Nội dung, nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu
Nội dung nghiên cứu
- Tình hình chăn nuôi gà thịt tại Hà Nội
- Phân lập, xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella spp từ các mẫu phân gà thịt
- Định type huyết thanh của các chủng vi khuẩn Salmonella spp phân lập được.
Nguyên liệu nghiên cứu
* Loại mẫu: Mẫu phân gà nuôi tại các trang trại gà thịt ở khu vực Hà Nội
* Đối tượng nghiên cứu: Giống gà Ross 308, 21 ngày tuổi
* Địa điểm nghiên cứu: Các trại gà nuôi gia công ở khu vực Hà Nội
- Quy mô trại: 5.000-8.000 con /trang trại
- Phương thức chăn nuôi: Chăn nuôi gia công
- Hệ thống chuồng trại: chuồng kín, có các thiết bị máng ăn, máng uống bán tự động hoặc tự động
3.2.2 Thiết bị và dụng cụ
Tủ ấm với nhiệt độ ổn định (37±0.5) °C và (41.5±0.5) °C, cùng với kính hiển vi, đĩa petri, pipette (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml), que cấy, lam kính, và tủ cấy trang bị đèn UV, là những thiết bị cần thiết trong nghiên cứu và thí nghiệm Ngoài ra, nồi hấp tiệt trùng hoạt động ở nhiệt độ (121±1) °C với áp suất 1 atm cũng đóng vai trò quan trọng trong việc đảm bảo độ sạch và an toàn cho các mẫu vật.
Các thiết bị, dụng cụ trong phòng thí nghiệm tất cả đều được vô trùng tuyệt đối
Buffered Peptone Water (BPW), Muller-Kauffmann Tetrathionate-novobiocin (MKTTn), Rappaport Vassiliadis Soy (RVS), Xylose Lysine Deoxycholate agar (XLD agar), Hektoen Enteric agar (HE agar), Nutrient agar (NA), Triple Sugar Iron Agar (TSI), Lysin Decarboxylase Broth, Christensen's Ure agar, VP Broth Tryptophan Medium, and 0.85% NaCl are essential media and solutions used in microbiological analysis for the isolation and identification of various microorganisms.
- Đĩa giấy O.N.P.G (Thuốc thử phát hiện β-Galactosidaza)
- Sử dụng chủng chuẩn Salmonella enteritidis ATCC ®13076 TM
Phương pháp nghiên cứu
Sử dụng phương pháp thống kê chuyên môn
- Túi nilon vô trùng , ticker dán mẫu, bút viết kính, dây chun, thùng xốp có chứa đá lạnh để vận chuyển mẫu
Hình 3.1 Trang trại gà thịt, huyện Ba Vì, Hà Nội
Hình 3.2 Trang trại gà thịt, huyện Chương Mỹ, Hà Nội
Để thu thập mẫu từ gà, trước tiên cần cố định gà và sử dụng bông cồn để lau sạch vùng lỗ huyệt Tiếp theo, dùng tăm bông vô trùng đưa vào sâu trong lỗ huyệt và ngoáy nhẹ nhàng Sau đó, chuyển tăm bông vào ống môi trường vận chuyển (ống fancol chứa môi trường thạch Carry Blaird), bẻ bỏ phần tăm bông đã cầm bằng tay Đặt ống fancol vào túi nilon, buộc chặt 2 lớp và ghi thông tin lên giấy dán vào mẫu Cuối cùng, bảo quản mẫu ở nhiệt độ 2-8 °C và vận chuyển về phòng thí nghiệm trong vòng 24 giờ sau khi lấy mẫu.
Trong đó 1 mẫu gồm 20 que tăm bông/ 1 chuồng (1 chuồng có 4 ô, mỗi ô bắt ngẫu nhiên 5 con gà ở 5 vị trí khác nhau)
Hình 3.3 Cố định gà để lấy mẫu
Hình 3.4 Mẫu được bảo quản lạnh trong thùng xốp
3.3.3 Phương pháp nuôi cấy và giám định vi khuẩn Salmonella spp
Nuôi cấy, phân lập và giám định Salmonella theo TCVN 4829:2005/SĐ
Sơ đồ 3.1 Sơ đồ phân lập vi khuẩn Salmonella T Ă N G S IN H C H Ọ N L Ọ C Đ Ổ Đ ĨA V À N H Ậ N D Ạ N G K H Ẳ N G Đ ỊN H
Mẫu + dung dịch đệm pepton Ủ ở 37 o C ± 1 o C/ 18 h ± 2 h
0.1 ml chủng cấy + 10 ml môi trường RVS Ủ trong 24h ± 3h ở 41.5 o C ± 1 o C
1 ml chủng cấy + 10 ml môi trường MKTTn Ủ trong 24h ± 3h ở 37 o C ± 1 o C
Môi trường XLD và môi trường thạch thứ hai Ủ trong 24h ± 3h ở
Từ mỗi đĩa thử một khuẩn lạc đặc trưng Nếu âm tính, thử bốn khuẩn lạc khác đã được đánh dấu
Khẳng định huyết thanh Khẳng định sinh hóa
Bảng 3.1 Cấu trúc kháng nguyên và các kháng huyết thanh đặc hiệu cần ngưng kết để định type của một số chủng Salmonella gây bệnh quan trọng
Tên chủng Cấu trúc kháng nguyên
(Nguồn: Lab gốc giống và sinh phẩm chẩn đoán, Khoa sản xuất, Viện Pasteur TP HCM)
Tiến hành xét nghiệm
Mẫu đã được chuẩn bị đảm bảo tiêu chuẩn để gửi đến phòng xét nghiệm
+ Tăng sinh sơ bộ trong môi trường lỏng không chọn lọc
Bổ sung dung dịch đệm pepton ở nhiệt độ phòng vào ống mẫu có chứa môi trường vận chuyển Carry Blaird, sau đó ủ ở (36 ± 2) 0 C trong (18 ± 2) giờ
+ Tăng sinh trong môi trường lỏng chọn lọc
Để trộn đều dịch tăng sinh trong môi trường không chọn lọc, lắc ống mẫu trên máy lắc Sau đó, sử dụng pipet vô trùng để hút 0,1ml dịch tăng sinh và cho vào 10ml môi trường Rappaport-Vassiliadis (RVS) Tiếp theo, hút 1ml dịch tăng sinh và cho vào 10ml môi trường Muller Kauffmann tetrathionate-novobiocin broth (MKTTn).
