà còn phổ biến trong ẩm thực, đặc biệt ở Trung Quốc và Nhật Bản, nơi dầu ăn chiết xuất từ hạt trà được ưa chuộng Hơn 200 loài trà đã được khai thác để sản xuất thực phẩm và phục vụ cho các ngành công nghiệp khác Bên cạnh đó, các hợp chất như acid tanic và oleic acid có trong lá và quả trà cũng đóng vai trò quan trọng trong ngành dược phẩm.
Dùng làm thuốc chữa bệnh
Cây trà hoa vàng sở hữu giá trị dược liệu quý báu, với nhiều công dụng được khoa học chứng minh Nghiên cứu cho thấy trà hoa vàng có khả năng kiềm chế sự sinh trưởng của khối u lên đến 33,8%, giảm 35% cholesterol và 36,1% lipoprotein trong máu, vượt trội hơn 10% so với thuốc tây Các chế phẩm từ trà hoa vàng còn giúp giảm triệu chứng xơ vữa động mạch và điều hòa huyết áp, đồng thời hỗ trợ điều trị các bệnh về đường hô hấp và bài tiết Trung Quốc đã khai thác tiềm năng này bằng cách xây dựng Vườn Camellia Quốc tế và sản xuất thành công các sản phẩm như Golden Camellia, mang lại lợi nhuận lớn Mặc dù Việt Nam có nguồn trà hoa vàng phong phú, nhưng nghiên cứu và ứng dụng giá trị dược liệu vẫn chưa được chú trọng, cùng với đó là tình trạng suy giảm đáng kể số lượng cá thể tự nhiên, đe dọa nguồn gen quý giá này.
Chi trà là nhóm thực vật có hoa lớn, đẹp và đa dạng màu sắc, đặc biệt một số loài nở đúng dịp Tết Nguyên đán, thường được dùng làm cây cảnh Sự lai tạo và phối hợp các màu hoa không chỉ thu hút sự chú ý của các nhà lai tạo mà còn làm tăng giá trị của cây trà, đặc biệt khi tạo ra giống trà với màu hoa hiếm và độc đáo.
Phân tích di truyền bằng kỹ thật RAPD–PCR
1.2.1 Kỹ thuật chỉ thị phân tử trong cải tiến di truyền Camellia
Cải tiến cây trồng đã bắt đầu từ khi con người bắt đầu canh tác Hiệu ứng di truyền nút cổ chai được áp dụng trong quá trình thuần hóa sớm và các hoạt động nhân giống hiện đại, dẫn đến việc tạo ra các giống cây trồng chỉ chứa một phần biến đổi hiện tại trong bộ gene.
Trà là dị hợp tử cao, và việc lai xa đã dẫn đến sự biến đổi liên tục trong các đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa Việc tạo ra các dòng trà có năng suất và chất lượng cao thông qua vi nhân giống đã trở nên phổ biến từ những năm 1960, thay thế cho phương pháp nhân giống bằng hạt Các dòng này đồng nhất về di truyền và tương đồng về năng suất, nhưng việc lựa chọn dòng vô tính cũng có nhược điểm, như sự thay đổi năng suất dưới điều kiện bất lợi và dễ bị tấn công bởi sâu bệnh Khả năng thích ứng và kháng cự của các giống trà chưa được xem xét đầy đủ, dẫn đến nguy cơ mất mát nguồn tài nguyên di truyền quý giá và tăng rủi ro từ sâu bệnh hại.
Đa dạng di truyền đóng vai trò quan trọng trong khả năng tồn tại và thích ứng của các giống trà với điều kiện môi trường thay đổi Nghiên cứu về đa dạng di truyền trong quần thể và hạt giống là cần thiết trước khi thay thế các giống trà có sự tương đồng di truyền Các chỉ thị phân tử, như RAPD, ISSR, AFLP và SSR, đã được áp dụng để đánh giá đa dạng di truyền, từ đó tạo cơ sở cho việc cải thiện nguồn gene trà và xây dựng các chương trình bảo tồn phù hợp Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng các chỉ thị phân tử này rất quan trọng trong việc định hướng nghiên cứu và phát triển giống trà mới.
2008 Bên cạnh đó các chỉ thị lục lạp như matK, rbcL, trnH-psbA, psbK-psbI bởi: Katoh et al., 2003 40; Nguyễn Đức Thành, 2015 16; Hà Văn Huân và cs, 2015 5
Tác giả đã chọn kỹ thuật RAPD để nghiên cứu đa dạng di truyền của 10 cá thể Trà hoa vàng Tam Đảo (Camellia tamdaoensis Hakoda et Ninh), nhằm xác định tính đa dạng di truyền làm cơ sở cho việc lựa chọn vật liệu trong mẫu in vitro.
Kỹ thuật RAPD dựa trên kỹ thuật PCR, bằng cách sử dụng những primer ngắn (8
Phản ứng PCR - RAPD sử dụng các primer có trình tự 20 nucleotide đã biết để bắt cặp và nhân bản ngẫu nhiên các đoạn ADN có trình tự bổ sung Nguyên tắc cơ bản là khi hai cá thể hoàn toàn giống nhau, chúng sẽ tạo ra số lượng đoạn băng giống nhau và chiều dài tương ứng khi thực hiện phản ứng trong cùng một điều kiện.
Kỹ thuật RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA) ra đời vào đầu thế kỷ 20, cho phép phát hiện đột biến thông qua sự xuất hiện hoặc mất đi vị trí bắt cặp ngẫu nhiên, tạo ra sự khác biệt về số lượng và chiều dài đoạn DNA giữa các cá thể Một trong những hạn chế của PCR chuẩn đối với marker ALP là yêu cầu phải có thông tin rõ ràng về chuỗi mã di truyền trước khi thiết kế các primer tương ứng, điều này gây khó khăn trong việc nghiên cứu DNA genome của giống cây trồng mới.
