Nội dung và phương pháp nghiên cứu
Địa điểm nghiên cứu
- Phòng thí nghiệm trọng điểm CNSH – Thú Y cụm 2 - Khoa Thú y – Học viện nông nghiệp Việt Nam
- Bộ môn nội chẩn dược độc chất - khoa Thú Y – HVNNVN
Đối tượng nghiên cứu
Mẫu gà có triệu chứng hô hấp nghi ngờ mắc bệnh ORT được thu thập từ các lứa tuổi khác nhau ở khu vực Hà Nội, Bắc Giang, Bắc Ninh và Hưng Yên.
Nguyên vât liệu
- Phòng thí nghiệm trọng điểm CNSH – Thú Y cụm 2 - Khoa Thú y – Học viện nông nghiệp Việt Nam
- Bộ môn nội chẩn dược độc chất - khoa Thú Y – HVNNVN
Mẫu gà có triệu chứng hô hấp nghi ngờ mắc bệnh ORT được thu thập từ các lứa tuổi khác nhau tại khu vực Hà Nội, Bắc Giang, Bắc Ninh và Hưng Yên.
1) Tình hình mắc bệnh đường hô hấp nói chung và bệnh ORT nói riêng trên đàn gà tại 4 tỉnh Hà Nội, Bắc Ninh, Bắc Giang và Hưng Yên
+ Tình hình mắc một số bệnh đường hô hấp tại 4 tỉnh Hà Nội, Bắc Ninh, Bắc Giang và Hưng Yên
+ Tình hình mắc một số bệnh đường hô hấp theo lứa tuổi
+ Tình hình mắc một số bệnh đường hô hấp theo mùa vụ
+ Tình hình mắc hoặc nghi mắc bệnh ORT tại 4 tỉnh
+ Nghiên cứu biểu hiện các triệu chứng lâm sàng và biến đổi bệnh lý đại thể của gà mắc bệnh ORT
2) Phân lập vi khuẩn ORT từ những gà mắc bệnh
+ Giám định vi khuẩn ORT bằng kĩ thuật PCR
+ Nuôi cấy và phân lập vi khuẩn ORT
+ Xác định tỷ lệ phân lập vi khuẩn ORT ở một số cơ quan của gà mắc bệnh
3) Giám định một số đặc tính sinh học của vi khuẩn ORT
4) Xác định tính mẫn cảm của vi khuẩn với một số loại kháng sinh
Gà và các mẫu bệnh phẩm nghi ngờ mắc bệnh ORT được thu thập từ phổi, hạnh phổi, khí quản, phế quản, mẫu Swab (dịch ngoáy mũi, mắt, miệng, ổ nhớp, khí quản), lách, ruột, và hạch Những mẫu này được lấy từ các trang trại chăn nuôi gà tại Hà Nội, Bắc Giang, Bắc Ninh và Hưng Yên.
3.4.2 Các loại môi trường, hoá chất
* Các loại môi trường nuôi cấy và phân lập vi khuẩn
Vi khuẩn phát triển trong điều kiện hiếu khí, hiếu khí tùy tiện hoặc yếm khí tùy tiện, với nhiệt độ tối ưu là 37°C, nhưng vẫn có thể sinh trưởng ở khoảng 30 – 42°C Sự phát triển của vi khuẩn được tăng cường khi bổ sung 5 – 10% máu cừu hoặc máu thỏ vào môi trường nuôi cấy, mặc dù chúng cũng có thể phát triển trên môi trường tryptose soy agar và chocolate agar Tuy nhiên, vi khuẩn không thể sinh trưởng trên các môi trường như Macconkey agar và Endo agar Các môi trường dạng lỏng như BHI và PB cần được lọc kỹ để đảm bảo sự phát triển của vi khuẩn.
Môi trường lý tưởng cho việc nuôi cấy vi khuẩn ORT là thạch mỏu Columbia Blood Agar, được bổ sung 5% mỏu cừu hoặc mỏu thỏ cùng với 5 µg/ml gentamycin (Asadpour et al., 2008).
Để pha thạch máu Blood agar, cần cân chính xác 3,9g thạch máu và hòa tan trong 100ml nước cất, sau đó hấp ướt ở 121°C trong 30 phút Để nguội đến 45-50°C, rồi bổ sung 5ml máu thỏ và lắc đều cho máu thỏ hòa tan trong thạch Thạch đạt tiêu chuẩn khi có màu đỏ tươi.
Để phân lập các vi khuẩn ORT từ các mẫu bị tạp nhiễm, cần bổ sung 10 µg gentamycin cho mỗi ml môi trường thạch mầu, vì hầu hết các ORT đều kháng gentamycin Sau đó, đổ dung dịch vào đĩa lồng với thể tích 10 – 15 ml cho mỗi đĩa.