Môi trường RVS được ủ ở bể điều nhiệt với nhiệt độ 41.5 ± 1°C trong 24 ± 3 giờ, trong khi môi trường MKTTn được ủ ở tủ ấm tại 37 ± 1°C trong cùng khoảng thời gian Sau khi ủ, canh trùng trở nên đục đều, xuất hiện màng mỏng trên bề mặt môi trường và có cặn ở đáy ống nghiệm.
Hình 3.5 Salmonella trên môi trường MKTTn và RVS
+ Đỗ đĩa và nhận dạng
Lắc đều các ống nghiệm chứa môi trường RVS và MKTTn, sau đó sử dụng que cấy vòng để chuyển dịch tăng sinh từ môi trường lỏng vào hai môi trường đặc chọn lọc: Xylose lysine deoxycholate agar (XLD agar) và Hektoen Enteric agar (HE agar) Thạch XLD và HE được ủ ở nhiệt độ 37 ±.
1) 0 C trong (24 ± 3) giờ Sau thời gian ủ, quan sát khuẩn lạc trên các môi trường
Trong môi trường XLD, khuẩn lạc xuất hiện với hình dạng tròn, lồi và trong suốt Chúng có thể có hoặc không có tâm đen, và đôi khi tâm đen lớn đến mức bao trùm toàn bộ khuẩn lạc, làm cho môi trường xung quanh chuyển sang màu hồng.
Trong môi trường HE, khuẩn lạc có sự thay đổi màu sắc từ xanh dương sang xanh lục Khuẩn lạc có thể xuất hiện với hoặc không có tâm đen, và đôi khi tâm đen có kích thước lớn, bao trùm toàn bộ khuẩn lạc.
Qua các bước tiền tăng sinh, tăng sinh chọn lọc và phân lập thì tế bào
Salmonella có xu hướng bị già và suy thoái, vì vậy việc phục hồi chúng trong các môi trường thạch dinh dưỡng là cần thiết để tăng sinh khối Từ mỗi môi trường phân lập, cần chuyển ít nhất 5 khuẩn lạc đặc trưng sang môi trường dinh dưỡng như TSA để đảm bảo sự phát triển tối ưu.
Nutrient Agar Ủ ở 37 0 C trong 18 – 24 giờ Dùng sinh khối trên môi trường dinh dưỡng này để thử phản ứng sinh hóa và huyết thanh
3.4.3.1 Phản ứng trên môi trường TSI
Cấy khuẩn lạc nghi ngờ Salmonella spp từ thạch Nutrient agar (NA) lên phần nghiêng của môi trường TSI agar bằng que cấy vòng, sau đó dùng que cấy thẳng để đâm sâu xuống đáy ống môi trường Sau khi cấy, ủ ở nhiệt độ (37± 1) °C trong thời gian (24 ± 3) giờ.
+ Salmonella spp cho phản ứng kiềm ở phần bề mặt nghiêng của ống môi trường (cho màu đỏ)
+ Phản ứng acid ở phần đáy (màu vàng) glucose dương tính có sinh khí, có sinh H2S (thạch bị đen)
3.4.3.2 Phản ứng Voges-Proskauer (VP)
- Chuẩn bị môi trường VP broth Hút vào mỗi ống nghiệm 3ml môi trường
- Dùng que cấy tròn cấy khuẩn lạc nghi ngờ từ thạch Nutrient agar (NA) vào 3ml môi trường VP broth Ủ ở (37 ± 1) 0 C trong (24 ± 3) giờ
Sau khi ủ mẫu trong ống môi trường nuôi cấy, thêm vào 2 giọt dung dịch creatin, 3 giọt Alpha-napthol 5% và 2 giọt KOH 40% Lắc nhẹ hỗn hợp và để yên trong 15 phút trước khi quan sát màu sắc của ống môi trường.
- Kết quả: Salmonella spp cho phản ứng (-), môi trường không đổi màu + Nếu phản ứng (+): dung dịch màu hồng đến màu đỏ sáng
+ Nếu phản ứng (-): dung dịch không đổi màu
- Chuẩn bị môi trường Trytophan Hút vào mỗi ống nghiệm 5ml môi trường
Cấy khuẩn lạc nghi ngờ Salmonella spp từ thạch Nutrient agar (NA) vào môi trường Trytophan bằng cách sử dụng que cấy tròn Sau đó, ủ mẫu ở nhiệt độ 37 ± 1 độ C trong thời gian 24 ± 3 giờ để quan sát sự phát triển của vi khuẩn.