Về cơ bản kỹ thuật RAPD được thực hiện theo ba bước:
Tách chiết DNA tổng số, nhân DNA bằng máy PCR
Điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamid
Xác định tính đa dạng di truyền bằng các phần mềm thông dụng (NTSYSpc 2.1, UPGMA cluster, Gelcompar, lập dedrogram)
Kỹ thuật RAPD dựa trên việc nhân bản ADN genom thông qua phản ứng PCR sử dụng các mồi ngẫu nhiên, nhằm tạo ra sự đa hình ADN do sự thay đổi hoặc mất mát nucleotide tại vị trí bắt mồi (Williams et al, 1991).
Kỹ thuật RAPD sử dụng các mồi ngẫu nhiên với độ dài khoảng 10 nucleotide và nhiệt độ kéo dài mồi từ 34-37 oC Mặc dù trình tự mồi là ngẫu nhiên, nhưng cần đảm bảo hai tiêu chí: tỷ lệ G-C tối thiểu 40% (thường từ 50-80%) và không có trình tự bazo đầu xuôi và ngược giống nhau.
Trong phản ứng này, các primer đơn gắn vào hai vị trí khác nhau trên các mạch đơn đối diện của ADN khuôn Nếu các vị trí gắn primer nằm trong khoảng có thể nhân bản (thường từ 200 đến 2000 nucleotide), đoạn ADN sẽ được nhân lên.
Sản phẩm của kỹ thuật RAPD được xác định thông qua điện di trên gel agarose hoặc polyacrylamide, cho thấy sự tương đồng hoàn toàn hoặc một phần giữa ADN genome và các primer oligonucleotide Các primer ngắn trong RAPD giúp dễ dàng tìm kiếm các đoạn tương đồng trên mạch đơn ADN, làm cho phương pháp này trở thành công cụ hiệu quả trong việc xác định tính đa hình nucleotide giữa các cá thể Tuy nhiên, kỹ thuật RAPD cũng có những ưu điểm và hạn chế riêng cần được xem xét.
RAPD là một kỹ thuật hiệu quả để phát hiện đa hình, vì nó không yêu cầu phân lập và đọc trình tự, đồng thời có khả năng phát hiện nhiều locus trong cùng một lần Phương pháp này mang lại nhiều ưu điểm nổi bật trong nghiên cứu di truyền.
- Kỹ thuật RAPD dễ thực hiện và dễ thành công do không cần biết trước trình tự bộ gen của đối tượng cần nghiên cứu;
- Chất lượng ADN khuôn không cần độ tinh sạch cao;
- Thời gian thực hiện nhanh, khả năng nhân bản cao
- Chi phí thực hiện thấp;
Kỹ thuật RAPD thường được áp dụng kết hợp với các phương pháp tiên tiến khác nhằm đánh giá sự đa dạng di truyền và xác định các chỉ thị phân tử có độ tin cậy cao.
Chỉ thị RAPD là một phương pháp phân tích ADN không yêu cầu biết trước trình tự nucleotide, giúp quy trình thực hiện nhanh chóng, dễ dàng và tiết kiệm chi phí Phương pháp này cho phép phát hiện đa hình cao với chỉ một lượng nhỏ ADN tính bằng nanogram và trên nhiều mẫu thí nghiệm Đặc biệt, RAPD không sử dụng chất phóng xạ, làm cho nó trở thành công cụ hữu ích trong việc xác định mối quan hệ thân thuộc giữa các cây trồng hoặc cá thể, phục vụ cho công tác lai tạo và phân loại.
Chỉ thị RAPD không chỉ được ứng dụng trong nghiên cứu đa dạng sinh học và nguồn gốc di truyền của động vật, thực vật và vi sinh vật, mà còn được sử dụng cho nhiều mục đích khác nhau.
Lập bản đồ liên kết là quá trình xác định các gen liên kết với những tính trạng nhất định, chẳng hạn như tính trạng chất lượng sợi ở cây bông và tính trạng kháng virus ở cà chua Việc này giúp hiểu rõ hơn về di truyền học và cải thiện giống cây trồng thông qua các phương pháp chọn lọc gen hiệu quả.
- Phân tích cấu trúc di truyền của quần thể;
- In dấu vân tay (DNA fingerprinting);
- Phát hiện sự khác biệt trong các dòng soma (somaclonal variation)
Tuy có nhiều ứng dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền những chỉ thị RAPD cũng có một số hạn chế như sau:
- Có tính trội do đó khó phân biệt được những gen lặn hay cá thể di hợp tử;
- Có tính chất ngẫu nhiên nên sản phẩm PCR thường không thống nhất;
- Cần phải có các thiết bị điện toán để xử lý số liệu;
- Độ tin cậy còn tùy thuộc vào kỹ thuật cá nhân;
- Kỹ thật RAPD có độ chính xác không cao;
- Không ổn định (thể hiện ở mức độ lặp lại giống nhau thấp);
- Khả năng nhân bản trong phản ứng PCR cao nhưng khả năng xuất hiện đa hình thấp;
- Khả năng nhận diện chỉ thị phân tử thấp và độ tin cậy không cao (William và cs,
Cơ sở khoa học nuôi cấy mô tế bào thực vật
1.3.1 Khái niệm nuôi cấy in vitro
Nuôi cấy in vitro là phương pháp trồng các bộ phận thực vật như tế bào, mô, và cơ quan trong ống nghiệm, sử dụng môi trường dinh dưỡng giàu muối khoáng, vitamin, đường và chất điều hòa sinh trưởng thực vật Quá trình này diễn ra trong điều kiện vô trùng và được kiểm soát để đảm bảo sự phát triển tối ưu của thực vật.
