Vật liệu- phương pháp nghiên cứu
Nội dung nghiên cứu
3.1.1 Nghiên cứu quy trình nuôi cấy tế bào Marc-145 trên hệ thống Microcarrier
- Xác định tốc độ khuấy thích hợp để nuôi tế bào Marc-145 trên hệ thống Microcarrier
- Xác định giá trị DO thích hợp để nuôi cấy tế bào Marc-145 trên hệ thống Microcarrier
- Xác định lưu lượng khí cấp vào thích hợp để nuôi cấy tế bào Marc-145 trên hệ thống Microcarrier
- Xác định lượng tế bào Marc-145 cấy vào hạt Cytodex trên hệ thống Microcarrier
- Xác định môi trường nuôi cấy thích hợp cho tế bào Marc-145 trên hệ thống Microcarrier
3.1.2 Nghiên cứu tính thích ứng của virus Tai Xanh nuôi cấy trên tế bào Marc-145 bằng hệ thống Microcarrier
- Xác định thời gian hấp phụ virus vào tế bào, xử lí dịch ủ virus
- Xác định môi trường duy trì sau gây nhiễm virus
- Xác định liều gây nhiễm, thời gian thu hoạch thích hợp trên hệ thống Microcarrier
3.1.3 Nghiên cứu quy trình thu hoạch và xử lí dịch virus sau khi thu hoạch 3.2 ĐỐI TƢỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
- Tế bào Marc-145 đang dùng sản xuất (working cell bank) giữ giống tại công ty Hanvet
- Giống virus nhược độc PRRS Hanvet1.vn đang dùng sản xuất (Product Seed)
- Tủ ấm CO2, tủ ấm thường
- Box cấy an toàn sinh học cấp 2
- Kính hiển vi soi ngược
- Chai schott 500ml, 1 lít, 2 lít, 5 lít, 10 lít
- Pipet man: 200àl, 1ml, 8 kờnh, 12 kờnh
- Pippet thủy tinh10ml, 20ml
- Đầu tuýp 200àl, 1ml, 5ml
- Giá để ống, khay nhôm, rổ nhựa
- Môi trường nuôi cấy tế bào: MEM, DMEM, M199, LH, Hank, PBS
- Hóa chất, huyết thanh : FBS, Tripsin-EDTA, Hepes, Trypan blu
- Môi trường kiểm tra độ thuần khiết: thạch máu, TSB và nước thịt gan yếm khí
- Phòng tế bào- trung tâm nghiên cứu- Công ty TNHH dược Hanvet- KCN phố nối A- Hưng Yên
3.5.1 Phương pháp nuôi cấy tế bào a Khôi phục tế bào:
Lấy ống tế bào đông lạnh ra và rã đông nhanh chóng ở nhiệt độ 37°C trong bể ổn nhiệt Sau đó, chuyển ống vào hệ thống Laminar air flow (Laf) vô trùng và chuyển hỗn dịch tế bào vào ống ly tâm chứa môi trường nuôi cấy đã được làm ấm Cuối cùng, ly tâm hỗn dịch tế bào ở tốc độ 1500 vòng/phút trong khoảng 5-10 phút.
Quá trình ly tâm giúp loại bỏ dịch nổi, đồng thời giữ lại tế bào lắng cặn ở dưới Sau đó, tế bào được hoàn nguyên bằng môi trường nuôi cấy và trộn đều bằng pipet để đảm bảo sự đồng nhất.
- Chuyển toàn bộ dung dịch tế bào này vào chai nuôi tế bào Tfask có môi trường nuôi dưỡng bổ sung huyết thanh và kháng sinh
- Ủ chai nuôi cấy ở tủ ấm 37°C, 5% CO2.
Sau 1 ngày, loại bỏ môi trường nuôi cấy cũ để loại trừ DMSO, sau đó rửa lớp tế bào bằng dung dịch PBS Tiếp theo, cung cấp môi trường nuôi cấy mới có bổ sung huyết thanh và ủ chai nuôi tế bào ở tủ ấm với nhiệt độ 37°C và 5% CO2 để tế bào phát triển hiệu quả.