Hình 3.1 Hình ảnh thạch máu có bổ sung gentamycin
- Hoá chất nhuộm Gram: tím Genxian, đỏ fucxin, cồn axetol 70 độ, dung dịch lugon
- Thử phản ứng oxydase: giấy thử phản ứng oxydase tẩm 1% dung dịch Tetrametyl-p Phenylenediamine hydrochloride
- Thử phản ứng indol: thuốc thử Kovac ’ s, nước trypton
- Thử phản ứng KOH: dung dịch KOH 10%
- Thư phản ứng ure: canh thang ure
- Các loại đường: Succarose, maltose, glucose, lactose, fructose
- Thử kháng sinh đồ: môi trường thạch máu thỏ, giấy tẩm kháng sinh
- Kit QIAamp DNA Mini Kit của hãng QIAGEN để chiết tách DNA
3.4.3 Máy móc, giống vi khuẩn
Trong nghiên cứu và thí nghiệm, các thiết bị như tủ ấm, tủ -80 độ C, kính hiển vi, máy ly tâm, máy vortex, máy PCR, máy chạy điện di, máy chụp gel, máy hấp ướt, tủ sấy khô, tủ lạnh bảo quản mẫu và tủ lạnh bảo quản môi trường đóng vai trò quan trọng trong việc đảm bảo chất lượng và độ chính xác của kết quả Những thiết bị này không chỉ hỗ trợ trong việc bảo quản mẫu mà còn giúp nâng cao hiệu quả trong các quy trình phân tích và thí nghiệm.
Dao, kéo, panh kẹp, khay, đèn cồn, eppendorf, lanmen, lam kính, bộ dụng cụ nhuộm, ống nghiệm, đĩa lồng, pipet, dụng cụ bảo hộ….
Phương pháp nghiên cứu
3.5.1 Phương pháp quan sát các triệu chứng lâm sàng
Chúng tôi đã tiến hành theo dõi và lấy mẫu gà từ các đàn nghi mắc bệnh ORT tại một số trại ở Hà Nội, Bắc Ninh, Bắc Giang và Hưng Yên Trong quá trình này, chúng tôi ghi chép các triệu chứng lâm sàng của gà còn sống, bao gồm: ủ rũ, khó thở, hắt hơi, vảy mỏ, mũi có dịch viêm và đau mắt.
Chúng tôi tiến hành mổ khám gà có triệu chứng rõ ràng để kiểm tra bệnh tích đại thể của tất cả các cơ quan, tuân thủ quy trình mổ khám gia cầm của Cục Thú y.
Nếu gia cầm còn sống phải dùng các biện pháp làm chết tránh gây biến đổi lớn về mức độ quan sát bệnh tích (dùng điện, cắt tiết…)
Kiểm tra bên ngoài: thể trạng cơ thể, da, lông, u, các lỗ tự nhiên, khớp, ngoại kí sinh trùng và các tổn thương…
Mổ khám kiểm tra nội tạng bên trong
Ghi báo cáo mổ khám và phiếu gửi bệnh phẩm
Xử lý tiêu độc xác gia cầm
3.5.3 Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu
Các mẫu được lấy theo quy định của ngành
Mẫu cơ quan tổ chức cần được lấy từ đúng cơ quan và đúng vùng tổn thương điển hình, đồng thời phải đảm bảo đủ thành phần cấu tạo cần nghiên cứu và đủ lượng cần thiết để đạt được kết quả chính xác.
Mẫu bệnh có thể được lấy từ dịch ngoáy mũi, dịch hầu họng, dịch khí quản và dịch phế quản của gà ở mọi lứa tuổi Để lấy mẫu dịch ngoáy mũi và hầu họng, sử dụng tăm bông vô trùng ngoáy sâu vào lỗ mũi/hầu họng của gà đã được sát trùng bằng cồn 70 độ, sau đó cho tăm bông vào ống nghiệm chứa môi trường vận chuyển như Stuart Transport medium hoặc dung dịch PBS, đậy nắp và ghi nhãn trước khi đưa về phòng thí nghiệm trong vòng 2-8 giờ Nếu khoảng cách xa, cần bảo quản mẫu ở tủ lạnh dương Đối với dịch khí quản và phế quản, dùng kéo vô trùng cắt dọc và sử dụng tăm bông để lấy dịch, sau đó cũng cho vào môi trường như trên, đậy nắp, ghi nhãn và vận chuyển về phòng thí nghiệm.