Nuôi cấy mô tế bào bao gồm các kỹ thuật sau:
Nuôi cấy cây non và cây trưởng thành
Nuôi cấy các cơ quan: rễ, thân, lá, hoa, quả, bao phấn…
Nuôi cấy phôi non, và phôi trưởng thành
Nuôi cấy tế bào đơn (huyền phù tế bào)
Nuôi cấy protoplast (nuôi cấy tế bào trần)
Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật cho phép tái sinh chồi hoặc cơ quan từ các mô như lá, thân, hoa, rễ, củ hoặc đỉnh sinh trưởng Các nhà khoa học hiện nay sử dụng hệ thống này để nghiên cứu các vấn đề liên quan đến sinh lý học, sinh hoá học, di truyền học và cấu trúc thực vật Kỹ thuật nuôi cấy mô cũng mở rộng tiềm năng nhân giống vô tính cho các loài cây trồng quan trọng, có giá trị kinh tế và thương mại trong cuộc sống hàng ngày của con người.
1.3.2 Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô tế bào
Phương pháp nuôi cấy mô tế bào dựa trên ba đặc tính cơ bản của tế bào: tính toàn năng, khả năng biệt hóa và phản biệt hóa, cùng với khả năng trẻ hóa.
Tính toàn năng của tế bào
Mỗi tế bào của sinh vật đều chứa toàn bộ thông tin di truyền (ADN) cần thiết để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh khi gặp điều kiện thích hợp Gottlieb Haberlandt, nhà thực vật học người Đức, đã đặt nền móng cho lĩnh vực nuôi cấy mô tế bào thực vật trong cuốn sách "Thực nghiệm về nuôi cấy tế bào tách rời" vào năm 1902.
Sự biệt hóa và phản biệt hóa
Sự phân hóa tế bào là quá trình mà các tế bào chuyên hóa thành các mô với chức năng khác nhau trong cơ thể Khi tế bào đã hoàn toàn chuyên hóa, chúng mất khả năng phân chia Tuy nhiên, trong những điều kiện thích hợp, tế bào có thể trở lại dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ, tương tự như tế bào ban đầu, từ đó tạo thành cây con hoàn chỉnh Quá trình này được gọi là phản phân hóa tế bào.
Sự trẻ hóa tế bào
Khả năng tái sinh của các bộ phận non trẻ vượt trội hơn so với các bộ phận trưởng thành, trong khi đó, tuổi thọ của dòng vô tính là vô hạn Do đó, trẻ hóa được coi là một biện pháp quan trọng trong quá trình nhân giống sinh dưỡng.
1.3.3 Ý nghĩa của nhân giống in vitro
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là phương pháp nhân giống vô tính, đặc biệt hữu ích cho những loài thực vật quý hiếm có giá trị kinh tế và sinh học cao, gặp khó khăn trong nhân giống hữu tính Mặc dù nhiều loại thực vật có khả năng nhân giống hữu tính bằng hạt với hệ số nhân cao, nhưng việc áp dụng nhân giống vô tính in vitro vẫn được tiến hành để tối ưu hóa quy trình và đảm bảo chất lượng giống cây.
Phương pháp nhân giống hữu tính bằng hạt mặc dù có hệ số nhân giống cao và dễ bảo quản, nhưng thường dẫn đến cây con không đồng nhất về hình thái và thành phần hóa học, gây khó khăn trong sản xuất công nghiệp và giảm giá trị thương phẩm Đặc biệt, trong cây thuốc, sự không đồng đều về chất lượng nguyên liệu ảnh hưởng đến nhu cầu sản xuất Để khắc phục, phương pháp nhân giống vô tính đã chứng minh hiệu quả kinh tế và sinh học, tạo ra cây con đồng đều về di truyền, giúp sản xuất sản phẩm chất lượng ổn định và rút ngắn thời gian thu hoạch Tuy nhiên, phương pháp vô tính truyền thống vẫn gặp phải vấn đề như lây nhiễm bệnh và hệ số nhân thấp Do đó, phương pháp nhân giống in vitro đã được áp dụng rộng rãi, mang lại nhiều ưu điểm vượt trội.
Hệ số nhân giống của cây rất cao, cho phép từ một cây mẹ có thể sản xuất hàng triệu cây trong vòng một năm Các loại cây khác nhau có hệ số nhân giống dao động từ 3-6 đến 10-12 cây mỗi năm, vượt trội hơn so với bất kỳ phương pháp nhân giống nào khác.
Cây con được nhân giống từ cây bố mẹ có tính đồng nhất và ổn định di truyền cao, đảm bảo rằng chúng giống hệt nhau Theo lý thuyết, từ bất kỳ cây chọn lọc ưu việt nào cũng có thể tạo ra một quần thể với độ đồng đều cao và số lượng không hạn chế.
Nâng cao chất lượng giống cây là mục tiêu quan trọng trong công tác nhân giống, tập trung vào việc tạo ra các giống sạch bệnh bằng cách loại bỏ các nguồn vi khuẩn, virus và nấm bệnh Phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng đã giúp phát triển giống cây hoàn toàn sạch virus, đảm bảo cả số lượng và chất lượng giống.
- Nhân giống in vitro có thể nhân nhanh cây không kết hạt hoặc kết hạt kém trong những điều kiện sinh thái nhất định
Có tiềm năng công nghiệp hóa mạnh mẽ nhờ vào khả năng kiểm soát chế độ chăm sóc, chiếu sáng và nhiệt độ, cho phép sản xuất liên tục suốt cả năm.
- Tạo được cây có kiểu gen mới bằng xử lý đa bội
- Bảo quản và lưu giữ được tập đoàn gen
Bên cạnh những ưu điểm trên, nhân giống in vitro vẫn không tránh khỏi một số nhược điểm như:
Nhiều loài thực vật quý hiếm hiện chưa thể nhân giống do gặp khó khăn trong lý thuyết nuôi cấy và tái sinh, dẫn đến hạn chế về chủng loại sản phẩm.