- Hằng ngày theo dõi sự phát triển của tế bào trên kính hiển vi quang học b Tách tế bào
- Rửa chai tế bào bằng PBS(-): 1 – 2 lần Cho TE 0,05% , láng chai Ủ
Để nuôi cấy tế bào, đầu tiên hãy đặt chúng ở nhiệt độ 37 độ C trong 5 – 15 phút cho đến khi tế bào co tròn và bắt đầu bong ra khỏi đáy chai Sau đó, nhẹ nhàng vỗ chai nuôi và trung hòa bằng môi trường chứa 5% huyết thanh Tiếp theo, đếm số lượng tế bào trên buồng đếm hồng cầu để định lượng tế bào Cuối cùng, tính toán và chia tế bào vào các chai nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ 37 độ C.
- Hàng ngày quan sát khả năng phát triển của tế trong các chai tế bào trên kính hiển vi quang học
- Nhân số lượng tế bào trên các chai nuôi cấy Để đủ số lượng tế bào Marc-145 nuôi trên hệ thống Microcarrie với dung tích
Để nhân tế bào Marc-145, cần sử dụng 10 lít môi trường và 50g hạt Cytodex-1, thực hiện quy trình nhân theo từng cấp độ với quy mô ngày càng lớn Quy trình chi tiết về cách nhân số lượng tế bào được thể hiện trong hình dưới đây.
Hình 3.1 Mô hình nhân số lƣợng tế bào cho nuôi cấy trên hệ thống
Microcarrier c Phương pháp đếm tế bào
Để đảm bảo vệ sinh và chính xác khi sử dụng buồng đếm, hãy dùng vải gạc sạch được tẩm cồn để lau chùi buồng đếm và phiến kính đậy Sau đó, cần để chúng khô hoàn toàn, có thể hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn để tăng tốc độ khô Khi đã khô, đặt buồng đếm lên bề mặt phẳng và đặt phiến kính đậy đúng vị trí, chú ý không để phiến kính bị lệch hoặc kênh.
Hình 3.2 Buồng đếm tế bào
Trên buồng đếm tế bào có 2 vùng đếm, 1 vùng ở trên và 1 vùng ở dưới Mỗi vùng có 4 ô đếm
Khi đếm, kết quả đếm được tính trên cả 2 vùng đếm bao gồm 8 ô đếm
- Trong mỗi ô đếm, thứ tự đếm được mô tả như trên hình vẽ
Tiến hành đếm số lượng tế bào
Sử dụng pipetman, hút và nhả hỗn dịch tế bào cùng thuốc nhuộm 5 lần, sau đó hút một lượng nhỏ hỗn dịch tế bào Đưa đầu típ vào cạnh phiến kính và nhẹ nhàng bơm hỗn dịch tế bào ra để nó vào buồng đếm bằng lực mao dẫn cho đến khi phủ kín lớp mỏng Sử dụng kính hiển vi với vật kính 10x để đếm số lượng tế bào Tiến hành đếm trên cả 2 buồng đếm, mỗi buồng có 4 ô vuông 1mm², chú ý đếm các tế bào ở ô đánh số 1.
Để đếm các tế bào sống, hãy chú ý đến những điểm tròn, sáng trên nền xanh Quy trình đếm diễn ra trong mỗi ô 1mm² theo hình zic-zắc, bắt đầu từ trái sang phải và từ trên xuống dưới.
Các tế bào trong ô đếm chỉ được tính nếu nằm giữa cạnh phía trên và cạnh bên trái, không bao gồm tế bào trên cạnh phía dưới và bên phải Để đảm bảo độ chính xác, số lượng tế bào trong mỗi ô đếm nên từ 20 đến 50 Nếu số lượng tế bào ít hơn 20 hoặc nhiều hơn 50, cần tiến hành đếm lại với độ pha loãng phù hợp.