- Sau khi ủ thêm 1ml thuốc thử Kovacs’Indol
- Đọc kết quả: Salmonella spp cho phản ứng (-),
+ Nếu phản ứng (+): dung dịch màu hồng đến màu đỏ sáng
+ Nếu phản ứng (-): dung dịch không đổi màu
- Chuẩn bị môi trường Lysine decarboxylase broth Hút vào mỗi ống nghiệm 5ml môi trường
- Cấy khuẩn lạc nghi ngờ Salmonella spp từ thạch Nutrient agar (NA) vào 5ml môi trường Lysin decarboxylase broth Ủ ở (37 ± 1) 0 C trong (24 ± 3) giờ
- Đọc kết quả: Salmonella spp cho phản ứng (+)
+ Nếu phản ứng (+): Môi trường nuôi cấy đục và có màu tím
+ Nếu phản ứng (-): Môi trường nuôi cấy có màu vàng
- Chuẩn bị môi trường thạch Urea Hút vào mỗi ống nghiệm 5ml môi trường
- Cấy khuẩn lạc nghi ngờ Salmonella spp từ thạch Nutrient agar (NA) vào môi trường thạch Urea Ủ ở 37 0 C ± 1 0 C trong 24 giờ ± 3 giờ
- Đọc kết quả: Salmonella spp cho phản ứng (-)
+ Nếu phản ứng (+): Môi trường nuôi cấy có màu hồng, sau đó đỏ hồng + Nếu phản ứng (-): Môi trường nuôi cấy không đổi màu
3.4.3.6 Phát hiện β-galactosidase (sử dụng đĩa giấy O.N.P.G)
- Cho đĩa giấy O.N.P.G vào ống nghiệm chứa 0,1 ml nước muối 0.85%
- Cấy 1 vòng sinh khối vi khuẩn lấy từ khuẩn lạc nghi ngờ trên môi trường
NA vào ống nghiệm chứa NaCl 0.85% và đĩa giấy O.N.P.G
- Ủ ống nghiệm ở (36±1) 0 C/ (24±3) h trong bể điều nhiệt, phản ứng thường xuất hiện sau từ 1-6 giờ
- Salmonella sẽ cho phản ứng β-galactosidase (-)
+ Nếu phản ứng (+): Môi trường có màu vàng
+ Nếu phản ứng (-): Môi trường không đổi màu
Bảng 3.2 Giải thích các phép thử sinh hóa P hé p th ử* (3 4 3 1 đ ến 3 4 3 6 )
Các chủng Salmonella như S typhi, S paratyphi A, S paratyphi B và S paratyphi C có phản ứng khác nhau với các loại đường như glucose, lactose và sucrose Trong đó, S typhi cho phản ứng dương tính với glucose và lactose, trong khi S paratyphi B có phản ứng tích cực với glucose nhưng không với lactose Các tỷ lệ phần trăm phản ứng này không đồng nhất giữa các chủng, cho thấy sự đa dạng trong khả năng lên men đường của chúng Đặc biệt, Salmonella typhi là loại vi khuẩn có khả năng gây bệnh cao Để hiểu rõ hơn về các chủng này, cần tiến hành các thí nghiệm bổ sung nhằm xác định tính chất và khả năng gây bệnh của chúng.
3.4.4 Khẳng định huyết thanh & type huyết thanh
Việc phát hiện sự có mặt của Salmonella kháng nguyên O, kháng nguyên
Vi và kháng nguyên H được kiểm tra thông qua phương pháp ngưng kết trên phiến kính, sử dụng huyết thanh phù hợp từ các khuẩn lạc thuần khiết, sau khi đã loại trừ các chủng có khả năng tự ngưng kết.
3.4.4.2 Loại trừ chủng tự ngư ng k ết
Cho một giọt dung dịch nước muối sinh lý 0,85% NaCl lên phiến kính thủy tinh sạch, sau đó dùng que cấy vòng trộn đều với khuẩn lạc cần thử để tạo huyền phù đục và đồng nhất Lắc nhẹ phiến kính trong 30 đến 60 giây và quan sát kết quả trên nền tối, tốt nhất là dùng kính lúp Nếu vi khuẩn có hiện tượng kết dính, chủng này được xem là tự ngưng kết và không cần thử nghiệm tiếp Ngược lại, nếu huyền dịch đục đều, tiến hành giám định theo các bước tiếp theo.
Sử dụng khuẩn lạc thuần khiết không tự ngưng kết, thay thế dung dịch nước muối sinh lý bằng một giọt huyết thanh kháng nguyên O theo quy trình 3.4.4.2 Nếu có hiện tượng ngưng kết xảy ra, phản ứng sẽ được xác định là dương tính Tiến hành lần lượt với huyết thanh đa giá và đơn giá.
3.4.4.4 Kiểm tra kháng nguyên Vi
Tiến hành theo 3.4.4.2 nhưng sử dụng một giọt huyết thanh kháng nguyên Vi Nếu xuất hiện ngưng kết thì phản ứng được xem là dương tính
Cấy khuẩn lạc thuần khiết không có khả năng tự ngưng kết vào môi trường thạch dinh dưỡng nửa đặc Semi-solid nutrient ager Ủ ở 37 °C trong 24 h ± 3h
Sử dụng chủng cấy này để kiểm tra kháng nguyên H, tiến hành theo 3.4.4.2 nhưng sử dụng một giọt huyết thanh kháng nguyên H
Nếu xuất hiện ngưng kết thì phản ứng được xem là dương tính
Có hay không có Salmonella trong mẫu
Bảng 3.3 Giải thích các kết quả các phép thử khẳng định
Phản ứng huyết thanh Giải thích Điển hình Không Kháng nguyên O,
Các chủng được coi là
Salmonella Điển hình Không Tất cả các phản ứng âm tính
Có thể là Salmonella Điển hình Có Không thử nghiệm
Phản ứng không điển hình Không/ Có Kháng nguyên O,
Vi hoặc H dương tính Phản ứng không điển hình Không/ Có Tất cả các phản ứng âm tính
Các chủng Salmonella được thu thập từ môi trường thạch dinh dưỡng và được bảo quản trong ống eppendorf với môi trường TSB và glycerin 80% theo tỷ lệ 0.8 ml : 0.2 ml ở nhiệt độ -20°C để duy trì giống Các mẫu này cần được gửi đến trung tâm chuẩn Salmonella đã được công nhận để xác định danh tính của Salmonella.
Kiểm soát kết quả xét nghiệm
Thực hiện mẫu đối chứng âm, mẫu đối chứng dương và mẫu trắng Mẫu dương được thực hiện bằng cách nhiễm 1ml chủng chuẩn có nồng độ pha loãng
Để thực hiện mẫu âm, bạn cần pha loãng 1ml chủng chuẩn không phải Salmonella (sử dụng E.coli) với nồng độ 10 -2 vào mẫu và làm theo hướng dẫn Đối với mẫu trắng, hãy thêm 1ml nước muối sinh lý vào mẫu và thực hiện theo hướng dẫn đã cung cấp.
Xác nhận định danh Salmonella
Các chủng vi khuẩn Salmonella sẽ được xác định loại huyết thanh theo phương pháp White-Kauffmann, theo hướng dẫn của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) năm 1983.