- Chi phí sản xuất cao do nhân giống in vitro đòi hỏi trang thiết bị hiện đại và lao động có tay nghề
Hiện tượng biến đổi kiểu hình ở sản phẩm do biến dị soma đã dẫn đến việc các cây con không duy trì được kiểu hình của cây bố mẹ, đặc biệt khi chúng được nuôi cấy từ callus.
Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, quá trình phản biệt hóa và biệt hóa diễn ra để tạo ra cây hoàn chỉnh Mỗi loại thực vật có những đặc điểm riêng, dẫn đến các phương pháp biến đổi khác nhau Mặc dù kết quả cuối cùng là sự tái sinh cây hoàn chỉnh, nhưng không có một phương thức chung áp dụng cho tất cả các loại thực vật.
1.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy a) Ảnh hưởng của điều kiện khử trùng mẫu cấy
Các công trình nghiên cứu về chi Camellia
1.4.1 Các công trình nghiên cứu về chi Camellia trên thế giới
Boonerjee và cộng sự (2013) đã phân tích 18 dòng trà (Camellia sinensis L.) bằng cách sử dụng 20 mồi ngẫu nhiên, tạo ra tổng cộng 755 băng với trung bình 37,75 dải RAPD Kết quả cho thấy 97,41% băng có tính đa hình, với kích thước phân tử của các đoạn ADN khuếch đại dao động từ 250 đến 5000 bp Mười dải được khuếch đại từ bộ gen của 18 dòng trà, với giá trị khoảng cách di truyền ghép đôi từ 24,0 đến 59,0 Khoảng cách di truyền cao nhất (59) giữa dòng BT16 và BT2, trong khi thấp nhất (24,0) giữa BT18 và BT5 Các dòng trà được chia thành hai nhóm chính: BT9 và BT13 trong cụm 1, và 16 dòng vô tính trong cụm 2, với cụm 2 tiếp tục phân chia thành nhiều tiểu cụm Dòng BT1 và BT3 cho thấy sự đa dạng di truyền cao.
Gonbad và cs (2012) đã nghiên cứu nhân giống C Sinensis (L.) bằng hệ thống ngâm tạm thời, cho thấy khử trùng mẫu bằng Clorox 20% trong 15 phút đạt tỷ lệ sống sót cao nhất là 60% Mẫu được cấy trên môi trường MS rắn với BAP (0,1,3, 5 và 7mg/l) và TDZ (0, 0,025, 0,05, 0,075 và 0,1 mg/l), trong đó môi trường MS rắn bổ sung 3 mg/l BAP và 0,5 mg/l GA3 cho số chồi trung bình là 7,5 chồi với chiều dài 0,85 cm Nuôi cấy lỏng với lắc liên tục cho kết quả tốt hơn so với nuôi tĩnh, với môi trường lỏng bổ sung 3mg/l BAP + 0,5mg/l GA3 đạt số chồi trung bình/cụm là 13,6 chồi Thời gian ngâm 120 phút mang lại chất lượng cây tốt với số lượng chồi (19), tỷ lệ sống sót (84,5%) và các chỉ số chiều dài gốc, chiều cao cây, số lá tối ưu trong môi trường nuôi cấy gồm than bùn + vermiculit + perlit (2: 1: 1 v/v) Kết quả khuếch đại ISSR bằng 11 marker cho thấy sự tương đồng 100% giữa các cây micropropagated và 10 cây trồng chuyển đổi ngẫu nhiên từ DNA mẹ của cây chè Iran.
Nghiên cứu của LIAO và cs (2013) cho thấy ba loại chất điều hòa sinh trưởng thực vật ABT6, CPD và NAA ảnh hưởng đến khả năng ra rễ của Camellia nitidissima Kết quả cho thấy ABT6 là chất điều hòa sinh trưởng hiệu quả nhất, với nồng độ tối ưu là 300mg/l, trong khi NAA đạt hiệu quả tốt nhất ở nồng độ 500mg/l Tỷ lệ phối trộn 90% đất vàng và 10% cát mang lại tỷ lệ ra rễ cao nhất, đạt 98,6%.
Kato và cộng sự (1986) đã thành công trong việc tái sinh cây con từ lát cắt lá mầm của hai loài Camellia japonica L và C Sinensis Nghiên cứu cho thấy phôi được hình thành trực tiếp trên bề mặt lá mầm trong môi trường có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng Đối với Camellia japonica L., phôi phát triển trong môi trường có GA3 và sau thời gian nuôi cấy đã tái sinh thành cây con Trong khi đó, C Sinensis cho thấy phôi phát triển từ cành non trong môi trường có 10mg/l BA và IBA Các nghiên cứu chỉ ra rằng nhân giống vô tính qua lát cắt lá và thân mầm có thể tạo ra cây con tái sinh ở chi Camellia.
Nghiên cứu của Tang và cs (2006) đánh giá đa dạng di truyền và cấu trúc quần thể trà hoa vàng (Camellia nitidissima) tại tỉnh Quảng Tây, Nam Trung Quốc, sử dụng kỹ thuật RAPD và AFLP Kết quả cho thấy 20 mồi RAPD tạo ra 183 dải, trong đó có 143 dải đa hình, và 8 cặp mồi AFLP tạo ra 502 dải, với 364 mẫu đa hình Phân tích cho thấy sáu quần thể có thể chia thành hai nhóm di truyền chính, tương ứng với các vùng Nam Ninh và Fangcheng Thử nghiệm Mantel chỉ ra mối tương quan đáng kể giữa khoảng cách di truyền và địa lý (r = 0,953, p = 0,0036) Phân tích ANOVA cho thấy biến dị di truyền giữa các nhóm là 36,09%, trong quần thể trong nhóm là 25,78%, và trong quần thể là 38,14% Nghiên cứu này cung cấp cái nhìn quan trọng về sự đa dạng di truyền và cấu trúc quần thể C Nitidissima, hỗ trợ cho công tác bảo tồn và quản lý loài thực vật quý hiếm này.