Nếu hơn 10% tế bào bám thành cụm phải làm lại từ đầu và bảo đảm các tế bào đã tách riêng rẽ
C : Hệ số pha loãng tế bào
A : Số tế bào đếm lần 1
B : Số tế bào đếm lần 2
16 : Số ô đếm của 2 buồng (8 ô 2 buồng đếm)
10 4 : Nghịch đảo thể tích dịch trong 1 ô đếm
V : Thể tích bình nuôi cấy tế bào d Phương pháp nuôi cấy tế bào trên hạt nang Cytodex bằng hệ thống Microcarrier
Để chuẩn bị Cân Cytodex-1, cho vào chai Schott hoặc bình tam giác có nắp và rửa hạt Cytodex 1 từ 1-2 lần bằng PBS(-) Sau đó, láng đều 10-15 lần, để lắng và loại bỏ nước nổi Sau khi rửa, bổ sung PBS(-), đóng nắp và sấy vô trùng ở nhiệt độ 121˚C trong 30 phút Cuối cùng, bảo quản ở nhiệt độ 2-8˚C.
Sau khi sấy hạt Cytodex, cần lắng hạt và loại bỏ dịch trong Tiếp theo, bổ sung môi trường nuôi cấy và huyết thanh để loại bỏ PBS(-) và lắc đều trước khi lắng để đổ bỏ môi trường.
(chú ý: tất cả thao tác đều được làm trong lab, thao tác vô trùng)
Nuôi cấy tế bào Marc-145 trên hệ thống Microcarrier
Sau khi hệ thống được xử lý vô trùng và lắp đặt hoàn tất, tiến hành chuyển tế bào Marc và hạt cytodex-1 vào hệ thống Quy trình thực hiện được thực hiện một cách cẩn thận để đảm bảo tính chính xác và hiệu quả.
Sau khi hấp vô trùng, hạt Cytodex được chuyển vào lab vô trùng để loại bỏ PBS(-) Tiếp theo, bổ sung 500ml môi trường nuôi cấy có kháng sinh và lắc nhẹ để hạt lắng ở nhiệt độ phòng.
Hút loại bỏ môi trường, bổ sung 500ml môi trường nuôi cấy + huyết thanh lắc nhẹ để lắng ở nhiệt độ 37ºC (khoảng 30 – 45 phút)
Để nuôi tế bào hiệu quả, trước tiên cần loại bỏ môi trường và bổ sung lượng tế bào Marc-145 đã chuẩn bị vào chai chứa hạt Cytodex Sử dụng chai 1 lít, chuyển hỗn hợp tế bào và hạt Cytodex vào bình nuôi của hệ thống Microcarrier Cuối cùng, bổ sung môi trường nuôi cấy theo các công thức đã thiết kế với nồng độ huyết thanh khác nhau để tối ưu hóa quá trình nuôi tế bào.
Kết nối bình nuôi sau khi sấy vào bộ điều khiển và bơm toàn bộ dịch trong bình ra ngoài Sau đó, kết nối bình nuôi với chai chứa hạt cytodex và chai chứa hỗn dịch tế bào Bơm toàn bộ hạt vào bình nuôi, tiếp theo bơm toàn bộ hỗn dịch tế bào vào bình và bật cánh khuấy của hệ thống Kiểm tra lượng hỗn dịch trong bình, kết nối chai môi trường và bơm vào bình cho đủ 500ml Bật hệ thống khí ở chế độ tự động để tự động chọn loại khí sục vào bình nuôi Cuối cùng, kết nối hệ thống để cân chỉnh điện cực DO và pH, đảm bảo các điện cực hoạt động tốt và hiển thị chính xác các thông số đo (Kjell Nilsson 1988).