- Bộ kháng huyết thanh Salmonella
- Các môi trường, hóa chất, dụng cụ, trang thiết bị phòng thí nghiệm
* Chuẩn bị vi khuẩn Salmonella
Lấy 1 ít vi khuẩn Salmonella từ môi trường đặc hiệu, ria cấy lên ống thạch Nutrient agar đã chuẩn bị, ủ ở 37 o C / 24 giờ
Thử kháng huyết thanh đa giá poly O
• Nhỏ 1 giọt khỏng huyết thanh Salmonella polyvalent O (20 àl) lờn phiến kính
• Nhỏ 1 giọt nước sinh lý lên vị trí khác trên phiến kính
• Lấy 1 ít vi khuẩn Salmonella đã nuôi cấy qua đêm trên môi trường Nutrient agar trộn đều vào 2 giọt kháng huyết thanh và nước sinh lý trên phiến kính
• Lắc nhẹ phiến kính 5-10s (20 lần)
Phản ứng dương tính: Có sự hình thành các hạt ngưng kết nhỏ li ti
Phản ứng âm tính: Huyễn dịch vi khuẩn và kháng huyết thanh đồng nhất không có những hạt nhỏ li ti mà có màu trắng sữa hơi đục
Nhóm đơn giá kháng huyết thanh O
Tiến hành với các nhóm OMA, OMB, OMC, tương tự kháng huyết thanh poly O Với nhóm cho phản ứng dương tính, tiếp tục với các kháng huyết thanh
Sơ đồ 3.2 Sơ đồ phân type kháng nguyên O
+ Nếu chủng âm tính với OMA, OMB, OMC, thì cần phải làm phản ứng tiếp theo với OMD, OME, OMF và OMG
+ Nếu chủng ngưng kết với OMA, tiếp tục kiểm tra với nhóm 2; 4; 9; 9,46; 3,10; 1,3,19; 21
+ Nếu chủng ngưng kết với OMB, tiếp tục kiểm tra với nhóm 7; 8; 11; 13; 6,14
+ Nếu chủng ngưng kết với OMC, tiếp tục kiểm tra với nhóm 16; 17; 18; 28; 30; 35; 38
+ Nếu chủng ngưng kết với OMD, tiếp tục kiểm tra với nhóm 39; 40; 41; 42; 43; 44; 45
+ Nếu chủng ngưng kết với OME, tiếp tục kiểm tra với nhóm 47; 48; 50; 51; 52; 53; 61
+ Nếu chủng ngưng kết với OMF, tiếp tục kiểm tra với nhóm 54, 55, 56,
+ Nếu chủng ngưng kết với OMG, tiếp tục kiểm tra với nhóm 60, 62, 63,
Sơ đồ 3.3 Sơ đồ phân type kháng nguyên H
Nhiều chủng Salmonella có hai pha kháng nguyên H, nhưng trong vi khuẩn Salmonella nuôi cấy thường chỉ thấy một pha Để phát hiện pha hai, cần ức chế sự xuất hiện của pha một bằng cách nhỏ một giọt kháng huyết thanh vào đĩa thạch Sven Gard.
Pha 1: Tiến hành tương tự như kháng nguyên O với kháng huyết thanh đa giá poly H, kháng huyết thanh nhóm H (HMA, HMB, HMC), kháng huyết thanh đơn giá H
Để chuẩn bị thạch Sven Gard, bạn cần sử dụng môi trường bán cố thể có sẵn trên thị trường và pha chế theo hướng dẫn của nhà sản xuất Sử dụng đĩa petri có đường kính 9mm và trước khi đổ thạch, hãy nhỏ 1 giọt Anti Sven Gard Serum để ức chế pha 1 Lưu ý rằng loại Anti Sven Gard Serum sẽ khác nhau tùy thuộc vào pha 1, bao gồm các loại SG1, SG2, SG3, SG4, SG5 và SG6.
SG1: ức chế Ha, Hb, Hc, H z10
SG2: ức chế Hd, Hi, He,h
SG3: ức chế Hk, Hy, Hl,w, Hl,z13, Hl,z26
SG4: ức chế Hr, Hz
SG5: ức chế He,n,x, He,n,z15
Sử dụng que cấy vô trùng, lấy một lượng vi khuẩn đã xác định có kháng nguyên H pha 1, sau đó chấm nhẹ lên bề mặt thạch tại vị trí trung tâm của đĩa thạch Sven gard.
- Tiến hành phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính tương tự như đối với pha 1
Bảng 3.4 Kháng huyết thanh ức chế Kháng nguyên H pha 1
STT Kháng huyết thanh Các kháng nguyên H pha 1 bị ức chế
(Ví dụ: Kháng nguyên H pha 1 xác định là Ai thì dùng SG2 để ức chế A)
Phương pháp xử lý số liệu
Các kết quả thu thập được xử lý bằng toán thống kê sinh vật học, sử dụng phần mềm Excell 2007.
Kết quả nghiên cứu và thảo luận
Tình hình chăn nuôi gà thịt tại khu vực Hà Nội
4.1.1 Khái quát về các điều kiện tự nhiên, kinh tế- xã hội ảnh hưởng tới chăn nuôi gà thịt tại khu vực Hà Nội
4.1.1.1 Khái quát về các điều kiện tự nhiên
Các trang trại gà thịt được nghiên cứu nằm tại các huyện ngoại thành của thành phố Hà Nội, bao gồm Sơn Tây, Ba Vì, Quốc Oai và Thạch Thất.
Mỹ Đức và Chương Mỹ nằm trong khoảng vĩ độ từ 20034’ đến 21018’ Bắc và kinh độ từ 104017’ đến 1060’ Đông Khu vực này giáp với Hưng Yên ở phía Đông, Hà Nam ở phía Đông Nam, Hòa Bình ở phía Tây Nam, cùng với Vĩnh Phúc và Phú Thọ ở phía Tây Bắc và Bắc.
Hà Nội, nằm ở trung tâm châu thổ Sông Hồng, là nơi hội tụ của các mạch núi Tây Bắc và Đông Bắc như Hoàng Liên Sơn, Con Voi, và Tam Đảo Với diện tích 3.323,6 km², Hà Nội sở hữu nhiều lợi thế về điều kiện tự nhiên và tài nguyên, góp phần vào sự phát triển kinh tế, xã hội và văn hóa Đây là đầu mối giao thương quan trọng với các tuyến đường bộ, đường sắt, đường hàng không và đường sông, tuy nhiên cũng tạo ra thách thức trong công tác phòng, chống dịch bệnh cho gia súc, gia cầm do sự giao lưu hàng hóa Địa hình Hà Nội chủ yếu là đồng bằng và đồi núi, trong đó đồng bằng chiếm khoảng 3/4 diện tích tự nhiên, thuận lợi cho việc phát triển chăn nuôi, đặc biệt là chăn nuôi gà.
