Nội dung và phương pháp nghiên cứu
Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Nghiên cứu được tiến hành tại Phòng thí nghiệm của Bộ môn Công nghệ Vi sinh thuộc Khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam, từ tháng 4 đến tháng 9 năm 2019.
Vật liệu
Bài viết này tổng hợp 18 mẫu bệnh lý từ cây cam, chanh và bưởi, bao gồm các triệu chứng như thối rễ, tàn lụi lá, thân xì mủ và thối quả Những mẫu này được thu thập từ các vùng Thái Bình, Hà Nội, Phú Thọ và Yên Bái.
Bộ môn Công nghệ Vi sinh thuộc Khoa Công nghệ sinh học của Học viện Nông Nghiệp Việt Nam đã cung cấp 80 chủng xạ khuẩn và 30 chủng vi khuẩn, phục vụ cho nghiên cứu và ứng dụng trong lĩnh vực công nghệ sinh học.
Môi trường nghiên cứu
Môi trường nuôi cấy Vi sinh vật gây bệnh
Môi trường PDA (Potato D-Glucose Agar) (w/v): 200g khoai tây; 20 D- Glucose; nước 1 lít; pH 5.8; với môi trường đặc bổ sung 2% agar
Môi trường WA (Water Agar): Agar 20g; nước 1 lít; pH = 7-7,4
Môi trường Czapek (g/l): Saccharose 30g; NaNO3 3g; K2HO4 1g; MgSO4
0,5g; KCl 0,5g; FeSO4 0,1g; nước 1 lít; pH =5-5,5
Môi trường V8-juice argar (g/l): V8-juice 100ml; L-Asparagine 10g; cao nâm men 2g; CaCO3 2g; Glucose 2g; Agar 20g; nước 1 lít; pH = 5.7 ± 0.2
Môi trường thử khả năng sinh enzyme cellulase: Agar; cơ chất (0.1% CMC); nước cất; thuốc nhuộm là dung dịch KI (0.1%)
Môi trường CMC gồm: (NH4)2SO4 1g; K2 HPO4 1g; MgSO4.7H2 O 0,5g; NaCl 0,01g; CMC 10g; Agar 10g; nước 1 lít; pH = 7
Môi trường hoạt hóa và nghiên cứu vi sinh vật có hoạt tính kháng
Môi trường Gause-I (w/v): 2% Tinh bột tan; 0.05% K2HPO4; 0.05% MgSO4.7H2O; 0.05% NaCl; 0.05% KNO3; 0.001% FeSO4; 2% Agar; pH 7.0-7.4
Môi trường ISPII (w/v): 0.4% cao nấm men; 1% cao malt; 0.4% D-glucose; 2% agar; pH 7-7.2
Môi trường LB (Luria Bertani) (w/v): 1% peptone; 0.5% cao nấm men; 1% NaCl; pH 7.0; với môi trường đặc bổ sung 2% agar.
Dụng cụ, thiết bị và hóa chất sử dụng
3.4.1 Dụng cụ Ống nghiệm, đĩa Petri, micropipet (50μl-1000μl), ống đong, cốc thuỷ tinh, đũa thuỷ tinh, pipet thuỷ tinh (1ml, 5ml, 10ml), que chang, que cấy, bao hấp, giấy gói, chun, ống Eppendorf, ống fancol, bình xịt,
Tủ cấy vô trùng Nuaire (Mỹ), tủ nuôi vi sinh vật Sanyo (Nhật Bản), nồi hấp Harayma (Nhật Bản), tủ sấy từ Đức, máy ly tâm SORVALL RC 6 (Đức), máy đo pH Horia (Nhật Bản), lò vi sóng Sanyo (Nhật Bản), bếp điện, nhiệt kế, cân điện tử, và tủ lạnh Sanyo (Nhật Bản) là những thiết bị quan trọng trong phòng thí nghiệm, hỗ trợ nghiên cứu và phát triển trong lĩnh vực vi sinh vật.
Các hóa chất pha môi trường
Hóa chất nghiên cứu một số đặc điểm sinh hóa của các chủng vi sinh vật Hóa chất để tách chiết DNA, PCR, điện di.