1 Kiểm tra đảm bảo điện cực pH đã được nối đúng với bộ điều khiển
2 Cắm điện và bật công tắc nguồn hệ thống nuôi cấy tế bào
3 Chờ cho thiết bị khởi động xong,
5 Nhấn dòng pH để hiệu chuẩn pH
6 Dùng nước cất rửa sạch điện cực pH, thấm khô bằng giấy thấm, nhúng điện cực vào dung dịch pH 7 chuẩn sao cho phần đầu đo ngập hoàn toàn
7 Nhấn cửa sổ bên dưới dòng Set Zero, dùng bàn phím nhập giá trị 7,00
Hình 3.3 Cân chỉnh điện cực pH
8 Chờ 2-3 phút cho hệ thống cân bằng- giá trị Current value trên màn hình tương đối ổn định.
9 Nhấn Set Zero, dùng bàn phím nhập lại giá trị 7,00 để xác nhận
10 Dùng nước cất rửa sạch điện cực, thấm khô bằng giấy thấm trung tính, sau đó nhúng ngập đầu điện cực vào dung dịch pH 4 chuẩn
11 Nhấn cửa sổ bên dưới dòng Set Span, dùng bàn phím nhập giá trị 4,00
12 Chờ 2-3 phút cho hệ thống cân bằng- giá trị Current value trên màn hình tương đối ổn định
Địa điểm nghiên cứu
- Phòng tế bào- trung tâm nghiên cứu- Công ty TNHH dược Hanvet- KCN phố nối A- Hưng Yên.
Thời gian nghiên cứu
Phương pháp nghiên cứu
3.5.1 Phương pháp nuôi cấy tế bào a Khôi phục tế bào:
Để bắt đầu quy trình, lấy ống tế bào đã được bảo quản đông lạnh trong nitơ lỏng và rã đông nhanh chóng trong bể ổn nhiệt 37°C Sau khi rã đông, chuyển ống vào Laminar air flow (Laf) vô trùng và chuyển hỗn dịch tế bào vào ống ly tâm có chứa môi trường nuôi cấy đã được làm ấm Cuối cùng, ly tâm hỗn dịch tế bào ở tốc độ 1500 vòng/phút trong khoảng 5-10 phút.
Quá trình ly tâm giúp loại bỏ dịch nổi, giữ lại phần tế bào lắng cặn ở dưới Sau đó, tế bào được hoàn nguyên bằng môi trường nuôi cấy và được trộn đều bằng pipet để đảm bảo sự đồng nhất.
- Chuyển toàn bộ dung dịch tế bào này vào chai nuôi tế bào Tfask có môi trường nuôi dưỡng bổ sung huyết thanh và kháng sinh
- Ủ chai nuôi cấy ở tủ ấm 37°C, 5% CO2.
Sau 1 ngày, cần loại bỏ môi trường nuôi cũ để loại bỏ DMSO, sau đó rửa lớp tế bào bằng dung dịch PBS Tiếp theo, bổ sung môi trường nuôi mới có huyết thanh và ủ chai nuôi tế bào ở tủ ấm với nhiệt độ 37°C và 5% CO2 để tế bào phát triển.
- Hằng ngày theo dõi sự phát triển của tế bào trên kính hiển vi quang học b Tách tế bào
- Rửa chai tế bào bằng PBS(-): 1 – 2 lần Cho TE 0,05% , láng chai Ủ
Để nuôi cấy tế bào, đầu tiên đặt ở nhiệt độ 37 độ C trong 5 – 15 phút cho đến khi tế bào co lại và bắt đầu bong ra khỏi đáy chai Sau đó, vỗ nhẹ chai nuôi và trung hòa bằng môi trường chứa 5% huyết thanh Tiến hành đếm số tế bào trên buồng đếm hồng cầu để định lượng tế bào, sau đó tính toán và chia tế bào vào các chai nuôi trong tủ ấm ở 37 độ C.