Với mẫu là tổ chức phổi: sau khi mổ khám gà, dùng kéo vô trùng cắt lấy tổ chức phổi ở vùng định xét nghiệm
Với mẫu là tổ chức phổi bệnh: chỉ lấy mẫu đối với phổi có bệnh tích quan sát được bằng mắt thường, cách lấy như trên
3.5.4 Phương pháp nuôi cấy và phân lập vi khuẩn
Phân lập vi khuẩn là quá trình tách riêng vi khuẩn từ quần thể ban đầu nhằm tạo ra vi khuẩn ở dạng thuần khiết Vi sinh vật thuần khiết được hình thành từ một tế bào ban đầu và đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật Thông qua phương pháp phân lập, chúng ta có thể thu được vi khuẩn thuần khiết, từ đó xác định các đặc điểm sinh học và hóa học liên quan đến khả năng gây bệnh của vi khuẩn.
Mẫu sau khi lấy về được cấy trên các môi trường thông thường và đặc biệt như: thạch máu thỏ 5-10%, nước thịt, thạch Chocolate Nuôi cấy ở 37 o C trong
Thời gian nuôi cấy vi khuẩn có thể từ 24 giờ đến 48 giờ, tùy thuộc vào loại vi khuẩn Để chọn lựa các khuẩn lạc riêng biệt, cần căn cứ vào tính chất phát triển trên các môi trường khác nhau Đối với ORT, quá trình nuôi cấy được thực hiện trên môi trường thạch máu thỏ có bổ sung gentamycin 5%, ở nhiệt độ 37°C trong khoảng 10 – 15 ngày Kết quả cho thấy khuẩn lạc nhỏ, không có hiện tượng dung huyết xung quanh, có màu xám đến xám trắng, thỉnh thoảng xuất hiện màu đỏ hung, với bề mặt lồi và bờ rìa rõ ràng Đặc biệt, vi khuẩn này không phát triển trên môi trường Macconkey.
Dựa vào sơ đồ phân lập:
Dịch ngoáy mũi của gà mắc ORT các lứa tuổi
↓ Nuôi cấy trên môi trường thạch máu thỏ
Phân lập thuần khiết khuẩn lạc trên môi trường Columbia Blood Agar
↓ Nhuộm Gram, kiểm tra hình thái
Kiểm định, định loại vi khuẩn bằng các đặc tính hình thái và sinh hoá
↓ Cấy vào thạch giữ giống, trộn với 25% glycerol nguyên chất
Trong quá trình nhuộm Gram, vi khuẩn Gram dương giữ lại phức hợp tím gentians nhờ vào cấu trúc vách tế bào đặc biệt, không bị tẩy màu bởi ancolhol Ngược lại, vi khuẩn Gram âm không giữ được phức hợp này và sẽ bắt màu hồng của fucshin Kết quả là, vi khuẩn Gram dương có màu tím gentians, trong khi vi khuẩn Gram âm có màu hồng.
Bước đầu tiên trong quy trình là dàn đều và cố định tiêu bản Bạn cần nhỏ một giọt nước muối sinh lý lên lam kính sạch, sau đó dùng que cấy vô trùng để lấy 1-3 khuẩn lạc từ đĩa thạch đã nuôi cấy và cho vào giọt nước để khô tự nhiên Cuối cùng, cố định tiêu bản bằng cách hơ nhanh phiến kính trên ngọn lửa đèn cồn từ 2-3 lần để vi khuẩn gắn chặt vào phiến kính, giúp vi khuẩn bắt màu tốt hơn.
Nhỏ dung dịch tím Gentians để yên trong vòng 1 phút, rửa nước
Nhỏ dung dịch Lugol và để yên trong vòng 1 phút, rửa nước
Khử màu bằng cách cho dung dịch alcohol 70% chảy qua, để khô
Nhỏ tiếp dung dịch Fucshin và để yên trong 1 phút, rửa nước, để khô Quan sát hình thái vi khuẩn được nhuộm ở vật kính dầu với độ phóng đại 100
3.5.6 Phương pháp thử các đặc tính sinh hoá của chủng vi khuẩn phân lập được
Phản ứng thử Oxydase được thực hiện bằng cách sử dụng thuốc thử của hãng Remel, với giấy thấm đã được tẩm 1% dung dịch Tetrametyl-p Phenylenediamine hydrochloride Để tiến hành, cần dùng que cấy vô trùng để lấy khuẩn lạc từ môi trường thạch máu và phết đều lên bề mặt giấy Nếu trong vòng 10 giây đầu, môi trường chuyển sang màu tím than, điều này cho thấy phản ứng dương tính và ORT có phản ứng Oxidase dương tính.