Khí hậu Hà Nội tiêu biểu cho kiểu khí hậu Bắc bộ với đặc điểm nhiệt đới gió mùa ẩm, gồm mùa hè nóng, mưa nhiều và mùa đông lạnh, mưa ít Nằm trong vùng nhiệt đới, Hà Nội nhận lượng bức xạ mặt trời dồi dào với nhiệt độ trung bình hàng năm đạt 23,6ºC Độ ẩm trung bình hàng năm là 79%, với lượng mưa trung bình 1800mm và khoảng 114 ngày mưa mỗi năm Sự khác biệt rõ nét giữa hai mùa nóng và lạnh là đặc điểm nổi bật của khí hậu Hà Nội, trong đó mùa nóng kéo dài từ tháng 5 đến tháng 9 với nhiệt độ trung bình 29,2ºC.
Từ tháng 11 đến tháng 3 năm sau, Hà Nội trải qua mùa đông với thời tiết khô ráo và nhiệt độ trung bình khoảng 15,2ºC Thành phố có đủ bốn mùa Xuân, Hạ, Thu, Đông nhờ vào hai thời kỳ chuyển tiếp vào tháng 4 và tháng 10 Khu vực Hà Tây cũ, khi nhập với Hà Nội, tạo ra những tiểu vùng khí hậu đặc trưng như vùng núi, gò đồi và đồng bằng Tuy nhiên, sự khác biệt về thời tiết và chênh lệch nhiệt độ giữa các địa phương trong Hà Nội hiện nay không lớn.
4.1.1.2 Khái quát về các điều kiện kinh tế- xã hội
Hà Nội, với dân số ước tính 7.558.965 người tính đến 31/12/2015, là thành phố đông dân thứ hai tại Việt Nam, chiếm hơn 8% tổng dân số cả nước Thành phố đang ở trong giai đoạn cơ cấu dân số vàng, tạo điều kiện thuận lợi cho việc cung ứng nguồn nhân lực cho các hoạt động kinh tế - xã hội Hà Nội bao gồm 12 quận, 1 thị xã và 17 huyện, với lượng dân cư lớn và tỷ lệ người có tri thức ngày càng cao, điều này không chỉ thúc đẩy sự phát triển kinh tế xã hội mà còn là động lực quan trọng cho sự phát triển kinh tế nông thôn và chăn nuôi.
Mặc dù phải đối mặt với nhiều khó khăn như thời tiết bất lợi, dịch bệnh ở gia súc, gia cầm và suy thoái kinh tế, sản xuất nông nghiệp tại Thủ đô vẫn tiếp tục phát triển mạnh mẽ Tổng giá trị sản xuất nông, lâm, ngư nghiệp ước đạt 33.640 tỷ đồng, cho thấy những kết quả đáng khích lệ trong bối cảnh hiện nay.
Tính đến năm 2010, ngành chăn nuôi và thủy sản chiếm 55,89% trong khi dịch vụ chỉ đạt 2,97% Giá trị sản phẩm nông nghiệp thu hoạch trên 1ha đất nông nghiệp ước đạt 233 triệu đồng Hệ thống hạ tầng nông thôn được cải thiện và nâng cấp, với các công trình đê điều và thủy lợi được củng cố nhằm phục vụ sản xuất và đảm bảo an toàn trong phòng chống lụt bão, cũng như khắc phục hậu quả thiên tai Nhờ đó, đời sống vật chất và tinh thần của nông dân được nâng cao, góp phần giữ vững an ninh chính trị và phát triển kinh tế - xã hội tại địa phương.
4.1.2 Tình hình phát triển chăn nuôi gà thịt tại khu vực Hà Nội
Hình 4.1 Trang trại gà thịt, huyện Quốc Oai, Hà Nội
Thủ đô Hà Nội sở hữu điều kiện tự nhiên đa dạng với 150 nghìn ha đất đồi gò, 125 nghìn ha đất bãi phù sa, 35 nghìn ha đất đồng bằng và đất trũng còn lại Nhờ vào điều kiện thuận lợi cho phát triển nông nghiệp cùng với sự phối hợp chặt chẽ giữa các cấp, các ngành, ngành chăn nuôi gia cầm, đặc biệt là chăn nuôi gà thịt, đã có những bước tiến rõ rệt trong những năm gần đây.
Bảng 4.1 Số lượng trang trại tại khu vực Hà Nội từ năm 2012-2015
(Nguồn: Tổng cục thống kê Hà Nội, 2016)
Bảng 4.2 Số lượng gia cầm tại khu vực Hà Nội từ năm 2012-2015
Số gia cầm 17996 21244 21616 21801 ĐVT: Triệu con (Nguồn: Tổng cục thống kê Hà Nội, 2016)
Quy mô chăn nuôi gà thịt hiện nay chủ yếu nằm trong khoảng từ 2.000-5.000 con/trang trại, chiếm 68,8% tổng số trang trại, tiếp theo là quy mô từ 5.000-8.000 con (20,6%), từ 8.000-11.000 con (4,2%), từ 11.000-15.000 con (3,4%) và trên 15.000 con (3,4%) Đối với đất trang trại, chủ yếu là đất vườn nhà và đất nông nghiệp, với diện tích phổ biến từ 1-2 ha/trang trại.
Hình 4.2 Trang trại gà thịt, Thị xã Sơn Tây, Hà Nội
Vốn đầu tư cho chăn nuôi trang trại : Bình quân đầu tư chuồng trại, trang thiết bị, con giống đối với chăn nuôi gà thịt 50-60 triệu đồng/1.000 con gà
Về giống: Hầu hết các giống cao sản của thế giới đều được nhập khẩu và nuôi ở trang trại như là: hướng thịt USA, Hubbard, Lohmann, AA, Cobb, Ross
Nhiều trang trại hiện nay đã đầu tư mạnh mẽ vào chuồng trại và thiết bị chăn nuôi theo tiêu chuẩn tiến tiến, bên cạnh việc sử dụng giống cao sản Kiểu chuồng phổ biến là chuồng sàn 1-2 tầng với hệ thống làm mát, mang lại nhiều ưu điểm nhờ đầu tư hợp lý và sử dụng vật liệu giá rẻ Một số ít trang trại còn áp dụng kiểu chuồng kín và kiên cố, kết hợp với thiết bị máng ăn, máng uống bán tự động hoặc tự động.