- Hàng ngày quan sát khả năng phát triển của tế trong các chai tế bào trên kính hiển vi quang học
- Nhân số lượng tế bào trên các chai nuôi cấy Để đủ số lượng tế bào Marc-145 nuôi trên hệ thống Microcarrie với dung tích
Để nhân tế bào Marc-145, cần sử dụng 10 lít môi trường và 50g hạt Cytodex-1, thực hiện quy trình nhân theo từng cấp độ với quy mô ngày càng lớn Quy trình chi tiết về việc nhân số lượng tế bào được minh họa trong hình dưới đây.
Hình 3.1 Mô hình nhân số lƣợng tế bào cho nuôi cấy trên hệ thống
Microcarrier c Phương pháp đếm tế bào
Sử dụng vải gạc sạch và cồn để lau sạch buồng đếm và phiến kính đậy Đảm bảo buồng đếm và phiến kính khô hoàn toàn, có thể sử dụng lửa đèn cồn để làm khô nhẹ nhàng Đặt buồng đếm trên bề mặt phẳng và cẩn thận đặt phiến kính đậy vào đúng vị trí, tránh tình trạng lệch hoặc kênh.
Hình 3.2 Buồng đếm tế bào
Trên buồng đếm tế bào có 2 vùng đếm, 1 vùng ở trên và 1 vùng ở dưới Mỗi vùng có 4 ô đếm
Khi đếm, kết quả đếm được tính trên cả 2 vùng đếm bao gồm 8 ô đếm
- Trong mỗi ô đếm, thứ tự đếm được mô tả như trên hình vẽ
Tiến hành đếm số lượng tế bào
Sử dụng pipetman, hút và nhả 5 lần hỗn dịch tế bào và thuốc nhuộm, sau đó lấy một lượng nhỏ hỗn dịch tế bào Đưa đầu típ vào cạnh phiến kính đậy và bơm nhẹ để hỗn dịch tế bào vào buồng đếm bằng lực mao dẫn cho đến khi phủ kín một lớp mỏng Sử dụng kính hiển vi với vật kính 10x để đếm số lượng tế bào, thực hiện đếm trên cả hai buồng đếm với mỗi buồng có 4 ô vuông 1mm², tập trung vào các ô được đánh số 1.
Để đếm số lượng tế bào sống, hãy chú ý đến những điểm tròn, sáng trên nền xanh Quá trình đếm diễn ra trong mỗi ô có diện tích 1mm², theo hình zic-zắc từ trái sang phải và từ trên xuống dưới.
Các tế bào trong ô đếm chỉ được tính nếu nằm giữa cạnh phía trên và cạnh bên trái, không bao gồm tế bào trên cạnh phía dưới và cạnh bên phải Để đảm bảo độ chính xác, số lượng tế bào trong mỗi ô đếm nên nằm trong khoảng 20 - 50 tế bào Nếu số lượng tế bào ít hơn 20 hoặc vượt quá 50, cần thực hiện việc đếm lại với độ pha loãng thích hợp.
Nếu hơn 10% tế bào bám thành cụm phải làm lại từ đầu và bảo đảm các tế bào đã tách riêng rẽ
C : Hệ số pha loãng tế bào
A : Số tế bào đếm lần 1
B : Số tế bào đếm lần 2
16 : Số ô đếm của 2 buồng (8 ô 2 buồng đếm)
10 4 : Nghịch đảo thể tích dịch trong 1 ô đếm
V : Thể tích bình nuôi cấy tế bào d Phương pháp nuôi cấy tế bào trên hạt nang Cytodex bằng hệ thống Microcarrier
Cân Cytodex-1 vào chai schott hoặc bình tam giác có nắp, rửa hạt Cytodex 1 từ 1-2 lần bằng PBS(-) Sau đó, láng đều từ 10-15 lần, để lắng và bỏ nước nổi Sau khi rửa xong, bổ sung PBS(-), đóng nắp và sấy vô trùng ở 121˚C trong 30 phút Cuối cùng, bảo quản sản phẩm ở nhiệt độ từ 2-8˚C.