Nghiên cứu của Yang và cộng sự (2013) đã xây dựng mô hình hoàn chỉnh hệ gen lục lạp ở bảy loài trà, đề xuất 11 vùng trình tự lục lạp tiềm năng cho phân tích mối quan hệ di truyền, bao gồm: accD-psaI, atpF-atpH, ccsA-nshD, clpP-psbB, ndhC-trnV, ndhF-rpl32, petD-rpoA, psbH-petB, rpl32-trnL, trnG-intron, và trnS-trnG Kết quả cho thấy các vùng trình tự thích hợp chủ yếu nằm ở vùng trình tự không mã hóa và vùng gen đơn bản của hệ gen lục lạp các loại trà.
1.4.2 Các công trình nghiên cứu về chi Camellia ở Việt Nam
Hà Văn Huân và cộng sự (2015) đã thiết kế một cặp mồi đặc hiệu dựa trên thông tin gen matK của loài Trà vàng pêtêlô, phân tích ADN từ 10 mẫu cây Trà hoa vàng Tam Đảo và Trà vàng lá dày Kết quả cho thấy, trình tự nucleotide của gen matK ở cây Trà hoa vàng Tam Đảo chỉ khác với cây Trà vàng lá dày 1 nucleotide tại vị trí 508 (thay A bằng G) và khác với loài Trà vàng pêtêlô 1 nucleotide tại vị trí 613 (thay C bằng A) So với Trà vàng pêtêlô, Trà vàng lá dày có 2 nucleotide sai khác tại vị trí 508 và 613 Trình tự nucleotide của gen matK từ cây Trà hoa vàng Tam Đảo và Trà vàng lá dày đã được đăng ký trên ngân hàng gen quốc tế (NCBI) với mã số KP241692 và KP241693, có thể trở thành chỉ thị phân loại cho các loài trà hoa vàng tại Việt Nam.
Phạm Văn Hoàng và cộng sự (2016) đã nghiên cứu phương pháp giâm hom và đạt được kết quả khả quan Sử dụng chất ĐHST ABT 200ppm trong 5 phút, sau 70 ngày thí nghiệm, tỷ lệ sống đạt 81,76%, tỷ lệ ra chồi 79,67%, và tỷ lệ ra rễ 80,33% với chỉ số ra rễ là 7,83 Khi sử dụng IBA 100 ppm trong 10 phút, sau 40 ngày, tỷ lệ sống đạt 80,88%, tỷ lệ hom ra chồi 79,85%, và tỷ lệ hom ra rễ 76,71% Nghiên cứu cho thấy hom ngọn và hom giữa có hiệu quả nhân giống cao, với tỷ lệ sống lần lượt là 78,67% và 84,33%, tỷ lệ ra rễ là 67,33% và 68,67% Cuối cùng, lựa chọn thành phần ruột bầu theo công thức đất: trấu hun: cát (2:1:1) mang lại tỷ lệ sống 87,79% và tỷ lệ ra rễ 74,82%.
Nguyễn Thị Nga và cộng sự (2003) đã tiến hành nhân gen mã hóa rARN 5,8s ở loài Trà hoa vàng petelitii, từ đó tách chiết thành công ADN tổng số của loài này Sản phẩm ADN thu được đạt đủ hàm lượng và độ sạch cần thiết cho các nghiên cứu tiếp theo Ngoài ra, nhóm nghiên cứu cũng đã xác định được đoạn gen mã hóa rARN 5,8s với cặp mồi thiết kế đặc hiệu cho chi Camellia.
Hoàng Minh Trang và cộng sự (2016) đã xác định đoạn DNA Barcode cho loài Trà hoa vàng lá dày, với kết quả phân tích cho thấy đoạn matK có 951 nucleotide, rbcL có 599 nucleotide, trnH-psbA có 504 nucleotide và ITS2 có 399 nucleotide So sánh trình tự của các đoạn mã vạch này với các loài trà khác trên ngân hàng gen NCBI cho thấy đoạn rbcL có độ tương đồng 100% với Camellia sinensis var; matK tương đồng 99,89% với Camellia tienii; trnH-psbA tương đồng 98,43% với Camellia petelotii; và ITS2 tương đồng 97,92% với Camellia longgangensis Do đó, chỉ thị ITS2 hoặc trnH-psbA được khuyến nghị sử dụng làm mã vạch DNA để giám định loài Trà vàng lá dày Camellia crassiphylla tại Việt Nam.
Hoàng Minh Trang và cộng sự (2016) đã xác định đoạn mã vạch ADN cho loài Hải đường vàng (Camellia tienii Ninh) nhằm phục vụ giám định loài Kết quả cho thấy đoạn matK dài 951 nucleotide, đoạn rbcL dài 599 nucleotide, đoạn trnH-psbA dài 397 nucleotide và đoạn ITS2 dài 900 nucleotide So sánh với dữ liệu trên ngân hàng gen Quốc tế NCBI, đoạn gen matK có độ tương đồng 100% với Camellia tamdaoensis, đoạn rbcL tương đồng 99,83% với Camellia sinensis, đoạn trnH-psbA tương đồng 99% với Camellia oleifera và đoạn ITS2 tương đồng 99,11% với một loài khác.