Năng suất chăn nuôi hiện nay đã có sự cải thiện đáng kể so với phương thức truyền thống nhờ vào việc áp dụng giống ngoại, giống cải tiến và công nghệ chăn nuôi tiên tiến, cũng như sử dụng thức ăn chăn nuôi công nghiệp Đặc biệt, thời gian nuôi gà thịt công nghiệp chỉ từ 42-49 ngày mỗi lứa, với khối lượng xuất chuồng đạt từ 2,3-2,4 kg/con và tiêu tốn khoảng 2,1-2,3 kg thức ăn cho mỗi kg tăng trọng.
Trong chăn nuôi trang trại hiện nay, có ba phương thức tiêu thụ sản phẩm chính: tự sản tự tiêu, tiêu thụ thông qua thương lái và chăn nuôi gia công Gần đây, phương thức tiêu thụ qua các hợp tác xã cũng đang dần hình thành, mở ra cơ hội mới cho người chăn nuôi.
Tự sản tự tiêu (tự bao tiêu sản phẩm) là một hình thức phổ biến trong các trang trại quy mô, trong đó chủ trang trại tự bỏ vốn đầu tư, kinh doanh và tiêu thụ sản phẩm Hình thức này mang lại lợi nhuận cao trong một số thời điểm và cho phép người chăn nuôi tự chủ trong kinh doanh Tuy nhiên, nó cũng gặp nhiều hạn chế như thiếu vốn đầu tư, khó khăn trong tiêu thụ sản phẩm, thiếu hỗ trợ kỹ thuật và rủi ro cao, đặc biệt khi xảy ra dịch bệnh.
Người chăn nuôi thường phải bán sản phẩm qua thương lái, dẫn đến việc bị ép giá, đặc biệt trong những thời điểm khó khăn như khi cung vượt cầu hoặc khi có dịch bệnh xảy ra.
Tỷ lệ phân lập và kết quả giám định một số đặc tính sinh vật, hóa học của các chủng Salmonella spp ở mẫu phân gà thịt
4.2.1 Tỷ lệ phân lập vi khuẩn Salmonella spp ở mẫu phân gà thịt
Kết quả phân lập vi khuẩn Salmonella spp từ 120 mẫu phân gà thịt được nuôi tại các trang trại ở khu vực Hà Nội, được trình bày ở bảng sau:
Bảng 4.3 Kết quả phân lập vi khuẩn Salmonella trong phân gà Địa điểm
Theo kết quả từ bảng 4.3, trong tổng số 120 mẫu phân gà được xét nghiệm, có 22 mẫu dương tính với vi khuẩn Salmonella, chiếm tỷ lệ 18,33% Tỷ lệ phân lập Salmonella cao nhất được ghi nhận tại Thị xã Sơn Tây với 40,00%, tiếp theo là huyện Quốc Oai với 27,78% và huyện Thạch Thất với 25,00% Các huyện Mỹ Đức, Chương Mỹ và Ba Vì có tỷ lệ mẫu dương tính lần lượt là 13,33%, 8,11% và 6,67%.
Biểu đồ 4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn Salmonella trong phân gà
Kết quả phân lập cho thấy sự khác biệt rõ rệt về tỷ lệ Salmonella trong mẫu phân gà thịt tại các trang trại ở Hà Nội, với Thị xã Sơn Tây ghi nhận tỷ lệ dương tính cao nhất Qua khảo sát 15 trại gà thịt tại Sơn Tây, một số trại vẫn sử dụng cơ sở vật chất và trang thiết bị thô sơ, cùng với việc an toàn sinh học chưa được đảm bảo, dẫn đến tỷ lệ nhiễm Salmonella ở gà cao.
Mỹ có số lượng trại gà lớn nhất trong 6 địa điểm nghiên cứu, với tỷ lệ mẫu phân gà nhiễm Salmonella chỉ đạt 3/37 trại Các trang trại gà ở huyện Chương Mỹ được trang bị máng ăn và máng uống hiện đại, đồng thời thực hiện vệ sinh sát trùng chuồng trại nghiêm ngặt trước khi nhập gà, đảm bảo an toàn sinh học trong quá trình chăn nuôi Nghiên cứu cho thấy mô hình chăn nuôi và các yếu tố liên quan đến an toàn sinh học, như nguồn cung cấp gà, vệ sinh chuồng trại, và quy trình chăm sóc và tiêm vaccine cho gà, có ảnh hưởng lớn đến tỷ lệ nhiễm Salmonella tại các trại gà thịt.
Biểu đồ 4.2 Kết quả phân lập vi khuẩn Salmonella trong phân gà
Salmonella là loại vi khuẩn có khả năng kháng cao và gây bệnh trên nhiều loài động vật, đặc biệt là ở các trại gà Tỷ lệ phân lập Salmonella ở những trại gà không có triệu chứng bệnh cho thấy nguy cơ mang trùng và khả năng bùng phát dịch bệnh Việc phát hiện Salmonella trong mẫu phân gà không chỉ đe dọa đến sức khỏe đàn gà mà còn ảnh hưởng đến chất lượng thịt và trứng Đặc biệt, các đàn gà thịt nuôi quy mô công nghiệp khi được đưa vào nhà máy chế biến thực phẩm cần phải được kiểm tra kỹ lưỡng để đảm bảo an toàn thực phẩm.
Salmonella có nguy cơ ảnh hưởng đến chất lượng thịt thương phẩm và các sản phẩm của thịt gà trong quá trình chế biến giết mổ
Theo báo cáo của Tổ chức an toàn vệ sinh thực phẩm châu Âu năm 2010, sự lưu hành Salmonella ở gia cầm từ 0 tới 26.6 % Ở các nước phát triển như
Mỹ, Anh, sự lưu hành Salmonella trên thịt gà là 4.2 % (n!2), và 4 % (n7)
Tại Việt Nam, tỷ lệ nhiễm Salmonella trong gia cầm thấp hơn so với nhiều quốc gia Đông Nam Á khác như Thái Lan (57 %), Campuchia (88.2 %) và Trung Quốc (52.2 %), nhưng lại cao hơn so với Malaysia (35.5 %).