Sau khi sấy hạt Cytodex, cần lắng hạt và loại bỏ dịch trong Tiếp theo, bổ sung môi trường nuôi cấy và huyết thanh để loại bỏ PBS(-), sau đó lắc đều và lắng để loại bỏ môi trường.
(chú ý: tất cả thao tác đều được làm trong lab, thao tác vô trùng)
Nuôi cấy tế bào Marc-145 trên hệ thống Microcarrier
Sau khi hệ thống được xử lý vô trùng và lắp đặt hoàn tất, tiến hành chuyển tế bào Marc cùng với hạt cytodex-1 vào hệ thống Quy trình thực hiện được thực hiện theo các bước cụ thể để đảm bảo hiệu quả và an toàn.
Sau khi hấp vô trùng, hạt Cytodex được chuyển vào phòng thí nghiệm vô trùng để loại bỏ PBS(-) Tiếp theo, bổ sung 500ml môi trường nuôi cấy có chứa kháng sinh và lắc nhẹ để hạt lắng ở nhiệt độ phòng.
Hút loại bỏ môi trường, bổ sung 500ml môi trường nuôi cấy + huyết thanh lắc nhẹ để lắng ở nhiệt độ 37ºC (khoảng 30 – 45 phút)
Hút bỏ môi trường và bổ sung tế bào Marc-145 vào chai chứa hạt Cytodex Sử dụng chai 1 lít để chuyển hỗn hợp tế bào và hạt Cytodex vào bình nuôi của hệ thống Microcarrier Cuối cùng, bổ sung môi trường nuôi cấy với các công thức đã thiết kế, điều chỉnh nồng độ huyết thanh khác nhau để nuôi tế bào hiệu quả.
Kết nối bình nuôi đã được sấy khô vào bộ điều khiển và bơm toàn bộ dịch trong bình ra ngoài Sau đó, kết nối bình nuôi với chai chứa hạt cytodex và chai chứa hỗn dịch tế bào Bơm toàn bộ lượng hạt vào bình nuôi, tiếp theo là bơm toàn bộ hỗn dịch tế bào vào bình Bật cánh khuấy của hệ thống và kiểm tra lượng hỗn dịch trong bình Kết nối chai môi trường và bơm vào bình cho đủ 500ml Bật hệ thống khí ở chế độ tự động để tự động chọn loại khí sục vào bình nuôi Cuối cùng, kết nối hệ thống để cân chỉnh điện cực DO và pH, đảm bảo các điện cực hoạt động tốt và hiển thị chính xác các thông số đo (Kjell Nilsson 1988).
1 Kiểm tra đảm bảo điện cực pH đã được nối đúng với bộ điều khiển
2 Cắm điện và bật công tắc nguồn hệ thống nuôi cấy tế bào
3 Chờ cho thiết bị khởi động xong,
5 Nhấn dòng pH để hiệu chuẩn pH
6 Dùng nước cất rửa sạch điện cực pH, thấm khô bằng giấy thấm, nhúng điện cực vào dung dịch pH 7 chuẩn sao cho phần đầu đo ngập hoàn toàn
7 Nhấn cửa sổ bên dưới dòng Set Zero, dùng bàn phím nhập giá trị 7,00
Hình 3.3 Cân chỉnh điện cực pH
8 Chờ 2-3 phút cho hệ thống cân bằng- giá trị Current value trên màn hình tương đối ổn định.
9 Nhấn Set Zero, dùng bàn phím nhập lại giá trị 7,00 để xác nhận
10 Dùng nước cất rửa sạch điện cực, thấm khô bằng giấy thấm trung tính, sau đó nhúng ngập đầu điện cực vào dung dịch pH 4 chuẩn
11 Nhấn cửa sổ bên dưới dòng Set Span, dùng bàn phím nhập giá trị 4,00
12 Chờ 2-3 phút cho hệ thống cân bằng- giá trị Current value trên màn hình tương đối ổn định