Phương pháp nghiên cứu
3.5.1 Giữ giống vi sinh vật
Để giữ giống vi khuẩn, các chủng vi khuẩn sau khi làm thuần sẽ được cấy trên môi trường thạch nghiêng trong ống nghiệm (Lương Đức Phẩm, 2004) Các chủng này được nuôi ở nhiệt độ 30°C trong 2 ngày Ống giống được bảo quản ở 4°C, thực hiện cấy chuyển hàng tháng và được hoạt hóa trước khi tiến hành nhân giống.
3.5.2 Phương pháp phân lập mẫu nấm bệnh
Quy trình thu mẫu được tiến hành tại các tỉnh Thái Bình, Hà Nội, Phú Thọ và Yên Bái, trong đó sau 2 ngày thu thập, đã thu được tổng cộng 18 mẫu, bao gồm 8 mẫu đất, 2 mẫu lá, 2 mẫu thân, 2 mẫu quả và 4 mẫu rễ từ cây chanh và bưởi.
Khi lựa chọn cây trồng, cần chú ý đến những cây có khả năng đang ủ bệnh, biểu hiện qua các dấu hiệu như thối rễ, lá tàn lụi, thân xì mủ và thối quả Ngoài ra, nếu khi đào đất xung quanh mà có mùi hôi thối, đó cũng là một dấu hiệu cảnh báo.
Mẫu đất và rễ được thu thập theo hình chiếu của tán cây, tức là lấy mẫu đến vị trí tán cây Sau khi xác định vị trí phù hợp, cần dùng cuốc để loại bỏ lớp đất bề mặt và tàn dư thực vật khoảng 10cm Mẫu đất và rễ sẽ được lấy từ tầng đất 10-30cm, đảm bảo đất không quá khô hay quá ướt.
2 địa điểm khác nhau trên cùng 1 cây và trộn với nhau, khoảng 200g đất và 100g rễ/mẫu Ghi rõ thông tin mẫu
Bẫy nấm bằng cánh hoa hồng
Sau khi thu mẫu từ khu vực bị bệnh, bạn cần cân 100g đất và cho vào cốc nhựa Tiếp theo, đổ nước vào cốc sao cho khoảng cách giữa đất và nước là 7cm Khuấy nhẹ để hòa trộn, sau đó vớt bọt và các vật thể nổi lên trên bề mặt, để yên một lúc Cuối cùng, hãy đặt từng cánh hoa hồng lên bề mặt cốc, đảm bảo cánh hoa chỉ tiếp xúc với bề mặt nước mà không bị chìm trong dung dịch.
Làm tương tự với các mẫu còn lại (rễ, thân và lá) Để cốc ở nơi thoáng mát và quan sát 3 ngày
Nếu cánh hoa hồng chuyển từ màu đỏ sang màu nâu cánh gián thì đó là nấm
Phytophthora, còn lại cánh hoa hồng không đổi màu thì đó không phải là nấm Phytophthora
Phân lập từ mẫu trực tiếp Đối với mẫu đất:
Trước tiên, các mẫu đất cần được xử lý bằng cách phơi khô ở nhiệt độ phòng trong 2-3 ngày, sau đó sử dụng rây để phân lập qua sàng có kích thước 2-3mm.
2 Cân 1g đất đã xử lý cho vào 9ml nước cất khử trùng, sử dụng máy vortex để trộn đều mẫu
3 Pha loãng mẫu ở các nồng độ pha loãng khác nhau: 10 -4 , 10 -5 để phân lập nấm trong đất.
4 Hút 0,5 ml dịch pha loãng ở 2 nồng độ trên nhỏ lên đĩa Petri chứa môi trường phân lập (môi trường PDA) Dùng que gạt trang đều dịch trên bề mặt thạch Quan sát đĩa sau 3-4 ngày Đối với mẫu thân, rễ, lá
Sau khi mang mẫu rễ, thân, lá về, cần rửa sạch và khử trùng bằng nước Javen 5% trong 10 phút Sau đó, để ráo và đặt lên đĩa thạch chứa môi trường PDA Đặt đĩa thạch trong tủ ở nhiệt độ 30°C và quan sát sau 3-4 ngày.