4.2.2 Kết quả giám định một số đặc tính sinh vật, hóa học của các chủng
Salmonella spp phân lập từ mẫu phân gà thịt
Tất cả các chủng Salmonella spp được phân lập sau khi đã đánh giá sơ bộ các đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy trên các môi trường khác nhau Để xác định và phân loại serotype, chúng tôi tiến hành nghiên cứu các đặc tính sinh vật và hóa học của chúng trên các môi trường giám định.
Kết quả cho thấy 100% chủng Salmonella spp nghiên cứu đều mọc và phát triển tốt trên các môi trường với những đặc điểm như sau:
- Môi trường XLD: Vi khuẩn Salmonella spp hình thành khuẩn lạc kích thước nhỏ, đường kính trung bình 0,5-1,5 mm, màu đen, trên nển môi trường màu sáng đỏ (hình 4.8)
Hình 4.4 Salmonella trên môi trường XLD
Môi trường HE cho phép vi khuẩn Salmonella phát triển với đặc điểm khuẩn lạc có màu biến đổi từ xanh dương sang xanh lục, có thể xuất hiện hoặc không có tâm đen Đôi khi, tâm đen có thể lớn đến mức bao trùm toàn bộ khuẩn lạc.
- Trên môi trường TSI: Các chủng Salmonella làm mặt thạch nghiêng chuyển màu đỏ, đáy màu vàng hoặc màu đen (sản sinh H2S) (hình 4.10)
Bài viết trình bày kết quả kiểm tra hình thái, khả năng di động, tính chất bắt màu, đặc tính sinh vật và hóa học của 22 chủng Salmonella spp được phân lập từ mẫu phân gà thịt, thông qua các môi trường khác nhau như được thể hiện trong bảng 4.4.
Hình 4.5 Salmonella trên môi trường HE
Hình 4.6 Salmonella trên môi trường TSI và Lysine
Kết quả từ bảng 4.3 và 4.4 cho thấy 100% các chủng Salmonella spp phân lập đều là trực khuẩn, Gram âm và có khả năng di động Tất cả các chủng này đều có đặc tính sinh hóa đặc trưng, bao gồm khả năng sinh H2S trên môi trường TSI, không sản sinh indole, và cho kết quả âm tính với phản ứng VP, β-galactosidase và ureaza Đặc biệt, phản ứng Lysine decarboxylase cho kết quả dương tính, dẫn đến việc khử carboxyl của Lysine thành Cadaverin, làm cho môi trường có tính kiềm và chuyển màu từ hồng sang tím dưới sự chỉ thị của Bromocresol.
Bảng 4.4 Đặc tính sinh vật, hoá học của các chủng Salmonella sppphân lập từ mẫu phân gà thịt trên một số môi trường
STT Môi trường nuôi cấy Đặc tính Tỷ lệ (%)
Bảng 4.5 Biểu hiện đặc trưng của Salmonella trong các phản ứng sinh hóa
Thử nghiệm Môi trường Biểu hiện đặc trưng
Phần thạch nghiêng màu đỏ, đáy ống nghiệm màu vàng, nứt thạch và xuất hiện vạch đen
VP VP Không đổi màu khi nhỏ α – napthol 5% và KOH 40%
Indole Tryptophan Không xuất hiện vòng đỏ khi nhỏ thuốc thử Kovac’s
Ureaza Urea Không đổi màu
Lysine decarboxylation medium Môi trường đục và có màu tím β-galactosidase Đĩa giấy O.N.P.G Không đổi màu
Hình 4.7 Các phản ứng sinh hóa vi khuẩn Salmonella
(TSI/ β-galactosidase/ Lysine decarboxylase / VP/ Ureaza/ Indole)
Trong quá trình kiểm tra các đặc tính sinh vật và hóa học trên các môi trường đặc hiệu, chúng tôi đã tiến hành thử nghiệm phản ứng lên men đường của các chủng Salmonella đã được phân lập Kết quả của nghiên cứu được trình bày trong bảng 4.6.
Bảng 4.6 Kết quả thử phản ứng lên men đường của các chủng Salmonella phân lập
Loại đường Kết quả phản ứng
Dương tính Tỷ lệ (%) Âm tính Tỷ lệ (%)
Kết quả nghiên cứu cho thấy 100% (22/22) các chủng Salmonella được phân lập từ mẫu phân gà thịt có khả năng lên men các loại đường như glucose, dextrose, maltose, mannitol và sorbitol Tuy nhiên, vi khuẩn này không có khả năng lên men lactose, sucrose và salicin.
Kết quả nghiên cứu cho thấy sự phù hợp với thang mẫu các loại đường trong phân lập và chẩn đoán Salmonella theo đề xuất của Quinn và cộng sự (1994) Thử nghiệm phản ứng lên men đường cũng xác nhận những đặc tính chung của giống Salmonella, như đã được Nguyễn Thị Ngọc Liên (1997) và Đặng Thị Oanh (2013) công bố Tất cả các chủng Salmonella spp phân lập đều thể hiện những đặc tính sinh vật và hóa học điển hình, đáp ứng tiêu chuẩn nhận định vi khuẩn.
Salmonella của Carter và Cole (1990), Nguyễn Như Thanh và cộng sự (2001)
Từ kết quả ban đầu này cho phép tiếp tục các nghiên cứu tiếp theo về vi khuẩn
Hình 4.8 Hình ảnh vi khuẩn Salmonella trên kính hiển vi
Kết quả xác định serotype của các chủng vi khuẩn Salmonella spp phân lập
Bài viết này trình bày 22 chủng Salmonella spp với các đặc tính sinh vật và hóa học đặc trưng, nhằm xác định serotype của các chủng vi khuẩn này thông qua phương pháp huyết thanh học Dựa trên phân loại của White-Kauffman (WHO, 1983), quá trình xác định nhóm vi khuẩn Salmonella spp được thực hiện theo hướng dẫn của hãng Remel, và kết quả được trình bày chi tiết trong bảng 4.7.