Camellia parvimuricata, đoạn ITStương đồng 97,96% so với loài Camellia acuticalyx
Các đoạn ADN như trnH-psbA, ITS và ITS2 có thể được sử dụng làm mã vạch cho loài Hải đường vàng Camellia tienii Ninh, trong đó đoạn ITS nổi bật với khả năng phân biệt tốt nhất.
Nghiên cứu của Nguyễn Văn Việt và cộng sự (2016) cho thấy, việc xử lý hom bằng benlat 0,5% trong 15 phút và tiếp tục với chất điều hòa sinh trưởng IBA 150 ppm trong 5 phút mang lại tỷ lệ sống 83,33%, tỷ lệ ra rễ 68,33% và tỷ lệ ra chồi 81,67%, với chỉ số ra rễ đạt 11,89 Đối với hom ngọn, tỷ lệ sống đạt 78,33% và tỷ lệ ra rễ 65,11%, chỉ số ra rễ là 7,82 Sử dụng giá thể giâm hom là đất và trấu hun theo tỷ lệ 1:1 cho tỷ lệ sống 81,11% và tỷ lệ ra rễ 72,33% Khi hom được che sáng 50%, tỷ lệ sống đạt 84,44% Quy trình nhân giống này có thể áp dụng để sản xuất cây giống Trà hoa vàng chất lượng tốt, đáp ứng nhu cầu hiện nay.
Nguyễn Văn Việt và cộng sự (2017) đã công bố kết quả nghiên cứu nhân giống trà hoa vàng (Camellia flava) bằng phương pháp giâm hom Hom được xử lý nấm bằng benlat 0,5% trong 15 phút và tiếp tục xử lý với chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong 4 phút, sau đó đánh giá kết quả sau 80 ngày Kết quả cho thấy, xử lý hom bằng IBA 100 ppm đạt tỷ lệ sống 72,24%, ra rễ 71,67%, ra chồi 71,33% với chỉ số ra rễ 7,92 Trong khi đó, xử lý bằng NAA 150 ppm cho tỷ lệ sống 69,18%, ra chồi 68,67% và chỉ số ra rễ 7,6 Hom giữa đạt tỷ lệ sống 77,33% và tỷ lệ ra rễ 73,67%, với chỉ số ra rễ 3,29 Giá thể hom sử dụng là đất tầng mặt, trấu hun và cát với tỷ lệ 2:1:1, cho tỷ lệ sống 78,67% và tỷ lệ ra rễ 76,32%.
Nguyễn Thị Hải Yến và cộng sự (2014) đã tiến hành nghiên cứu khả năng tái sinh in vitro của cây chè nhằm mục tiêu chọn tạo các giống chè với năng suất cao và chất lượng tốt cho sản xuất Kết quả nghiên cứu cho thấy 2,4-D là chất phù hợp để tạo mô sẹo và tái sinh cây chè hiệu quả.
MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Mục tiêu nghiên cứu
Mục tiêu của nghiên cứu này là đánh giá sự đa dạng di truyền của quần thể Trà hoa vàng Tam Đảo, nhằm cung cấp cơ sở khoa học cho công tác bảo tồn và phát triển nguồn gen quý này.
+ Đánh giá di truyền quần thể Trà hoa vàng Tam Đảo bằng kỹ thuật RAPD
+ Xây dựng được quy trình nhân giống in vitro Trà hoa vàng Tam Đảo (Camellia tamdaoensis Ninh et Hakoda).
Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng: Cây Trà hoa vàng Tam Đảo (Camellia tamdaoensis Ninh et Hakoda) tại Vườn quốc gia Tam Đảo
Để đánh giá đa dạng di truyền của quần thể trà hoa vàng, các nhà nghiên cứu đã thu thập lá trà hoa vàng từ 10 cá thể khác nhau tại Vườn Quốc gia Tam Đảo, mỗi cá thể cung cấp 3 lá.
Vật liệu để nhân giống là quả được thu hài từ cây Trà hoa vàng Tam Đảo có độ đa hình cao
Bảng 2.1 Trình tự các cặp mồi sử dụng
STT Tên mồi Trình tự nucleotide, 5’ tới 3’
Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Mẫu được thu thập tại Vườn quốc gia Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc, và thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ tế bào, Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm nghiệp.
Nội dung nghiên cứu
2.4.1 Phân tích đa hình ADN loài Trà hoa vàng Tam Đảo bằng kỹ thuật RAPD
Tách chiết ADN tổng số
Khuếch đại ADN bằng kỹ thuật PCR- RAPD
Phân tích dữ liệu PCR- RAPD
2.4.2 Xây dựng quy trình nhân giống trà hoa vàng bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro
Nghiên cứu ảnh hưởng của công thức khử trùng đến khả năng tạo mẫu sạch in vitro;
Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện khử trùng tới khả năng nảy mầm;
Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng tới khả năng nhân nhanh chồi;
Nghiên cứu ảnh hưởng của loại và hàm lượng đường đến khả năng nhân nhanh chồi;
Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng nhân nhanh chồi;
Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp nồng độ BAP và kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi;
Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ IBA và NAA đến khả năng ra rễ in vitro.
Phương pháp nghiên cứu
2.5.1 Phân tích đa hình ADN loài Trà hoa vàng Tam Đảo
Thu mẫu và tách chiết ADN tổng số
Các mẫu lá non tươi được thu thập từ 10 cây Trà hoa vàng Tam Đảo (Camellia tamdaoensis Hakoda et Ninh) tại Vườn Quốc gia Tam Đảo Ngay sau khi thu hoạch, mẫu lá được cho vào túi Ziplock chứa silica gel và vận chuyển về phòng thí nghiệm, nơi được bảo quản ở nhiệt độ -20 độ C cho đến khi thực hiện tách chiết ADN Mỗi mẫu được ký hiệu từ CtHN1 đến CtHN10, kèm theo các thông số GPS tương ứng.