Phản ứng Catalase được thực hiện bằng cách dùng que cấy vô trùng để lấy khuẩn lạc từ môi trường thạch và đặt lên một điểm trên phiến kính sạch Sau đó, nhỏ một giọt dung dịch oxy già (H2O2 3%) lên khuẩn lạc và trộn đều Nếu xuất hiện hiện tượng sủi bọt, đó là phản ứng dương tính, trong khi ORT có phản ứng Catalase âm tính.
Phản ứng Indol được sử dụng để phát hiện vi khuẩn có enzyme tryptophanase, có khả năng chuyển hóa tryptophan thành indol Để thực hiện, cấy vi khuẩn vào môi trường nước trypton và ủ ở 37°C trong 24 giờ Sau đó, nhỏ vài giọt thuốc thử Kovac’s; nếu phản ứng dương tính, sẽ xuất hiện vòng màu hồng cánh sen nổi lên trên do indol kết hợp với p-dimethylaminobenzaldehyde trong thuốc thử Ngược lại, nếu không có màu hoặc màu vàng xuất hiện, đây là phản ứng âm tính Cần lưu ý rằng ORT có phản ứng indol âm tính.
Phản ứng KOH là một phương pháp kiểm tra vi khuẩn bằng cách sử dụng que cấy để lấy khuẩn lạc từ môi trường thạch máu và phết lên phiến kính đã có sẵn một giọt dung dịch KOH 10% Nếu khuẩn lạc vón cục, kết quả là dương tính; ngược lại, nếu khuẩn lạc tan ra và không tạo nhớt, kết quả là âm tính Đặc biệt, ORT có phản ứng KOH âm tính.
Phản ứng phân giải ure liên quan đến enzyme urease, giúp chuyển đổi ure thành ammonia và carbon dioxide Sự hình thành ammonia làm kiềm hóa môi trường Để thực hiện thí nghiệm, cấy vi khuẩn vào canh thang ure và ủ ở nhiệt độ 37°C trong 24 – 48 giờ Kết quả dương tính sẽ cho thấy môi trường có màu tím đỏ, trong khi kết quả âm tính sẽ không có màu ORT cho kết quả phản ứng ure dương tính.
3.5.7.1 Phương pháp chiết tách DNA
Chúng tôi sử dụng bộ kit QIAamp DNA Mini Kit của Hãng QIAGEN (QIAGEN Inc., USA) để tách chiết DNA tổng số theo các bước:
Bước 1: Cho 20àl Proteinase K vào ống Eppendorf Thờm 180 àl Buffer
ATL, trộn đều ủ ở 56 o C trong 3 giờ
Bước 2: Thờm 4àl ARNase và 200 àl Buffer AL Ủ ở 70 o C trong 30 phỳt
Bước 3: Thờm 200 àl Ethanol (96 - 100%), trộn đều
Bước 4: Chuyển mẫu sang cột có màng lọc, ly tâm 13000 vòng/phút trong
1 phút Loại bỏ dịch ở dưới
Bước 5: Thờm 500àl Buffer AW1, rồi ly tõm 8000 vũng/phỳt trong 1 phút, bỏ dịch dưới
Bước 6: Thờm 500àl Buffer AW2, ly tõm 13000 vũng/phỳt trong 2 phỳt, bỏ dịch dưới Tiếp tục ly tâm thêm 1 lần nữa như trên
Chuyển ADN hệ gen của vi khuẩn từ cột lọc sang ống Eppendorf 1,5ml, thêm 100 µl Buffer AE và ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút Sau đó, ly tâm ở tốc độ 13000 vòng/phút trong 1 phút, thu dịch lỏng bên dưới và bảo quản ở -20°C.
3.5.7.2 Quy trình thực hiện phản ứng PCR
Thành phẩn của phản ứng PCR:
STT Nội dung Thể tớch (àl)
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR:
Giai đoạn Bước Nhiệt độ (ºC) Thời gian Số vòng
Tổng hợp sợi mới 72 90 giây
3.5.8 Phương pháp xác định khả năng mẫn cảm của vi khuẩn với kháng sinh
Khả năng mẫn cảm với kháng sinh của chủng vi khuẩn ORT phân lập được xác định bằng phương pháp kháng sinh đồ
Chủng vi khuẩn kiểm tra được tăng sinh trong môi trường BHI, nuôi trong tủ ấm 37 o C, 5% CO2 trong vòng 24 – 48 giờ Chuẩn bị đĩa thạch máu để tủ ấm
Trước khi sử dụng, hãy lấy 0,1ml canh khuẩn cần kiểm tra và nhỏ vào đĩa thạch, sau đó láng đều Để đĩa thạch khô trong khoảng 3 – 5 phút, nhưng không để quá lâu.