Phân lập từ cách hoa hồng
Môi trường dùng để phân lập là PDA
Chọn những cánh hoa hồng đã chuyển từ màu đỏ sang màu nâu, cắt nhỏ các phần xỉn màu và đặt lên đĩa petri có môi trường PDA Để đĩa thạch trong tủ ở nhiệt độ 30°C và quan sát sau 3-4 ngày.
3.5.3 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái của chủng nấm
Quan sát hình thái của nấm sau khi nuôi cấy chúng ở nhiệt độ 30°C sau 24h nuôi cấy Quan sát đặc điểm sinh học của nấm
Các đặc điểm hình thái đặc trưng cần quan sát: Hình dạng bào tử, đặc điểm cuống sinh bào tử, bào tử
Bước 1: Làm tiêu bản trên lam kính, lam kính cần rửa sạch, lamen bọc giấy hấp khử trùng ở 121°C trong 45 phút
Để thực hiện bước 2, hãy làm việc trong điều kiện tủ cấy vô trùng Sử dụng que cấy để lấy sợi nấm và đặt chúng lên lam kính, sau đó nhẹ nhàng đậy lamen lên với góc nghiêng từ 45° xuống.
Bước 3: Để thấy rõ đặc điểm hình thái cần sử dụng thuốc nhuộm Cách sử dụng thuốc nhuộm:
Phương pháp này áp dụng thuốc nhuộm ít độc hại hoặc không độc đối với vi sinh vật, được pha loãng ở nồng độ an toàn nhằm đảm bảo rằng tế bào vi sinh vật vẫn sống sót và hoạt động bình thường sau khi nhuộm màu.
Nhỏ 1 giọt thuốc nhuộm xanh metylen 0,001% lên phiến kính
Nhỏ 1 giọt canh trường vi sinh vật với thuốc nhuộm Đậy lá kính lên giọt dịch Có thể nhỏ thêm dầu kính để soi rõ hơn
Quan sát tiêu bản ở vật kính khác nhau
Ghi rõ đặc điểm hình thái, thời gian, quan sát sau 8h/lần
3.5.4 Phương pháp tái lây nhiễm
Sau khi phân lập thu được chủng nấm thuần nuôi ở 30°C trên môi trường PDA rồi tiến hành tái lây nhiễm
Các bước thực hiện quá trình tái lây nhiễm:
Để chuẩn bị môi trường PDA lỏng, trước tiên bạn cần pha chế môi trường mà không bổ sung agar Sau khi pha xong, hãy cho môi trường vào ống nghiệm và hấp khử trùng ở nhiệt độ 121°C trong 45 phút.
Bước 2: Hút mỗi ống nghiệm 5-7ml sau đó bịt chặt đầu ống nghiệm lại bằng nút bông, sau khi xong mang ống nghiệm đi hấp khử trùng ở 121°C trong 45 phút
Để thực hiện bước 3, bạn cần làm việc trong môi trường tủ cấy vô trùng Sử dụng dao để cắt nhỏ từng chủng nấm, sau đó dùng que cấy để chuyển nấm vào từng ống nghiệm và nút bông chặt lại Đừng quên ghi rõ tên chủng và thời gian lưu trữ trên thành ống nghiệm.
Bước 4: Nuôi lắc ở 30°C trong 7 ngày
Để thực hiện lây nhiễm nhân tạo trên quả chanh, tạo một vết cắt dài 3-4 mm trên vỏ quả bằng dao mổ Sau đó, tưới dịch nấm đã chuẩn bị và đắp trực tiếp sợi nấm lên vết cắt Đối với quả chanh làm đối chứng, thực hiện tương tự nhưng thay dịch nấm bằng nước cất và không đắp sợi nấm Sau một tuần, quan sát quả chanh; nếu quả chuyển từ màu vàng sang màu nâu, đó là dấu hiệu của sự nhiễm nấm.
Quá trình lây nhiễm nhân tạo đóng vai trò quan trọng trong việc xác định các chủng nấm gây bệnh cho cây, từ đó hỗ trợ cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.5.5 Đánh giá dặc điểm sinh học a Khả năng sinh enzyme cellulase