Tách chiết ADN tổng số
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã áp dụng phương pháp tách chiết ADN của Shagai Maroof, được cải tiến để phù hợp với việc tách chiết ADN genome từ các mẫu Trà hoa vàng Tam Đảo Quy trình thực hiện bao gồm nhiều bước cụ thể nhằm đảm bảo độ chính xác và hiệu quả trong việc thu nhận ADN.
Để bắt đầu, nghiền 100 gam lá Trà hoa vàng trong nitơ lỏng bằng chày cối sứ Sau khi nghiền, cho bột vào ống ly tâm 1,5ml và thêm 0,8ml đệm CTAB buffer đã được làm ấm ở 65 độ C trong 10 phút.
Bước 2: Ủ các ống ở điều kiện 65 o C trong 30 phút, lắc nhẹ nhàng nhưng dứt khoát 15 phút một lần để việc tách có hiệu quả
Bước 3: Chuyển các ống từ tủ ấm ra, để nguội ở nhiệt độ phòng 5 phút, thêm 0,8ml dung dịch phenol / chlorofoml / isoamyalcohol (25:24:1) lắc ống nhẹ nhàng 10 phút
Bước 4: Ly tâm 15 phút tốc độ 10.000 vòng/phút ở nhiệt độ phòng
Bước5: Chuyển lớp trên cùng vào ống ly tâm mới (1,5ml) Thêm 0,8ml chlorofom / isoamy alcohol (24:1), xoay ống nhẹ nhàng 10 phút
Bước 6: Ly tâm 10.000 vòng /phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng
Bước 7: Dùng Pipetman hút lớp trên cùng sang ống ly tâm mới (1,5ml) thêm 1ml iopropanol lạnh, xoay ống nhẹ vài phút và ủ ở nhiệt độ 20 o C trong 60 phút
Trong quy trình tách chiết ADN, bước 8 yêu cầu ly tâm trong 15 phút với tốc độ 10.000 vòng/phút ở nhiệt độ phòng để thu được tủa Tiếp theo, bước 9 là rửa tủa ADN bằng cồn 70%, thực hiện lắc nhẹ và ly tâm trong 7 phút với cùng tốc độ 10.000 vòng/phút.
Bước 10: Rửa ADN lần thứ hai bằng 500 µl cồn 70%, lắc nhẹ và ly tâm ở 10.000 vòng/phút trong 5 phút để thu phần tủa Sau đó, thổi khô trong 30 phút, thêm 100 µl Rnase loãng và ủ ở 37°C qua đêm.
Kiểm tra ADN tổng số: Chất lượng ADN tổng số được kiểm tra trên gel agarose 1%
Khuếch đại gen bằng kỹ thuật PCR - RAPD
Phản ứng RAPD - PCR được thực hiện trên tất cả các mẫu với 15 mồi ngẫu nhiên Các hỗn hợp được trộn đều và đưa vào máy PCR, sau đó chạy theo chương trình RAPD - CT đã được cài đặt sẵn, bao gồm 45 chu kỳ với các bước chi tiết trong bảng 1.1.
Bảng 2.2 Thành phần phản ứng dùng cho mỗi phản ứng RAPD - PCR
STT Thành phần phản ứng Thể tớch (àl)
Tổng thể tớch phản ứng: 25 àl
Sau khi đủ thành phần, hàm lượng các chất cần thiết, tiến hành đặt chương trình chạy cho máy Chu trình nhiệt trong máy PCR như sau:
Bảng 2.3 Chương trình chạy của phản ứng PCR
Bước Nhiệt độ ( o C) Thời gian (phút) Chu kỳ
Ghi chú: Bước 2a: Biến tính, Bước 2b: Gắn mồi, Bước 2c: Kéo dài Điện di DNA trên gel agarose
- Cân 1,2 g bột agarose, đong 100ml TBE 1X cho vào bình tam giác
- Đung sôi dịch agarose trong lò vi sóng cho đến khi tạo thành một dung dịch đồng nhất
- Để nguội đến khoảng 50 - 60 0 C , thờm 0,5 - 1àl Redsafe và lắc đều
- Chuẩn bị khay và lược Đổ dung dịch agarose vào khay sao cho không có bót khí Chờ khoảng 45 - 50 phút gel đông
- Rút lược, đặt gel vào bể điện di, đổ đệm TBE 1X tới khi ngập mặt gel
- Tra mẫu DNA vào giếng
- Quan sát và chụp ảnh: Bản gel sau khi nhộm được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại với bước sóng λ = 302 nm
Phân tích đa hình ADN
Các băng ADN được xác định dựa trên sự hiện diện hoặc vắng mặt của chúng trong các giống nghiên cứu theo ADN marker, với ký hiệu 1 cho sự có mặt và 0 cho sự không có mặt Dữ liệu này được xử lý bằng phần mềm NTSYS pc 2.1 (Rophlf F J; Virmani S S., Siddiq E A., Muralidharau K, 1998) để tính toán ma trận tương đồng giữa các mẫu Ma trận tương đồng được tính toán dựa trên một công thức cụ thể.
Trong đó: a: Số băng ADN có ở hai dòng i và j d: Số băng ADN không có băng cả hai dòng i và j n: Tổng số băng thu được
J ij : Hệ số tương đồng Jaccard giữa hai dòng i và j
Sau đó các số liệu nghiên cứu được sử lý tiếp trong NTSYS - SIMQUAL để phân nhóm lại và được biểu hiện trên biểu đồ
2.5.2 Xây dựng quy trình nhân giống Trà hoa vàng Tam Đảo
Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của các công thức khử trùng đến khả năng tạo mẫu sạch in vitro;
- Vật liệu: Quả của cây trà hoa vàng
- Hóa chất: dung dịch HgCl2 0,1%, cồn 70 0 , nước cất vô trùng, dung dịch xà phòng loãng 1%, môi trường khoáng cơ bản WPM có bổ sung 0,2 mg/l BAP,
Khử trùng ngoài box cấy là quy trình quan trọng để loại bỏ vi sinh vật và bụi bẩn bám trên mẫu Đầu tiên, mẫu được làm sạch bằng xà phòng và nước cất để đảm bảo bề mặt ngoài không còn tạp chất Sau đó, mẫu sẽ được rửa sạch bằng nước cất vô trùng trước khi đưa vào box cấy vô trùng, nơi thực hiện các thao tác khử trùng tiếp theo.