Kết quả định type kháng nguyên O theo nhóm cho thấy, các chủng
Trong nghiên cứu về Salmonella spp, mẫu phân gà thịt nuôi tại các trang trại ở Hà Nội cho thấy tỷ lệ phân lập cao nhất thuộc nhóm E1, chiếm 54,55% (12/22 mẫu) Tiếp theo là nhóm D1 với tỷ lệ 36,36% (8/22 mẫu), trong khi có 9,09% (2/22 mẫu) không xác định được nhóm Kết quả cho thấy các chủng Salmonella chủ yếu thuộc hai nhóm E1 và D1 tại khu vực này.
Bảng 4.7 Kết quả xác định nhóm kháng nguyên O của các chủng vi khuẩn
Salmonella spp phân lập (n") Nhóm huyết thanh Số mẫu dương tính Tỷ lệ (%) Cấu trúc kháng nguyên
Ghi chú: (-) = Không xác định được cấu trúc kháng nguyên
Biểu đồ 4.3 Kết quả xác định nhóm huyết thanh Salmonella spp
Hình 4.14 Phản ứng ngưng kết giữa Salmonella với kháng huyết thanh O đa giá
Sau khi xác định nhóm huyết thanh của các chủng Salmonella bằng kháng huyết thanh O đơn giá, chúng tôi tiếp tục xác định serotype của vi khuẩn Salmonella phân lập bằng cách sử dụng kháng huyết thanh H pha 1 Âm tính Dương tính và pha 2 Kết quả của quá trình này được trình bày chi tiết trong bảng 4.8.
Bảng 4.8 Kết quả xác định serotype của các chủng vi khuẩn Salmonella spp phân lập (n") Kháng nguyên H
Thành phần pha 2 g, m - 8/22 36,36 S enteritidis e, h l, w 5/22 22,73 S meleagridis g, m - 4/22 18,18 S suberu g, m, s - 3/22 13,64 S amsterdam
Kết quả nghiên cứu cho thấy trong 22 chủng Salmonella spp, có 8 chủng thuộc nhóm D1 là Salmonella enteritidis, chiếm 36,36%; 5 chủng thuộc nhóm E1 là S meleagridis, chiếm 22,73%; 4 chủng (18,18%) là S suberu và 3 chủng (13,64%) là S amsterdam.
Biểu đồ 4.4 Kết quả định chủng Salmonella từ mẫu phân gà thịt tại khu vực Hà Nội
Nghiên cứu chỉ ra rằng, chủng Salmonella S enteritidis hiện đang có tỷ lệ lưu hành cao nhất tại các trang trại gà thịt trong khu vực.
Hà Nội, sau đó là chủng S meleagridis chiếm tỷ lệ 22,73%
Nghiên cứu của Nguyễn Thị Ngọc Liên (1997) về bệnh phó thương hàn vịt ở tỉnh Hà Tây cho thấy có sự xuất hiện của nhóm vi khuẩn E1 chiếm 12.5% và nhóm D1 chiếm 18.75%, trong đó S enteritidis là đại diện chính Trần Thị Hanh và cộng sự (2009) đã phát hiện S enteritidis có mặt ở cả hai hình thức giết mổ gà thịt công nghiệp và thủ công Năm 2012, Trần Ngọc Bích cũng phát hiện S enteritidis trên mẫu thịt và mẫu phân của thủy cầm tại tỉnh Hậu Giang Ngoài ra, Nguyễn Viết Không và cộng sự (2012) ghi nhận sự hiện diện của S enteritidis tại các điểm giết mổ gia cầm quy mô nhỏ ở các huyện ngoại thành.
Sự phát hiện Salmonella ở 5 khâu của chuỗi sản xuất (Phạm Thị Ngọc và cộng sự, 2015) cho thấy tình trạng nhiễm Salmonella đang trở thành mối lo ngại lớn Nghiên cứu chỉ ra rằng hai chủng Salmonella chính gây ngộ độc thực phẩm ở người là S enteritidis và S typhimurium, với sự hiện diện của S enteritidis trong các mẫu nghiên cứu là cơ sở khoa học để đề ra các biện pháp phòng ngừa hiệu quả Việc thịt gà và trứng gà bị nhiễm Salmonella không chỉ ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm mà còn gây ra những rủi ro nghiêm trọng cho sức khỏe người tiêu dùng.
Tỷ lệ nhiễm Salmonella trong nghiên cứu này đạt 18,33%, cho thấy việc kiểm soát Salmonella trong chăn nuôi gà thịt chưa hiệu quả Cụ thể, tỷ lệ nhiễm theo chuỗi sản xuất từ cơ sở gà giống bố mẹ, cơ sở ấp trứng, trang trại gà, cơ sở giết mổ và điểm tiêu thụ lần lượt là 32,8%, 11%, 32,08%, 43,3% và 36,9% (Phạm Thị Ngọc và cộng sự, 2015) Các trang trại gà thịt quy mô lớn cung cấp nguồn nguyên liệu cho các điểm giết mổ và nhà máy chế biến thực phẩm, do đó, nếu quy trình giết mổ không được kiểm soát chặt chẽ, nguy cơ nhiễm Salmonella vào thịt gà sẽ gia tăng.
Theo tiêu chuẩn Việt Nam số 7046/2002 QĐ-Bộ Y tế, không được phép có vi khuẩn Salmonella trong 25 gram mẫu thịt sản phẩm Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn
Sự hiện diện của chủng Salmonella enteritidis với tỷ lệ 36,36% trong các mẫu khảo sát cho thấy nguy cơ lây nhiễm cao nếu không kiểm soát tốt trong quá trình vận chuyển, giết mổ và tiêu thụ thịt gia cầm Do đó, việc thiết lập quy trình giết mổ hợp lý và bố trí nơi bày bán thịt gia cầm sạch sẽ, khô ráo là rất cần thiết để giảm thiểu nguy cơ nhiễm khuẩn Salmonella cho người tiêu dùng.
Salmonella vào thân thịt gà, từ đó giúp hạn chế ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn Salmonella gây ra cho con người.