Để khử trùng trong box cấy, cần sử dụng dung dịch cồn 70% trong vòng 1 phút, sau đó rửa sạch mẫu bằng nước cất vô trùng từ 3 đến 4 lần Tiếp theo, tiến hành khử trùng mẫu quả bằng dung dịch HgCl2 theo các khoảng thời gian đã được bố trí trong thí nghiệm Lưu ý rằng sau mỗi lần khử trùng bằng dung dịch HgCl2, mẫu phải được rửa sạch bằng nước cất vô trùng.
+ Cấy mẫu: Mẫu sau khi được khử trùng xong, dùng dao tách bỏ phần vỏ hạt sau đó cấy lên môi trường khoáng cơ bản WPM
Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện khử trùng tới khả năng nảy mầm
Hạt trà được chia thành hai lô thí nghiệm để nghiên cứu hiệu quả khử trùng Lô 1 tách vỏ hạt trước khi khử trùng, trong khi lô 2 thực hiện việc bóc vỏ sau khi khử trùng Cả hai lô đều trải qua quy trình khử trùng sơ qua bằng cồn 70% trong 1 phút, sau đó rửa ba lần bằng nước cất và tiếp tục khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong 13 phút Sau khi khử trùng, mẫu được cấy lên môi trường khoáng cơ bản WPM với 0,2 mg/l BAP, 30 g/l sucrose và 6 g/l agar Kết quả thí nghiệm được thu thập sau 6 tuần nuôi cấy.
Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng tới khả năng nhân nhanh chồi
Môi trường dinh dưỡng đóng vai trò quan trọng trong quá trình nhân giống cây Trà hoa vàng Tam Đảo Chúng tôi đã sử dụng các loại môi trường cơ bản như MS, ẵ MS, WPM và Knops, với thành phần bổ sung 6 g/l agar, 30 g/l đường sucrose và 100 ml/l nước dừa Mục tiêu là nuôi cấy thăm dò để xác định môi trường hiệu quả cho việc nhân nhanh chồi, và số liệu được thu thập sau 6 tuần nuôi cấy.
Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng nhân nhanh chồi
Tiến hành cắt mẫu và chuyển vào môi trường nhân nhanh chồi, sử dụng môi trường khoáng cơ bản tốt nhất từ thí nghiệm 3, đồng thời bổ sung BAP với nồng độ từ 0 đến 0,5 mg/l, 6 g/l agar và 100 ml/l nước dừa Thí nghiệm được thực hiện với 6 công thức khác nhau và thu thập số liệu sau 6 tuần nuôi cấy.
Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của loại và hàm lượng đường đến khả năng nhân nhanh chồi
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã xác định môi trường dinh dưỡng tối ưu từ thí nghiệm 3 và nồng độ BAP tốt nhất từ thí nghiệm 4, sau đó bổ sung riêng rẽ và phối trộn hai loại đường sucrose (10 - 30 g/l) và glucose (10 - 30 g/l) cùng với 6 g/l agar và 100 ml/l nước dừa Mục tiêu là tìm ra loại đường và hàm lượng đường phù hợp cho quá trình nuôi cấy nhân nhanh chồi, với số liệu được thu thập sau 6 tuần nuôi cấy.
Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP và Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi
Dựa trên các công thức tốt nhất từ thí nghiệm 3, 4, 5, chúng tôi tiến hành thí nghiệm 6 bằng cách bổ sung kinetin với nồng độ từ 0,1 - 0,5 mg/l, cùng với 20 g/l sucrose, 10 g/l glucose, 6 g/l agar và 100 ml/l nước dừa Kết quả thí nghiệm sẽ được thu thập sau 6 tuần nuôi cấy.
Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ IBA và NAA đến khả năng ra rễ
Chọn những chồi đạt kích thước tiêu chuẩn để cấy vào môi trường tạo rễ, bao gồm các thành phần khoáng cơ bản và IBA (0,1 - 0,3 mg/l), NAA (0,1 - 0,3 mg/l), 20 g/l sucrose, 10 g/l glucose, 100 ml/l nước dừa, và 6 g/l agar Kết quả thí nghiệm sẽ được thu thập sau 6 tuần nuôi cấy.
Phương pháp đánh giá kết quả và xử lý số liệu
2 Tỷ lệ mẫu tái sinh= Σ Số mẫu tái sinh
X 100 Σ Số mẫu cấy ban đầu
3 Tỷ lệ mẫu ra rễ= Σ Số mẫu ra rễ
4 Số chồi TB / mẫu= Σ Số chồi tạo thành Σ Số chồi ban đầu ban đầu
5 Chiều cao TB / chồi (cm) = Σ Chiều cao các chồi Σ Số chồi theo dõi
6 Sỗ rễ TB / mẫu = Σ Số rễ Σ Số chồi
7 Chiều dài TB / rễ (cm)= Σ Chiều dài rễ Σ Số rễ
Thời gian quan sát và thu thập số liệu: 2 tuần quan sát, đo đếm và ghi số liệu 1 lần 2.6.2 Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được tính toán theo phương pháp phân tích thống kê toán học sử dụng theo chương trình MICROSOFT EXCEL trên máy vi tính.
